CN109576283B

CN109576283B - 大豆GER蛋白编码基因GmGER12的应用

Info

Publication number: CN109576283B
Application number: CN201811563241.1A
Authority: CN
Inventors: 程浩; 王晴; 杜文凯; 杨宇明; 赵梦; 刘永顺; 喻德跃
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109576283A

Abstract

本发明公开了大豆GER蛋白编码基因GmGER12的应用。大豆GER蛋白编码基因GmGER12，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。将构建的植物过量表达载体pMDC83‑GmGER12在拟南芥的野生型中进行异源表达，发现过表达的植株根毛长度和数目都会增加，表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过对植物根系结构的改变使其更易于吸收磷元素，从而提高转基因植物的耐低磷能力。可见，本发明所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12可在通过基因工程增加根系数量和长度，提高转基因植物耐低磷能力方面应用。

Description

大豆GER蛋白编码基因GmGER12的应用

技术领域

本发明涉及大豆germin-like(GER)蛋白编码基因GmGER12的应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及来源于大豆的萌发素类蛋白GmGER12基因在增加植物根毛长度和数目，进而影响转基因植物耐低磷能力的应用。

背景技术

作为植物生长发育必须的矿质元素之一，磷元素参与了植物体内光合作用、呼吸作用、碳代谢及能量转移等过程。但是在许多农业生态系统中，土壤中的有效磷浓度很难满足植物生长的需要。因此，研究大豆磷效率相关基因的功能，进一步解析磷元素的分子调控机制对提高植物抗逆性具有重要的理论和生产意义。

萌发素家族基因已被鉴定到在植物多个生物学过程中发挥着重要作用。早在1994年就有学者在盐胁迫大麦的根中鉴定到Germin-Like蛋白的存在，随后编码Germin(GER)蛋白和Germin-Like(GLP)蛋白的基因功能陆续被挖掘到，如与细胞壁沉积相关，与锰离子胁迫相关等等。目前，拟南芥和水稻中分别鉴定到了32个和43个GLPs基因的存在。在拟南芥根中显著高表达的PDGLP1和PDGLP2都参与调控了主根的生长，当其过表达时拟南芥的主根变短，侧根长度增加。水稻根中OsRGLP2的启动子与多种非生物胁迫相关，如伤害损伤、盐胁迫和温度胁迫，同时学者也发现对植物生长和发育起重要作用的蛋白酶抑制剂(PI-II)基因的表达在胁迫条件下受OsRGLP2启动子调控。在水稻叶片和种子中高表达的OsGLP2-1与水稻稻瘟病抗性相关，过表达OsGLP2-1的转基因水稻株系的稻瘟病抗性增加，同时参与茉莉酸信号通路的抗病性相关基因的表达也会发生改变。另外已有研究表明水稻中OsGLP1与其耐盐性相关，特别是在发芽期及其初期生长阶段。

GER基因家族基因参与了植物生长发育和各种生物非生物胁迫，如锰离子胁迫、盐胁迫、水稻稻瘟病抗性、干旱胁迫和外源脱落酸刺激等。GmGER家族基因在大豆的生物学代谢过程中所发挥的作用也亟待研究。

发明内容

本发明的目的在于公开一个大豆GER蛋白编码基因GmGER12的抗逆性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的耐低磷能力，以进行植物品种改良。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆GER蛋白编码基因GmGER12，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

大豆GER12蛋白，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

含有本发明所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12的重组表达载体。

使用GmGER12构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)。从转基因植物的安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化植株。

大豆GER蛋白编码基因GmGER12在通过基因工程增加根系数量和长度，提高转基因植物耐低磷能力方面的应用；所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12，其核苷酸序列为：SEQID NO.1。

含有大豆GER蛋白编码基因GmGER12的重组表达载体在通过基因工程增加根系数量和长度，提高转基因植物耐低磷能力方面的应用；所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

携带有本发明GmGER12的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

有益效果

GmGER12基因功能是改变植物的根系结构，这是植物应对低磷胁迫的一种重要机制。实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative RT-PCR)分析表明：耐低磷材料中GmGER12在低磷处理第七天的时候相对表达量达到高峰位置(图3)，表明该基因的表达变化与低磷胁迫相关。构建了亚细胞定位载体pAN580-GmGER12，将其和空载体分别转入拟南芥原生质体中，结果表明GmGER12蛋白主要定位于细胞膜，少量定位于细胞质中(图3)。同时构建了植物过量表达载体pMDC83-GmGER12,并将其在拟南芥的野生型中进行异源表达。对筛选出的T₃代阳性苗进行鉴定，发现过表达的植株根毛长度和数目都会增加(图4)，表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过对植物根系结构的改变使其更易于吸收磷元素，从而提高转基因植物的耐低磷能力。

附图说明

图1GmGER12基因的PCR扩增

M：DL2000marker

图2GmGER12的亚细胞定位

含GFP的质粒pAN580-GmGER12转入拟南芥原生质体中，并在激光共聚焦显微镜下观察。

图3GmGER12基因在持续低磷胁迫下的诱导表达

CD+P、CD-P:基因在春豆CD中正常磷和低磷条件下

YH+P、YH-P:基因在云和蜂窝豆YH中正常磷和低磷条件下

图4过表达阳性植株与对照植株表型对比

a和b：野生型拟南芥植株与过表达GmGER12阳性拟南芥植株分别在正常MS培养基上的表型；c和d：野生型拟南芥植株与过表达GmGER12阳性拟南芥植株分别在低磷MS培养基上的表型；e和f：体视镜下野生型拟南芥植株与过表达GmGER12阳性拟南芥植株在低磷MS培养基上的根毛表型

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)大豆GER蛋白编码基因GmGER12的克隆

以大豆品种春豆CD(大豆耐低磷种质)为材料，根据GmGER12基因号Glyma20g36320在Soybase数据库中找到该基因相对应的碱基序列，根据该序列设计特异性引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

以低磷处理7天的大豆品种春豆CD为取材对象，取其根，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Tiangen，Beijing，China)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照Takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温。随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的长度为669bp的大豆GmGER12基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，命名为GmGER12，由669bp组成(图1)。

2)GmGER12的亚细胞定位研究

以双酶切法构建GmGER12的亚细胞定位载体，首先设计含有目的基因GmGER12完整CDS序列(不含终止子)的带有特定酶切位点的特异性引物，引物序列同SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，具体的PCR过程与步骤1)相同。然后将PCR产物割胶纯化，纯化后的PCR产物及pAN580空载质粒一起以选定的两种限制性内切酶酶切，酶切后将两者以T4连接酶在22℃连接3小时，通过转化、阳性单克隆的测序工作即得到构建成功的亚细胞定位载体pAN580-GmGER12。将其和空载体分别转入拟南芥原生质体，结果表明GmGER12蛋白主要定位于细胞膜，少量定位于细胞质中(图2)。

3)GmGER12在持续低磷胁迫诱导下的表达分析

将长势一致的大豆磷敏感品种云和蜂窝豆YH和耐低磷品种春豆CD两种材料幼苗分别在含有0.005mM KH₂PO₄(低磷)和0.5mM KH₂PO₄(正常磷)的1/2Hogland营养液中培养，在胁迫处理0h，0.5d，1d，3d，7d时取材料CD和YH的根，液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以大豆组成型表达的Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQ ID NO.5和SEQID NO.6。以来自大豆磷敏感品种(YH)和耐低磷品种(CD)两种材料不同处理条件下根的总RNA为模板，反转为cDNA之后进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)，引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，检测GmGER12基因受低磷胁迫的表达量变化。

我们发现在低磷胁迫处理的7d内，材料CD中，除了0.5d胁迫处理这一时间点，GmGER12在低磷条件下的表达量始终都是高于正常磷条件的。低磷胁迫处理0.5d时，GmGER12表达量出现显著下降，而后逐渐上升，直至7d时表达量达到最高。而材料YH中，短时间的低磷胁迫处理，即0.5d和1d时，GmGER12基因在低磷条件下的表达量高于正常磷条件下的，而后随着低磷胁迫处理时间的延长，GmGER12基因表达量虽然也是处于增加的状态，但是在低磷条件下的表达量却并没有正常磷条件下的高(图3)。该结果说明GmGER12基因与大豆低磷胁迫存在一定的关系，并且极有可能是在大豆苗期遭受低磷胁迫的中后期发挥作用。

实施例2基因GmGER12的基因工程应用

1)大豆GER蛋白编码基因GmGER12的克隆

以大豆(Glycine max)耐低磷材料CD的根总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，将PCR产物克隆至pAN580载体，测序后获得具有完整编码区的长度为669bp的大豆GmGER12基因的CDS序列,其中编码区序列见SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

将GmGER12基因序列与Invitrogen公司的

Technology withClonase^TMII试剂盒中的pDONR221载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，具体的PCR过程与步骤1)相同，获得入门克隆；将得到的入门克隆与Invitrogen公司开发的目的表达载体pMDC83进行重组交换，得到pMDC83-GmGER12植物过量表达表达载体，植物转化载体pMDC83含有2x35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmGER12在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的含pMDC83-GmGER12载体的根癌农杆菌菌株EHA105通过采用沾花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0型生态型，对获得的转基因植株进行PCR，利用目的基因特异性引物对提取的DNA片段进行PCR特异性扩增，引物序列见SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10，检测基因编码框是否插入拟南芥基因组DNA中，具体的PCR过程与步骤1)相同，实时荧光定量qPCR引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，验证后进行植物的表型性状分析；

将筛选得到的纯合T₃代转基因株系种植于MS培养基中，1周后将拟南芥幼苗转移到正常磷和低磷的MS培养基中继续生长，观察并记录转基因拟南芥的生长发育过程及其表型性状。拟南芥在固体培养基上生长10天后，使用体视镜对其根毛进行观察。结果表明正常磷条件下，野生型拟南芥植株和过表达拟南芥植株长势无显著差别，但是低磷条件下过表达拟南芥植株根毛长度和数目会增加(图4)。该结果表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过对植物根系结构的改变使其更易于吸收磷元素，从而提高转基因植物的耐低磷能力。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆GER蛋白编码基因GmGER12的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgaaggttg tttacttctt cgttgtgcta ttggctttgg catcctccat tgcctttgct 60

tatgatccaa gccccctgca agacttttgt gtggctatca atgataccaa aactggtgtg 120

ttcgtgaatg gaaaattttg caaggatcca aagcttgcta aggctgaaga tttcttcttt 180

cctggattgg gacccggaaa cacttcaaac cccctaggct caaaggtgac cagtgtcacg 240

gttaatgaaa tattagggct caacacactt ggcatttcct tggcacgcat agattttgca 300

ccaaagggtt tgaaccctcc acacactcac cctcgaggga cagagattct tgtagtcttg 360

gaaggtaccc tctatgttgg ctttgttgcg tccaatcaaa acgataaccg tttattcacc 420

aaagtgctga acaagggtga tgtgtttgtg ttccctattg ggctcattca cttccagcaa 480

aacataggtt atggaaatgc tttggccatt gctggtctta gtagccaaaa ccctggagtt 540

attaccattg caaatgctgt gtttggatct aaacctccta tctctgatga agttcttgcc 600

aaagcttttc aagtgggcaa aaacgtaatc gactaccttc agaagcaatt ctggtacaac 660

aatagttag 669

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Lys Val Val Tyr Phe Phe Val Val Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ile Ala Phe Ala Tyr Asp Pro Ser Pro Leu Gln Asp Phe Cys Val Ala

20 25 30

Ile Asn Asp Thr Lys Thr Gly Val Phe Val Asn Gly Lys Phe Cys Lys

35 40 45

Asp Pro Lys Leu Ala Lys Ala Glu Asp Phe Phe Phe Pro Gly Leu Gly

50 55 60

Pro Gly Asn Thr Ser Asn Pro Leu Gly Ser Lys Val Thr Ala Val Thr

65 70 75 80

Val Asn Glu Ile Leu Gly Leu Asn Thr Leu Gly Ile Ser Leu Ala Arg

85 90 95

Ile Asp Phe Ala Pro Lys Gly Leu Asn Pro Pro His Thr His Pro Arg

100 105 110

Gly Thr Glu Ile Leu Val Val Leu Glu Gly Thr Leu Tyr Val Gly Phe

115 120 125

Val Ala Ser Asn Gln Asn Asp Asn Arg Leu Phe Thr Lys Val Leu Asn

130 135 140

Lys Gly Asp Val Phe Val Phe Pro Ile Gly Leu Ile His Phe Gln Gln

145 150 155 160

Asn Ile Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Ala Ile Ala Gly Leu Ser Ser Gln

165 170 175

Asn Pro Gly Val Ile Thr Ile Ala Asn Ala Val Phe Gly Ser Lys Pro

180 185 190

Pro Ile Ser Asp Glu Val Leu Ala Lys Ala Phe Gln Val Gly Lys Asn

195 200 205

Val Ile Asp Tyr Leu Gln Lys Gln Phe Trp Tyr Asn Asn Ser

210 215 220

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acggactagt atgaaggttg tttacttctt cg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgctctaga actattgttg taccagaatt gc 32

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagttcaca gaggcagag 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cacttacgca tcacatagca 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgataaccgt ttattcacca aag 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaatgagcc caatagggaa cac 23

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgaaggtt gtttacttct tcg 53

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc taactattgt tgtaccaga 49

Claims

1.大豆GER蛋白编码基因GmGER12在低磷条件下增加根系数量和长度，提高转基因植物耐低磷能力方面的应用；所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12 ，其核苷酸序列为： SEQ IDNO. 1。

2.含有大豆GER蛋白编码基因GmGER12的重组表达载体在低磷条件下增加根系数量和长度，提高转基因植物耐低磷能力方面的应用；所述的大豆GER蛋白编码基因GmGER12，其核苷酸序列为： SEQ ID NO. 1。