WO2006126294A1 - ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子 - Google Patents

ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子 Download PDF

Info

Publication number
WO2006126294A1
WO2006126294A1 PCT/JP2005/021558 JP2005021558W WO2006126294A1 WO 2006126294 A1 WO2006126294 A1 WO 2006126294A1 JP 2005021558 W JP2005021558 W JP 2005021558W WO 2006126294 A1 WO2006126294 A1 WO 2006126294A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
iron
gene
complex
protein
activity
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/021558
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiko Murata
Takashi Iwashita
Original Assignee
Suntory Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Limited filed Critical Suntory Limited
Priority to CA002609164A priority Critical patent/CA2609164A1/en
Priority to US11/920,841 priority patent/US20110016579A1/en
Priority to JP2007517717A priority patent/JPWO2006126294A1/ja
Publication of WO2006126294A1 publication Critical patent/WO2006126294A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a barley transporter protein that is responsible for the uptake of iron barley complex from soil, a gene encoding the protein, a vector containing the gene, and a transgenic plant using the vector. .
  • Gramineae plants secrete mugineic acid, a phytosiderophore, into the soil when they fall into iron deficiency. Mugineic acid is thought to form a complex with trivalent iron in alkaline soil, and the transporter of the grass family absorbs iron as an iron complex of mugineate.
  • Various studies have been conducted in order to clarify the functions of Gramineae plants, and various transgenic plants into which the genes involved in phytosiderophores have been isolated and introduced have been proposed!
  • a 36 kDa protein that is deeply involved in the mechanism of iron acquisition via the mugineic acid of gramineous plants and improves iron absorption of gramineous plants and the gene encoding the protein have been clarified (see Patent Document 1). It has been revealed that the 36 kDa protein has a function as a gene of an enzyme group involved in mugineic acid synthesis.
  • the gene IDS3, an enzyme that biosynthesizes deoximugineate into mugineic acid can be introduced into rice to enable secretion of mugineic acid (see Non-Patent Document 1), and it is also an enzyme in the pathway of mugineic acid biosynthesis.
  • cathodic also Yellow stripes 1 gene in maize that encodes a protein that mediates the chelated iron uptake (y S l gene) was cloned, Yellow stripe 1 protein (YS1 protein) were isolated.
  • yeast and oocytes transformed with a gene that expresses the YS1 protein are non-selective for metals, that is, take up other metals including heavy metals in addition to iron, such as copper, zinc, lead, cobalt, or nickel. It was clarified that it can also mediate (see Patent Document 3 and Non-Patent Document 2).
  • YS1 protein has been reported to transport a cotianamine iron complex that is involved in iron transport in plant cells (see Non-Patent Documents 3 and 4).
  • Mugrate iron complex is thought to be incorporated into plants via a unique transporter.
  • Transporter proteins that selectively incorporate iron mugineate complexes and the genes that encode them are still unknown. Being,,,.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-17181
  • Patent Document 2 JP 2001-17012 A
  • Patent Document 3 JP 2005-501502 Publication
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-316192
  • Non-Patent Document 1 Kobayashi, T. and 5 others, Planta, 2001, No. 212, p. 864-871
  • Non-Patent Document 2 Curie, C et al., Nature, 2001, 49th, p. 346
  • Non-Patent Document 3 Syaaf GJ et al., Journal ⁇ Biological ⁇ Ke Miss Lee (J. Biol. Chem), 2004, No. 279, p. 9091-9096
  • Non-Patent Document 4 Roberts LA et al., Plant Physology
  • Non-Patent Document 5 Koike S et al., The 'Plant' Journal (Plant J.), 2004, No. 39, p. 415-424
  • Non-patent document 6 DiDonato R-J-J et al., The Plant Journal (Plant J.), 2004, 39th, p. 403-414
  • the present invention preferably clones a gene that selectively takes an iron complex of mugineate from the roots of iron-deficient barley (Hordeum vulgare L.) into the plant body from the soil, and transports the gene in the presence of mugineic acid.
  • the purpose is to create a transgenic plant that can be cultivated in the introduced iron-deficient state (alkaline soil).
  • the iron acquisition mechanism found in Gramineae plants is by synthesizing mugineic acids in the plant body and releasing it into the soil and incorporating the iron mugineate complex produced into the plant body.
  • barley in particular, is considered to have the strongest alkali resistance corresponding to the highest secretion of wheat acid. Therefore, if a transporter gene that incorporates the iron complex of barley into the plant body is introduced into plants other than barley, plants other than barley that grow vigorously in alkaline soil as well as barley can be developed.
  • the present inventors tried to isolate a transporter gene by extracting RNA from the roots of barley (Hordeum vulgare L.) grown in an iron-deficient state (Invitrogen). By searching for homology with the maize yellow 1 (ZmYSl) gene in the barley database (DDBJ), we found several ESTs with 60% or more homology, and used these EST sequences as primers. And 5'—, 3′—RACE (System of rapid Amplification of cDNA Ends) (Invitrogen, manufactured by Roche) together with the RNA extracted from the above-mentioned barley mosquito. Released. The inventors have further studied and completed the present invention. That is, the present invention
  • a gene comprising a DNA encoding a transporter protein comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of (a) and having an activity of selectively incorporating an iron muginate complex ;
  • a trachea having an activity of selectively taking in an iron muginate complex characterized in that the host cell according to [4] is cultured under conditions where the gene according to [2] is expressed.
  • a method for producing a sporter protein
  • a protein having any one of the following (a) to (c) having an activity of selectively incorporating an iron muginate complex (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
  • the plant is selected from the group of grasses, cucumbers, legumes, roses, camellia, akabanae, beech, citrus and solanaceae.
  • [12] A method for imparting an activity of selectively incorporating an iron muginate complex into a plant, characterized by expressing the gene of [1] or [2] in the plant,
  • the present invention is preferably a transporter gene that selectively incorporates an iron complex of mugineate that has been identified among the grasses, which is most resistant to iron deficiency, that is, can be taken into the body even under alkaline soil.
  • HvYSl Hadeum Vulgare Yellow
  • transgenic plant such as a cereal
  • a transgenic plant such as a cereal
  • Such transgenic plants can grow in alkaline soils that do not contain divalent iron, for example, trivalent iron, so that they can be used as farmland even on poor soils that were previously inappropriate as farmland, especially alkaline soils.
  • divalent iron for example, trivalent iron
  • the pasture can be expanded and used for expanding pasture in dairy farming.
  • the transgenic plant of the present invention has a function of selectively incorporating the iron mugineate complex. Therefore, it is safe as a food with a low risk of incorporating metals other than iron, such as heavy metals that are harmful to the human body, like plants into which transporter genes that non-selectively incorporate metals into plants are introduced. Can produce various crops.
  • the transgenic plant of the present invention has a feature that its growth is fast because iron necessary for photosynthesis is absorbed even when cultivated in alkaline soil. For this reason, by introducing the transporter gene of the present invention into a plant other than barley, it becomes possible to increase the productivity of the plant.
  • Bacteria, yeast, animal cells, plant cells, etc. transformed by introducing the transporter gene of the present invention can be used as cells for elucidating the transporter mechanism. Furthermore, the transporter gene of the present invention or a partial base sequence thereof can be used as a probe for other transporter genes.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence determined from the barley HvYS 1 cDNA. Boxes represent homology with maize ZmYSl, and Roman numerals indicate ZmYSl transmembrane regions (12), where SOSUI program power is also estimated.
  • FIG. 2 is a diagram showing expression of HvYSl in barley yarn and weave.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Example 3.
  • HvYSl indicates the HvYSl-expressing DDY4 strain
  • ZmYSl indicates the ZmYSl-expressing DDY4 strain
  • VEC indicates the DDY4 strain into which only the vector has been introduced.
  • Fe (ni) —citrate represents an iron ( ⁇ ) citrate complex
  • Fe (III) —MA represents an iron (III) complex of mugineate
  • Fe (ll) —NA represents a nicotianamine iron (II) complex. .
  • FIG. 4 is a graph showing electrophysiological reactivity to various mugineic acid metal complexes and -cotianamine iron (II) complexes in Xenopus HvYSl-expressing oocytes.
  • the vertical axis shows the percentage of potential change of other metal complexes when the potential change of iron muginate complex is 100%.
  • FIG. 5 is a diagram showing the localization of HvYSl in iron-deficient barley roots.
  • a and b show the longitudinal section of the root
  • c and d show the transverse section of the root.
  • a and c are the results of hybridization of the sense probe (negative control)
  • b and d are the results of hybridization of the antisense probe.
  • Scale 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of the plasmid Mac-HvYSl-mas-pBinPlus.
  • FIG. 7 is a view showing the expression of HvYSl by RT-PCR in a transgenic plant.
  • 1, 2 and 3 indicate HvYSl-expressing transgenic plants
  • 4 and 5 indicate normal plants into which H vYSl has not been introduced (negative control)
  • M indicates the molecular weight.
  • An "iron mugineate complex” refers to a chelate compound formed by coordination of mugineic acids with iron ions, particularly trivalent iron ions.
  • mugineic acids include mugineic acid, 2′-deoxymugineic acid, 3-hydroxymugineic acid, 3-epoxyhydroxymugineic acid, avenic acid, disteconic acid, epihydroxydeoximineic acid, and avenic acid. Is mentioned.
  • Selective incorporation of iron mugineate refers to the transport and transport of only the iron mugineate complex into the cell with the help of extracellular force.
  • Complex compounds formed from mugineic acids and metals other than iron it means that a chelate complex compound formed by coordination of a mugineic acid analog such as nicotianamine with an iron ion is not transported or transported.
  • Transporter protein refers to a protein that exists on the cell membrane responsible for transport of a substance through the cell membrane, and in the present specification, it means a protein responsible for cell membrane transport of an iron muginate complex. In particular, a protein having an activity of selectively incorporating an iron muginate complex is preferred.
  • Examples of the protein having the activity of selectively incorporating the iron muginate complex include a protein having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 even if it is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, the protein is iron iron As long as it has a function of selectively taking in the complex, it is included in the protein according to the present invention.
  • the above-mentioned several preferably 20 or less, more preferably 10 or less, more preferably 5 or less.
  • amino acid sequence “one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added” can be generated by a well-known technical method such as a genetic engineering method or a site-directed mutagenesis method. Or it means that the number of naturally occurring numbers has been deleted, substituted or added.
  • a protein having at least 60% homology with the amino acid sequence preferably a protein having 70% or more homology, more preferably a protein having 80% or more homology, more preferably As long as it is a protein having a homology of 90% or more, particularly preferably a protein having a homology of 95% or more and having a function of selectively incorporating an iron muginate complex, Included in proteins.
  • homologous for the above amino acid sequences means the degree of coincidence of amino acid residues constituting each sequence by comparing the primary structures of proteins.
  • Gene means a functional unit of DNA and has specific information on a protein.
  • a gene containing DNA encoding a transporter protein in the present specification (sometimes abbreviated as a transporter gene in this specification) is a transporter protein having an activity of selectively incorporating an iron muginate complex. Have information. Therefore, the transporter gene includes, but is not limited to, a DNA sequence encoding the transporter protein and Z or a regulatory sequence necessary for their expression. Transporter genes are non-expressed, eg forming recognition sequences for other proteins
  • the RNA transcript includes a primary transcript of DNA encoding a transporter protein, and a process such as precursor RNA strand cleavage, 3 ′ end formation, RNA splicing or RNA editing by post-transcriptional processing. Examples include functional mature mRNA, tRNA and rRNA.
  • mRNA is first extracted from the mRNA source that encodes the transporter protein, and cDNA is prepared using reverse transcriptase.
  • 3 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), 5, —RACE and Z or 5 ′ Z3′—RACE are performed to obtain the target transporter gene.
  • a source of mRNA encoding the transporter protein for example, gramineous plants cultivated by hydroponics, such as barley, wheat, rye, embatta, corn, sorghum or rice, preferably barley roots are used. be able to.
  • the transporter gene of the present invention is a gene that is expressed in an iron-deficient environment, it is exposed to an environment in which iron ions are exposed to a trivalent water-insoluble environment under an iron ion-free or alkaline condition ( Preferably, barley roots can be used preferably.
  • a grass family (preferably barley) which is sown in a solid medium such as GM medium or Murashige's stag medium (hereinafter referred to as MS medium) and grown under aseptic conditions.
  • a solid medium such as GM medium or Murashige's stag medium (hereinafter referred to as MS medium) and grown under aseptic conditions.
  • MS medium Murashige's stag medium
  • Any kind of cells may be used as long as they contain mRNA of the desired gene, such as callus and cultured cells of gramineae (preferably barley) grown under aseptic conditions.
  • Extraction of mRNA from an mRNA source can be performed by a known method. For example, barley plants grown in hydroponics are exposed to iron-deficient conditions and then roots are collected. The collected roots are frozen with liquid nitrogen. After grinding frozen roots in a mortar, etc., the resulting ground product is treated with the darioxal method, guanidine thiocyanate cesium chloride method, lithium chloride-urea method, proteinase K-deoxyribonuclease method, AGPC method.
  • MRNA can be extracted using (Acid gua nidinium-Phenol-Chloroform method) or the like, but it can also be extracted using a commercially available RNA extraction kit.
  • RNA extraction kits include RNA isolation kit (Stratagene), Isogen (Tubon Gene), Trizol (Invitrogen), Concert plant RNA extraction reagent (Invit rogen) Etc.
  • the extraction method is preferably carried out according to the kit manual. After mRNA extraction, mRNA may be purified using a column [eg RNeasy (QIAGEN) etc.].
  • the 3, RACE is a commercially available kit such as 3, RACE (System of Rapid Amplification of cDNA Ends; manufactured by Invitrogen), 3 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (manufactured by Life Technologies). ) Or 3, -full R ACE core set (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like.
  • 5—RACE is a commercially available kit such as 5, —RACE (Invitrogen), CapFi This can be done by using shing Full-Length cDNA Premix Kit (Funakoshi Co., Ltd.) or 5, full RACE core set (Takara Bio Co., Ltd.). 5, / 3, An RACE, 5, / 3, Race kit, 2 nd generation (Roche Corp.) can be carried out by using a.
  • the primer used in the above 3'-RACE, 5, one RACE or 5 'Z3'-RACE is homologous to a partial base sequence possessed by a gene encoding a membrane protein that mediates uptake of known chelated iron
  • Oligonucleotides having a base sequence of about 15 to 25 bp are preferably about 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • Examples of the 3′-RACE primer include an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, 6 or 7.
  • Examples of the 5′-RACE primer include an oligonucleotide having a base sequence ability represented by SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 or 12.
  • Examples of the 5 ′ Z3′—RACE primer include an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 14 or 15.
  • the known gene encoding a membrane protein that mediates uptake of the above-mentioned known chelated iron is, for example, the corn yellow stripe 1 gene (Sequence Listing) registered in Genebank as Accession Number AF186234. SEQ ID NO: 3) and the like can be preferably used.
  • EST examples include IJ, etc., registered as Accession No. AF472629, BJ470821, BJ448359 or BQ765689 in DDBJ for Barley.
  • EST is a gene fragment, usually 300-400 nucleotides long, that has also been sequenced for the 3 'end or 5' end force of a complementary DNA (cDNA) clone.
  • the homology search can be performed on Gen Bank or DDBJ databases using analysis software such as BLAST and FASTA.
  • ESTs to be detected are genes that are highly conserved and have regions and functions, and are particularly high and homologous to the amino acid sequences of these regions. It is essential for the function of the protein, and it is preferable that the amino acid is stored and the sequence is preserved.
  • PCR can be performed by a known method. PCR products can be inserted into vectors and introduced into the host for amplification. [0022] The entire nucleotide sequence of the obtained gene can be determined by a known method. To determine the nucleotide sequence, use Maxam Gilbert's chemical modification method or M13 phage.
  • V force capable of mentioning a dideoxynucleotide chain termination method, etc.
  • an automatic base sequencer for example, an automatic DNA sequencer ABI PRIS MTM 310 geneticAnalyzer manufactured by PerkinElmer Japan.
  • a transporter protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to the DNA encoding the transporter protein and has an activity of selectively incorporating an iron muginate complex is included in the DNA.
  • DNA encoding means, for example, a colony ⁇ ⁇ hybridizer using a partial sequence of DNA encoding a transporter protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a probe. It means DNA obtained by using the Chillon method, the plaque hybridization method, the Southern blot hybridization method, or the like.
  • the “stringent conditions” referred to herein are, for example, DNA having at least about 50%, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the conditions are such that DNAs hybridize with each other and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or an SSC solution with a concentration of about 0.1 to 2 times (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride, 1 It consists of 5 mM sodium citrate.) Hybridization conditions at a temperature of about 65 ° C.
  • DNA refers to deoxyribonucleic acid.
  • the unit of DNA is called nucleotide, and it consists of base, sugar (D-deoxyribose), and phosphate.
  • bases There are four types of bases: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T), and genetic information is defined by the arrangement of these four types.
  • V and a DNA fragment having the nucleotide sequence by PCR using genomic DNA in a cage type Can be hybridized as a probe to obtain the transporter gene of the present invention.
  • the transporter gene of the present invention is a gene comprising DNA encoding a protein having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 is a protein having amino acid alignment ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, the protein selectively incorporates the iron muginate complex.
  • the gene encoding it is also included in the transporter gene of the present invention.
  • the “several” and “deletion, substitution or addition of one or more amino acids” have the same meaning as described in the above protein.
  • a mutagenesis kit using, for example, a site-specific sudden mutagenesis method is performed by a known method such as the Kunkel method or the gap duplex method or a method analogous thereto.
  • a known method such as the Kunkel method or the gap duplex method or a method analogous thereto.
  • Mutant-K manufactured by Takara Bio Inc.
  • Mutant-G manufactured by Takara Bio Inc.
  • LA PCR LA PCR in vitro Mutagenesis series kit of Takara Bio Inc. Can do.
  • a protein having at least 60% homology with the amino acid sequence preferably a protein having 70% or more homology, more preferably a protein having 80% or more homology, more preferably Encode this protein as long as it has a homology of 90% or more, particularly preferably a protein with a homology of 95% or more, and has a function of selectively incorporating the iron muginate complex.
  • the gene is also included in the transporter gene of the present invention. “Homologous” in the amino acid sequence has the same meaning as described in the above protein.
  • the activity of selectively incorporating the iron mugineate complex of the transporter protein according to the present invention is, for example, the same as that of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae double mutant fet3fet4 (DDY4 strain). It can be confirmed by transforming yeast transformed with the gene and culturing the transformed yeast in a medium supplemented with iron (III) muginate complex.
  • the strain DDY4 has a deficiency in the bivalent iron uptake system and cannot grow on iron-restricted media (Eide, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19 96, 93, p.
  • the activity of selectively incorporating the iron mugineate complex can be confirmed by observing changes in cell membrane potential in Xenopus oocytes and the like.
  • the change in cell membrane potential is measured by adding a solution containing an iron muginate complex to an oocyte into which the transporter gene of the present invention has been introduced, and iron iron muginate incorporated through the transporter protein expressed on the oocyte membrane. It is possible to change the cell membrane potential of the oocyte that accompanies the complex by measuring the potential inside and outside the cell membrane directly with an electrode by the membrane potential fixation method or the like.
  • the transporter protein according to the present invention can be obtained by introducing the transporter gene of the present invention into a vector, culturing a host transformed with the vector under inducing conditions, and purifying the host protein. it can.
  • Vector refers to a substance having a function of introducing a gene into a cell, and includes plasmids, viral vectors, artificial non-viral vectors, and the like.
  • Non-viral vectors include, but are not limited to, for example, ribosomes and polylysine compounds.
  • the vector according to the present invention contains the transporter gene, promoter, terminator, etc. of the present invention on the multicloning site of the basic vector (hereinafter referred to as the basic vector for convenience). What is necessary is just to build and build.
  • the basic vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. Examples of plasmid DNA include plasmids for E.
  • coli hosts such as pBR322, pBR325, pUC118 or pUC119, for example, plasmids for Bacillus subtilis hosts such as pUBl10 or pTP5, such as pFL61 (manufactured by ATCC), ⁇ 13, ⁇ 24 or YCp50 Plasmids for yeast hosts, such as pUC strains [pUC18, pUC19, PSR-01, PSA-01, PSR-02, PSR-03 (manufactured by Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.)] plasmids for plasmid cells or PBI221 Or for example pWTT23132 (DN Binary vectors such as AP), and phage DNAs include ⁇ phage. Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • the vector when producing a transgenic plant into which the transporter gene of the present invention has been introduced, is not particularly limited as long as it is a plant cell host vector that can be transformed into a plant.
  • Any promoter may be used as long as it can be expressed in the host.
  • the host is E. coli, trp promoter, lac promoter, P promoter
  • yeast such as SPOl promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc.
  • pFL61 manufactured by ATCC
  • PH05 promoter PH05 promoter
  • PGK promoter GAP promoter
  • ADH promoter and the like are preferable.
  • an enhancer sequence of the 35S RNA promoter of the force reflower mosaic virus a plant-derived promoter such as the rd29A gene promoter or the rbcS promoter, or the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus is used as an agrobacterium.
  • a constitutive promoter such as the mac-1 promoter added to the 5 ′ side of the derived mannopine synthase promoter sequence is preferred.
  • artificially modified promoters such as the tac promoter may be used.
  • the mac-1 promoter is preferred.
  • Any terminator can be used as long as it can be expressed in the host.
  • examples include rrn promoter, psbA terminator, 35 S terminator, rpsl6 terminator, CaMV35S terminator, ORF25polyA transcription terminator, PsbA terminator, and the like.
  • the vector according to the present invention preferably has a gene for identifying a gene recombinant.
  • the gene for identifying the gene recombinant is not particularly limited, and a gene known per se may be used. Examples of the gene include various drug resistance residues. Examples include genes that complement the auxotrophy of a gene or host. More specifically, for example, an ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene (G418 resistance), chloramphenicol resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, U
  • RA3 gene tetracycline resistance gene or herbicide chlorsulfuron resistance gene.
  • plug motor and a terminator for recognizing the gene upstream and downstream of the gene.
  • Another vector for example, a gene encoding a biosynthesis enzyme of mugineic acid can be introduced into the vector according to the present invention.
  • a gene encoding a biosynthetic enzyme of mugineic acid is introduced into a vector, and the plant transformed with the vector has a function of selectively incorporating an iron mugineate complex, Can be biosynthesized by the plant itself and secreted into the soil, so that it is possible to incorporate the iron muginate complex even in alkaline soils that do not contain mugineic acids.
  • Examples of the gene encoding the biosynthetic enzyme of mugineic acid include a gene encoding a 36 kDa protein described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-17181 and a cocotamineamine amino group described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-17012. Examples include, but are not limited to, genes encoding transferase.
  • the other gene also includes a gene that contains a DNA that hybridizes with the other gene under stringent conditions and encodes a protein that biosynthesizes mugineic acids. Stringent conditions are the same as above.
  • the method for producing the vector according to the present invention is not particularly limited, and each of the above-described DNA segments (promoter, terminator, transporter gene, drug resistance gene, etc.) is added to the basic vector. They should be introduced in the prescribed order.
  • the method for introducing the vector into the host is not particularly limited.
  • a method using calcium ions [Cohen, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69th p. — 21 14 (1972)]
  • electo-position method [Becker, DM et al., Methods. Enzymol., 194th, p. 182—187 (1990)]
  • Sufferoplast method [Hinnen, A. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 75, p. 1929— 1933 (1978)]
  • dithium acetate method [Itoh, H., J. Bacteriol., 153, p.
  • microinjection also called particle acceleration method or biolistic' bombardment
  • virus transformation agrobacterium transformation
  • particle gun method Svab, Z., Hajdu kiewicz, P., and Maliga, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87th, p. 8 526-8530
  • PEG method Golds, T., Various methods such as, but not limited to, Maliga, P., and Koop, H.-U., Bio / Technol., 1993, VIII, p. 95-97).
  • the method for growing the host into which the vector according to the present invention has been introduced is not particularly limited, and it is preferable to use a known method according to the host.
  • separation and purification of the transporter protein according to the present invention can be performed by an appropriate combination of per se known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting out solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Hydrophobic methods such as methods using differences in charge, methods utilizing differences in charge such as ion exchange chromatography, methods utilizing specific affinity such as affinity chromatography, and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Examples thereof include a method using a difference and a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • a transgenic plant that expresses or overexpresses the transporter gene of the present invention can be produced using the above-described genetic manipulation method.
  • the transgenic plant according to the present invention produces a transporter protein by the expression of the transporter gene of the present invention, and this transporter gene is particularly preferably expressed in root epidermis cells.
  • This transporter gene of the present invention By expressing the transporter gene of the present invention on the root surface This facilitates the uptake of iron mugineate complex into the soil.
  • Expression of the gene in transgenic plants can be confirmed by histological staining. Histological staining can be performed by a known method.
  • the transgenic plant of the present invention can be cultivated in soil containing trivalent iron or iron muginate complex in divalent iron-free, for example, alkaline soil. Further, the transgenic plant of the present invention absorbs iron necessary for photosynthesis, and thus has a feature of rapid growth, and can improve plant productivity.
  • a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant is preferred. More specifically, for example, gramineous plants (for example, rice, barley, wheat, amberjack, rye, corn, amber, hi, koryan, pasture), cucurbitaceae (for example, cucumber, hop, cub, rubber tree).
  • gramineous plants for example, rice, barley, wheat, amberjack, rye, corn, amber, hi, koryan, pasture
  • cucurbitaceae for example, cucumber, hop, cub, rubber tree.
  • legumes eg, soybean, azuki bean, peanut, kidney bean, broad bean, etc.
  • broad-leaved plants eg, strawberry, ume, rose, etc.
  • camellia plants eg, chrysanthemum, etc.
  • Plants for example, coffee tree, gardenia, etc.
  • beech family plants for example, oak, beech, oak moth, etc.
  • citrus family plants for example, daidai, yuzu, bunshikan, salamander, etc.
  • solanaceous plants for example, eggplant
  • Tomatoes, peppers, potatoes, tobacco, datura, physalis, petuchini, caribracore, jurenbergia) Etc. are not limited force thereto which include
  • PBS Phosphate buffer saline
  • RT PCR: reverse transcription—polymerase chain reaction
  • Chenic acid-iron complex iron iron complex of taenoate
  • Fe (III) ⁇ MA iron mugineate complex (iron (III) mugineate complex)
  • Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • DIG digoxigenin
  • culture medium for cultivation After seeding barley (variety Morex), it was cultured in lZ5Hoagland culture medium (hereinafter referred to as culture medium for cultivation). The seedlings on day 16 were treated with iron deficiency (cultivated with an iron ion-free culture medium) for 4 days. The roots were collected and total RNA was extracted using a concert plant RNA extraction reagent (Invitrogen).
  • RNA was converted to cDNA using reverse transcriptase.
  • RACE manufactured by Invitrogen
  • 5 was performed using the obtained cDNA. 5
  • As the primer used for -RACE a synthesized oligonucleotide was selected from the ESTs detected in (2) above, selecting the base sequence shown in Table 3 from the internal force of AF472629.
  • PCR was performed. For this PCR, select the base sequence of AF472629 from the base sequence shown in Table 5 and select the synthesized forward primer (SEQ ID NO: 14 in the sequence list) and the base sequence shown in Table 5 from the sequence of BJ470821. (SEQ ID NO: 15 in the sequence listing) was used.
  • the cDNA of the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, gene extraction from the gel, and transformation into E. coli in the same manner as in (2) above, and the entire base sequence was determined. Now that the entire nucleotide sequence has been determined, PCR is performed again using the cDNA obtained from reverse transcriptase from the total RNA of barley root obtained in (1) above and the primers in Table 6 and Table 7. It was.
  • the cDNA obtained by PCR was subjected to 1.2% (w / v) agarose gel electrophoresis, extraction from the gel, and transformation into E. coli were carried out in the same manner as in (2) above.
  • the transformed Escherichia coli was cultured overnight at 37 ° C in LB (Luria-Bertani) medium supplemented with 50 ⁇ g of ampicillin at 37 ° C. DNA was extracted with the system. This nucleotide sequence was determined, the entire sequence was confirmed (SEQ ID NO: 1), and named HvYSl (Hordeum Vulgare Yellow Stripel, DDBJ Accession No. AB214183).
  • the primers shown in Table 8 were used as sequence primers for determining the base sequence.
  • the amino acid sequence of the HvYS 1 protein (SEQ ID NO: 2) was determined.
  • the protein is 678 amino acids long and has about 73% homology with maize ZmYSl protein. reference).
  • GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene was used as a controller.
  • HvYS l is hardly expressed when the iron complex of mugineate is abundant, but in iron deficiency, the expression level was selectively increased at the root (see Fig. 2).
  • the budding yeast Saccharomyces cerevisiae double mutant fe t3fet4 has two genes responsible for uptake of divalent iron (fet3 (gene that converts trivalent iron into divalent iron) and fet4 (a gene that directly takes in divalent iron)] is deficient, and cannot grow on iron-restricted media (Eide, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93rd, p. 5624— 5628), unable to grow using iron complexed with mugineic acid (Fe (III) ⁇ ⁇ ) (Loulergue, C. Gene, 1998, 225, p. 47 — 57 ).
  • the present inventors used DDY4 strain into which HvYS lc DNA was introduced and used DDY4 strain that expressed the gene as Fe (III) MA as the only iron source. It was investigated whether it can grow on the culture medium containing.
  • HvYSl has substrate selectivity
  • three different iron sources namely Fe (III) 'taenoic acid or Fe (III) ⁇ , Fe (II) ⁇ were mixed in the culture medium and the culture test was conducted.
  • Yeast was cultured in Ura, a minimal medium supplemented with 10 M FeCl, FeCl as a 50 M Fe (lll) 'thaenic acid, Fe (III) ⁇ , or ⁇ ⁇ Fe (II) ⁇ and blank. . 10 M Fe (lll)
  • BPDS a strong chelating agent of divalent iron
  • Fe (m) ⁇ ⁇ was prepared according to von Wiren, N et al., Biochem. Biophys. Acta, 1998, 1371, p. 143-155. Nicotianamine was also purchased by Hasegawa Koryo Co., Ltd., and Fe (II) 'nicotianamine was prepared according to Schaaf G et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, p. 9091-9096. Incubation was performed at 30 ° C for 4 days. Three dilutions of yeast cultures (with optical densities (OD) at a wavelength of 600 nm of 0.2, 0.02 and 0.002) were spotted on the plate.
  • OD optical densities
  • the HvYSl-expressing DDY4 strain did not grow. In the presence of 10 M Fe (III) ⁇ MA, the HvYSl-expressing DDY4 strain grew in the same manner as the ZmYSl-expressing DDY4 strain. When iron is supplied as an Fe (III) MA chelate, the HvYSl-expressing DDY4 strain can grow. When iron is supplied as Fe (m) 'citrate, the gene-expressing DDY4 strain cannot or cannot grow. It was suggested that the HvYSl protein encodes an iron transporter selective for Fe (III) MA. To clarify this point, BPDS, a strong Fe (II) chelating agent, was added to Fe (lll) • so that all residual Fe (II) was removed. It was added to MA-supplemented medium.
  • Hv YS1-expressing DDY4 strain In the presence of BPDS, the Hv YS1-expressing DDY4 strain also grew on the Fe (m) ⁇ MA-supplemented medium. This strongly suggests that the HvYSl protein is a phytosiderophore-bound Fe (III) transporter protein.
  • corn transporter ZmYSl transports Fe (II) ⁇ present in all plants in addition to Fe (III) ⁇
  • HvYSl-expressing DDY4 strain has Fe (II) ⁇ Uptake was not observed or growth was strongly suppressed. This indicates that the HvYSl protein is present in the roots and the soil force is also selectively working to incorporate Fe (III) ⁇ . (See Fig. 3).
  • HvYS 1 cDNA was inserted into the Xbal and BamHI sites of pSP64Poly (A) vector (manufactured by Promega), and cRNA was prepared using mMESSAGE mMACHINE Kit from Ambion.
  • Oocytes were cultured in ND-96 solution at 17 ° C for 48-72 hours.
  • the present inventors have determined that the substrate selectivity is determined by using copper, zinc, nickel, as a substrate other than Fe (lll) ⁇ MA, Manganese and cobalt mugineic acid complexes were prepared in the same manner as iron.
  • Ovocytes expressing HvYSl were set in a chamber filled with ND-96 solution, and 10 ⁇ L of each substrate was poured into 10 ⁇ L (final concentration 50 ⁇ ) to measure electrophysiological activity.
  • Axoclamp-2 type two-electrode potential-fixed amplifier (Axon) in a mode in which two microelectrodes filled with 3 ⁇ KC1 (internal resistance 0.5-2 ⁇ ) were inserted into the oocyte, and the potential of the experimental tank was fixed at OmV. was used to fix the potential.
  • the current was passed through a 1kHz low-pass filter (-3dB, 8-pole Bessel filter / Cyber amplifier, manufactured by Axon), sampled at 10kHz using a Digidata 1200 interface (Axon), digitized and stored. .
  • ORIGIN 6.1 software (Microcal Software) was used to analyze the potential program, recorded and stored data. Measurements were made at a fixed potential of 60 mV.
  • the iron-deficient barley root prepared in Example 1 was placed in 4% paraformaldehyde ZPBS, and reduced in pressure and repeated at normal pressure every 15 minutes until the roots subsided, and incubated at 4 ° C overnight. After washing with PBS twice for 30 minutes, the cells were incubated with 30%, 40%, 50%, and 60% ethanol aqueous solutions for 30 minutes twice in succession to make 70% ethanol aqueous solution, and incubated at 4 ° C for one day and night.
  • HvYS 1 cDNA was introduced into the Xbal and Hindlll sites of the plasmid vector pBluescript KS (+) and prepared with the DIG (digoxigenin) RNA Labeling kit manufactured by Roche.
  • the sense was prepared by linearizing the vector with Hindlll restriction enzyme and T7 polymerase, and the antisense probe was prepared by linearizing the vector with Xbal restriction enzyme and T3 polymerase.
  • 150bp alkali treatment 42mM NaHCO3, 63mM NaC
  • Acetylation was performed with 2N HC1 for 10 minutes, PBS twice for 2 minutes, glycine 2 mg / mL PBS solution for 15 minutes twice, PBS for 3 minutes twice. After washing twice with 2 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4) for 2 minutes, it was again dehydrated as described above, dehydrated to 100% ethanol, and dried in a desiccator for 1 hour.
  • 2 X SSC 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4
  • a noble hybridization solution containing the probe (50% deionized formamide, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, IX Denhat's solution, 10% (wZv) dextran sulfate, 20 / z gZmL yeast tRNA , 0.3M NaCl, 0.3M DTT (dithiothreitol)] on the section and force the parafilm to 50.
  • PCGP1394 (Tanaka et al., 1995, Plant Cell Physiol, 36: 1023-1031 Is digested with Hindlll and SacII and pCGP1394 is digested with Pstl, blunt-ended using a blunting kit (TaKaRa), and further digested with SacII. About 2 kb of DNA fragment obtained in this way and pBinPLUS (van Engelen et a 1., 1995, Trangenic Research, 4, 288-290) were digested with Sacl and then blunted in the same manner, and digested with Hindlll. A plasmid obtained by ligating 3 kinds of 12 kb DNA fragments was designated as PSPB185.
  • HvYSl the TOPO-TA cloning kit (Invitrogen) was used, and the PCR product amplified with the primers shown in Table 10 was subcloned into the PERU-TOPO vector.
  • the forward primer in Table 10 has an Xbal sequence (GCTCTAGA) attached to the 5 'end of the HvYSl translation region as a restriction enzyme site, and the reverse primer has a Hindlll sequence as a restriction enzyme site at the 3' end of the HvYSl translation region. (CCCAAGCTT) is added.
  • This HvYSl-containing plasmid (subcloned PERII-TOPO vector 1) was first digested with Hindlll, and the protruding ends were blunt-ended using a blunting kit (TaKaRa), and further A DNA fragment containing about 2 kb of HvYS 1 was removed by digestion with Xbal.
  • the amplified PSPB185 was digested with Kpnl, the ends were similarly blunted, and further digested with Xbal to obtain a DNA fragment of about 14 kb.
  • the obtained transgenic petunia leaves were ground, and total RNA was extracted with RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
  • CDNA was prepared from 1 g of the extracted RNA using First Strand cDNA Synthesis Kit using Invitrogen's Superscript TM II RT enzyme.
  • the forward primer SEQ ID NO: 26 in the sequence listing
  • reverse primer sequence listing
  • the reverse primer synthesized the internal sequence of the 1644th and 1621st positions of the same base sequence.
  • a GAPDH (glyceroaldehydride 3-phosphate dehydrogenase) gene was used as a control gene.
  • the GAPDH gene primer the forward primer and reverse primer shown in Table 12 were used.
  • Transgenic plants introduced with HvYS 1 showed a difference in the amount of PCR product, but a band was detected at 755 bp expected as a PCR product from HvYSl, and the HvYSl gene was detected. It was confirmed that it was introduced in Petunia. In normal petunia without HvYSl gene introduced (Fig. 7, 4 and 5: control), the GAPDH PCR product (about lOOObp) was detected. The PCR product derived from HvYSl was not detected. Industrial applicability

Abstract

　ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子を含むトランスジェニック植物を創製することを目的とする。係るトランスジェニック植物は、２価鉄不含の例えば３価鉄を含むアルカリ土壌において生育できる植物として有用である。  

Description

ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、土壌からのムギネ酸鉄錯体の取り込みを担うォォムギのトランスポータ 一タンパク質、前記タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、なら びに前記ベクターを使ったトランスジエニック植物に関する。
背景技術
[0002] 地球の土壌面積のうち、主食である穀物やいも類を生産できる農地は約 10%にす ぎず、残りの約 90%は植物の生育に必須元素を質的又は量的に欠 ヽて 、るために 植物の生育が阻害される不良土壌であるといわれている。特に鉄は、植物の光合成 の律速因子であり、鉄分を質的又は量的に欠いている土壌に生育した植物は鉄欠 乏クロロシスが発現し枯死する。不良土壌のうち約 30%はアルカリ性土壌であり、こ の条件下では鉄が植物の根から吸収されにく 、3価の水不溶体鉄となって 、て、土 壌に鉄が豊富にあっても植物の健全な生育に必要な鉄の量は満たされない。
イネ科植物は鉄欠乏に陥ると、ファイトシデロフォア（phytosiderophore ;鉄キレー ター）であるムギネ酸を土壌に分泌する。ムギネ酸は、アルカリ性土壌における 3価の 鉄と錯体を形成し、イネ科植物のトランスポーターが根カゝらムギネ酸鉄錯体として鉄 分を吸収すると考えられている。イネ科植物の該機能を明らかにするために種々の 研究がなされ、ファイトシデロフォアに関与する遺伝子の分離及び該遺伝子を導入し たトランスジエニック植物が種々提案されて!ヽる。例えばイネ科植物のムギネ酸を介し た鉄獲得機構に深く関与しイネ科植物の鉄吸収を改善する 36kDaタンパク質及び そのタンパク質をコードする遺伝子が明らかにされた (特許文献 1参照)。該 36kDaタ ンパク質は、ムギネ酸合成に関与する酵素群の遺伝子としての機能を持つことが明ら かにされている。
また、イネにデォキシムギネ酸カもムギネ酸に生合成する酵素の遺伝子 IDS3を導 入して、ムギネ酸分泌を可能にしたり（非特許文献 1参照）、同じくムギネ酸生合成経 路中の酵素である-コチアナミン'アミノ基転移酵素 (NAAT)をコードする遺伝子を 導入して、鉄欠乏耐性が改善されたイネを製造して！/、る (特許文献 2参照)。
また、土カもキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードするトウモロコシ のイェローストライプ 1遺伝子（ySl遺伝子）がクローン化され、イェローストライプ 1タ ンパク質 (YS1タンパク質)が単離された。さらに YS1タンパク質を発現する遺伝子で 形質転換された酵母や卵母細胞は、金属を非選択的に、すなわち鉄以外に重金属 を含む他の金属、例えば銅、亜鉛、鉛、コバルト又はニッケル等の取り込みも媒介で きることが明かにされた (特許文献 3、非特許文献 2参照)。また、 YS1タンパク質は、 植物細胞内の鉄輸送に関与している-コチアナミン鉄錯体を輸送することが報告さ れて 、る (非特許文献 3、 4参照)。
上記 YS1タンパク質をコードする遺伝子と約 70〜80%の高いホモロジ一を有する 遺伝子が、イネから 14個、シロイヌナズナから 8個見つかっている。このうち、イネの O sYSL2 (非特許文献 5参照）、シロイヌナズナの AtYSL2 (例えば特許文献 3、非特 許文献 6参照）は、ムギネ酸鉄錯体を輸送せず、ニコチアナミン鉄錯体のみを輸送し 、植物内部の鉄の輸送に関与していることが報告されている。しかし、ニコチアナミン 鉄錯体として鉄の吸収及び吸収後の茎葉部への鉄の移行は、ムギネ酸鉄錯体と比 ベて低 、ことが知られて 、る (特許文献 4参照)。
ムギネ酸鉄錯体は、固有のトランスポーターを介して植物体に取り込まれると考えら れている力 ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質やそれ をコードする遺伝子にっ 、ては未だ知られて 、な 、。
特許文献 1：特開 2001— 17181号公報
特許文献 2：特開 2001— 17012号公報
特許文献 3：特表 2005 - 501502公報
特許文献 4：特開 2001— 316192号公報
非特許文献 1 :コバヤシ 'ティー（Kobayashi, T. )他 5名、プランタ（Planta)、 2001年、 第 212卷、 p. 864-871
非特許文献 2 :キユリ一'シー（Curie, C)ら，ネイチヤー（Nature)、 2001年、第 49卷、 p. 346
非特許文献 3：シヤーフ ·ジ一'ジエイ（Schaaf GJ)ら，ジャーナル ·バイオロジカル ·ケ ミス卜リー（J. Biol. Chem)、 2004年、第 279卷、 p. 9091— 9096
非特許文献 4:ロバーツ'エル'エー（Roberts LA)ら，プラント'フィジオロジー（Plant
Physiolo.；)、 2004年、第 135卷、 p. 112—120
非特許文献 5 :コィケ 'エス（Koike S)ら，ザ'プラント 'ジャーナル（Plant J. ) , 2004 年、第 39卷、 p. 415-424
非特許文献 6：ディ 'ドナト'アール ·ジエイ ·ジエイ (DiDonato R-J-J)ら，ザ ·プラント · ジャーナル（Plant J. )、 2004年、第 39卷、 p. 403—414
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、好ましくは鉄欠乏ォォムギ（Hordeum vulgare L. )の根からムギネ 酸鉄錯体を選択的に土壌から植物体内に取り込み、輸送する遺伝子をクローン化し 、ムギネ酸存在下該遺伝子を導入した鉄欠乏状態 (アルカリ土壌)で栽培が可能なト ランスジヱニック植物を創製することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] イネ科植物に見られる鉄獲得機構は、植物体内でムギネ酸類を合成し、これを土 壌中に放出して生成するムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むことによる。イネ科植 物の中でも、特にォォムギはムギネ酸の分泌量が最も多ぐアルカリ耐性がそれに対 応して最も強いと考えられる。故に、ォォムギ以外の植物に、土壌力もムギネ酸鉄錯 体を植物体内に取り込むトランスポーター遺伝子を導入すれば、ォォムギと同様に、 アルカリ土壌でも旺盛に生育するォォムギ以外の植物が開発できる。
本発明者らは、鉄欠乏状態で育てたォォムギ (Hordeum vulgare L. )の根から RNAを抽出して (Invitrogen社製）、トランスポーター遺伝子の単離を試みた。ォォ ムギのデータベース（DDBJ)でトウモロコシイェロー 1 (ZmYSl)遺伝子との相同性 を検索することによって行い、 60%以上相同性がある数種の ESTを見いだし、これら ESTの配列を利用してプライマーを作製し、前記ォォムギカゝら抽出した RNAと共に 5'—、 3'— RACE (System of rapid Amplification of cDNA Ends) (Invi trogen、 Roche社製）を行い、全長 2430bpのォォムギのトランスポーター遺伝子を 単離した。本発明者らはさらに研究を進め、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、
[1] ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードする D NAを含む遺伝子、
[2] 以下の（a)〜（d)の 、ずれかであることを特徴とする上記 [1]に記載の遺伝子；
(a)配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 なるトランスポータータンパク質 をコードする DNAを含む遺伝子；
(b)前記 (a)のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有 するトランスポータータンパク質をコードする DNAを含む遺伝子；
(c)前記 (a)のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパ ク質をコードする DNAを含む遺伝子；
(d)前記（a)の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつムギネ酸鉄 錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードする DNA を含む遺伝子、
[3] 上記 [1]又は [2]に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター、
[4] 上記 [3]に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞、
[5] 上記 [1]又は [2]に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジ エニック植物、
[6] 上記 [3]に記載のベクターが導入されて 、ることを特徴とするトランスジエニック 植物
[7] 上記 [2]に記載の遺伝子が発現される条件下で、上記 [4]に記載の宿主細胞 を培養することを特徴とする、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトラ ンスポータータンパク質を製造する方法、
[8] 上記 [7]に記載の方法によって製造されるムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む 活性を有するトランスポータータンパク質、
[9] ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する、以下の（a)〜（c)のいずれ かであるタンパク質； (a)配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)前記 (a)のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有 するタンパク質；
(c)前記 (a)のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質、
[10] 上記 [1]に記載の DNAの RNA転写物、
[11] 植物が、イネ科植物、クヮ科植物、マメ科植物、バラ科植物、ツバキ科植物、 ァカネ科植物、ブナ科植物、ミカン科植物及びナス科植物カゝらなる群カゝら選択される いずれかの科に属するものであることを特徴とする上記 [6]に記載のトランスジェ-ッ ク植物、及び
[12] 上記 [1]又は [2]の遺伝子を植物体内で発現させることを特徴とする、植物体 にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を付与する方法、
に関する。
発明の効果
本発明はイネ科植物の中でも、好ましくは最も鉄欠乏耐性に強い、つまりアルカリ 土壌下でも 3価の鉄イオンを体内に摂取できるォォムギカゝら同定したムギネ酸鉄錯体 を選択的に取り込むトランスポーター遺伝子 HvYSl (Hordeum Vulgare Yellow
Stripel)とそのトランスポータータンパク質を提供するものである。このトランスポー ター遺伝子とムギネ酸鉄錯体摂取メカニズムを利用することにより、従来生育不能で あったアルカリ土壌でも生育できるトランスジエニック植物（例えば、穀物等）が開発で きる。係るトランスジエニック植物は、 2価鉄不含の例えば 3価鉄を含むアルカリ土壌 において生育できるので、従来農地として不適切であった不良土壌、特にアルカリ土 壌であっても農地として利用可能となる。このことは、穀物等の食糧野菜の作付け面 積を拡大できることになり、人口増加による食糧不足を補足し得る。
また、発明の遺伝子を牧草等に導入することにより、牧草地を拡大することができ、 酪農における放牧地拡大に利用できる。
また、本発明のトランスジヱニック植物は、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む機能 を有するため、非選択的に金属を植物体内に取り込むトランスポーター遺伝子が導 入された植物のように、鉄以外の金属、例えば人体等に有害な重金属等を取り込む 危険性が少なぐ食糧として安全な作物を生産できる。
さらに、本発明のトランスジエニック植物は、アルカリ土壌中で栽培しても光合成に 必要な鉄が吸収されるため、生長が速いという特徴を持つ。このため、本発明のトラ ンスポーター遺伝子をォォムギ以外の植物に導入することにより植物の生産能を高 めることが可能となる。
本発明のトランスポーター遺伝子を導入し、形質転換した細菌、酵母、動物細胞又 は植物細胞等は、トランスポーター機構を解明するための細胞として利用できる。さら に本発明のトランスポーター遺伝子又はその部分塩基配列は、他のトランスポーター 遺伝子のプローブとして利用し得る。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、ォォムギの HvYS 1の cDNAから決定されたアミノ酸配列を示す図であ る。ボックスは、トウモロコシの ZmYSlとの相同性を表し、ローマ数字は、 SOSUIプ ログラム力も推定される ZmYSlの膜貫通領域（12個）を示す。
[図 2]図 2は、ォォムギの糸且織における HvYSlの発現を示す図である。
[図 3]図 3は、実施例 3の結果を示す図である。 HvYSlは、 HvYSl発現 DDY4株を 、 ZmYSlは、 ZmYSl発現 DDY4株を、 VECは、ベクターのみ導入した DDY4株 を示す。 Fe(ni)— citrateは、クェン酸鉄（ΠΙ)錯体を、 Fe (III)— MAは、ムギネ酸 鉄 (III)錯体を、 Fe (ll)—NAは、ニコチアナミン鉄 (II)錯体を示す。
[図 4]図 4は、アフリカッメガエルの HvYSl発現卵母細胞における、種々のムギネ酸 金属錯体、及び-コチアナミン鉄 (II)錯体に対する電気生理反応性を示す図である 。縦軸はムギネ酸鉄錯体の電位変化を 100%としたときの、他の金属錯体の電位変 化の％を示す。
[図 5]図 5は、鉄欠乏ォォムギの根における HvYSlの局在を示す図である。図中 a及 び bは、根の縦断面を、 c及び dは、根の横断面を示す。 a及び cはセンスプローブ（ネ ガティブコントロール）を、 b及び dは、アンチセンスプローブを各々ハイブリダィゼーシ ヨンした結果を示す。スケール； 100 μ m。 [図 6]図 6は、プラスミド Mac— HvYSl—mas—pBinPlusの模式図を示す。
[図 7]図 7は、トランスジエニック植物における RT—PCRでの HvYSlの発現を示す 図である。図中 1、 2、 3は、 HvYSl発現トランスジエニック植物を示し、 4及び 5は、 H vYSlを導入していない通常の植物（ネガティブコントロール）を示し、 Mは分子量マ 一力一を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 「ムギネ酸鉄錯体」とは、ムギネ酸類が鉄イオン、とりわけ 3価の鉄イオンと配位結合 して形成するキレートイ匕合物をいう。ムギネ酸類としては、例えばムギネ酸、 2'—デォ キシムギネ酸、 3—ヒドロキシムギネ酸、 3—ェピヒドロキシムギネ酸、アベニン酸、ディ ステイコン酸，ェピヒドロキシデォキシムギネ酸又はアベニン酸等が挙げられる。 「ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む」とは、ムギネ酸鉄錯体のみを細胞外力ゝら細胞 内に移送、輸送することをいい、ムギネ酸類と鉄以外の金属から形成される錯体化合 物や、ムギネ酸アナログの例えばニコチアナミンが鉄イオンと配位して形成するキレ 一ト錯体化合物等を移送、輸送しないことをいう。
[0009] 「トランスポータータンパク質」とは、物質の細胞膜を介した輸送を担う細胞膜上に 存在するタンパク質をいうが、本明細書においては、ムギネ酸鉄錯体の細胞膜輸送 を担うタンパク質を意味する。特にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する タンパク質が好ましい。
ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質としては、例えば配列 番号 2で示されるアミノ酸配列力 なるタンパク質等が挙げられる。配列番号 2で示さ れるアミノ酸配列からなるタンパク質にお 、て 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなるタンパク質であっても、該タンパク質がム ギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有する限り、本発明に係るタ ンパク質に含まれる。なお、前記数個とは好ましくは 20個以下、さらに好ましくは 10 個以下、より好ましくは 5個以下を意味する。ここで、アミノ酸配列について、「1若しく は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異 的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により生じうる、又は天然に生じうる程度 の数が、欠失、置換若しくは付加」等されていることを意味する。 [0010] さらに、上記アミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するタンパク質、好ま しくは 70%以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは 80%以上の相同性を有 するタンパク質、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有するタンパク質、特に好まし くは 95%以上の相同性を有するタンパク質であって、かつムギネ酸鉄錯体を選択的 に取り込む活性を有する機能を有する限り、本発明に係るタンパク質に含まれる。上 記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において 各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
[0011] 「遺伝子」とは、 DNAの機能単位を意味し、タンパク質の特定の情報を有する。本 明細書におけるトランスポータータンパク質をコードする DNAを含む遺伝子 (本明細 書において、トランスポーター遺伝子と略記することもある。）は、ムギネ酸鉄錯体を選 択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質の情報を有する。したがつ てトランスポーター遺伝子は、該トランスポータータンパク質をコードする DNA配列 及び Z又はそれらの発現に必要な調節配列を含むが、これらに限定されない。トラン スポーター遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列等を形成する非発現
DNAセグメントを含むこともできる。
[0012] RNA転写物としては、トランスポータータンパク質をコードする DNAの一次転写物 、並びに転写後プロセシングにより前駆体 RNA鎖切断、 3'末端形成、 RNAスプライ シング又は RNAエディティングなどの過程をへて機能を持つ成熟した mRNA、 tRN A及び rRNAが挙げられる。
[0013] 本発明のトランスポーター遺伝子は、例えば、まずトランスポータータンパク質をコ ードする mRNAの供給源カゝら mRNAを抽出し、逆転写酵素を用いて cDNAを調製 する。次いで、例えば 3，—RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)、5 ，—RACE及び Z又は 5 ' Z3'—RACEを行ない、 目的のトランスポーター遺伝子を 得る。 3， -RACE, 5，一 RACE又は 5' /3'—RACEで用いるプライマーは、公知 のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする遺伝子を基にォォムギ のデータベースのホモロジ一検索を行い、公知の前記遺伝子と約 60%以上の相同 性を示す ESTをォォムギの遺伝子配列から選択し、次いで、得られた ESTを基に設 計するのが好ましい。 [0014] トランスポータータンパク質をコードする mRNAの供給源としては、例えば水耕栽 培したイネ科の植物、例えばォォムギ、コムギ、ライムギ、ェンバタ、トウモロコシ、ソル ガム又はイネ、好ましくはォォムギの根を用いることができる。さらに、本発明のトラン スポーター遺伝子は鉄欠乏環境下に発現する遺伝子であるため、鉄イオンフリーあ るいはアルカリ性条件下で鉄イオンを 3価の水不溶性とした環境下に曝露させたイネ 科 (好ましくはォォムギ）の根を好適に用いることができる。また、イネ科 (好ましくはォ ォムギ）の種子を GM培地又はムラシゲ 'スターグ培地（以下、 MS培地という。）等の 固体培地に播種し、無菌条件下で生育させたイネ科 (好ましくはォォムギ)の根を用 V、てもよ 、。またカルスや無菌条件下で育てたイネ科 (好ましくはォォムギ）の培養細 胞等でもよぐ目的とする遺伝子の mRNAを含んでいる細胞であればその種類は問 わない。
[0015] mRNAの供給源から mRNAの抽出は、公知の方法で行なうことができる。例えば 水耕栽培で生育させたォォムギの植物体を鉄欠乏条件下に曝露後、根を採取する 。採取した根を液体窒素で凍結する。凍結した根を乳鉢等で摩砕後、得られた摩砕 物から、ダリオキサール法、グァニジンチオシァネート一塩化セシウム法、塩化リチウ ム—尿素法、プロティナーゼ Kーデォキシリボヌクレアーゼ法、 AGPC法 (Acid gua nidinium— Phenol— Chloroform法）等を用いて mRNAを抽出することができるが 、市販の RNA抽出キットを用いて抽出することもできる。該市販の RNA抽出キットと しては、 RNA isolation Kit (Stratagene社製）、アイソジェン（株式会社-ツボン ジーン製）、トライゾール（Invitrogen社製）、コンサート植物用 RNA抽出試薬（Invit rogen社製)等が挙げられる。抽出方法はキットのマニュアルに準じて行うのがよい。 mRNA抽出後にカラム [例えば RNeasy (QIAGEN社製）等）などにより mRNAの精 製を行ってもよい。
[0016] 上記 3，—RACEは、市販のキット、例えば 3，—RACE (System of Rapid Am plification of cDNA Ends ; Invitrogen社製)、 3 ' RACE System for Rapi d Amplification of cDNA Ends (Life Technologies社製）又は 3，—full R ACE core set (タカラバイオ株式会社製)等を用いることにより行なうことができる。 上記 5，—RACEは、市販のキット、例えば 5，— RACE (Invitrogen社製）、 CapFi shing Full -Length cDNA Premix Kit (フナコシ株式会社製）又は 5，—full RACE core set (タカラバイオ株式会社製)等を用いることにより行なうことができ る。 5，/3，一 RACEとしては、 5，/3，Race kit, 2nd generation (Roche社製）等 を用いることにより行なうことができる。
[0017] 上記 3' -RACE, 5，一RACE又は 5' Z3'—RACEで用いるプライマーとしては、 公知のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする遺伝子が有する部 分塩基配列と相同性が約 90%以上、好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98%以 上である約 15〜25bp程度の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。 3' - RACEのプライマーとしては、例えば配列番号 4、 5、 6又は 7で示される塩基配列か らなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。 5'— RACEのプライマーとしては、例えば 配列番号 8、 9、 10、 11又は 12で示される塩基配列力もなるオリゴヌクレオチド等が 挙げられる。 5 ' Z3'— RACEのプライマーとしては、例えば配列番号 14又は 15で 示される塩基配列力 なるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
[0018] 上記公知のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする公知の遺伝 子は、例えばジーンバンクに登録ナンバー（Accession Number) AF186234とし て登録されているトウモロコシのイェローストライプ 1遺伝子 (配列表の配列番号 3)等 を好ましく用いることができる。
[0019] 上記 ESTとしては、ォォムギについての DDBJに Accession No. AF472629, BJ470821, BJ448359又は BQ765689として登録されて!ヽる酉己歹 IJ等力挙げ、られる 。なお、 ESTは、相補 DNA (cDNA)クローンの 3'末端又は 5'末端力も配列決定さ れた、通例 300〜400ヌクレオチド長の遺伝子断片である。
[0020] 上記ホモロジ一検索は、例えば BLASTや FASTA等の解析ソフトを用いて、 Gen Bankや DDBJのデータベースに対して行うことができる。検出対象である ESTは保 存性の高 、領域や機能を有して 、ると予想されて 、る領域のアミノ酸配列にぉ 、て、 特に高 、相同性を有して 、る遺伝子であり、タンパク質の機能に必須とされて 、るァ ミノ酸を保存して 、る配列であることが好ま 、。
[0021] PCRは、公知の方法により行なうことができる。 PCR産物は、ベクターに挿入し、宿 主に導入して増幅することができる。 [0022] 得られる遺伝子は、公知の方法により全塩基配列の決定を行うことができる。塩基 配列の決定法としては、マキサム ギルバートの化学修飾法又は M13ファージを用
V、るジデォキシヌクレオチド鎖終結法等を挙げることができる力 通常は自動塩基配 列決定機（例えばパーキンエルマ一ジャパン社製自動 DNAシーケンサ ABI PRIS MTM 310 geneticAnalyzer等）を用いて行われ得る。
[0023] こうして、トランスポータータンパク質をコードする DNA (配列表の配列番号 1の第 1 69〜2202番目の塩基配列）を含む遺伝子として、例えば配列表の配列番号 1で示 される塩基配列力 なる遺伝子を単離できる。
また、前記 DNAには、前記トランスポータータンパク質をコードする DNAと相補的 な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつムギネ 酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードする DNAも包含される。「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」とは、例え ば、配列番号 1に示されるアミノ酸配列力もなるトランスポータータンパク質をコードす る DNAの部分配列をプローブとして、コロニ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク' ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用い ることにより得られる DNAを意味する。なお、ここでいう「ストリンジヱントな条件」とは、 例えば、少なくとも配列番号 1で示される塩基配列と約 50%以上、好ましくは約 60% 以上、より好ましくは約 80%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、そ れより相同性が低い DNA同士がハイブリダィズしない条件、あるいは、約 0. 1〜2倍 程度の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 1 5mMクェン酸ナトリウムよりなる。 )、温度約 65°C程度でのハイブリダィズする条件を いう。
なお、「DNA」とは、デォキシリボ核酸のことをいう。 DNAの単位はヌクレオチドと呼 ばれ、塩基、糖 (D デォキシリボース）、リン酸でできている。塩基には、アデニン (A )、グァニン (G)、シトシン (C)、チミン (T)の 4種類があり、この 4種類の並び方で、遺 伝情報が規定されている。
[0024] 塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子の cDNAな
V、しゲノム DNAを铸型とした PCRによって、ある 、は該塩基配列を有する DNA断片 をプローブとしてハイブリダィズさせることにより、本発明のトランスポーター遺伝子を 得ることができる。
[0025] また、本発明のトランスポーター遺伝子は配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 な るタンパク質をコードする DNAを含む遺伝子である。ただし、配列番号 2で示される アミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列力もなるタンパク質であっても、該タンパク質がムギネ酸鉄錯体を選択的に 取り込む活性を有する機能を有する限り、これをコードする遺伝子も本発明のトランス ポーター遺伝子に含まれる。なお、前記「数個」及び「1若しくは複数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加」とは、上記タンパク質において記載した意味と同様である。 なお、本発明のトランスポーター遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gappe d duplex法等の公知の方法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然 変異誘発法を利用した変異導入用キット [例えば Mutant— K (タカラバイオ株式会 社製)や Mutant— G (タカラバイオ株式会社製)等]を用いて、あるいは、タカラバィ ォ株式会社の LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット等を用いて行うこと ができる。
[0026] さらに、上記アミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するタンパク質、好ま しくは 70%以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは 80%以上の相同性を有 するタンパク質、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有するタンパク質、特に好まし くは 95%以上の相同性を有するタンパク質であって、かつムギネ酸鉄錯体を選択的 に取り込む活性を有する機能を有する限り、これをコードする遺伝子も本発明のトラ ンスポーター遺伝子に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、上記タンパ ク質において記載した意味と同様である。
[0027] 本発明に係るトランスポータータンパク質のムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活 性能は、例えば発芽酵母サッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) 二重変異体 fet3fet4 (DDY4株）に、本発明のトランスポーター遺伝子を導入して形 質転換し、形質転換された酵母を、ムギネ酸鉄 (III)錯体を添加した培地で培養する ことにより確かめることができる。 DDY4株は、 2価鉄の取込み系に欠損を持ち、鉄制 限培地では生育することができず（Eide, Dら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19 96年，第 93卷， p. 5624— 5628)、かつ、ムギネ酸 (III)鉄錯体を利用して生育する こと力 Sできな ヽ（Loulergue, C. Gene, 1998年，第 225卷， p. 47— 57)酵母であ るので、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能を有する酵母はムギネ酸鉄 [III] 錯体を添加した培地で生育し、該活性能を有さな 、酵母は生育できな ヽ。
[0028] また、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能は、アフリカッメガエル卵母細胞 等で細胞膜電位変化等の観察を行うことにより、確かめることができる。細胞膜電位 変化の測定は、ムギネ酸鉄錯体を含有する溶液を本発明のトランスポーター遺伝子 を導入した卵母細胞に添加し、該卵母細胞膜に発現したトランスポータータンパク質 を介して取り込まれるムギネ酸鉄錯体に伴っておこる卵母細胞の細胞膜電位変化を 膜電位固定法等により、細胞膜内外の電位を電極で直接測定等することにより行うこ とが可能である。
[0029] 本発明に係るトランスポータータンパク質は、本発明のトランスポーター遺伝子をべ クタ一に導入し、該ベクターにより形質転換した宿主を誘導条件下で培養し、この宿 主力 精製して得ることができる。
[0030] 「ベクター」とは、遺伝子を細胞内へ導入する働きを持つ物質を指し、プラスミド、ゥ ィルスベクターや、人工的な非ウィルスベクター等が含まれる。非ウィルスベクターと しては、例えばリボソーム、ポリリジンィ匕合物等が挙げられる力 これらに限定されな い。
[0031] 本発明に係るベクターは、基礎となるベクター（以下の説明では、便宜上、基礎べク ターと称する）のマルチクローユングサイトに、本発明のトランスポーター遺伝子、プロ モーター及びターミネータ一等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記基礎べク ターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド DNAとしては、例えば pBR322、 p BR325、 pUC118又は pUC119等の大腸菌宿主用プラスミド、例えば pUBl lO又 は pTP5等の枯草菌宿主用プラスミド、例えば pFL61 (ATCC社製）、 ΥΕρ13、 ΥΕρ 24又は YCp50等の酵母宿主用プラスミド、例えば pUC系 [pUC18、 pUC19、 PSR -01, PSA— 01、 PSR— 02, PSR— 03 (クミアイ化学工業株式会社製)等]プラス ミド又は PBI221等の植物細胞宿主用プラスミド、或いは例えば pWTT23132 (DN AP社製)等のバイナリーベクター等が挙げられ、ファージ DNAとしては λファージ等 が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウィルス等の動物ウィルス、バキ ュロウィルス等の昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。
特に、本発明のトランスポーター遺伝子を導入したトランスジエニック植物を作製す る場合には、植物に形質転換することが可能な植物細胞宿主用ベクターであれば特 に限定されない。
[0032] プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例 えば宿主が大腸菌である場合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 Pプロモータ
L
一、 Pプロモーター等の大腸菌由来のプロモーター、宿主が枯草菌である場合は、
R
SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等、宿主が酵母であ る場合は、 pFL61 (ATCC社製）、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーター等が好ましい。また、宿主が植物である場合は、力 リフラワーモザイクウィルスの 35S RNAプロモーター、 rd29A遺伝子プロモーター 又は rbcSプロモーター等の植物由来のプロモーター、或いはカリフラワーモザイクゥ ィルスの 35Sプロモーターのェンハンサー配列をァグロバタテリゥム由来のマンノピン 合成酵素プロモーター配列の 5'側に付加した mac— 1プロモーター等のような構成 的プロモーター等が好ましい。さらに、 tacプロモーター等のように、人為的に設計改 変されたプロモーターを用いてもよい。なかでも mac— 1プロモーターが好ましい。前 記 mac— 1プロモーターを用い構築されたベクターが植物ゲノム中に挿入された場 合、該プロモーターの下流に連結された遺伝子 (HvYSl)が植物体のほとんど全て の器官で、 V、ずれの成長段階にぉ 、ても高レベルで発現し得る。
[0033] ターミネータ一としては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
特に、宿主が植物である場合は、例えば rrnプロモーター、 psbAターミネータ一、 35 Sターミネータ一、 rpsl6ターミネータ一、 CaMV35Sターミネータ一、 ORF25polyA 転写ターミネータ一、 PsbAターミネータ一等が挙げられる。
[0034] また、本発明に係るベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有 することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定さ れず、自体公知のものを用いてよい。該遺伝子としては、例えば、各種の薬剤耐性遺 伝子又は宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例 えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子 (G418耐性）、クロラムフエ 二コール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、 U
RA3遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子又は除草剤クロルスルフロン耐性遺伝子等 が挙げられる。また、該遺伝子の上流及び下流には、該遺伝子を認識するためのプ 口モーター及びターミネータ一を有することが好まし 、。
[0035] 本発明に係るベクターには、さらに他の遺伝子、例えばムギネ酸類の生合成酵素 をコードする遺伝子等を導入し得る。本発明のトランスポーター遺伝子に加えムギネ 酸類の生合成酵素をコードする遺伝子がベクターに導入され、該ベクターで形質転 換される植物は、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む機能に加え、ムギネ酸類を植 物体自身で生合成し土壌に分泌し得るので、ムギネ酸類を含まな ヽアルカリ土壌に お!ヽてもムギネ酸鉄錯体を取り込むことができ得る。ムギネ酸類の生合成酵素をコー ドする遺伝子としては、例えば特開 2001— 17181号公報に記載の 36kDaタンパク 質をコードする遺伝子や、特開 2001— 17012号公報に記載の-コチアナミン'アミ ノ基転移酵素をコードする遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、 前記他の遺伝子には、前記他の遺伝子とストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし 、かつムギネ酸類を生合成するタンパク質をコードする DNAを含む遺伝子も包含さ れる。ストリンジェントな条件は上記と同様である。
[0036] 本発明に係るベクターの作製方法については、特に限定されるものではなぐ上記 基礎ベクターに、上述した各 DNAセグメント（プロモーター、ターミネータ一、本発明 のトランスポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等)を所定の順序となるように導入すれ ばよい。
[0037] 宿主へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用い る方法 [Cohen, S.N. et al. ： Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,第 69卷、 p. 2110— 21 14 (1972年）]、エレクト口ポレーシヨン法 [Becker, D.M. et al. , Methods. Enzymol . ,第 194卷、 p. 182— 187 (1990年）]、スフエロプラスト法 [Hinnen, A. et al. ： Pr oc. Natl. Acad. Sci. , USA,第 75卷、 p. 1929— 1933 (1978年）]、酢酸ジチウム法 [Itoh, H. , J. Bacteriol. ,第 153卷、 p. 163— 168 (1983年）]等が挙げられる。こ れらの他にもマイクロインジェクション、マイクロプロジェクタィル 'ボンバードメント（粒 子加速法又はバイオリスティック 'ボンバードメントとも呼ばれる）、ウィルスによる形質 転換、及びァグロバタテリゥムによる形質転換、パーティクルガン法 (Svab, Z. , Hajdu kiewicz, P. , and Maliga, P. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990年，第 87卷， p. 8 526— 8530)や PEG法（Golds, T. , Maliga, P. , and Koop, H.-U. , Bio/Technol . , 1993年,第 11卷， p. 95— 97)等、様々な方法が挙げられるが、これらに限定さ れない。
[0038] 本発明に係るベクターが導入された宿主を増殖させる方法についても特に限定さ れるものではなく、宿主に応じた公知の方法を用いることが好ま 、。
[0039] 宿主細胞力も本発明に係るトランスポータータンパク質の分離、精製は、自体公知 の分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精 製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法 、ゲル濾過法、及び SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の 差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、ァ フィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク 口マトグラフィ一等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の 差を利用する方法等が挙げられる。
[0040] なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例え ば、 1982年発行のモレキュラ^ ~ ·クロー-ング（Molecular Cloning)コールド'スプリ ング.ハーバ^ ~ ·ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory)、 1989年発行のモ レキユラ^ ~ ·クロー-ング第 2版（Molecular Cloning, 2nd ed. )コールド 'スプリング 'ハーバ■ _ ·ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory)等に記載された方法に 従って容易に行うことができる。
[0041] 本発明のトランスポーター遺伝子を発現又は過剰発現させるトランスジエニック植物 は、上記遺伝子操作法を使って作出することができる。本発明にかかるトランスジェ- ック植物は、本発明のトランスポーター遺伝子の発現によりトランスポータータンパク 質を生産するものであるが、このトランスポーター遺伝子は特に根の表皮細胞に発現 することが好ましい。根の表面に本発明のトランスポーター遺伝子が発現することによ り、土壌中のムギネ酸鉄錯体の取り込みが容易となる。トランスジエニック植物におけ る該遺伝子の発現は、組織学的染色により確認できる。組織学的染色は、公知の方 法により行なうことができる。
[0042] 本発明のトランスジエニック植物は、 2価鉄不含の例えばアルカリ土壌において 3価 鉄やムギネ酸鉄錯体を含有する土壌において栽培できる。また、本発明のトランスジ エニック植物は、光合成に必要な鉄が吸収されるため、生長が速いという特徴を持ち 、植物の生産性を向上できる。
[0043] 本発明のトランスポーター遺伝子を使って形質転換される好ましい植物としては、 単子葉植物又は双子葉植物が好ましい。より具体的には、例えばイネ科植物 (例え ば、コメ、ォォムギ、コムギ、ェンバタ、ライムギ、トウモロコシ、ァヮ、ヒェ、コゥリヤン、 牧草類）、クヮ科植物（例えば、クヮ、ホップ、コゥゾ、ゴムノキ、アサ等）、マメ科植物（ 例えば、ダイズ、ァズキ、ラッカセィ、インゲンマメ、ソラマメ等）、ノ ラ科植物（例えば、 イチゴ、ウメ、バラ等）、ツバキ科植物（例えば、チヤノキ等）、ァカネ科植物（例えば、 コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（例えば、ナラ、ブナ、カシヮ等）、ミカン科植 物（例えば、ダイダイ、ュズ、ゥンシユウミカン、サンショウ等)又はナス科植物（例えば 、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホォズキ、ペチュ 二了、カリブラコア、ユーレンベルギア等）などが挙げられる力 これらに限定されない
[0044] 以下に、実施例をあげ本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。なお、％は特に記載しない場合は容量％を示す。また、本明細書 において、略語は以下を示す。
a :アデニン
c :シトシン
g :グァニン
t :チアミン
PBS : Phosphate buffer saline (リン酸緩衝食塩水）
PCR: Polymerase Chain Reaction (ポリメラーゼ連鎖反応）
RACE : Rapid Amplification of cDNA Ends EST: Expressed Sequence Tag (発現配列タグ）
RT—PCR: reverse transcription— polymerase chain reaction
SOSUI :膜タンパク質の二次構造推定システム
Fe (III) ·クェン酸：クェン酸—鉄錯体（タエン酸鉄アンモ-ゥム錯体）
Fe (III) · MA：ムギネ酸鉄錯体 (ムギネ酸鉄 (III)錯体）
Fe (ll) ·ΝΑ:ニコチアナミン鉄錯体
Tris：トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン
EDTA:エチレンジァミン四酢酸
HEPES： 2 [4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル]エタンスルホン酸 MASコ ~~ト： Matsunami Adhesive Slideglass
DIG :ジゴキシゲニン
実施例 1
HvYSl cDNAのクローニング
(1) Total RNAの抽出
ォォムギ（品種 Morex)を播種後、 lZ5Hoagland培養液 (以下、栽培用培養液と いう。）にて培養した。 16日目の苗に鉄欠乏処理 (鉄イオンフリーの栽培用培養液で 栽培)を 4日間行った。その根を採取し、コンサート植物用 RNA抽出試薬 (Invitroge n社製）を用 、て Total RNAを抽出した。
(2) 3' -RACE
Total RNA 1 gを逆転写酵素で cDNAとした。次いで得られた cDNAを用い て 3'—RACE (System of Rapid Amplification of cDNA Ends ; Invitrog en社製）を行った。 3，一 RACEに用いたプライマーは、ォォムギのデータベース（D DBJ)で ZmYSlを検索配列として、 60%以上相同性力ある 4種類 (AF472629, BJ 470821, BJ448359, BQ765689)の ESTを検出し、このうち BJ470821の配列 内から表 1の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌクレオチドを使用した。
[表 1] プライマー 塩基配列 配列表
3 ' R ACE-G S P 5 ' -CATTGCCGGCCTTGTTGCTG 配列番号 4
3 ' R ACE-Ne s t G S P 5 ' -CGGCCTTGTTGCTGGCACC 配列番号 5
[0046] 3，一 RACEで得られた cDN Aを 1 % (w/v)ァガロースゲル電気泳動に力 4ナ、ゲル からの精製を、 Qiagen GIA quick gel Extraction kit (Qiagen社製）を用い て行った。精製された cDNAを TOPO TA cloning versionR (Invitrogen社製） の pCRII—TOPO vector (4. Okb)〖こ挿入し、大腸菌 TOP 10に形質転換した。 C olony PCRを行い、予想される長さの産物をパーキンエルマ一ジャパン社製自動 D NAシーケンサ ABI PRISMTM 310 genetic Analyzerで塩基配列を決定した 。シーケンサ用プライマーとしては、表 2のプライマーを使用した。
[表 2]
Figure imgf000020_0001
(3) 5' -RACE
また、 3'—RACEと同様に、 Total RNA 1 μ gを逆転写酵素で cDNAとした。次 いで得られた cDNAを用いて 5，—RACE (Invitrogen社製）を行った。 5， -RACE に用いたプライマーは、上記（2)で検出した ESTのうち、 AF472629の配列内力ら 表 3の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌクレオチドを使用した。
[表 3]
Figure imgf000020_0002
[0048] 5，ーRACEで得られたcDNAをl.2% (w/v)ァガロースゲル電気泳動に力 4ナ、 ゲルからの遺伝子の抽出、大腸菌への形質変換は上記（2)の 3'— RACEで得られ た cDNAと同様に行なった。シークェンスも同様に行 ヽ5 '側の配列を途中まで決定 した。 5'末端が高次構造をとつているために、さらに mRNAの逆転写酵素の温度が高い (55°C) , 5' /3'Race kit, 2nd generation (Roche社製）のキットを使って、 5，— RACEと同様に操作し、 5'末端までの配列を決定した。 5 ' Z3'— RACEに用いた プライマーは、 AF472629の配列内力ゝら表 4の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌ クレオチドを使用した。
[表 4]
Figure imgf000021_0001
[0049] (4)塩基配列の確定
5' /3' Raceで決定した配列の、 5， RACEで決定した塩基配列とのつなぎ目部分 を確定するため、上記（ 1)で得られた Total RNAから逆転写酵素で得た cDNAを 用いて PCRを行った。該 PCRには、 AF472629の配列内力 表 5の塩基配列を選 択し、合成したフォワードプライマー（配列表の配列番号 14)及び BJ470821の配列 内から表 5の塩基配列を選択し、合成したリバースプライマー (配列表の配列番号 15 )を用いた。
[表 5]
Figure imgf000021_0002
[0050] 得られた PCR産物の cDNAを上記（2)と同様に、ァガロースゲル電気泳動、ゲル からの遺伝子の抽出、大腸菌への形質変換を行ない、全塩基配列を決定した。 全塩基配列が決定したので、もう一度全長の塩基配列を、上記（1)で得たォォムギ の根の Total RNAから逆転写酵素で得た cDNAと表 6及び表 7のプライマーを用 いて PCRを行った。
[表 6] 1 s t P C R
Figure imgf000022_0001
[表 7]
2 n d P C R
Figure imgf000022_0002
[0051] PCRで得られた cDNAを 1. 2% (w/v)ァガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルから の抽出、大腸菌への形質変換は上記 (2)と同様に行なった。この形質変換した大腸 菌をアンピシリン 50 μ gZmLを添カ卩した LB (Luria— Bertani)培地で 37°Cの下、終 夜培養し、この培養液から VIOGENE社製の Mini— M plasmid DNA Extract ion systemで DNAを抽出した。この塩基配列を決定し、全配列を確定し (配列番 号 1)、 HvYSl (Hordeum Vulgare Yellow Stripel, DDBJ Accession No . AB214183)と命名した。
塩基配列決定のためのシーケンスプライマーとして、表 8のプライマーを用いた。
[表 8]
Figure imgf000022_0003
[0052] この cDNAの配列から、 HvYS 1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2)を決定した 。タンパク質は 678アミノ酸長で、トウモロコシの ZmYSlタンパク質と約 73%の相同 性があり、特に SOSUIプログラム力 予想される ZmYS 1の 12個の膜貫通領域では 高 、相同性を示して 、る (図 1参照)。
実施例 2
[0053] ォォムギ組織における遺伝子の発現量の比較 ォォムギ（Morex)を播種後、 1週間 20 Mムギネ酸鉄錯体を添カ卩した栽培用培 養液にて前培養した。その後、鉄フリー栽培用培養液又は 20 Mムギネ酸鉄錯体 添加栽培用培養液にて 6日間培養したォォムギの根カゝら RNAをそれぞれ抽出した。 そこから表 9のプライマーを用いて、 real time !^丁ー？0^ (26サィクル）（八81 pri sm 7000 sequence detection system； Applied Bio systems)を行つた。
[表 9]
Figure imgf000023_0001
コントローノレとして GAPDH、glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase )遺伝子を用いた。 HvYS lはムギネ酸鉄錯体が豊富にあるときにはほとんど発現し ていないが、鉄欠乏状態では、根に選択的に発現量が増えることがわ力つた（図 2参 照)。
実施例 3
[0054] 形質転換酵母における HvYSlの機能
発芽酵母サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)二重変異体 f e t3fet4 (DDY4株）は、 2価鉄の取り込みを担う 2種類の遺伝子 [fet3 (3価鉄を 2価 鉄に転換して取り込む遺伝子)及び fet4 (2価鉄をそのまま取り込む遺伝子） ]を欠損 するので、鉄制限培地では生育することができず（Eide, Dら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996年，第 93卷， p. 5624— 5628)、ムギネ酸と錯ィ匕した鉄（Fe (III) · ΜΑ) を利用して生育することができない（Loulergue, C. Gene, 1998年，第 225卷， p. 47 — 57)。鉄輸送における HvYSlの機能を調べるために、本発明者らは、 HvYS l c DNAを導入した DDY4株を用いて該遺伝子の発現した DDY4株力 唯一の鉄源と して Fe (III) · MAを含む培地で生育できるかどうかを調べた。
[0055] DDY4株と DY1457 (野生型）株に 3つのプラスミド、すなわち（1)発現ベクター pF L61 (ATCC社製）の Notlサイトにクローユングした HvYSl cDNAを挿入したプラ スミド、（2)同じく pFL61ベクターにクローユングした ZmYSl cDNA (Curie, Cら， N ature, 2001年，第 49卷， p. 346— 349)を挿入したプラスミ、及び対照として（3)前 記!、ずれの遺伝子をも挿入して 、な 、pFL61ベクターを個別に導入した。
次に、本発明者らは、 HvYSlに基質選択性があるとすれば、その基質選択性を決 定するために、 3つの異なる鉄源、すなわち Fe (III) 'タエン酸又は Fe (III) ·ΜΑ、 Fe ( II) ·ΝΑを培地中に混入して、培養試験を行なった。酵母は、 50 M Fe (lll) 'タエ ン酸、 Fe (III) ·ΜΑ、又は ΙΟ Μ Fe (II) ·ΝΑ及びブランクとして 10 Μ FeCl , FeClを添カ卩した最少培地一 Uraで培養した。また 10 M Fe (lll) ·ΜΑ添
2 3
加培地に 2価鉄の強力なキレート剤である BPDSも 10 Μ添カ卩して、酵母の生育を 阻害する力も調べた。 Fe (m) ·ΜΑは von Wiren, Nら， Biochem. Biophys. Acta, 19 98年，第 1371卷， p. 143— 155に従って調製した。ニコチアナミンは長谷川香料 社力も購入し、 Schaaf Gら、 J. Biol. Chem. , 2004年，第 279卷， p. 9091— 9096 に従って Fe (II) 'ニコチアナミンを調製した。培養は 30°Cで 4日間行なった。 3つの酵 母培養物希釈液（波長 600nmでの光学密度（OD)が 0. 2、 0. 02及び 0. 002であ るもの）をプレート上にスポットした。
FeCl , FeCl、 Fe (III) 'タエン酸を唯一の鉄源として供給した場合、 HvYSl発現
2 3
DDY4株は、生育しなかった。 10 M Fe (III) · MAが存在する場合、 HvYSl発現 DDY4株は ZmYSl発現 DDY4株と同様に生育した。鉄を Fe (III) · MAキレートとし て供給した場合、 HvYSl発現 DDY4株は生育できる力 鉄を Fe (m) 'クェン酸とし て供給した場合は、該遺伝子発現 DDY4株は生育できないか、生育が強く抑制され ること力ら、 HvYSlタンパク質は Fe (III) · MAに選択的な鉄トランスポーターをコード することが示唆された。この点を明らかにするために、 Fe (lll) ·ΜΑ添加培地力 残 留 Fe (II)が全て除去されるように、強力な Fe (II)キレート剤である BPDSを、 Fe (lll) •MA添カ卩培地に添カ卩した。 BPDSの存在下に Fe (m) · MA添カ卩培地においても Hv YS1発現 DDY4株は生育した。このことは、 HvYSlタンパク質がファイトシデロフォ ァ結合型 Fe (III)のトランスポータータンパク質であることを強く示唆している。また、ト ゥモロコシのトランスポーターである ZmYSlが Fe (III) ·ΜΑの他に、植物全部に存 在する Fe (II) ·ΝΑを輸送するのに対し、 HvYSl発現 DDY4株では Fe (II) ·ΝΑの 取り込みが認められないか、生育が強く抑制された。このことは、 HvYSlタンパク質 が根に存在し、土壌力も Fe (III) ·ΜΑを取り込むことに選択的に働いていることを示 すものである（図 3参照)。
実施例 4
[0057] アフリカッメガエルの形質転換卵母細胞における電気生理活性における HvYSlの 作用
pSP64Poly (A)ベクター（Promega社製）の Xbalと BamHIのサイトに HvYS 1 c DNAを挿入し、これを用いて Ambion社の mMESSAGE mMACHINE Kitで c RNAを作製した。
アフリカッメガエル (浜松生物教材から購入)の腹部を切開し、卵母細胞 (Xenopus Oocytes)を摘出した。そして、 Collagenase typeIA(Sigma社製）を 2mg/mL とした OR— 2溶液（82. 5mM NaCl, 2mM KC1、 ImM MgCl、 5mM HEPE
2
S)が入った遠沈管に卵母細胞を移し、室温で約 2時間インキュベートした後、 OR— 2溶液で 3回、さらに ND— 96溶液（96mM NaCl, 2mM KC1、 ImM MgCl、 1
2
. 8mM CaCl , 5mM HEPES)で 3回洗浄した。 CRNA50 /Z g/mL, 50nLをデ
2
ジタル式マイクロディスペンサー（Drummond SCIENTIFIC)で、アフリカッメガエ ルの卵母細胞に注入した。卵母細胞は ND— 96溶液中、 17°Cで 48〜72時間培養 した。
[0058] 次に、本発明者らは、 HvYSlタンパク質に基質選択性があるとすれば、その基質 選択性を決定するために、 Fe (lll) · MA以外の基質として銅、亜鉛、ニッケル、マン ガン、コバルトのムギネ酸錯体も鉄同様に作製した。 HvYSlを発現させた卵母細胞 を ND— 96溶液で充たしたチャンバ一にセットし、各々基質 5mMを 10 μ L力けて（ 最終濃度 50 μ Μ)電気生理活性を測定した。卵母細胞に 2本の 3Μ KC1を充たし た微小電極（内部抵抗 0. 5— 2Μ Ω )を差し込み、実験槽の電位を OmVに固定した モードで、 Axoclamp - 2型二電極電位固定アンプ（ァクソン社製）を用いて電位固 定した。電流は 1kHzのローパスフィルター（— 3dB, 8ポールベッセル型フィルター /サイバー アンプ、ァクソン社製）を通し、デジデータ 1200型インターフェース（ァ クソン社製）を用いて 10kHzでサンプリングし、デジタル化して保存した。電位のプロ グラム、記録及び保存したデータの解析は、 ORIGIN 6. 1 software (Microcal Software)を用いた。固定電位 60mVで測定した。 Fe (lll) · MA以外の種々のムギネ酸金属錯体、及び-コチアナミン鉄 (II)錯体に 比べて、ムギネ酸鉄 (III)錯体は圧倒的に強い電位の変化が認められた。ニコチアナ ミン鉄 (II)錯体の反応は実施例 3の酵母の研究結果と一致した（図 4)。
実施例 5
[0059] ォォムギの根における HvYS 1の発現部位
操作はすべて RNase freeで行った。実施例 1で作製した鉄欠乏状態のォォムギ の根を 4%パラフオルムアルデヒド ZPBS中に入れ、根が沈むまで減圧、常圧を 15 分おきに繰り返し、 4°Cで 1昼夜インキュベートした。 PBSで 30分 2回洗浄後、 30%、 40%、 50%、 60%エタノール水溶液で、順次 30分 2回インキュベートし、 70%ェタノ ール水溶液にして、 4°Cで 1昼夜インキュベートした。翌日、 85%、 95%、エタノール 水溶液、 100%エタノールまで同様に脱水し、 25%、 50%、 75%キシレン Zェタノ ール溶液、 100%キシレンまで移して、 100%キシレンにパラフィンチップ（Paraplas t Plus, Tyco社製）を入れて、 42°Cで 1昼夜インキュベートした。その後、パラフィン を 1日 2回交換して、 3日間 60°Cでインキュベートし、組織をパラフィン中に包埋した。 回転式ミクロトーム (池本理ィ匕学工業社製)を用いて 5 μ mの連続切片を作製し、 MA Sコートのスライドグラス (マツナミ）に貼り付けて— 20°Cで保存した。
cRNAプローブは HvYS 1 cDNAをプラスミドベクター pBluescript KS ( + )の X bal、 Hindlllサイトに導入し、 Roche社製の DIG (ジゴキシゲニン） RNA Labeling kitで作成した。センスは Hindlll制限酵素でベクターを直線にして T7ポリメラーゼ で、アンチセンスのプローブは Xbal制限酵素でベクターを直線にして T3ポリメラーゼ で各々作成した。その後 150bpにアルカリ処理（42mM NaHCO , 63mM Na C
3 2
O溶液中 60°C 56分)で断片化して、エタノール沈殿後 DEPC処理水に溶解した。
3
[0060] in situハイブリダィゼーシヨン（hybridization)は Cindy Lincoln & David J ackson' s Protocolに基づいて行った。パラフィン切片を貼り付けたスライドを 10 分乾燥し、キシレン 10分 2回、 1000/0エタノーノレ、 90%, 80%, 70%、 500/0エタノー ル水溶液で 2分、 PBS5分 2回処理した。プロティナーゼ K処理（1 μ g/mL プロテ イナーゼ K (Sigma社製）、 lOOmM Tris— HCl (pH7. 4)、 50mM EDTA)を 37 。Cで 30分行い、 PBS2分洗浄後、 4%PFAZPBSで 20分固定し、 PBS2分 2回、 0. 2N HC1で 10分、 PBS2分 2回、グリシン 2mg/mL PBS溶液 15分 2回、 PBS3 分 2回、そしてァセチル化を行った。 2 X SSC (150mM NaCl、 15mMクェン酸ナト リウム、 pH7. 4)で 2分 2回洗浄後、再び上記と同様に脱水して、 100%エタノールま で脱水し、デシケーター内で 1時間乾燥した。その後プローブをカ卩えたノヽイブリダィ ゼーシヨン溶液 [50%脱イオンホルムアミド、 10mM Tris-HCl (pH7. 4)、 5mM EDTA, IX Denhat' s溶液、 10% (wZv)デキストラン硫酸、 20 /z gZmL 酵母 tRNA、0. 3M NaCl, 0. 3M DTT (ジチオスレィトール）]を切片にかけ、パラフィ ルムを力ぶせて、 50。C、 16時間インキュベートした。 0. 2 X SSC 55。Cで 60分 2回 洗浄し、 RNase処理（RNaseA 20 μ g/mL, 0. 5M NaCl, lOmM Tris— HC1 (pH7. 4)、 ImM EDTA)を 37。C、 30分行った。 0. 2 X SSC 55。Cで 30分 2回洗 浄後、 PBS室温 5分処理し、 DIGの発色を行った。緩衝液 1 [0. 15M NaCl, 100 mM Tris— HCl (pH7. 4) ] 10分 2回、緩衝液 2 [15% (wZv)ブロッキング試薬 (R oche社製） Z緩衝液 1]45分、緩衝液 1 5分処理後、 anti— DIG抗体 (Roche社製 ) 750倍希釈を室温で 1時間反応させた。緩衝液 1、 5分 2回、緩衝液 3 [0. 1M Na CI, lOOmM Tris— HCl (pH9. 5)、 50mM MgSO ] 10分後、ナカライのアル力
4
リフォスファターゼ用 NBTZBCIP溶液キットでー晚発色させた。緩衝液 4[10mM Tris— HCl (pH8. 0)、 ImM EDTA] 10分で発色を停止し、蒸留水で洗浄後、タリ スタルマウント（コスモバイオ）で封入後、光学顕微鏡（Eclipse E400,ニコン社製） で検鏡した。その結果を図 5に示したが、鉄欠乏アンチセンス HvYSl導入トランスジ エニックォォムギの根の表皮細胞部分に発色が認められ、 HvYS 1が強く発現して 、 ることが分力つた（図 5)。
実施例 6
[0061] HvYSlを導入したトランスジエニック植物の作成
本実施例において、分子生物学的手法は特に断らない限り、 WO96Z25500ある いは Molecular Cloning (Sambrook et al. , (1989) , Cold Spring Harbo ur Laboratory Press)に記載されている方法に従った。
[0062] (HvYSl発現ベクターの構築）
PCGP1394 (Tanaka et al. , 1995, Plant Cell Physiol, 36 : 1023— 1031 に記載）を Hindlllと SacIIで消化して得られる約 1. 3kbの DNA断片と、 pCGP139 4を Pstlで消化後ブランティングキット (TaKaRa社製)を用いて平滑末端ィ匕し、さらに SacIIで消化して得られる約 2kbの DNA断片と、 pBinPLUS (van Engelen et a 1. , 1995, Trangenic Research, 4, 288— 290)を Saclで消ィ匕後同様に平滑末 端化しさらに Hindlllで消化した約 12kbの DNA断片の 3種の DNA断片をライゲー シヨンして得られるプラスミドを PSPB185とした。
HvYSlは TOPO— TAクロー-ングキット（Invitrogen社製）を用い、 PERU -TO POのベクターに表 10のプライマーで増幅した PCR産物をサブクローユングした。
[表 10]
H V Y S 1 プライマー
Figure imgf000028_0001
表 10のフォワードプライマーは、 HvYSl翻訳領域 5'末端に制限酵素サイトとして Xbal配列（GCTCTAGA)を付カ卩したものであり、リバースプライマーは、 HvYSl翻 訳領域 3'末端に制限酵素サイトとして Hindlll配列（CCCAAGCTT)を付加したも のである。
[0064] この HvYSlを含有するプラスミド（サブクローユングされた PERII—TOPOベクタ 一）を、まず Hindlllで消化し、突出する末端をブランティングキット (TaKaRa社製） を用 、て平滑末端化し、さらに Xbalで消化して約 2kbの HvYS 1を含有する DNA断 片を取り出した。別途、増幅した PSPB185を Kpnlで消化し、末端を同様に平滑末 端化し、さらに Xbalで消化して約 14kbの DNA断片を得た。次いで、前記 HvYSlを 含有する DNA断片と約 14kbの DNA断片をライゲーシヨンして連結し、図 6に示す プラスミド Mac— HvYSl— mas— pBinPlusを作製した。このプラスミドは、植物にお いて、 HvYSlを Macプロモーター（Comai et al. , 1990, Plant Mol Biol, 15, 3 73 - 381)により構成的に発現させることを目的として!/、る。
[0065] (ペチュニアの形質転換）
引き続いて、公知の方法（Plant J., 5, 81, 1994)に基づいて、 Mac— HvYSl—m as— pBinPms 用 ヽて/'グロノヽクァリウム (AgroDacterium tumefaciens strain AglO)を形質転換した。次いで、該形質転換されたァグロパクテリゥムをペチュ- ァ（Petunia hybrida品種サフィ-ァパープルミニ（サントリーフラワーズ社製)）に感 染させ、 HvYS 1の翻訳領域遺伝子をペチュニアに導入した。
すべての植物を 16時間照射（60 E.冷白色蛍光灯）のもとで 23 ± 2°Cに保持し た。根が 2〜3cmの長さに達した時、トランスジエニックペチュニア植物を、 15cmの 培養ポット中のオートクレーブ殺菌された Debco 51410/2ポットミックスに移植し た。 4週間後、植物を同じポットミックスを用いる 15cmのポットに再移植し、そして 14 時間照射（300 μ Ε.ハロゲンィ匕水銀灯）のもとで 23°Cにて保持した。
[0066] (導入された HvYSlの RT— PCR法による検出）
得られたトランスジエニックペチュニアの葉を磨砕し、 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社製）により、 Total RNAを抽出した。抽出した RNA 1 gから Invitr ogen社の Superscript™ II RTの酵素を用いた First Strand cDNA Synth esis Kitにより cDN Aを作製した。 HvYS 1の有無を確認するため、トランスジェ-ッ クペチュニア力 抽出した Total RNA力 作成した cDNAを铸型として、表 11のフ ォワードプライマー（配列表の配列番号 26)及びリバースプライマー（配列表の配列 番号 27)を用いて PCRを行った。前記フォワードプライマーは HvYS 1の塩基配列（ 配列表の配列番号 1)力も第 889番目から第 910番目の内部配列を合成した。リバ一 スプライマーは、同塩基配列の第 1644番目力も第 1621番目の内部配列を合成し た。コントロール遺伝子として GAPDH (グリセロアルデハイド 3リン酸デヒドロゲナー ゼ）遺伝子を用 、た。 GAPDH遺伝子のプライマーは表 12のフォワードプライマーと リバースプライマーを使用した。
[0067] [表 11]
H Y S 1 のプライマ一
Figure imgf000029_0001
[0068] [表 12] コントロール G A P D Hのプライマ一
Figure imgf000030_0001
[0069] PCR産物を 1. 2 (w/v) %ァガロースゲル電気泳動で検出した。 （図 7)
HvYS 1を導入したトランスジエニック植物（図 7の 1〜 3)では PCR産物の量の違!ヽ はあるが、 HvYSl由来の PCR産物として予想される 755bpにバンドが検出され、 H vYSl遺伝子がペチュニアに導入されていることを確認した。 HvYSl遺伝子を導入 していない通常のペチュニア（図 7の 4、 5 :コントロール）においては GAPDHの PCR 産物（約 lOOObp)は検出された力 HvYSl由来の PCR産物は検出されな力つた。 産業上の利用可能性
[0070] 発明の遺伝子を導入した植物は、従来不可能であった、アルカリ土壌での成育が 可能となるので、アルカリ土壌における植物の生産が可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードする DNA を含む遺伝子。
[2] 以下の（a)〜（d)のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の遺 伝子；
(a)配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 なるトランスポータータンパク質 をコードする DNAを含む遺伝子；
(b)前記 (a)のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有 するトランスポータータンパク質をコードする DNAを含む遺伝子；
(c)前記 (a)のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパ ク質をコードする DNAを含む遺伝子；
(d)前記（a)の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつムギネ酸鉄 錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードする DNA を含む遺伝子。
[3] 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
[4] 請求の範囲第 3項に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
[5] 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とするト ランスジェニック植物。
[6] 請求の範囲第 3項に記載のベクターが導入されていることを特徴とするトランスジェ ニック植物。
[7] 請求の範囲第 2項に記載の遺伝子が発現される条件下で、請求の範囲第 4項に記 載の宿主細胞を培養することを特徴とする、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活 性を有するトランスポータータンパク質を製造する方法。
[8] 請求の範囲第 7項に記載の方法によって製造されるムギネ酸鉄錯体を選択的に取 り込む活性を有するトランスポータータンパク質。
[9] ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する、以下の（a)〜（c)の 、ずれかで あるタンパク質；
(a)配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)前記 (a)のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有 するタンパク質；
(c)前記 (a)のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質。
[10] 請求の範囲第 1項に記載の DNAの RNA転写物。
[11] 植物が、イネ科植物、クヮ科植物、マメ科植物、バラ科植物、ツバキ科植物、ァカネ 科植物、ブナ科植物、ミカン科植物及びナス科植物カゝらなる群カゝら選択されるいず れかの科に属するものであることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載のトランスジェ ニック植物 o
[12] 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の遺伝子を植物体内で発現させることを特徴 とする、植物体にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を付与する方法。
PCT/JP2005/021558 2005-05-24 2005-11-24 ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子 WO2006126294A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002609164A CA2609164A1 (en) 2005-05-24 2005-11-24 Gene of transporter selective to mugineic acid-iron complex
US11/920,841 US20110016579A1 (en) 2005-05-24 2005-11-24 Gene of transporter selective to mugineic acid-iron complex
JP2007517717A JPWO2006126294A1 (ja) 2005-05-24 2005-11-24 ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-151676 2005-05-24
JP2005151676 2005-05-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006126294A1 true WO2006126294A1 (ja) 2006-11-30

Family

ID=37451728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/021558 WO2006126294A1 (ja) 2005-05-24 2005-11-24 ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110016579A1 (ja)
JP (1) JPWO2006126294A1 (ja)
CA (1) CA2609164A1 (ja)
WO (1) WO2006126294A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010106676A1 (ja) * 2009-03-19 2010-09-23 サントリーホールディングス株式会社 植物の色素量を増加させる方法
WO2012023583A1 (ja) 2010-08-19 2012-02-23 サントリーホールディングス株式会社 フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素及びその用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017184500A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Bloomsburg University of Pennsylvania Compositions and methods of delivering molecules to plants

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040034888A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-19 Jingdong Liu Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2005501502A (ja) * 2000-11-16 2005-01-20 エール ユニヴァーシティ トウモロコシ・イエローストライプ１および関連遺伝子
WO2005030950A1 (ja) * 2003-09-26 2005-04-07 Japan Science And Technology Agency イネの鉄などの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター、その遺伝子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4084502B2 (ja) * 1999-07-05 2008-04-30 独立行政法人科学技術振興機構 鉄欠乏耐性イネの創製

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040034888A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-19 Jingdong Liu Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2005501502A (ja) * 2000-11-16 2005-01-20 エール ユニヴァーシティ トウモロコシ・イエローストライプ１および関連遺伝子
WO2005030950A1 (ja) * 2003-09-26 2005-04-07 Japan Science And Technology Agency イネの鉄などの金属錯体の吸収や輸送に関与するトランスポーター、その遺伝子

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010106676A1 (ja) * 2009-03-19 2010-09-23 サントリーホールディングス株式会社 植物の色素量を増加させる方法
WO2012023583A1 (ja) 2010-08-19 2012-02-23 サントリーホールディングス株式会社 フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006126294A1 (ja) 2008-12-25
CA2609164A1 (en) 2006-11-30
US20110016579A1 (en) 2011-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110885833B (zh) 编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用
ES2372607T3 (es) El gen del factor de transcripción osnacx del arroz y su uso para mejorar la tolerancia de las plantas a la sequía y la sal.
ES2392332T3 (es) Genes y usos para la mejora de plantas
CN112639086B (zh) 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用
CN110872598B (zh) 一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用
CN108998470B (zh) 大豆MYB32转录因子编码基因GmMYB32的应用
CN111433363A (zh) 非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法
AU2005203616B2 (en) Methods for increasing plant cell proliferation by functionally inhibiting a plant cyclin inhibitor gene
CN110923253B (zh) OsPTP1在植物磷高效育种中的应用
US7238865B2 (en) SOS1 gene from halophila that confers salt tolerance
US20150128304A1 (en) Plant Body Showing Improved Resistance Against Environmental Stress and Method for Producing Same
WO2006126294A1 (ja) ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子
KR20200136921A (ko) 식물 내 아미노산 함량 조절
US11525143B2 (en) Method for promoting an increase in plant biomass, productivity, and drought resistance
CN110004159B (zh) 一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1及其应用
CN114032245A (zh) 基因VLNHX3D在调节植物细胞Na+和/或K+浓度中的应用
CN113136389B (zh) 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用
KR20140032694A (ko) 내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＭＬＤ 유전자 및 이의 용도
US11618903B2 (en) Methods for improving plant abiotic stress tolerance and yield
KR101825219B1 (ko) 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도
JP3564537B2 (ja) 植物のＲａｎ遺伝子変異体、および該変異体を用いた植物の開花時期の促進方法
WO2024077110A2 (en) Uorf::reporter gene fusions to select sequence changes to gene edit into uorfs to regulate ascorbate genes
AU2020242361A1 (en) A method to improve the agronomic characteristics of plants
CA3125360A1 (en) Gene expression elements and systems and use thereof
CN114716521A (zh) 玉米抗旱相关蛋白及其在植物抗旱中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007517717

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2609164

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11920841

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05809199

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1