CN110004159B - 一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控柽柳盐耐性的关键基因TcNAC1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。TcNAC1表达的蛋白产物为柽柳NAC转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过转化拟南芥，得到超表达TcNAC1基因的拟南芥，其种子的耐盐萌发率显著下降，其植株的耐盐性生理指标显著下降，总体表现出生长抑制的典型盐敏感表型，说明了该基因为重要的调控植物耐盐性的关键因子，在林木耐盐性育种领域有重要应用价值。

Description

一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1及其应用。

背景技术

据联合国粮农组织统计，陆地总面积的6.5％为无法耕种的盐碱地，我国盐碱地面积约20多万平方公里，盐碱地产生高盐胁迫，直接影响作物产量，通过抗逆育种手段充分利用盐碱地，对增加作物产量、解决粮食危机意义重大。尽管在在拟南芥、水稻等模式物种中已经阐明了一些普遍的耐盐机制，但很多耐盐基因研究表明，目前应用这些基因的转基因植物耐盐性提高的效果并不理想，不能满足在实际生产中的需求，难以推广(Zhu，2002)。相比草本植物和禾本科作物，耐盐树种具有独特的高度耐盐的优良特性，可以在高度盐碱化的盐渍化土壤、滩涂上正常生长并完成整个生活史，目前仅仅在生理层面解析了相关机制，如泌盐、离子区域化等特有机制，但是其分子层面了解较少，迫切需要阐明其高耐盐调控机理，为获取高耐盐性的转基因植株提供有效的理论指导。

中国柽柳(Tamarix chinenses Lour.)作为耐盐性最强的树种之一，是研究植物耐盐机制的良好材料。柽柳是我国乡土树种，在维持黄河三角洲等海滨湿地盐渍化地区的生态稳定中发挥了重要作用重，也是我国沿海防护林构建的重要资源(李艳华等，2000；赵明范等，1997)。柽柳具有独特的耐高盐胁迫特有机制，挖掘其耐盐性调控关键基因，对植物耐盐机理研究意义重大，可以为盐渍地脱盐、抗逆植物育种提供理论基础，目前在柽柳属的其他物种中已经克隆得到了几十个相关的抗逆基因，为植物耐盐育种提供了重要分子工具，但在我国分布面积最广的柽柳中尚未有耐盐调控基因的报道，急需开展其耐盐调控基因的分离鉴定。

NAC是成员最多的转录因子家族之一。NAC家族在拟南芥中有138个成员，粳稻中有170个成员，杨树中有289个成员，在高等植物中广泛分布(牟桂萍等，2013)。NAC转录因子的命名源于NAM(No Apical Meristem，‘无顶端分生组织’)、ATAFl/2(Arabidopsis thalianaactivating factor；‘拟南芥激活因子’)以及CUC2(CUp-shaped Cotyledon；‘杯状子叶’)三类基因的缩写。NAM最早发现于矮牵牛(Petunia hybrida)，ATAF和CUC来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(彭辉等，2010)。NAC包含保守的N端和高度可变的C端，N端含有约160个氨基酸残基组成NAC结构域，C端有转录激活作用，NAC大多以同源或异源二聚体形式发挥功能，C端序列影响寡聚化作用。NAC家族广泛参与植物的生物胁迫响应、非生物胁迫响应、器官发育、次生生长、果实成熟等生物过程相关调控，功能广泛，但相对于数量巨大的NAC家族成员，对其功能研究仍然不足(Olsen et al.，2005)。

拟南芥中5个NAC参与植株的营养器官的形成、分生组织边界确立、侧根发生和衰老，CUCl/2双突变体，相比野生型萼片变形和花瓣较少，超表达CUC1和CUC2，植株分别出现叶片发育畸形和器官边缘扩张的表型，表明NAC控制着着组织发育中边界相关的功能。非生物胁迫方面，水稻中NAC作为miR164的靶基因，负调控植株抗旱性；在胡杨中，三个NAC表达模式有不一致甚至相反的情况，相对矛盾的胁迫相关性暗示着NAC在调控胡杨非生物胁迫方面存在复杂的调控模式。拟南芥AtNAC4(ANAC080)最初报道为影响侧根发生和叶片衰老进程，近年研究发现和N、P等营养元素胁迫密切相关(Lee et al.，2016)且含有保守的miR164响应元件，暗示着AtNAC4可能在受到转录后调控水平影响胁迫响应；拟南芥ANAC019、ANAC055受到ABA和干旱诱导(Bu et al.，2009)，提高了超表达植株的抗旱能力，刚毛柽柳ThNAC13异源表达提高了拟南芥耐盐性和渗透胁迫耐受能力(Wang，Li，Lu andWang，2017)，刚毛柽柳ThNAC7的过表达类似ThNAC13提高了植株的耐盐性(张明意，2015)。

由上述研究结果可以看出，NAC在调控植物非生物胁迫方面存在复杂的调控模式，一些NAC转录因子被鉴定为耐盐调控的关键因子。目前，尚未有中国柽柳的NAC转录因子相关报道，克隆和开发利用中国柽柳NAC转录因子，不仅有助于阐明柽柳高度耐盐的分子机制，而且可以为筛选重要耐盐基因和抗逆遗传育种提供理论基础和分子工具，对盐碱地利用和农业综合生产能力提高具有重要应用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种柽柳基因TcNAC1，是调控柽柳耐盐性的关键基因。本发明的另一目的是提供一种上述调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

含有所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1的载体。

采用通路克隆技术构建植物超表达载体PBI121GW-TcNAC1，组装通路克隆attR1和attR2元件，快速组装TcNAC1基因表达框并确保准确翻译；组装LB和RB序列，促使组装于其间的TcNAC1基因和筛选标记基因NPTII整合至侵染的拟南芥染色体中；基因TcNAC1位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，TcNAC1可在拟南芥体内高效表达，从而调控耐盐性；在TcNAC1基因的5′端组装组成型强表达启动子P35S，使TcNAC1基因在植物体内高效表达；在TcNAC1基因的3′端组装了强终止子NOS，可有效终止TcNAC1基因的转录。

含有所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1的宿主细胞。

所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1在植物耐盐性育种中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本申请的优点在于：本申请公开了一种调控柽柳盐耐性的关键基因TcNAC1，将TcNAC1基因转入拟南芥，超表达TcNAC1基因的拟南芥植株耐盐性显著下降，其种子的耐盐萌发率显著下降，说明TcNAC1基因是调控柽柳耐盐性的关键调节因子，可用于土壤盐度指示植物的育种，为柽柳耐盐性的基因表达调控分子机制提供理论研究依据和基因序列，在林木基因工程和耐盐性育种领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物超表达载体PBI121GW的结构示意图；

图2是10株成功转化的转基因拟南芥的TcNAC1插入片段的PCR检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图3是超表达TcNAC1基因的拟南芥和野生型拟南芥形态比较图：1为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长28d，2为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天，3为野生型0.3％NaCl培养基生长28d，4为野生型0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天；

图4是超表达TcNAC1基因的拟南芥和野生型拟南芥种子萌发率比较图，右为野生型，左为超表达TcNAC1基因的拟南芥。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：通过RACE技术克隆TcNAC1基因

基于柽柳RNA-seq数据的TcNAC1序列，设计5′和3′的RACE引物，通过巢式PCR扩增两段特异性产物，通过T-载体克隆测序，测序结果通过重叠区拼接，得到cNDA全长。

具体如下：

I.引物设计

3′RACE正向引物为：

Outer PrimerF：5′-TCAACGCCAACAGCAATCACTACAT-3′；

Inner PrimerF：5′-CGGCGTTGAACTCATTCTATGG-3′；

3′RACE反向引物为：

Outer PrimerR：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；

Inner PrimerR：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

5′RACE正向引物为

Outer PrimerF：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；

Inner PrimerF：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

5′RACE反向引物为：

Outer PrimerR：5′-AGTAGGTAGACTTGGCTTCGTTGT-3′；

Inner PrimerR：5′-TCCGCTCCTGACTCCACTTACT-3′；

II.3′RACE反应过程：

(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotal RNA(植物材料为柽柳叶片)，4μL dNTP Mix，2μL 3′RACE Adapter，2μL 10X RTBuffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-freeWater补至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1小时，进入PCR步骤；

(3)3′RACE巢式PCR；

3′RACE Outer PCR反应体系(50μL)组成：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μL MgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each2.5mM)，2.0μL 3′RACE Outer PrimerF(10μM)，2.0μL 3′Outer PrimerR(10μM)，1μL RT reaction product，0.5μL TakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

3′RACE Inner PCR反应体系(50μL)组成：5.0μL 10×LAPCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μL MgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each2.5mM)，2.0μL 3′RACE Inner PrimerF(10μM)，2.0μL 3′RACE Inner PrimerR(10μM)，1μL Outer 3′RACE PCR product，0.5μLTakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

反应程序：94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，35cycles；72℃7分钟。

(4)纯化片段的连接反应

采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19 Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃30分钟；4℃过夜。

(5)大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃水浴中热击90秒，迅速置于冰上3-5分钟；加入800μL LB液体培养基，37℃100转/分钟摇菌1小时；4000转/分钟离心3分钟，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

(6)阳性克隆筛选及测序分析

从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃250转/分钟摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。

反应体系(20μL)：2.0μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺free)，1.5μL MgCl₂(25mM)，1.3μLdNTP Mixture(each2.5mM)，1.0μL3′RACE gene specific inner primer(10μM)，1.0μL 3′RACE Inner Primer(10μM)，0.1μL菌液，1.0μL rTaq，12.1μL Milli-Q Water。反应程序：94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，28cycles；72℃7分钟。

阳性克隆通过Sanger测序法测序得到碱基序列。

III.5′RACE反应过程

(1)RNA处理：CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg TotalRNA，2μL 10X CIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP)，Nuclease-free Water至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1小时；

(3)加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL Ammonium Acetate Solution，115μLNuclease-free Water，150μL acid phenol：chloroform。

(4)充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5分钟；

(5)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5分钟；

(6)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10分钟；

(7)最大转速离心20分钟，用0.5ml预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5分钟，小心弃乙醇，气干沉淀；

(8)以11μL Nuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；

(9)TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA，1μL 10X TAP buffer，2μL Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)，2μL Nuclease-freeWater：

(10)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1小时，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物；

(11)5′RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μLCIP/TAP-treated RNA，1μL 5′RACE Adapter，1μL 10×RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNALigase(2.5U/μL)，4μL Nuclease-free Water。

(12)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1小时，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

(13)将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：2μL LigatedRNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10X RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补至20μL。

(14)轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1小时，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

(15)5′RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3′RACE的巢式PCR一致。

(16)PCR产物克隆测序，操作与3′RACE克隆一致。

IV.ORF扩增

对3′RACE和5′RACE序列进行拼接，并利用NCBI-ORF finder工具预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行TcNAC1基因的全长克隆。其中，TcNAC1 ORF正向引物：5′-ATGGAAAACATTCCTGGATTT-3′，TcNAC1 ORF反向引物：5′-TTAATAGTAACCCCAAAGGTC-3′，高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer5.0μL；2.5mM dNTP Mixture8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(柽柳cDNA)1μL；加无菌ddH2O补足50μL。反应程序：预变性94℃3分钟-(94℃40秒-55℃30秒-72℃30秒)×35个循环-72℃10分钟。

TcNAC1全长cDNA序列为2033bp，其序列如SEQ ID No.1所示，包含一个1164bp的完整阅读框，对应的TcNAC1蛋白的氨基酸序列为387aa，其序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：TcNAC1基因植物表达载体构建

利用通路克隆技术构建TcNAC1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的TcNAC1 ORF引物)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将TcNAC1基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR8/GW/TOPOTM vector(Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μL；pCR8/GW/TOPOTM vector1μL；加无菌ddH2O补足6μL。反应程序为：室温静置30分钟。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行测序验证，阳性入门载体与植物表达载体PBI121GW进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：入门载体100ng；PBI121GW vector(100ng/μL)1.5μL；LR Clonase II enzyme mix 2μL；加TE(pH8.0)补足10μL；。反应条件：25℃1小时。经LR反应后，TcNAC1基因导入植物表达载体PBI121GW中。PBI121GW组装有通路克隆attR1和attR2元件，快速组装TcNAC1基因表达框并确保准确翻译；组装有LB和RB序列，促使组装于其间的TcNAC1基因和筛选标记基因NPTII整合至侵染的植物染色体中。另外，在TcNAC1基因的5′端组装组成型强表达启动子P35S，它能使TcNAC1高效表达。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为PBI121GW-TcNAC1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，TcNAC1可在植物体内高效表达。

实施例3：TcNAC1基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的PBI121GW-TcNAC1过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105，通过农杆菌的花絮侵染法将TcNAC1基因转入拟南芥。得到的阳性拟南芥种子，在含有0.3％NaCl(51mM)的MS固体培养基上进行发芽率测定和植株表型观察测。图2为10株成功转化的转基因拟南芥的TcNAC1插入片段的PCR检测；图3为超表达TcNAC1的转基因拟南芥与野生型整体形态比较，生长基质为含有0.3％NaCl(51mM)的MS固体培养基，1为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长28d，2为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天，3为野生型0.3％NaCl培养基生长28d，4为野生型0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天；图4是超表达TcNAC1的转基因拟南芥和野生型拟南芥种子萌发率比较图，培养基质为含有0.3％NaCl(51mM)的MS固体培养基，右为野生型种子，左为超表达TcNAC1基因的拟南芥种子。从结果可以明显得出，过量表达TcNAC1基因使得拟南芥出现盐敏感表型，转基因拟南芥耐盐性显著下降，说明TcNAC1基因是调控植物耐盐性的关键因子，TcNAC1及其过量表达技术可以作为高效的分子工具加速植物耐盐性育种的进程。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1及其应用

<130> 100

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2033

<212> DNA

<213> Tamarix chinenses Lour.

<400> 1

gattgcagtt ttttcttttt cttgtttgaa agctctgttt ttcgtttccc tccttttgag 60

ctgctcgtct tcttcaagat cacaacttta ttaatagcgc gtcggtttct ttccttcttt 120

ctcttagttc attaagccat actctttaca gtttttcctc atccatatcc aaatccaatt 180

ccccatccct gcccctatct ctctccatct ctctctatat attgtataga actcccctcc 240

ctttcaactc atttctacaa ttccatagca cccacatccc tagttagcag tattggcccg 300

gaacacagaa gactagattg agctggttag attggatagg actagtaagt ggagtcagga 360

gcggatagga agtataagaa atggaaaaca ttcctggatt tgttggtggt tgtggaggtg 420

atcaggaaga acgaatggaa ttaccacctg gattccgatt ccatcccaca gatgaagagc 480

tcatcactca ctacctttct cctaaagtag ttgataacag cttctctgct agagctatcg 540

gcgaggttga tttgaacaag tctgaaccat gggaattgcg tgaacgggcg aagatgggag 600

aaaaggaatg gtatttcttc tgtgtcagag accggaaata cccaactggt ttaagaacga 660

acagggcgac agaagctggt tattggaaag ctactgggaa ggacaaagaa attcgtagag 720

gaaaaccact tgttggtatg aagaaaactc tggttttcta caagggtcga gctccaaagg 780

gggagaaatc aaattgggtc atgcatgaat atagactgga gggtaaatta tccctgcaaa 840

atcttcctaa ttcagctaag cagaacgagt gggtgatatg ccgggtcttt cagaagagtg 900

caggatgtaa gaagattcaa tacccaggtt taatccgatc cgaatcatcg gaattcggtc 960

cttcgtcagg tttaccacca ttgacggact cttcacctta ctttgacccc caacaaacga 1020

agccaagtct acctactgat tcccttcacg tgtcctgctt ctccaacccc accatcatgt 1080

ctaatcctca atcaaacatc aacgccaaca gcaatcacta catgttcgat tcctacgaaa 1140

atagtaacac gattagtccc ttcatgcccg gttatcatgc caaattagga ggaggaggag 1200

gaccgacgac gtcggcgttg aactcattct atggatctga attcaatccg aatccgttgt 1260

cgtacccggg agcaggtgga ggaggatacg tgtcggagca gtcaatctta aggtctatcc 1320

tggagaggaa cggaacggag ggcgtgatga aggcggagag ccatatgatc tctgtttctc 1380

aagacaccgt tttgtcaggt gatatgaatg ctgaaatctc atctgttgtc tcaaattatg 1440

agatgggagg taggagcgca tttgatgatc aacctcagca tccttctgtt gctgctgctg 1500

ctgctggacc tgtggatgtg ggagaccttt ggggttacta ttaattgaat ctgaatctga 1560

atctgaatct gaatctacga ggatgatgca gcagcagaag agattagcta ggtgagctca 1620

tatagactga taaaaatcat tggaagaaga agaagaagaa gaagctgttt agcgtcaata 1680

cctatgttag tatattggta agtgaagtca cttgtggtaa ttgatatagt ttgtgtatag 1740

tatttctctg tatcagaagg tgggggtggg ggaacaggaa aaagaaagaa ggaagaagag 1800

ggtacacata caattatgta acatataatc cattatagta tagtatcagc ttcttctttt 1860

atttttgtca tttttcgttt gcaaattatg ggcgtagttt tgttatcttg gtagcactgg 1920

taatatgttt agcggttgcc atagtatata ctatactgtc ttttagttct tattaaaata 1980

aaattgaatg taaaatattt gatcaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2033

<210> 2

<211> 387

<212> PRT

<213> Tamarix chinenses Lour.

<400> 2

Met Glu Asn Ile Pro Gly Phe Val Gly Gly Cys Gly Gly Asp Gln Glu

1 5 10 15

Glu Arg Met Glu Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu

20 25 30

Glu Leu Ile Thr His Tyr Leu Ser Pro Lys Val Val Asp Asn Ser Phe

35 40 45

Ser Ala Arg Ala Ile Gly Glu Val Asp Leu Asn Lys Ser Glu Pro Trp

50 55 60

Glu Leu Arg Glu Arg Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe

65 70 75 80

Cys Val Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala

85 90 95

Thr Glu Ala Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Arg

100 105 110

Arg Gly Lys Pro Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys

115 120 125

Gly Arg Ala Pro Lys Gly Glu Lys Ser Asn Trp Val Met His Glu Tyr

130 135 140

Arg Leu Glu Gly Lys Leu Ser Leu Gln Asn Leu Pro Asn Ser Ala Lys

145 150 155 160

Gln Asn Glu Trp Val Ile Cys Arg Val Phe Gln Lys Ser Ala Gly Cys

165 170 175

Lys Lys Ile Gln Tyr Pro Gly Leu Ile Arg Ser Glu Ser Ser Glu Phe

180 185 190

Gly Pro Ser Ser Gly Leu Pro Pro Leu Thr Asp Ser Ser Pro Tyr Phe

195 200 205

Asp Pro Gln Gln Thr Lys Pro Ser Leu Pro Thr Asp Ser Leu His Val

210 215 220

Ser Cys Phe Ser Asn Pro Thr Ile Met Ser Asn Pro Gln Ser Asn Ile

225 230 235 240

Asn Ala Asn Ser Asn His Tyr Met Phe Asp Ser Tyr Glu Asn Ser Asn

245 250 255

Thr Ile Ser Pro Phe Met Pro Gly Tyr His Ala Lys Leu Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Pro Thr Thr Ser Ala Leu Asn Ser Phe Tyr Gly Ser Glu Phe

275 280 285

Asn Pro Asn Pro Leu Ser Tyr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Val

290 295 300

Ser Glu Gln Ser Ile Leu Arg Ser Ile Leu Glu Arg Asn Gly Thr Glu

305 310 315 320

Gly Val Met Lys Ala Glu Ser His Met Ile Ser Val Ser Gln Asp Thr

325 330 335

Val Leu Ser Gly Asp Met Asn Ala Glu Ile Ser Ser Val Val Ser Asn

340 345 350

Tyr Glu Met Gly Gly Arg Ser Ala Phe Asp Asp Gln Pro Gln His Pro

355 360 365

Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Val Asp Val Gly Asp Leu Trp

370 375 380

Gly Tyr Tyr

385

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 3'RACE Outer Primer F引物序列(Artificial)

<400> 3

tcaacgccaa cagcaatcac tacat 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 3'RACE Inner Primer F引物序列(Artificial)

<400> 4

cggcgttgaa ctcattctat gg 22

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 3' RACE Outer PrimerR引物序列(Artificial)

<400> 5

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 3' RACE Inner PrimerR引物序列(Artificial)

<400> 6

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 5'RACE Outer PrimerF引物序列(Artificial)

<400> 7

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 5'RACE Inner PrimerF引物序列(Artificial)

<400> 8

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 5'RACE Outer Primer R引物序列(Artificial)

<400> 9

agtaggtaga cttggcttcg tttgt 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 5'RACE Inner Primer R 引物序列(Artificial)

<400> 10

tccgctcctg actccactta ct 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> TcNAC1 ORF正向引物(Artificial)

<400> 11

atggaaaaca ttcctggatt t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> TcNAC1 ORF反向引物(Artificial)

<400> 12

ttaatagtaa ccccaaaggt c 21

Claims (1)

1.一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcNAC1在植物耐盐性育种中的应用，所述基因TcNAC1其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

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