CN112322645A

CN112322645A - OsHDA710表观调控因子基因在水稻发育和抗逆中的应用

Info

Publication number: CN112322645A
Application number: CN202010963152.7A
Authority: CN
Inventors: 赵毓; 徐秋涛; 周道绣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及OsHDA710表观调控因子基因在水稻发育和抗逆中的应用。OsHDA710表观调控因子基因是一个与抗逆相关的HDAC家族组蛋白去乙酰化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。该基因受逆境如干旱模拟、冷、盐、热激和ABA、NAA、6‑BA、JA、IAA等植物激素诱导。自然条件下该基因突变体的结实率显著下降。NaCl和ABA处理超表达、突变体以及野生型植株幼苗，发现该基因的突变体达可对NaCl和ABA具有抗性，同时该基因超表达植株的生长和种子发芽率均受外源ABA的影响。ABA处理后对不同突变体转基因家系植株抗逆相关基因的表达水平检测表明该基因在水稻抗过程中具有重要的调控功能。

Description

OsHDA710表观调控因子基因在水稻发育和抗逆中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻HDAC家族组蛋白去乙酰化酶基因OsHDA710的功能验证及其在水稻发育和抗逆中的应用。

背景技术

植物在其生长发育的一生由于其固定生长的特性会经历各种非生物环境因素的胁迫，例如干旱、洪涝、高盐、高温、矿物质缺乏等等。这些非生物胁迫对于植物特别是农作物的产量具有重要的影响。(Boyer 1982.Plant productivity and environment.Science218:443-448)。目前世界上每年大约有50％的粮食作物因非生物胁迫导致产量减少(Mantri et al.2012.Abiotic stress responses in plants:present andfuture.Abiotic stress responses in plants:Springer)。其中土壤盐碱化而导致的盐胁迫已经是抑制作物物生长、降低作物产量的主要环境因素。盐胁迫主要通过渗透胁迫影响植物的生长和发育。因此解析植物盐反应和耐盐特性的分子机制变得至关重要，该机制的阐明将大大提高我们在高盐条件下开发高产植物的能力。

在植物中，对非生物胁迫的响应主要是由脱落酸(ABA)依赖的信号通路介导的(Cutler et al.2010.Abscisic acid:emergence of a core signaling network.AnnuRev Plant Biol 61:651-679；Vishwakarma et al.2017.Abscisic Acid Signaling andAbiotic Stress Tolerance in Plants:A Review on Current Knowledge and FutureProspects.Front Plant Sci.8:161)。ABA作为一种植物激素在整合各种应激信号和调节下游应激反应中起着至关重要的作用。因此对内源ABA的精确调控是必要的，以使植物对其周围的生理和环境条件作出精确反应(Tuteja 2007.Abscisic Acid and abiotic stresssignaling.Plant signaling&behavior 2:135-138.)。在模式植物拟南芥的许多研究表明：ABA信号除了参与植物的正常命周期过程，包括气孔关闭、种子和芽休眠等(Gomez-Porras et al.2007.Genome-wide analysis of ABA-responsive elements ABRE andCE3 reveals divergent patterns in Arabidopsis and rice.BMC Genomics 8:260；Yoshida et al.2015.Omics Approaches Toward Defining the ComprehensiveAbscisic Acid Signaling Network in Plants.Plant Cell Physiol 56:1043-1052)，还在干旱和盐胁迫响应中起着关键的调控作用(Fujii and Zhu 2009.Arabidopsis mutantdeficient in 3abscisic acid-activated protein kinases reveals critical rolesin growth,reproduction,and stress.Proc Natl Acad Sci U S A.106:8380-8385；Maet al.2009.Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acidsensors.Science 324:1064-1068)，同时调控多个干旱和盐度响应基因(ABI、bZIP、MYB2、RAB18、RD29A、ABF4、AOX1、DREB2等)的表达(Banerjee and Roychoudhury 2017.Abscisic-acid-dependent basic leucine zipper(bZIP)transcription factors in plantabiotic stress.Protoplasma 254:3-16；Cutler et al.2010.Abscisic acid:emergenceof a core signaling network.Annu Rev Plant Biol.61:651-679；Qin et al.2015.Awheat salinity-induced WRKY transcription factor TaWRKY93 confers multipleabiotic stress tolerance in Arabidopsis thaliana.Biochemical and biophysicalresearch communications 464:428-433)。在干旱胁迫下，ABA在植物细胞中积累，然后被由浆膜定位的细胞受体识别。ABA受体是转导ABA信号的基本元件，主要由PyrabactinResistance/Pyrabactin Resistance-Like/Regulatory Component of Abscisic acidReceptor(PYR/PYL/RCAR)家族蛋白组成(Gonzalez-Guzman et al.2012.ArabidopsisPYR/PYL/RCAR receptors play a major role in quantitative regulation ofstomatal aperture and transcriptional response to abscisic acid.Plant Cell24:2483-2496)。在正常情况下，当ABA含量较低时，蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(sucrosenon-fermenting-1-related protein kinase 2,SnRK2)蛋白活性被蛋白磷酸酶2C(PP2C)去磷酸化从而抑制其活性；而在干旱和盐胁迫下，细胞中ABA含量增加，ABA与PYR/PYL/RCAR结合并抑制PP2C的活性。由于PP2C蛋白酶活被抑制，从而SnRK2蛋白以其活性形式释放，激活的SnRK2s磷酸化其下游的转录因子和膜离子通道等靶点，触发ABA诱导的生理和分子反应，同时调节植物中几种与胁迫相关的基因的表达，进而提高植物对干旱和盐碱的耐受性。(Danquah et al.2014.The role of ABA and MAPK signaling pathways in plantabiotic stress responses.Biotechnol Adv.32:40-52；Dong et al.2015.Abscisicacid:biosynthesis,inactivation,homoeostasis and signalling.Essays Biochem 58:29-48；Fujii and Zhu et al.2009.Arabidopsis mutant deficient in 3abscisicacid-activated protein kinases reveals critical roles in growth,reproduction,and stress.Proc Natl Acad Sci U S A.106:8380-8385)。

在植物中，HDACs已被证明可以参与调节多种细胞生物学过程，包括发育、生殖和应激反应等((Luo et a.l.2017.Plant responses to abiotic stress regulated byhistone deacetylases.Frontiers in plant science 8:2147；Mehdi et al.2016.TheWD40 Domain Protein MSI1 Functions in a Histone Deacetylase Complex to Fine-Tune Abscisic Acid Signaling.The Plant Cell 2016,28:42；Shen etal.2019.Arabidopsis histone deacetylase HDA15 directly represses plantresponse to elevated ambient temperature.The Plant Journal 100:991-1006；Uedaet al.2017.The distinct roles of class I and II RPD3-like histonedeacetylases in salinity stress response.Plant physiology 175:1760-1773；Zhenget al.2016.Histone deacetylase HDA9 negatively regulates salt and droughtstress responsiveness in Arabidopsis.Journal of Experimental Botany 67:1703-1713)。在植物应激反应方面，HDAC家族成员表现出不同的调控功能。例如，在拟南芥中，HDA9和HD2D作为负调控因子参与盐胁迫响应(Han et al.2016.AtHD2D Gene Plays aRole in Plant Growth,Development,and Response to Abiotic Stresses inArabidopsis thaliana.Front Plant Sci.7:310；Zheng et al.2016.Histonedeacetylase HDA9 negatively regulates salt and drought stress responsivenessin Arabidopsis.Journal of Experimental Botany 67:1703-1713)；而HDA6和HD2C则作为正调节因子参与盐胁迫相应(Chen et al.2010.Involvement of Arabidopsi shistone deacetylase HDA6 in ABA and salt stress response.Journal ofexperimental botany 61:3345-3353；Luo et al.2012.HD2C interacts with HDA6 andis involved in ABA and salt stress response in Arabidopsis.Journal ofexperimental botany 63:3297-3306)。此外，前人对HDA19在盐胁迫响应方面的研究结果表明同一基因在不同品种的植株中可能扮演者不同甚至相反的功能。例如，在拟南芥Wassilewskija背景的植株中敲除HDA19植株表现出盐胁迫敏感性(Chen and Wu2010.Role of histone deacetylases HDA6 and HDA19 in ABA and abiotic stressresponse.Plant signaling&behavior.5:1318-1320)，而在Columbia-0背景下的HDA19突变体则表现出耐盐表型(Mehdi et al.2016.The WD40 Domain Protein MSI1 Functionsin a Histone Deacetylase Complex to Fine-Tune Abscisic Acid Signaling.ThePlant Cell 28:42；Ueda et al.2017.The distinct roles of class I and II RPD3-like histone deacetylases in salinity stress response.Plant physiology 175:1760-1773)。这些结果表明，HDAC在参与盐胁迫响应过程存在功能的不一致性。而且目前关于HDACs参与盐胁迫响应的研究大部分是围绕拟南芥展开的，但在水稻中的报道则较少。此外，HDACs在水稻对非生物胁迫，特别是干旱和盐碱胁迫的响应中所起的作用机制目前还鲜有报道。因此，阐明HDACs在水稻抗旱性和耐盐性的作用机理则显得尤为必要。

综上所述，植物在其生长发育过程中受不同激素及多种环境刺激的影响，而关于HDACs类表观调控因子能增强水稻对盐胁迫的研究目前较少，同时对于这类基因抗逆的机制也未有阐明。本发明通过转基因、生化、分子生物学等方法对OsHDA710生物学功能进行了系统研究，进一步揭示了该基因在水稻生长发育和盐胁迫中有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于克隆一个与水稻发育和响应盐胁迫的表观调控因子基因，通过遗传转化获得这个基因的转基因植株。通过对转基因水稻幼苗和成熟期植株进行表型观察及相应的分子机理的研究，确定了该基因在水稻生长发育和抗逆过程中的作用，为培育新型水稻抗逆品种提供了技术基础。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

(1)本发明从水稻中鉴定到一个与水稻发育和盐胁迫相关的表观调控因子基因OsHDA710(LOC_Os02g12380)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在该序列表中的第140-5660位所示的序列是该基因的编码区，根据网站ChromDB(http://www.chromdb.org/)的命名规则，申请人将该基因被命名为OsHDA710。从cDNA文库中通过PCR扩增出该基因CDS全长(见序列表SEQ ID NO:2)并构建了该基因的超表达载体，同时利用CRISPR/CAS9技术构建了其突变载体，其中gRNA序列是序列表SEQ ID NO:1中的第433-453和1776-1795位所示的DNA序列。为了确定该基因的亚细胞定位，构建了HDA710-pC1301S-GFP(全长cDNA序列，它是序列表SEQ ID NO:2所示的DNA序列)载体，即根据GFP信号在细胞中的位置来确定该基因编码的蛋白定位。

本发明的水稻表观调控因子基因由6096个碱基组成，预测的蛋白质编码序列有1530个碱基，对应的编码氨基酸数目为509个(氨基酸序列见SEQ ID NO:2所示，蛋白质序列见SEQ ID NO:3所示)。目前还未有任何文献关于该基因在激素、逆境胁迫应答及对水稻生长发育的影响上的报道。对OsHDA710的表达谱分析发现该基因主要在水稻愈伤组织、根、雌蕊和幼穗有表达，其中以愈伤组织和根中的表达水平相对较高。通过不同的胁迫和激素处理，检测该基因的表达水平变化发现OsHDA710受冷(4℃处理)、NaCl、干旱、PEG(20％)、黑暗、淹水，以及各种外源植物激素，如脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、萘乙酸(NAA)、2，4-D等诱导(见图4)。通过构建载体获得了该基因的超标达载体PU1301-OsHDA710(其序列如SEQ IDNO:2所示)，pCXUN-OsHDA710载体(序列如SEQ ID NO:1所示)，并通过对水稻品种“中花11”(ZH11)进行遗传转化获得了该基因的超表达和CRISPR/CAS9突变体植株。对突变体和超表达的转基因植株进行表型统计，发现与野生型比较幼苗时期(21天)超表达植株显著变矮，而突变体植株则没有明显变化(图5、图6)。以成熟期与野生型比较，突变体和超表达植株的株高没有明显变化，但是突变体的结实率显著下降(图6中的B图)。通过烟草瞬时表达试验显示HDA710定位于细胞质和细胞核(见图7中的A图)。对野生型中花11、oshda710突变体和超表达植株进行组蛋白抽提，并通过免疫印迹试验检测组蛋白H3K27、H3K14、H3K、H3、H4K5和H4K16等位点的乙酰化水平，结果显示突变OsHDA710导致H4K5和H4K16位点的乙酰化修饰水平显著上升，同时超表达植株中这两种修饰的水平显著下降(图7中的B图-D图)。对野生型中花11、OsHDA710突变体和超表达植株进行NaCl处理(150mM)，结果显示与野生型中花11相比，突变体的表现出很强的抗性，而超表达则非常敏感，此外，处理后的植株存活率突变体要显著高于野生型中花11，同时野生型中花11显著高于超表达(图8)。为探究是否突变体对盐胁迫的抗性与ABA信号途径有关。对野生型中花11、OsHDA710突变体和超表达植株进行ABA处理(浓度为3μM和5μM)。结果显示，与野生型比较突变体的表现出很强的抗性，而超表达则非常敏感，此外，处理后突变体株高要显著高于野生型中花11，同时野生型中花11显著高于超表达(图9)。进一步qPCR结果检测显示，在ABA处理下，与野生型中花11相比参与抗逆反应的基因OsLEA、OsABI5和OsbZIP72其表达量在突变体oshda710中显著上调(图9)。

具体操作步骤如下：

(1)根据OsHDA710基因的登录号LOC_Os12g38400，在Rice Genome AnnotationProject(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)网站上获取该基因的cDNA参考序列，设计相关载体的引物，以水稻cDNA为模板通过PCR扩增OsHDA710基因的全长cDNA，(翻译起始位点至下游1530个碱基)，获得DNA片段。所用引物序列如下：

OsHDA710-F:5’-ATGGACCCCTCGTCGGCG-3’,

OsHDA710-R:5’-TAGTGAGCTTCCCGGTTCAT-3’.

(2)根据测序的OsHDA710基因序列信息，设计CRISPR/CAS9的gRNA用于构建pCXUN-OsHDA710载体，所用gRNA序列如下：

HDA710-gRNA-1:5’-GGAGACCCAGTTCGACCAGAT-3’，

HDA710-gRNA-2:5’-ACAGGGGACATCCGCGATAT-3’。

(3)将步骤1)和2)中扩增得到的片段用相应的限制性内切酶酶切，并同时用相对应的限制性内切酶分别切割超表达载体pU1301(Sun and Zhou,2008,Rice jmjC domain-containing gene JMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment.PNAS.36:13679-13684)上(图1)和CRSIPR/CAS9载体pCXUN(He et al.2017,Self-cleaving ribozymes enable the production of guide RNAs from unlimitedchoices of promoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing.J GenetGenomics.2017；44:469–72)(图2)。再用连接酶连接片段和载体然后电转化到大肠杆菌感受态菌株DH10B中。pU1301是由国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun et al.,2004.Xa26,a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae inrice,encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37:517-527)基础上改造而成。获得转化载体OsHDA710-pU1301和OsHDA710-pCXUN。利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei et.al.,1994.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.6:271-282)将所述的载体分别导入水稻受体“中花11”，获得转化植株OEHDA710和hda710。

(4)通过PCR的方法鉴定转基因阳性植株，并扩增gRNA序列然后测序，在DsDecodeM网站(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)对测序结果进行解析，筛选出纯合突变体。再利用荧光定量PCR，检测转基因植株中相关基因的表达量，筛选出表达量上升较高的植株。考察转基因植株的表型并进行统计分析；

(5)利用高盐、冷和干旱等逆境以及各种激素处理野生型水稻“中花11”发芽14天后的幼苗，同时检测OsHDA710对不同胁迫条件的应答。

(6)抽提OsHDA710突变体和超量表达转基因阳性植株的组蛋白，并通过免疫印迹法检测组蛋白H3和H4上不赖氨酸同位点的乙酰化修饰变化。

(7)将发芽14天的OsHDA710的突变体和超量表达转基因阳性植株幼苗用150mMNaCl溶液处理2天以及10天，然后分别测定盐胁迫下植株的鲜重以及存活率。

(8)用3μM和5μM ABA处理OsHDA710的突变体和超量表达转基因阳性植株幼苗，考察ABA处理下植株的表型以及参与抗逆反应基因OsLEA、OsABI5和OsbZIP72在突变体hda710的表达水平变化。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

水稻作为我国主要的粮食作物之一，对于其抗逆分子作用机制的解析有助于培养新型抗逆品种，从而解决目前的粮食短缺以及国家粮食安全有着极其重要的战略意义。如何培育具有高抗逆高产的水稻品种是当前需要急需解决一个重大科学问题。水稻抗性基因的挖掘以及参与抗逆性代谢网络的解析势必有助于提高水稻对逆境环境的适应性，扩大水稻种植的区域同时促进其产业化规模的增大，进而提高水稻的整体产量。许多研究表明表观调控因子尤其是组蛋白去乙酰化酶在植物逆境响应过程扮演着非常重要的角色，但是这些研究大多集中于双子叶模式植物拟南芥中，对于单子叶的模式植物水稻中的相关研究与报道目前还是非常少。本发明克隆到了一个水稻HDAC家族成员OsHDA710，通过外界胁迫和激素处理野生型水稻植株幼苗，qPCR检测OsHDA710表达水平变化，发现该基因受各种处理诱导，其中以NaCl和干旱(Drought)两种处理最为显著。通过遗传转化获得该基因的CRISPR/CAS9和超表达载体，获得了其突变体和超表达植株。表型考察发现与野生型比较幼苗时期(21天)超表达植株显著变矮，而突变体植株则没有明显变化；成熟期与野生型比较突变体和超表达植株的株高没有明显变化，但是突变体结实率显著下降。通过ABA处理，发现与野生型比较突变体表现出很强的抗性，而超表达则非常敏感。表明OsHDA710基因能够对逆境作出应答，参与逆境响应的调控。

附图说明

图1：本发明涉及的载体pU1301及超表达载体OsHDA710-pU1301的结构示意图。图1的上半部分为表达载体质粒pU1301结构图，图1的下半部分为本发明构建的超表达载体OsHDA710-pU1301的结构图谱。

图2：CRISPR/CAS9载体pCXUN及OsHDA710-pCXUN结构示意图。图2的上半部分为CRISPR/CAS9载体质粒pCXUN图谱，图2的下半部分为本发明构建的载体OsHDA710-pCXUN结构图。

图3：核定位载体PC1301S-GFP及OsHDA710-PC1301-GFP的结构示意图。附图标记说明：图3的上半部分为亚细胞定位载体的质粒PC1301S-GFP图，图3的下半部分为本发明构建的OsHDA710-PC1301-GFP亚细胞定位载体图。

图4：OsHDA710表达谱分析以及不同胁迫以及植物激素处理下表达水平的变化。附图标记说明：图4中的A图中标记CA为愈伤组织，S为茎，PR为主根，CR为冠根，IN为节间，PS为雌蕊，PA为幼穗。D中PEG为聚乙二醇。B-L为不同处理条件下OsHDA710表达水平的变化。其中B图为盐(NaCl)处理；C图为干旱(Drought)处理；D图为PEG处理；E图为黑暗(Dark)处理；F图为冷(Cold)处理；G图为淹水(Submergence)处理；H图为ABA处理；I图为JA处理；J图为GA3处理；K图为2,4-D处理；L图为NAA处理。

图5：OsHDA710 CRISPR/CAS9突变体和超表达转基因植株构建以及检测。附图标记说明：图5中的A图为OsHDA710的基因结构以及gRNA的位置。图4中的B图为OsHDA719突变基因型检测。图4中的C图为OsHDA710超表达载体结构图。图4中的D图为OsHDA710超表达家系的表达量检测。图4中的E图为OsHDA710超表达家系蛋白水平的检测。

图6：OsHDA710 CRISPR/CAS9突变体和超表达转基因植株表型考察。附图标记说明：图6中的A图为OsHDA710超表达、突变体的苗期幼苗株高检测。图6中的B图为oshda710突变体的穗型以及结实率检测。C图为OsHDA710超表达、突变体成熟期植株表型。

图7：OsHDA710亚细胞定位以及OsHDA710 CRISPR/CAS9突变体和超表达植株中组蛋白赖氨酸乙酰化修饰水平的变化。附图标记说明：图7中的A图为OsHDA710蛋白的亚细胞定位检测。图7中的B图为oshda710突变体中组蛋白H3上的赖氨酸乙酰化修饰变化免疫印迹检测。图7中的C图为oshda710突变体中组蛋白H4上的赖氨酸乙酰化修饰变化免疫印迹检测。图7中的D图为图7中的B图和图7中的C图的结果的统计分析。

图8：150mM NaCl处理OsHDA710 CRISPR/CAS9突变体、超表达、野生型(中花11)植株后，对应的转基因植株鲜重和植株存活率统计。附图标记说明：图8中的A图为150mM NaCl处理后OsHDA710突变体、超表达的叶片表型。图8中的B图为150mM NaCl处理后OsHDA710突变体、超表达植株的鲜重统计。图8中的C图为150mM NaCl处理10天后OsHDA710突变体、超表达植株的表型。图8中的D图为150mM NaCl处理10天后OsHDA710突变体、超表达植株的存活率统计。

图9：ABA处理OsHDA710超量表达植株、OsHDA710突变体植株以及野生型植株后，转基因植株表型统计以及基因OsLEA、OsABI5和OsbZIP72在突变体oshda710中表达水平变化的检测。附图标记说明：图9中的A图为3μM和5μM ABA处理后OsHDA710突变体、超表达的植株的表型。图9中的B图为3μM和5μM ABA处理后OsHDA710突变体、超表达的植株的株高变化统计分析。图9中的C图为0μM、3μM和5μM ABA处理后OsHDA710突变体、超表达的种子发芽率统计分析。图9中的D图为OsLEA3基因ABA(control、5μM ABA)处理后在野生型和oshda710中的表达差异分析。图9中的E图为OsABI5基因ABA(control、5μM ABA)处理后在野生型以及oshda710中的表达差异分析。图9中的F图为OsBZIP72基因ABA(control、5μM ABA)处理后在野生型以及oshda710中的表达差异分析。图9中的G图为OsNHX1基因NaCl(control、150mMNaCl)处理后在野生型以及oshda710中的表达差异分析。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的表观调控因子基因OsHDA710的核苷酸序列。序列长度为6096bp。

序列表SEQ ID NO:2是序列表SEQ ID NO:1所示的基因OsHDA710的cDNA序列，序列长度为1530bp，编码509个氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO:3是OsHDA710基因编码的蛋白质序列。

实施例1：OsHDA710基因的克隆

本发明的基因OsHDA710的克隆(LOC_Os02g12380)主要通过RT-PCR的方法获得(方法参考：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，北京，2002版)。具体操作步骤如下：

(1)抽提水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物科学研究所)幼苗叶片RNA，RNA抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤参见试剂盒的说明书)；

(2)RT-PCR反转录合成cDNA第一链：①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2U,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配制混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴10分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

(3)然后根据Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的OsHDA710基因的全长cDNA序列，设计引物PCR扩增片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，正向引物F和反向引物R各0.4μl，r Taq酶0.2μl，加水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。

用于克隆OsHDA710基因序列全长的引物为：

正向引物OsHDA710-F:5’-ATGGACCCCTCGTCGGCG-3’,

反向引物OsHDA710-R:5’-TAGTGAGCTTCCCGGTTCAT-3’；

最终得到OsHDA710基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

(4)最后将扩增产物连接到T/A克隆载体pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)上用T7和SP6引物进行测序验证。

实施例2：OsHDA710超表达载体的构建

(1)设计适于构建超表达载体的引物并，在引物两端加上Kpn I和BamH I的酶切接头，以实施例1中所获得的全长cDNA为模板，通过PCR的方法扩增得到OsHDA710的CDs序列。

(2)分别用Kpn I和BamH I酶切PCR产物和超量表达载体质粒pU1301(见图1)，目的片段回收纯化后用连接酶连接，连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法参见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，北京，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

(3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，北京，2002版报道的方法抽提质粒，用Kpn I和Bam HI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达载体：即pU1301-OsHDA710。用来克隆OsHDA710超表达载体片段的引物为：

正向引物OsHDA710-F:5’-GGTACCATGGACCCCTCGTCGGCG-3’，

反向引物OsHDA710-R:5’-GGATCCTAGTGAGCTTCCCGGTTCAT-3’。

实施例3：CRISPR/CAS9载体的构建

根据实施例1中所得到的OsHDA710的基因全长序列，设计gRNA序列，通过融合PCR构建得到U3-promoter-gRNA序列，再使用KpnI酶切克隆质粒，最后连接到用KpnI酶切开的pCXUN-Cas9载体上，筛选含有外源片段的阳性克隆。

具体步骤：查找敲除的靶位点，使用信息是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室生物信息中心开发的网站CRISPR-P(Lei et al 2014；Liu et al 2017)。将目的基因的基因组序列或编码区序列复制到网站首页，执行搜索功能，在靠近基因编码区序列的5′端，选择可能的脱靶位点最少且Score的分值最高的点作为靶位点，并设计引物。

本实施例采用的CRISPR/Cas9载体构建体系为申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室赵云德教授建立的系统，采用的载体pCXUN-Cas9参考赵云德教授课题组发表的文献(He et al 2017)。查找敲除的靶位点，使用的是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室生物信息中心开发的网站CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)。将目的基因的基因组序列或编码区序列复制到网站首页，执行搜索功能，在靠近基因编码区序列的5′端，选择可能的脱靶位点最少且Score的分值最高的点作为靶位点，并设计引物。

(1)以U3序列为模板和引物OsU3-F/HDA710-CRP-R(1/2)、HDA710-CRP-F(1/2)+OsU3-R、OsU3-F/HDA710-CRP-R(1/2)、HDA710-CRP-F(1/2)+OsU3-R进行PCR反应。将对应基因的PCR产物切胶纯化后回收，通过两两混合作为模板，使用引物OsU3-F/OsU3-R进行下一轮PCR反应，回收目标条带，与经Kpn I酶切的载体质粒pCXUN(华中农业大学作物遗传与改良国家重点实验室赵云德教授赠送；该质粒的图谱见图2；参见文献：He等,Self-cleavingribozymes enable the production of guide RNAs from unlimited choices ofpromoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing.J Genet Genomics.2017；44:469–72.)连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司生产，使用方法及用量参照该公司提供的产品说明书；连接酶购自上海英俊生物技术有限公司。

(2)按照实施例1中的方法，将连接产物转到大肠杆菌DH10B感受态中，并挑取克隆子测序验证。用来构建pCXUN载体的gRNA序列和引物为：

HDA710-gRNA-1:5’-GGAGACCCAGTTCGACCAGAT-3’，

HDA710-gRNA-2:5’-ACAGGGGACATCCGCGATAT-3’。

HDA710-CRP-F1:5’-ATCTGGTCGAACTGGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA-3’

HDA710-CRP-R1:5’-GGAGACCCAGTTCGACCAGATGCCACGGATCATCTGCACAAC-3’

HDA710-CRP-F2:5’-ACAGGGGACATCCGCGATATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA-3’

HDA710-CRP-R2:5’-ATATCGCGGATGTCCCCTGTGCCACGGATCATCTGCACAAC-3’

OsU3-F:5’-CCCCTTTCGCCAGGGGTACCGTAATTCATCCAGGTCTCCAAG-3’

OsU3-R:5’-TACGAATTCGAGCTCGGTACCGCTGTGCCGTACGACGGTACG-3’

最终得到OsHDA710基因CRISPR/CAS9载体pCXUN-OsHDA710。

实施例4:水稻HDAC家族转组蛋白去乙酰化酶OsHDA710在水稻抗逆中的功能研究，

具体步骤如下：

A.OsHDA710基因的表达模式

分别取水稻品种“中花11”不同生长时期的不同组织，用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒的说明书)抽提RNA，反转录后用荧光定量PCR仪检测OsHDA710基因在愈伤组织(CA)、茎(S)、主根(PR)、冠根(CR)、节间(IN)、雌蕊(PS)和幼穗(PA)中的表达量，结果如图4中的A图，由图4中的A图可知，OsHDA710基因在水稻除茎外其他检测的组织中均有表达，其中愈伤组织中的表达量最高，冠根次之。

B.OsHDA710基因的亚细胞定位

(1)亚细胞定位载体的构建。用于基因亚细胞定位研究的载体为pC1301S-GFP，是基于pCAMBIA1301，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室王磊博士改造而成(见图3)。

(2)以上述实施例2中构建的载体pU1301-OsHDA710为模板，通过扩增程序(94℃预变性3min；94℃30sec，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸8min)将其扩增出来，扩增产物通过BamH I单酶切，连入已进行同样单酶切的pC1301S-GFP载体；转化大肠杆菌后提取质粒用载体引物测序验证。得到OsHDA710-pC1301S-GFP载体(见图3)。用来构建亚细胞定位载体的引物为：

OsHDA710-GFP-F:5’-AGCTGTACAAGTAAGGATCCATGGACCCCTCGTCGGCG-3’，

OsHDA710-GFP-R:5’-AACGATCGGGAATTGGATCCTCATAGTGAGCTTCCCGGTTC-3’；

为了确定该基因表达蛋白的亚细胞定位，本发明采用烟草瞬时转化方法。

具体操作如下：将OsHDA710-pC1301-GFP烟草瞬时转化载体按实施例2方法转化进农杆菌(EHA105)后，挑取克隆于LB培养基中得到菌液。取一灭菌10ml离心管，加入3ml含有相应抗生素的LB培养基，再加入60μL 0.5M的MES(pH5.6)和1.6μL 100mM的乙酰丁香酮(AS)，再接种10μL的农杆菌菌液，28度培养至OD600＝1.0左右，4000rpm离心10分钟收集菌体，用10mM的MgCl2重新悬浮至OD600＝1.0，按照2μL/ml加入AS，静置3小时以上。为了增加外源蛋白的表达量，将P19质粒以同样的方法得到农杆菌菌液。以等体积混合目标载体和P19的农杆菌菌液(Voinnet et al 2003)，吸到一次性注射器中，去掉针头。取生长4周左右的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用手指抵住烟草叶片的近轴面，将注射器中的农杆菌菌液从远轴面压入烟草叶片中，正常条件下生长4天左右的烟草中取样。在共聚焦显微镜(TCS SP2；Leica，德国)下观察GFP荧光在烟草表皮细胞中的表达部位，观察结果如图5中的A图，由此可知，OsHDA710基因表达的蛋白定位于细胞质和细胞核内。

C.不同条件处理野生型植株后检测OsHDA710对逆境的应答

(1)将OsHDA710在非生物胁迫如干旱处理、淹水、冷处理、NaCl处理、热激和甘露醇处理条件下的表达情况。下述试验均用正常光照和温度下将发芽14天的水稻品种中花11的幼苗进行处理。干旱处理时取14天水稻品种中花11的幼苗放置在干燥的玻璃培养皿中，让其水分自然蒸发，分别在处理后0h、1h、3h、6h、12h和24h取样。其中冷处理在4℃光照培养箱中进行，在生根培养基上室温条件下发芽14天的幼苗转移到4℃光照培养箱中培养)，分别在处理后0h、1h、3h、6h、12h和24h取样；热激温度为42℃，0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，NaCl处理用含150mM的水溶液浸泡幼苗后0h、1h、3h、6h、12h和24h取样；甘露醇处理用含20％的PEG6000水溶液浸泡幼苗后0h、1h、3h、6h、12h和24h取样；淹水处理，让发芽14天的幼苗整株浸没于单蒸馏水中，在处理0h、1h、3h、6h、12h和24h取样。上述处理取样部位均为叶片，反转录产物用于荧光定量PCR检测OsHDA710基因的表达量，所述结果如图4，由图4可知，OsHDA710基因在冷、干旱、热激、淹水、NaCl和甘露醇处理时表达量均呈上升趋势，说明这些条件能诱导OsHDA710基因的表达。

(2)分别用5μM IAA、5μM NAA、5μM 6-BA、5μM KT、5μM GA3、100μM JA和100μMABA外源激素处理发芽14天的野生型中花11幼苗：将在含有40mL生根培养基、无菌状态下发芽13天的幼苗移出无菌环境炼苗一天后，在其叶片表面喷施上述外源激素的水溶液，从喷施开始，不同时间点取样，按照实施例1中的RNA抽提方法抽提RNA，反转录后用荧光定量PCR检测OsHDA710基因的表达量，结果如图4，显示OsHDA710基因在不同植物激素处理后的表达量均上升。

D.双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性、表达量检测和CRISPR/CAS9突变体的鉴定：

(1)将实施例2，实施例3中获得的载体pU1301-OsHDA710和pCXUN-OsHDA710向水稻受体品种“中花11”转化，转化方法按照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的标准方法(例如：专利号ZL200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用；专利公开号：CN101200725A；专利授权日：2010年04月21日的专利文献)进行。所获得的T0代转基因植株命名为OE-HDA710-n或hda710-n,其中n＝1,2,3…代表转基因的不同家系。

(2)取T0代转化植株叶片抽提总DNA。DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。以叶片总DNA为模板，用PCR方法对T0代转化植株用Hn引物进行阳性检测。

所用载体引物如下：

Hn-F：5'-CTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG-3’，

Hn-R：5'-TCGATGTAGGAGGGCGTGGATAT-3’；

以上引物均由上海

生物工程技术有限公司合成

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物(GUS-LF和GUS-LR)各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为载体引物(HnF和HnR)为转化载体所特有，这样能扩增出特异条带的转基因植株即为阳性植株。对T0代阳性植株收种子(称为T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

(3)为了检测超表达植株中的目标基因的表达量，申请人采用Real-time PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。抽提了T0代转基因植株的总RNA并进行反转录，抽提用试剂为Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)，RT-PCR中反转录合成cDNA第一链，具体步骤如下：

①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2Μ,10xDNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA；

②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟；

③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)；

④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟；

⑤配混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时；

⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟；

⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；

得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测OsHDA710的表达量。试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司生产的7500。PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。Real-time PCR所用引物序列为：

OsHDA710 Realtime PCR-F：5'-ACGGGAGAAGTTGCCTTATAAC-3’

OsHDA710 Realtime PCR-R：5'-TCCTAGTGTCCAATTTGAAGAGC-3’

最终得到的T0代超表达转基因植株中OsHDA710表达结果见图5中的D图，其中标记WT代表阴性对照，OE(1-11)代表超表达转基因阳性植株不同家系的T1代植株，在所检测的11个家系中其RNA水平表达量显著上升，超表达效果较明显。

(4)为了检测超表达植株中的目标基因的蛋白水平，申请人采用免疫印迹的方法转基因T0代植株进行了分析。具体步骤如下：取2-3片水稻叶片，经液氮磨成粉末，放入1.5ml离心管中，加入0.5-1ml PEB(plant extraction buffer；50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.5％NP-40，1mM PMSF)，混匀后离心取上清，上清即为水稻叶片总蛋白。然后总蛋白通过12％的SDS-PAGE胶进行分离，通过转膜将蛋白从SDS-PAGE胶转至PV膜上，然后2％BSA(PBS，pH7.5)封闭1h，接着一抗(anti-flag，1：2000，Abcam，ab49763)、二抗(Goatanti-Mouse，1：10000，Thermo Fisher，G-21040)分别孵育1.5h，最后显影。结果如5E所示，在所检测的三个家系中，OE7中的HDA710蛋白水平最高。

(5)为了检测HDA710 CRISPR/CAS9突变体的基因型，申请人采用扩增DNA序列加测序的方法对转基因T0代植株进行了分析。取T0代转化的阳性植株叶片抽提总DNA。DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica anjaponica rice detected by RFLP analysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。以叶片总DNA为模板，用PCR方法对T0代转化植株用检测引物进行扩增。

所用载体引物如下，其中HDA710-CRISPR-F1/R1和HDA710-CRISPR-F2/R2分别为gRNA1和gRNA2对应的检测引物：

HDA710-CRISPR-F1：5'-CAACTACTACTACGGGCAGGGT-3’，

HDA710-CRISPR-R1：5'-ACGAACAAACACAAGTACGAGC-3’

HDA710-CRISPR-F2：5'-AAGAATGTATGTTGCGTAAAGAC-3’

HDA710-CRISPR-R2：5'-TGTAAATGGGAGATAGGTGTTC-3’

以上引物均由上海

生物工程技术有限公司合成

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺ 1.5μl，左、右引物(GUS-LF和GUS-LR)各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、r-Taq酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。

将最终得到的PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在DsDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)进行解码，确定转基因植株的突变基因型，结果如图5中的B图所示，为两个不同缺失突变的纯合突变体测序以及解码结果。

E.T1代性状调查、HDA710调控修饰以及表达分析：

a:OsHDA710转基因植株幼苗以及大田生长状态下表型统计分析

1)水稻种子在催芽生长21天左右，取OsHDA710超表达和CRISPR/CAS9突变体植株各2个家系以及中花11各30株，对突变体和超表达的转基因植株进行表型统计发现与野生型比超表达植株显著变矮，而突变体植株则没有明显变化(图6中的A图)。

2)水稻种子催芽后秧田生长30天左右移植大田生长至抽穗期，取OsHDA710超表达和CRISPR/CAS9突变体植株各2个家系以及中花11各30株，结果显示与野生型比较突变体和超表达植株的株高没有明显变化，但是突变体的穗子长度显著变短同时种子的结实率也显著下降(图6中的B图-D图)。

b:HDA710调控的组蛋白赖氨酸乙酰化修饰位点

取中花11水稻种子催芽14天后的幼苗，取500mg叶片，经液氮磨成粉末，放入1.5ml离心管中，按照EpiQuik Total Histone Extraction Kit试剂盒(Epigentek，OP-0006)抽提组蛋白。然后总蛋白通过12％的SDS-PAGE胶进行分离，通过转膜将蛋白从SDS-PAGE胶转至PV膜上，然后2％牛血清白蛋白(BSA)(PBS，pH7.5)封闭1h，接着一抗(见后面描述)(体积比为1：2000)、二抗(体积比为1：10000)分别孵育1.5h，最后显影。其中所用到的一抗为：Anti-acetyl H3(货号为ab47915；Abcam)、Anti-acetyl H4(货号为ab177790；Abcam)、Anti-acetyl H3K9(货号为ab10812；Abcam)、Anti-acetyl H3K14(货号为ab52946；Abcam)、Anti-acetyl H3K27(货号为ab4729；Abcam)、Anti-acetyl H4K5(货号为ab51997；Abcam)和Anti-acetyl H4K16(货号为ab109463；Abcam)；二抗为Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(货号为ab6721；Abcam)。结果如图7所示，突变HDA710导致组蛋白H4K5和H4K16位点的乙酰化修饰水平显著上升，同时超表达植株中这两种修饰的水平显著下降。

c:NaCl处理转基因植株表型统计及分析

1)水稻种子在催芽14天的中花11幼苗进行的处理，取OsHDA710超表达和CRISPR/CAS9突变体植株各2个家系以及中花11各30株，置于含有150mM NaCl的水溶液浸泡幼苗(使溶液刚好没过根部)，两天后进行表型统计，结果显示突变体oshda710生长影响较小表现为植株鲜重最大，继续处理到第四天然后去除NaCl，把植株转移到正常培养条件，让植株继续正常生长，到第十天进行存活率统计，结果显示突变体的存活率最高，而超表达则相反，存活率最低(见图8)。

d:ABA处理转基因植株表型统计及表达差异分析

1)将T1代种子OsHDA710超表达和CRISPR/CAS9突变体植株各2个家系以及中花11各40粒种子置于含有3μmol/L和5μmol/L的ABA生根培养基的平皿上发芽24h，之后开始统计，然后每隔12h统计一次，一直统计到发芽120h，结果显示正常情况下，三者发芽率没有显著区别，外源添加ABA可以显著抑制超表达和野生型种子的萌发，而突变体则影响较小，表明OsHDA710基因表达可以增强种子发芽期间对ABA的敏感性。

2)取野生型(中花11)、超表达及CRISPR/CAS9突变体的种子分别在的MS基本培养基上发芽3天后，转移到含3μmol/L和5μmol/L的ABA培养液中，处理9天，然后统计植株的地上高度，发现突变体的株高明显大于对照组，而超标达株高则明显低于对照组，表明突变OsHDA710能增强水稻幼苗对ABA的抗性。结果如图9中的A图和图9中的B图。

3)野生型(中花11)和CRISPR/CAS9突变体种子分别在的生根培养基上发芽12天后，转移到含5μmol/L的ABA培养液中，处理12h，然后取叶片，抽提RNA，然后qPCR检测表达量。结果检测显示，在ABA处理下，与野生型(中花11)相比参与抗逆反应的基因OsLEA、OsABI5和OsbZIP72其表达量在突变体hda710中显著上调(图9)。

Real-time PCR所用引物序列为：

OsBZIP72-F:5'-AGACGGTGGACGAGGTATGG-3’，

OsBZIP72-R:5'-CGCAGCGGGTGGATTTT-3’；

OsABI5-F:5'-CGGCAGTCGTCAATCCTCTC-3’，

OsABI5-R:5'-TGTTAGCCACAAACTCGTCCAT-3’；

OsLEA3-F:5'-CTCCAACAGGCGAGTGAGC-3’，

OsLEA3-R:5'-CGGTGGCAGAGGTGTCCTT-3’。

特别说明：本发明专利申请得到“国家自然科学基金面上项目(31730049)和国家自然科学基金重点项目(31730049)"的资助。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsHDA710表观调控因子基因在水稻发育和抗逆中的应用

<141> 2020-09-14

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6096

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(6096)

<400> 1

atcgcggcat cgctcgcctc ctctgcttcg cttccttctc cagcaagcac ccgaccacaa 60

cacacacgcg agctcctcga cctcgagaga gagagaaaac ccaaccccga attcggcggc 120

ggaggcggag gcagcggcga tggacccctc gtcggcgggc gccggcggca actcgctggc 180

gtcggcgtcg tgcggcgacg cgcagaagcg gcgggtgtgc tacttctacg atccggaggt 240

gggcaactac tactacgggc agggtcaccc gatgaagccc caccgcgtga ggatgaccca 300

cgcgctgctc gcccactacg gcctcctcgc cccggccaag atgcaggtgc tccgcccgct 360

ccccgcccgc gaccgcgacc tctgccgctt ccactccgac gactacgtcg ccttcctccg 420

cgccgtcacc ccggagaccc agttcgacca gatccgctcc ctccgccgct tcaacgtcgg 480

cgaggactgc cccgtcttcg acggcctcta cgcctactgc cagacctacg cgggggcctc 540

cgtcggcgcc gccgtcaagc tcaaccacgg cacccacgac atcgccatca actggtccgg 600

cgggttgcac cacgccaaga agtccgaggc ctccggcttc tgctacgtca acgacatcgt 660

cctcgccatc ctcgagctcc tcaagctcca tgaggtgacg tcatcctatt ccgctcgtac 720

ttgtgtttgt tcgttttttt ttttgggttc gtttaatgtt tcgaatagat taggagtagt 780

actatttgga tgggtggttt gtttaatttt tcgaatagat agattacttg atgtgtaagt 840

tgggtgggtc aatgaagacg gaagcaaaaa tcatcttgac ttctttctct tcagttgctc 900

tgattttgtc gtgtacagtt cgatcgatct tccgctaaat tttgatcggt aggaaatatt 960

aatcatgtgt aagtgtaaat gaaatggcta tctgtagaca gaaattggat taactttttg 1020

ctcaacttaa tctcatatat attcgttacg cgattacaca ttgtctgaat agtatgtcat 1080

attggcacgt gcagaattat gtattaacaa atttattcag atttttgttt tcctggataa 1140

aagctcatgt acgttgatga atcatgctga atgtatgtat gtatttctag ttgatataat 1200

gatgttccaa agagagagaa tgatatgacg acgaacttgc tgcgtttgtt attaaatttg 1260

cccatgatgt acactgttaa agctatgtac tccctccgtc caaaaaaaaa aagtgaatct 1320

aggactggat gtgatatatt atagtacaat gtctagattc gttgtactag gatgtgtcac 1380

atccagtact aggttggttt tttatgggac gatggagtac gacgtacaca attagaatgt 1440

tcattggacg gttcatgata agagattgat ttgattgaaa cgtattcaga acaagaggtg 1500

attaatcaga cagatctgaa gaatgtatgt tgcgtaaaga caatcctaga ttatcatgaa 1560

cagttgaaag tttgaaaaca gatcagatgt tttttcccct atttggtcta gttgtcttct 1620

tgtgctaaac cactaatatg ctgtcttcat atttacagcg agttctgtat attgatattg 1680

atatccatca tggagatgga gttgaggagg cattctacac aacaaacagg gttatgacag 1740

tctcatttca caagtttggg gattatttcc cgggaacagg ggacatccgc gatattgggt 1800

attcagaagg gaagtattac tgcctgaatg tcccgctgga tgatggaatt gatgatgaca 1860

gctaccagtc catcttcaag ccgatcatca gcaaagtcat ggagatgtat cgtcctggtg 1920

cagtcgtgct tcagtgcggc gctgattcgt tgtccggtga taggttgggc tgtttcaatc 1980

tctcaggcaa aggtcatgct gaatgtgtta agttcatgag gtctttcaat gttccgttgc 2040

ttcttcttgg tggtggtgga tataccataa gaaatgttgc acgctgctgg tgttacgagg 2100

tatctatact ttcccccgtt tttttttcct tatgccttta acaaacaatt aattaattct 2160

attaattatg gatgacaaag caaagccatg agctcggtaa tgtgttagaa cctaatttgc 2220

ttttgtgttt ccactttgtt ccttgctcag catcaagaac ttgtcttcta gtagttggta 2280

cctactgcct ggctttgttt attgatccat gttgctgtaa ttttacaatc accaaactaa 2340

gattttggtt tgtactgagc agatgactga aatgcacaga acacctatct cccatttaca 2400

tgtaatgctt aatgtattta ttttctactc tgtttcattc aaatgcatta atttgtgaga 2460

acttgtgcag taacaaatca tccggtgttt ctcaaagcat taaagtgtgg ttatttttaa 2520

acagataagt atcaggcaag gcactgctag ctaactgtta acccttgcaa aatcatatgc 2580

ttcaggccac cacctgttcc tcagttgtta gctttcatca gagatgtctt taataaatta 2640

gcaacccaaa atctggtctc tttggacctt gcaagcctgg tttcgttgcc ttttgtgaat 2700

ttataaatct gaacacacaa caggctaaac atggcgaaca agtgtgaatg gctgcactta 2760

tgcttgcttg agtaaattat ctcttatatc aggaacacct gttgctacag ctatggtttt 2820

atcctctgac tgtttatttg gttttttatt tggccagaca ggagttgcac ttggtgaaga 2880

gctacgggag aagttgcctt ataacgagta ttatgaatat tttggtccag aatacagtct 2940

ttacgttgca gcaagtaaca tggagaacag aaatacaaac aagcaattgg aggaaataaa 3000

atgcaacatt ctggacaatc tctcaaaact tcaacatgct cctagtgtcc aatttgaaga 3060

gcgaattcct gaaacaaagc tacctgaggt gagtctccag gcttcctaat attataagca 3120

tgaaaaaaaa agatgtcttg gaagtgataa ctcaagggct gactgaatgt attcgtgtcc 3180

tgtacatatg tgctcattat tcagccagat gaagatcaag atgatccaga tgaaaggcac 3240

gaccctgact ctgatatgct gttggatgat cacaaaccta tgggacactc agcaaggtat 3300

ctatttttcc tttttctaaa agctgtatta aattttgttt aattctgtgc cctgcctcat 3360

gttatatttt catttagaag ccttattcac aacatcggag ttaagagaga aattactgaa 3420

acagagacca aagatcaggt accttttcct cagttcattc caatgagcgg tgctgtcctt 3480

tctcattcat aaatttcaac acacgacgtc caccatttta ttttgagatg tctccttttt 3540

agctaaatcc ttagaactaa cagtatactt actccattct tttattaaca tgtgcccttt 3600

tgtttaaggg gctattgctt atttgacccc tttttgaatc ctaactacca atttgaccct 3660

actttttaga gtttacttat ttgaccctcc ttttcagaaa cgaagctccc gtctgaccct 3720

gtttccatta gtccgttaag ttttaattta aaacaaaaaa aaagaaatac aactaatatt 3780

cataataccc agaataccgt tagaaaaccc tatgcatcca ccaaacccta tccacatttc 3840

tctccttgcg gcgacggcgg cgacttgcgg cgagacggcg agccggtgcc gccaccccct 3900

cagatcggcg ccgccctggt gacgacgacg atgagccggc accggcccta gtgacgacga 3960

cgatgagctg gcaccggccc tagtgacgat gacgacgacg aggagtggcg gcggcggctc 4020

atcgacgacg aagagccgaa gccggcgccc tgctgacgag gacgaggacg acgacgaaga 4080

gccggagccg gcgccgccac cccctcagat ctggcgccac cgccgctgcg tcctccctcc 4140

ttccgcacgc ttgcgccagc gccggccccc tcccccgcct cctccctcct tccgggcgct 4200

tgcgccgctg ccgccgtcgc cacctcctcc ctccttccgc tcgcctgcgc cgccgtcgtt 4260

cctccctccc tccacgagcc aggacggccg ctcgccccct ccgtgcgccc ccgccgcaac 4320

tcaccccctc cgtcagccgc cgctgcctcc ctccgccccc tctccctcag ccccctcaaa 4380

gcgccgccgc cgccggccca tcagtcgccg ccccgtggag gagaggagaa gagaagagaa 4440

gagagaagag aggagaggag aagaaggaac tgcgggtggg tcccacatgt aatagagtca 4500

aatgagtaag gacaaaagag acattttgtg cttcagttaa caccgttaga tgcccttaac 4560

agaacagggt catacgggag cttcgttttt gaaaaggagg gtcaaataag caaactttaa 4620

aaagtagggt caaattggta gttagggctc aaaacggggt caaataagca attgtcccgt 4680

ttaaagaagg tggcattccc cttttgggtt tatttatata cttgctccgt ttcatattat 4740

aagtcgtttg acttttttcc tagtcaattt tttttagttt gtccaaattt ataaaaaaat 4800

atattagtat tttcagcata aaacaaacat gttatcaaaa tgtattcagt gtaagattta 4860

ataaaactag tatggtattt tagattttgc tatttttttc tataaatttg gtcaaactta 4920

gttaagtttg attaggaaaa aggttaaatg acttataata tgaaagtatg gaacgtaggg 4980

agtaacaatg aggttttctt tatagaattc tgttcttgct ggcttgctgc tatatgtgaa 5040

ttataatctt atccatatcg gtgctagaaa catagtgaaa ttctcttgtg ctgttgagtt 5100

gtggaggaag actggtgtgc tgatgaaaac atgtgctcat catgtattga cattttcatc 5160

taaatgaaat ttaaggccgc attggttgta ccttttttta tctcacagga tttttttttg 5220

ggttgtgcat aatctcatcc agattattta gaatctacct tgcatttatg cgaaacgagc 5280

cctttgaaat tcttgcagca cggacttgca tctttgtgtg atcttttgtt gaactaacac 5340

tttctgattt acacattctg cagcatggta agagattaac aactgaacat aaagtaccag 5400

aaccgatggc agacgatctt ggttcctcca agcaagttcc tgtaagtcgt cgtcttctct 5460

atccatctgc aaatccatag cacaaactct gcattgcata atgcctatat ggatatagaa 5520

ttatccaaca ccatggttta atctgctcta acaaatcttt tcatcttcac attgcttatc 5580

aacgatagac tgcggatgca aattcgatgg ccatcaacgc gccaggcaac gccaagaatg 5640

aaccgggaag ctcactatga actaacccac ttcaggccac cagctcttat gccacggatt 5700

cctgcatgct attagttact tactccgagg tgttgtatga ctgtttcttc tgtaggagtt 5760

tacaaattac aactgtttct tttgttgaag aattccaaag tgtccaggca atactggacg 5820

tggagacatt agtctgatca atgtactgca gagtacagaa catgtaacat gaaccaagtt 5880

acagtgtata gtcttttaga ctgttagatg gaactttcag gcgaaatgcc tgtgcctact 5940

tgtgtgtgct ctctgttggt tgtttttcgt taaaatattt tgttccggtt tatcatgtac 6000

ttcctacgtt tttatgtatg agttgtttta aagagacaaa taaatctatt ttttaattta 6060

taatagttaa tacttaatta attatgtgct agtaaa 6096

<210> 2

<211> 1530

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1530)

<400> 2

atg gac ccc tcg tcg gcg ggc gcc ggc ggc aac tcg ctg gcg tcg gcg 48

Met Asp Pro Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gly Asn Ser Leu Ala Ser Ala

1 5 10 15

tcg tgc ggc gac gcg cag aag cgg cgg gtg tgc tac ttc tac gat ccg 96

Ser Cys Gly Asp Ala Gln Lys Arg Arg Val Cys Tyr Phe Tyr Asp Pro

20 25 30

gag gtg ggc aac tac tac tac ggg cag ggt cac ccg atg aag ccc cac 144

Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His

35 40 45

cgc gtg agg atg acc cac gcg ctg ctc gcc cac tac ggc ctc ctc gcc 192

Arg Val Arg Met Thr His Ala Leu Leu Ala His Tyr Gly Leu Leu Ala

50 55 60

ccg gcc aag atg cag gtg ctc cgc ccg ctc ccc gcc cgc gac cgc gac 240

Pro Ala Lys Met Gln Val Leu Arg Pro Leu Pro Ala Arg Asp Arg Asp

65 70 75 80

ctc tgc cgc ttc cac tcc gac gac tac gtc gcc ttc ctc cgc gcc gtc 288

Leu Cys Arg Phe His Ser Asp Asp Tyr Val Ala Phe Leu Arg Ala Val

85 90 95

acc ccg gag acc cag ttc gac cag atc cgc tcc ctc cgc cgc ttc aac 336

Thr Pro Glu Thr Gln Phe Asp Gln Ile Arg Ser Leu Arg Arg Phe Asn

100 105 110

gtc ggc gag gac tgc ccc gtc ttc gac ggc ctc tac gcc tac tgc cag 384

Val Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Ala Tyr Cys Gln

115 120 125

acc tac gcg ggg gcc tcc gtc ggc gcc gcc gtc aag ctc aac cac ggc 432

Thr Tyr Ala Gly Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Lys Leu Asn His Gly

130 135 140

acc cac gac atc gcc atc aac tgg tcc ggc ggg ttg cac cac gcc aag 480

Thr His Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Leu His His Ala Lys

145 150 155 160

aag tcc gag gcc tcc ggc ttc tgc tac gtc aac gac atc gtc ctc gcc 528

Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala

165 170 175

atc ctc gag ctc ctc aag ctc cat gag cga gtt ctg tat att gat att 576

Ile Leu Glu Leu Leu Lys Leu His Glu Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile

180 185 190

gat atc cat cat gga gat gga gtt gag gag gca ttc tac aca aca aac 624

Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asn

195 200 205

agg gtt atg aca gtc tca ttt cac aag ttt ggg gat tat ttc ccg gga 672

Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Tyr Phe Pro Gly

210 215 220

aca ggg gac atc cgc gat att ggg tat tca gaa ggg aag tat tac tgc 720

Thr Gly Asp Ile Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Glu Gly Lys Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

ctg aat gtc ccg ctg gat gat gga att gat gat gac agc tac cag tcc 768

Leu Asn Val Pro Leu Asp Asp Gly Ile Asp Asp Asp Ser Tyr Gln Ser

245 250 255

atc ttc aag ccg atc atc agc aaa gtc atg gag atg tat cgt cct ggt 816

Ile Phe Lys Pro Ile Ile Ser Lys Val Met Glu Met Tyr Arg Pro Gly

260 265 270

gca gtc gtg ctt cag tgc ggc gct gat tcg ttg tcc ggt gat agg ttg 864

Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu

275 280 285

ggc tgt ttc aat ctc tca ggc aaa ggt cat gct gaa tgt gtt aag ttc 912

Gly Cys Phe Asn Leu Ser Gly Lys Gly His Ala Glu Cys Val Lys Phe

290 295 300

atg agg tct ttc aat gtt ccg ttg ctt ctt ctt ggt ggt ggt gga tat 960

Met Arg Ser Phe Asn Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr

305 310 315 320

acc ata aga aat gtt gca cgc tgc tgg tgt tac gag aca gga gtt gca 1008

Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Gly Val Ala

325 330 335

ctt ggt gaa gag cta cgg gag aag ttg cct tat aac gag tat tat gaa 1056

Leu Gly Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu

340 345 350

tat ttt ggt cca gaa tac agt ctt tac gtt gca gca agt aac atg gag 1104

Tyr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Leu Tyr Val Ala Ala Ser Asn Met Glu

355 360 365

aac aga aat aca aac aag caa ttg gag gaa ata aaa tgc aac att ctg 1152

Asn Arg Asn Thr Asn Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Cys Asn Ile Leu

370 375 380

gac aat ctc tca aaa ctt caa cat gct cct agt gtc caa ttt gaa gag 1200

Asp Asn Leu Ser Lys Leu Gln His Ala Pro Ser Val Gln Phe Glu Glu

385 390 395 400

cga att cct gaa aca aag cta cct gag cca gat gaa gat caa gat gat 1248

Arg Ile Pro Glu Thr Lys Leu Pro Glu Pro Asp Glu Asp Gln Asp Asp

405 410 415

cca gat gaa agg cac gac cct gac tct gat atg ctg ttg gat gat cac 1296

Pro Asp Glu Arg His Asp Pro Asp Ser Asp Met Leu Leu Asp Asp His

420 425 430

aaa cct atg gga cac tca gca aga agc ctt att cac aac atc gga gtt 1344

Lys Pro Met Gly His Ser Ala Arg Ser Leu Ile His Asn Ile Gly Val

435 440 445

aag aga gaa att act gaa aca gag acc aaa gat cag cat ggt aag aga 1392

Lys Arg Glu Ile Thr Glu Thr Glu Thr Lys Asp Gln His Gly Lys Arg

450 455 460

tta aca act gaa cat aaa gta cca gaa ccg atg gca gac gat ctt ggt 1440

Leu Thr Thr Glu His Lys Val Pro Glu Pro Met Ala Asp Asp Leu Gly

465 470 475 480

tcc tcc aag caa gtt cct act gcg gat gca aat tcg atg gcc atc aac 1488

Ser Ser Lys Gln Val Pro Thr Ala Asp Ala Asn Ser Met Ala Ile Asn

485 490 495

gcg cca ggc aac gcc aag aat gaa ccg gga agc tca cta tga 1530

Ala Pro Gly Asn Ala Lys Asn Glu Pro Gly Ser Ser Leu

500 505

<210> 3

<211> 509

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Asp Pro Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gly Asn Ser Leu Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Cys Gly Asp Ala Gln Lys Arg Arg Val Cys Tyr Phe Tyr Asp Pro

20 25 30

Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His

35 40 45

Arg Val Arg Met Thr His Ala Leu Leu Ala His Tyr Gly Leu Leu Ala

50 55 60

Pro Ala Lys Met Gln Val Leu Arg Pro Leu Pro Ala Arg Asp Arg Asp

65 70 75 80

Leu Cys Arg Phe His Ser Asp Asp Tyr Val Ala Phe Leu Arg Ala Val

85 90 95

Thr Pro Glu Thr Gln Phe Asp Gln Ile Arg Ser Leu Arg Arg Phe Asn

100 105 110

Val Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Ala Tyr Cys Gln

115 120 125

Thr Tyr Ala Gly Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Lys Leu Asn His Gly

130 135 140

Thr His Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Leu His His Ala Lys

145 150 155 160

Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala

165 170 175

Ile Leu Glu Leu Leu Lys Leu His Glu Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile

180 185 190

Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asn

195 200 205

Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Tyr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Gly Asp Ile Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Glu Gly Lys Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Leu Asn Val Pro Leu Asp Asp Gly Ile Asp Asp Asp Ser Tyr Gln Ser

245 250 255

Ile Phe Lys Pro Ile Ile Ser Lys Val Met Glu Met Tyr Arg Pro Gly

260 265 270

Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu

275 280 285

Gly Cys Phe Asn Leu Ser Gly Lys Gly His Ala Glu Cys Val Lys Phe

290 295 300

Met Arg Ser Phe Asn Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr

305 310 315 320

Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Gly Val Ala

325 330 335

Leu Gly Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu

340 345 350

Tyr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Leu Tyr Val Ala Ala Ser Asn Met Glu

355 360 365

Asn Arg Asn Thr Asn Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Cys Asn Ile Leu

370 375 380

Asp Asn Leu Ser Lys Leu Gln His Ala Pro Ser Val Gln Phe Glu Glu

385 390 395 400

Arg Ile Pro Glu Thr Lys Leu Pro Glu Pro Asp Glu Asp Gln Asp Asp

405 410 415

Pro Asp Glu Arg His Asp Pro Asp Ser Asp Met Leu Leu Asp Asp His

420 425 430

Lys Pro Met Gly His Ser Ala Arg Ser Leu Ile His Asn Ile Gly Val

435 440 445

Lys Arg Glu Ile Thr Glu Thr Glu Thr Lys Asp Gln His Gly Lys Arg

450 455 460

Leu Thr Thr Glu His Lys Val Pro Glu Pro Met Ala Asp Asp Leu Gly

465 470 475 480

Ser Ser Lys Gln Val Pro Thr Ala Asp Ala Asn Ser Met Ala Ile Asn

485 490 495

Ala Pro Gly Asn Ala Lys Asn Glu Pro Gly Ser Ser Leu

500 505

Claims

1.一种表观调控因子基因OsHDA710在水稻发育和抗逆中的应用，其特征在于，所述表观调控因子基因OsHDA710的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.如权利要求1所述表观调控因子基因OsHDA710水稻发育和抗逆中的应用，其特征在于，所述的应用包括调控水稻的结实率。

3.如权利要求1所述表观调控因子基因OsHDA710水稻发育和抗逆中的应用，其特征在于，所述的应用包括水稻的抗高盐性。