CN113322260B

CN113322260B - 高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN113322260B
Application number: CN202110588378.8A
Authority: CN
Inventors: 马斯琦; 李义强; 张成省; 吕林; 徐宗昌; 孟晨
Original assignee: Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Current assignee: Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113322260A

Abstract

本发明属基因工程技术领域，具体涉及高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用。高粱基因SbbZIP51的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。高粱抗逆性基因SbbZIP51编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO.2所示氨基酸衍生的氨基酸序列。高粱SbbZIP51可以调节植株的耐盐性，在拟南芥中超量表达后提高植株对ABA的敏感性、对盐处理的抗性、对甘露醇(渗透胁迫)处理的抗性。

Description

高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用。

背景技术

土地盐渍化是世界范围内广泛存在的问题，盐渍土地面积已超过陆地面积的6％，另外约20％的可用耕地已发生或正在发生不同程度的盐渍化(Deng et al.,2015；Yang etal.,2019)。土地盐渍化已经严重制约着作物的生长和产量，加剧了耕地减少、人口剧增、粮食产量不足的形势。高粱作为第五大作物，具有抗旱、耐盐碱、耐瘠薄的特点，同时其生物产量大、用途广泛(可用于食用、制糖、饲用、酿酒和制造乙醇等)，是非常有潜力的粮食作物、饲料作物和能源作物(Mullet et al.,2014)。因此，创新耐盐高粱品种不仅可以提高盐渍边际土地的利用、促进相关地区传统农业的发展，还能为生物能源的开发奠定基础、促进相关新能源的开发与利用。

转基因技术是对高粱品种进行抗逆性遗传改良的重要手段，寻找高粱中可真正用于抗逆性遗传改良的基因是其中的关键。在非生物逆境应答中，转录因子是调控基因表达的主要调控因子，发挥着重要的作用，其中涉及bZIP、DREB2/AP2、NAC、MYB/MYC、WRKY等诸多转录因子家族，形成了十分复杂而精细的调控网络(Vishwakarma et al.,2017)。bZIP转录因子家族是真核生物中分布最广泛、最保守的转录因子家族之一。bZIP转录因子参与植物的多种生物学过程，包括植物的生长发育、代谢以及对生物和非生物逆境胁迫的响应等。bZIP结构域主要由碱性区域(basic region)和亮氨酸拉链区域(leucine zipper)构成。碱性区域包含16个氨基酸、核定位信号以及N-X₇-R/K结构域，主要负责与特异DNA的结合；亮氨酸拉链区域由L-X₆-L-X₆-L结构域组成，直接参与到bZIP蛋白的二聚体化(Kang et al.,2002)。

根据bZIP结构域的特性，在拟南芥的基因组中鉴定出75个bZIP家族成员，在水稻中鉴定出86个bZIP类的转录因子(Xiang et al.,2008)。水稻中，编码bZIP类转录因子的OsABI5基因的表达量在ABA处理和盐处理后上升，在干旱和低温的处理后下降。OsABI5作为负调控因子参与非生物逆境应答，超量表达OsABI5导致植株的耐盐性降低，沉默其表达后的植株耐盐性提高(Zou et al.,2008)。OsABF1的表达受到多种非生物逆境的诱导，例如盐、干旱、氧化胁迫、低温胁迫等。OsABF1的突变体与野生型相比，对干旱和盐的抗性降低(Amir Hossain et al.,2010)。OsbZIP52作为负调控因子参与胁迫应答，其表达量在低温处理下显著上升，超量表达该基因后导致许多逆境应答的基因下调表达，植株产生对低温胁迫、干旱胁迫敏感的表型(Liu et al.,2012)。水稻基因OsbZIP71的表达受到干旱、ABA处理、甘露醇处理的强烈诱导，而在盐胁迫处理下表达量下降。OsbZIP71通过调控不同的靶基因参与到不同的逆境应答中，在水稻中超量表达OsbZIP71后可以提高水稻对干旱、盐、渗透胁迫的抗性，沉默表达后可以降低植株对逆境胁迫的敏感性(Liu et al.,2014)。水稻OsbZIP23的表达受到干旱、盐等逆境胁迫的诱导，超量表达OsbZIP23可以显著提高水稻对逆境的耐受力(Xiang et al.,2008)。

随着高粱全基因组测序完成，高粱的bZIP转录因子家族已被初步鉴定至少具有92个家族成员，但其功能还知之甚少。因此，发现高粱在非生物逆境应答中具有重要的调节功能的基因具有重要意义。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提供克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种高粱耐盐基因SbbZIP51的应用。

本发明由如下技术方案实现的：一个高粱耐盐基因SbbZIP51，所述高粱耐盐基因SbbZIP51的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了所述的高粱耐盐基因SbbZIP51的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO.2所示氨基酸衍生的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供含有所述高粱耐盐基因SbbZIP51的载体。

本发明还提供了含有所述载体的宿主。含有所述基因或其特异性片段的转基因植物。

本发明还提供了所述和/或编码的蛋白在调节植物耐盐中的应用。

所述的应用是在植物体内过量表达高粱SbbZIP51基因，提高植物耐盐性。

所述的高粱抗逆性基因SbbZIP51在调节植物耐盐碱性中的应用。所述的应用是在植物体内过量表达高粱SbbZIP51基因，对植株的生长发育没有明显的影响，但可以提高植株对脱落酸ABA的敏感性、对盐处理的抗性和对甘露醇(渗透胁迫)处理的抗性。

本发明的高粱基因SbbZIP51是从高粱中克隆到的一个基因。

一种培育抗逆性植物的方法，包括如下步骤：

用所述核苷酸序列转化植物细胞；

将被转化的植物细胞再生为植物；

培养再生的植物并使所述核苷酸序列过量表达。

一种高粱抗逆性基因SbbZIP51转基因植株的检测试剂盒，含有引物的序列如下所示：

pRI101-AN-F：CTCTAGATACATCACAATCACAC；

pRI101-AN-R：TGTTTGAACGATCGGGGAAATTC；

PCR扩增出扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出这个片段则说明是转基因阴性植株。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

因此，本发明的高粱抗逆性基因SbbZIP51的编码蛋白还包括如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，且具有同等活性的由SEQ ID NO.2所示氨基酸衍生的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明发现bZIP基因SbbZIP51(根据其在染色体上的位置命名)的表达量在盐碱胁迫后升高，SbbZIP51在拟南芥中超量表达后提高植株对ABA的敏感性、对盐处理的抗性、对甘露醇(渗透胁迫)的抗性。高粱基因SbbZIP51可以提高植株的耐盐性，在高粱盐胁迫应答中具有重要的功能。

附图说明

图1为SbbZIP511在不同盐浓度胁迫下的表达量分析图；

图2为SbbZIP51在不同逆境胁迫下的表达量分析图；

图3为SbbZIP51超量表达载体结构示意图；

图4为SbbZIP51转化拟南芥后的抗性分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：SbbZIP51逆境条件下表达量的变化

利用qRT-PCR技术发现有一个bZIP家族成员的表达量随着土壤含盐量的增加而显著升高(如图1)。这个基因是位于第四染色体上的Sobic.004g309600，根据其在高粱染色体上的位置将其命名为SbbZIP51。

同时，检测了在不同逆境胁迫下SbbZIP51的表达量，分别用100μM ABA(脱落酸)、10μM JA(茉莉酸)、10mM Na₂CO₃(碱)、200mM NaCl(盐)处理高粱幼苗，在0、1、3、6小时取样后提取RNA进行反转录后进行qPCR检测。结果如图2。

具体方法为：选用Btx623材料作为表达谱分析的材料。分别用100μM ABA(脱落酸)、10μM JA(茉莉酸)、10mM Na₂CO₃(碱)、200mM NaCl(盐)处理高粱14天幼苗，在0h，1h，3h，6h取组织材料的RNA样品，总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照TRIZOL试剂说明书，利用反转录酶MLV(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(SbbZIP51qF：5’-CCATGGCGATGTGTTTGCT-3’和SbbZIP51qR：5’-ACCCATTCCCGAATTGCA-3’)对SbbZIP51基因进行特异的PCR扩增。

同时用引物(Sbactin-qF：5’-GTGCGACGTGGATATTAGG-3’和Sbactin-qR：5’-GGAGCCAAGGCAGTGATT-3’)对高粱actin基因做特异扩增(扩增产物长66bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：50℃2min；95℃2min；95℃3sec，60℃30sec，40个循环。

反应过程中进行荧光检测实时定量分析。

实施例2：SbbZIP51基因的分离与克隆

设计引物SbbZIP51-FL-F：5’-GGggtaccATGAATTTCCCGGGAGGAAG-3’、SbbZIP51-FL-R：5’-CGggatccTTACCACGGACCTGTCAATGTC-3’。以高粱Btx623叶片cDNA作为模板，使用引物SbbZIP51-FL-F和SbbZIP51-FL-R扩增SbbZIP51基因编码的蛋白质编码区CDS的序列，扩增的序列为SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，33个循环；72℃延伸5min。

将扩增获得的PCR产物通过TA克隆的方法连入pGEM-T Easy载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得SbbZIP51的蛋白质编码区CDS的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，该克隆命名为pGEM-SbbZIP51质粒。

实施例3：SbbZIP51超量表达载体构建

将实施例2中得到的阳性克隆pGEM-SbbZIP51质粒用引物设计引物SbbZIP51-FL-F：5’-GGggtaccATGAATTTCCCGGGAGGAAG-3’、SbbZIP51-FL-R：5’-CGggatccTTACCACGGACCTGTCAATGTC-3’扩增出包含SbbZIP51基因完整编码区段的DNA片段；

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。将获得的PCR产物通过Gibson Assembly的方法连入经限制性内切酶KpnI消化的pRI101-AN表达载体，对载体进行测序确认，最终获得可用于遗传转化的SbbZIP51基因超量表达载体，如图3。

实施例4：拟南芥转化和阳性植株筛选

从大肠杆菌中提取构建好的表达载体质粒，采用电转化法转入农杆菌GV3101，步骤如下：

(1)从-80℃取出农杆菌感受态细胞置于冰上融化，加入2μL构建成功的过表达载体质粒，用移液枪吹打混匀；

(2)用移液枪将混有质粒的农杆菌吸入预冷的电击杯中，并将电击杯置于电击仪(BTX，ECM399 electroporation system)的电击槽中，2500V电压，电击5msec；

(3)电击结束后，立即在电击杯加入1mL不含任何抗生素的液体LB培养基，吹打混匀后转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm振荡培养1-2h；

(4)吸取200μL菌液，涂布于含50mg/L的Rif和50mg/L的Kan抗性的LB固体培养基上，28℃倒置培养48h。

拟南芥侵染步骤：

拟南芥侵染选在盛花期时进行，侵染时间一般为上午10:00左右，侵染方法参考滴花法(Clough and Bent,1998)进行，具体操作方法稍有改动，过程如下：

(1)侵染前一天晚上摇菌，在250mL锥形瓶中倒入80mL的LB液体培养基，加入抗生素Rif和Kan，终浓度均为50mg/L。用无菌枪头将长好的农杆菌从LB固体培养基上刮下，放于锥形瓶里，28℃，200rpm过夜振荡培养。并于当夜将需要侵染的拟南芥苗子浇足水分；

(2)次日待培养基呈现鲜亮的橙黄色时，50mL离心管收集菌体。7000rpm常温条件离心6min，弃上清；

(3)准备重悬液，5％蔗糖溶液，添加Silwet-77，使终浓度为0.02％；

(4)使用30mL重悬液重悬菌体(重悬液体积一般为摇菌体积的1/3-1/2)；

(5)菌体重悬后，倒入直径为9cm的圆形培养皿中，将拟南芥的花序完全浸入到重悬液中，前后摆动数次后取出，平放在苗盆中；

(6)将苗盆盖上盖子，置于黑暗条件下，过夜；

(7)次日清晨揭开盖子将拟南芥取出，正常生长直至收种(在此期间可根据需要再一次侵染拟南芥，两次侵染之间间隔7-10d)。

T1代转基因拟南芥阳性苗筛选：

侵染获得的拟南芥T1代种子经表面无菌化处理后铺在含Kan(50mg/L)的1/2MS培养基上，将培养基平放在培养间里。Kan筛选大约需要经过7d左右的时间，阳性苗较培养基里其它的拟南芥高挑，子叶展开并且有主根生长，将这样的苗子挑选出，种在蛭石基质里。按照正常方式进行管理，约3周左右，分单株提取拟南芥植株DNA，采用引物对：pRI101-AN-F：CTCTAGATACATCACAATCACAC；

pRI101-AN-R：TGTTTGAACGATCGGGGAAATTC；

对拟南芥进行阳性苗鉴定，进一步剔除假阳性植株。

实施例5：过表达植株耐盐表型

野生型和过表达种子经表面消毒后点播在1/2MS培养基上，置于温度24±1℃，光周期16小时光照8小时黑暗的植物培养间中生长5-7天，至根长在0.8cm左右时转移到1/2MS培养基，含100μM ABA、200mM NaCl、300mM甘露醇的1/2MS培养基上继续培养，进行抗逆性实验。生长10天左右，进行表型统计。抗性实验分析结果显示(如图4)。

附图的具体说明：

图1为SbbZIP51在不同盐浓度胁迫下的表达量分析；图中*代表显著差异，**代表极显著差异；一个基因家族的成员的表达量随着土壤含盐量从0、3‰、5‰的增加而显著升高表面该基因与抗逆性相关。

图2为SbbZIP51在不同逆境胁迫下的表达量分析；结果显示，ABA处理、NaCl处理后SbbZIP51的表达量明显的升高，Na₂CO₃处理后SbbZIP51的表达量略有升高，JA处理后表达量没有明显变化(如图2)。这些结果表明SbbZIP51不仅参与盐胁迫应答，同时还参与到碱胁迫应答中，并且很有可能是通过ABA信号传导途径参与应答调控。

图3为SbbZIP51超量表达载体结构示意图；将高粱基因SbbZIP51的核苷酸序列(红框标识)经过Kpn1酶切位点连入pRI101-AN载体。

图4为SbbZIP51在拟南芥中超量表达后的抗性分析。SbbZIP51-OE8(图中标注OE8)是实施例4中鉴定的转基因阳性苗之一，WT表示对应的野生型植株对照。SbbZIP51在拟南芥中超量表达后提高植株对ABA的敏感性、对盐处理的抗性、对甘露醇的抗性。此结果表明，SbbZIP51确实参与盐胁迫应答，且可以提高植株的耐盐性。

100μM ABA处理转基因植株相比野生型植株，转基因植株的根系、叶片长势弱，对ABA敏感(对ABA敏感，说明更容易激活其逆境应答模式，是抗性提高的表型之一)。

200mM NaCl处理转基因植株相比野生型植株，转基因植株长势明显好于野生型。

300mM甘露醇处理转基因植株相比野生型植株，转基因植株的根系、叶片均比野生型对照长势好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaatttcc cgggaggaag cgggaggcgg cagcagcagg agccggagca cctgccgccg 60

atgacgccgc tcccgctggc gcggcagggg tcggtgtact cgctcacgtt cgacgagttc 120

cagagctcgc tcggcggggc cgccaaggac ttcgggtcca tgaacatgga cgagctcctc 180

cgcagcatct ggtccgcgga ggagatacac aacgtcgcgg ccgccaacgc gtcggcggcg 240

gaccacgccc acgccgcgcg ggcgtcgtcc atccagcgcc agggctcgct caccctcccc 300

cgcacgctca gccagaagac cgtcgacgag gtctggcggg acctcgtgtg cgtcggcggc 360

ggaccctccg ccgaggctgc ggcgccgccc ccgccggccc agcggcagcc cacgctcggg 420

gagatcacgc tggaggagtt cctcgtccgt gccggcgtgg tgagggagga catgaccgcg 480

ccgccgcccg tactgccggc gccggtgtgc ccgccacctc ctccgcagca gacaatgctg 540

tttccccatg gcgatgtgtt tgctcccttg gtgcctccgc tgcaattcgg gaatgggttg 600

gtgtcggggg ctgtcggtca gcagcaggga ggtggtcctg cggccccggc ggtatcgccg 660

cggccggtga cggcaagcgg gttcgggaag atggaaggag acgacttgtc gtctctgtcg 720

ccatcaccgg ttccgtacgt tttcggtggt ggtttgagag caaggaagcc accagctatg 780

gagaaggtgg ttgagaggag gcagcgccgg atgatcaaga accgggagtc cgccgcgagg 840

tcgcgtcaaa ggaaacaggc atatatgatg gagctggaag ctgaggtggc aaaacttaaa 900

gagatgaacg atgaattgca gaagaagcag gtcgaaatgt tggagaagca aaagaatgag 960

gtcctggaga gaatgagacg acaagttgga cccaccgcaa agagaatttg tctgcggagg 1020

acattgacag gtccgtgg 1038

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Phe Pro Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gln Gln Gln Glu Pro Glu

1 5 10 15

His Leu Pro Pro Met Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Gln Gly Ser Val

20 25 30

Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Ser Ser Leu Gly Gly Ala Ala

35 40 45

Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ile Trp

50 55 60

Ser Ala Glu Glu Ile His Asn Val Ala Ala Ala Asn Ala Ser Ala Ala

65 70 75 80

Asp His Ala His Ala Ala Arg Ala Ser Ser Ile Gln Arg Gln Gly Ser

85 90 95

Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val Trp

100 105 110

Arg Asp Leu Val Cys Val Gly Gly Gly Pro Ser Ala Glu Ala Ala Ala

115 120 125

Pro Pro Pro Pro Ala Gln Arg Gln Pro Thr Leu Gly Glu Ile Thr Leu

130 135 140

Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Met Thr Ala

145 150 155 160

Pro Pro Pro Val Leu Pro Ala Pro Val Cys Pro Pro Pro Pro Pro Gln

165 170 175

Gln Thr Met Leu Phe Pro His Gly Asp Val Phe Ala Pro Leu Val Pro

180 185 190

Pro Leu Gln Phe Gly Asn Gly Leu Val Ser Gly Ala Val Gly Gln Gln

195 200 205

Gln Gly Gly Gly Pro Ala Ala Pro Ala Val Ser Pro Arg Pro Val Thr

210 215 220

Ala Ser Gly Phe Gly Lys Met Glu Gly Asp Asp Leu Ser Ser Leu Ser

225 230 235 240

Pro Ser Pro Val Pro Tyr Val Phe Gly Gly Gly Leu Arg Ala Arg Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Met Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile

260 265 270

Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Gln Arg Lys Gln Ala Tyr

275 280 285

Met Met Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu Met Asn Asp

290 295 300

Glu Leu Gln Lys Lys Gln Val Glu Met Leu Glu Lys Gln Lys Asn Glu

305 310 315 320

Val Leu Glu Arg Met Arg Arg Gln Val Gly Pro Thr Ala Lys Arg Ile

325 330 335

Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp

340 345

Claims

1.一种包含高粱基因SbbZIP51的载体在提高植物抗逆性中的应用，其特征在于：所述高粱基因SbbZIP51的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述应用是在植物体内过量表达高粱基因SbbZIP51，植物抗逆性为对ABA的敏感性、对盐的抗性、对甘露醇的抗性，所述植物为拟南芥。

2.一种培育抗逆性植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

用包含高粱基因SbbZIP51的核苷酸序列转化植物细胞；

将被转化的植物细胞再生为植物；

培养再生的植物并使所述核苷酸序列过量表达；

其中，所述高粱基因SbbZIP51的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，植物抗逆性为对ABA的敏感性、对盐的抗性、对甘露醇的抗性，所述植物为拟南芥。