CN112626084B

CN112626084B - 草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用

Info

Publication number: CN112626084B
Application number: CN202011634095.4A
Authority: CN
Inventors: 赵静; 谢兴斌; 孙培培; 方从兵; 王帅帅; 冯欢; 薛浩
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112626084A

Abstract

本发明公开了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明克隆出草莓MYB转录因子FvMYB24基因，并通过过表达转基因拟南芥抗逆试验发现，FvMYB24与植物抗盐相关，将该基因过量表达后，其表达量增高，AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3等SOS途径主要基因表达量明显增加。可见，该FvMYB24基因在植物抗盐中将具有广泛的应用。

Description

草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用

技术领域

本发明涉及一种植物分子基因工程技术，尤其涉及的是一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是一种具有较高的经济价值且栽培范围广的多年生草本果树，果实中含有丰富的维生素C、钾、多酚、叶酸、纤维和抗氧化剂，是一种营养价值很高的水果，并在各个国家小浆果类的生产当中，草莓的产量和栽培面积均居于首要地位。

盐渍化是指水溶性盐分在土壤中或土壤中的积聚，影响农业生产，环境健康和经济效益，全球100多个国家的土壤不同程度到受盐渍化影响。草莓被认为是对盐分最敏感的作物之一，不同的栽培品种之间其耐受性差异较大。过量的盐分会导致草莓叶片边缘烧伤和坏死，养分失衡，产生离子毒性，果实品质和产量严重，甚至在长期盐分胁迫条件下，引起植物死亡。我国约有15亿亩各种盐渍化土壤，另外，近年来由于设施栽培迅速普及、种植种类过于单一以及耕种措施的不合理等因素，土壤盐渍化面积和土壤中盐含量也在逐年增加，盐胁迫己成为影响农业生产最重要的环境胁迫因子。

拟南芥是一种不起眼的开花植物，被用作经典植物遗传学实验的模式植物已有45年之久，用来解决植物生理学、生物化学和发育方面的问题，被誉为“植物中的果蝇”。拟南芥因其植株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗传操作简便，使它广泛地用于基因研究，在粮食增产、农作物耐逆、环境保护等领域做出了重要贡献。

如何提高在高盐环境中生长的植物的抗盐能力，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：如何提高植物的抗盐性能，提供了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明提供了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达载体。

本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的宿主菌。

本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因在表达AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因中的应用。

一种所述的草莓MYB转录因子FvMYB24基因在植物抗盐中的应用。

一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在植物抗盐中的应用，采用花序浸染法侵染植物。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明克隆出草莓MYB转录因子FvMYB24基因，并通过过表达转基因拟南芥抗逆试验发现，FvMYB24与植物抗盐相关，将该基因过量表达后，其表达量增高，AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3等SOS途径主要基因表达量明显增加。可见，该FvMYB24基因在植物抗盐中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是在‘Hawaii4’草莓果实中克隆得到FvMYB24；

图2是不同盐浓度的1/2MS平板上生长七天的生长量结果图；

A：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在0mM NaCl的1/2MS平板上；

B：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在75mM NaCl的1/2MS平板上；

C：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在150mM NaCl的1/2MS平板上；

D：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在200mM NaCl的1/2MS平板上；

图3是过表达转基因拟南芥株系SOS途径主要基因的表达结果图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

以NCBI中搜索到的草莓MYB24基因序列为模板，进一步设计引物；以“Hawaii4”草莓大绿期果实的cDNA为模版，以MYB24-F为上游引物，以MYB24-R为下游引物，进行PCR反应，克隆得到FvMYB24基因，转化pMD19-T载体，提取质粒备用。本实施例使用的“Hawaii4”草莓为安徽农业大学种质资源圃采集。

一、转化步骤如下：

(1)连接产物转化大肠杆菌感受态：重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42℃的热击处理90s，促进吸收DNA，然后在37℃非选择LB液体(未添加抗生素)培养基中震荡培养45min，均匀地涂布在添加氨苄青霉素(Amp)抗生素的固体培养基中37℃过夜培养。

(2)挑取单克隆，重新进行活化，即在新的含Amp抗生素的固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃过夜培养。

(3)挑取菌落，按照上述PCR反应体系进行菌落PCR反应检测。

(4)根据菌落PCR结果，挑取菌落，置于添加Amp的液体LB培养基中震荡培养12h，送去上海生工生物工程有限公司测序。

选取测序正确的单菌落，放入(20mLLB+20uLAmp)的LB液体培养基，37℃摇床摇12～16h，提质粒。

二、提质粒步骤如下：

(1)取1～4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清。

(2)加250μL Buffer S1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块(确认Buffer S1中已加入RNaseA)。

(3)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

(4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转4-6次，12000×g离心10min。

吸取步骤(4)中的离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液。

将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液。

将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液，重复一次。

将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。

将制备管移入新的1.5ml中，在制备管膜中央加50～80μL Eluent或去离子水，室温静置3～5min，12000×g离心1min。

MYB24-F：ATGGCTGGTGTTGCAAACAGTG，

MYB24-R：TCACATCCCCTGCATGTTCCATA。

PCR体系为如表1所示：

表1 PCR反应体系

PCR程序为：

PCR反应条件:

如图1所示，‘Hawaii4’草莓果实中克隆得到FvMYB24基因序列全长852bp，编码248个氨基酸。其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

将实施例1得到的FvMYB24基因，转化pMD19-T载体，提取质粒；以FvMYB24-pCXSN-F和FvMYB24-pCXSN-R为扩增引物，以pMD19-T-FvMYB24质粒为模板进行PCR反应，回收目的基因产物。将目的基因与pCXSN-FLAG载体进行连接。16℃连接12h后热激法转化大肠杆菌感受态。提取验证正确的菌株质粒，冻融法转化农杆菌GV3101。菌落PCR鉴定。

具体如下：

采用pCXSN-FLAG过量表达载体进行重组构建，在FvMYB24的5’端选取20bp左右的片段设计引物，并在特异引物前加入一个碱基A，作为目标片段的上游引物；在FvMYB24的3’端选取20bp左右的片段设计引物，作为目标片段的下游引物。引物信息如下：以MYB24-pMD19-T为模板扩增得到目标片段，PCR产物经回收后，经Soultion1连接至pCXSN-FLAG载体，构建成目的载体。选取菌落PCR反应后正确的单克隆菌株，提取质粒并以pCXSN-FLAG载体自身上游引物pCXSN-FLAG-F和MYB24下游引物FvMYB24-pCXSN-R进行PCR验证。

引物如下：

FvMYB330-pCXSN-F：AATGGCTGGTGTTGCAAACAG，

FvMYB330-pCXSN-R：TCACATCCCCTGCATGTTCC,

pCXSN-FLAG-F：GATTACAAGGATGATGATGAT。

PCR体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

PCR程序为：

PCR反应条件：

农杆菌转化步骤如下：

(1)从-80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

(2)每100μL感受态加1μg质粒DNA混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

(3)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；

(4)5000rpm离心三分钟收集菌，留取50μL左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天

(5)挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每300μL加入50％甘油700μL置于-80℃保存。

实施例3

如图3所示，挑选实施例2鉴定正确的单菌落采用花序浸染法侵染拟南芥，并将收取的种子种在含有25mg L-¹的1/2MS培养基上筛选阳性植株，使用T3代纯合转基因植株进行抗盐试验，具体方法如下：

(1)菌液活化：吸取100μl左右菌液加入到30ml液体LB(含Kan/Rif抗生素)中，28℃，250rpm，过夜培养；

(2)继代：活化好的的菌液按1:100的比例转移到100mL的LB中，28℃，250rpm，培养至菌液的OD600＝1.0左右；

(3)将(2)中培养好的菌液分装在50mL离心管中，5000rpm，离心5min，去除液体，加入5％的蔗糖缓冲溶液重悬菌体，使菌液浓度达到OD600＝0.6；

(4)在调好浓度的50mL离心管中，加入占总体浓度0.02％的SweetL-77，混合均匀，准备进行拟南芥侵染；

(5)侵染拟南芥：将拟南芥的花序在侵染液中浸染10s，侵染完成后将植株黑暗培养1d；一周以后进行第二次侵染；

(6)阳性植株筛选：收取的种子播种到含25mg L^-1Hyg抗生素的1/2MS培养基中，并对生长正常的植株提取DNA进行阳性鉴定，并对再次收取的种子进行重复播种，直到种植在1/2MS培养基中(含25mg L^-1Hyg)存活率为100％时，确定为纯化株系，一般T3代开始纯合，备用；

(7)表型鉴定：灭菌后的T3代种子和WT种子播种于不同盐浓度的1/2MS平板上，黑暗培养2d，进行正常培养；生长7d后对植株进行拍照，如图2所示；

(8)数据测定：将T3代纯合过表达植株与野生型提RNA做荧光定量QPCR，分析相关基因在拟南芥中的表达模式。

PCR程序如表3所示：

表3 PCR反应体系

PCR反应条件：95℃，2min；95℃，15sec；60℃，1min(50个循环)；溶解曲线。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> Fragaria × ananassa Duch.

<400> 1

atggctggtg ttgcaaacag tgcgagcata agtcctaatg aagaagagaa tgagctgaga 60

aaagggccat ggacgcttga cgaagacacc ctgctcatac attacattga aaaccacggt 120

gaaggccatt ggaatgcctt agcaaaatgt gcaggattga agaggacagg aaaaagctgc 180

agattgagat ggctgaatta cttgaaacct gacatcaagc gtgggaacct tactccacaa 240

gaacaactct tgatccttga gctccattcc aagtggggta acaggtggtc gaaaatagca 300

caacatttgc caggaagaac agacaatgag attaagaact actggagaac aagggtgcaa 360

aaacaggcac gccaacttaa tattgagtct aatagccaga ggtttcttga tgcagttcga 420

tgtttctgga tgccgacttt gcgtcagaag atggagcaaa cttcacttag tttagaccct 480

tcaccttctc cttccagtta cttaacttct cacatctctg cagctcctac tcctcctcca 540

ccaagcaaga tggtgtcaca cgtatctgat tattccctaa ttggaaattc atgcccgagt 600

cataatagtc cttcggagtc tcttatctca cagctgcctc aaattccaga acagccagca 660

agttcatcct atgcctttga agctttaaat gacagttatt atgtggacta tgacatgggg 720

ggtcttgtcc tcgaccctgt ttcagaaatg gcctctttcg acgcttcaca gtttgattgc 780

caaatgacag aaagcgattg gatgtcgaac aattacatga ctgacacttt atggaacatg 840

caggggatgt ga 852

<210> 2

<211> 283

<212> PRT

<213> Fragaria × ananassa Duch.

<400> 2

Met Ala Gly Val Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ser Pro Asn Glu Glu Glu

1 5 10 15

Asn Glu Leu Arg Lys Gly Pro Trp Thr Leu Asp Glu Asp Thr Leu Leu

20 25 30

Ile His Tyr Ile Glu Asn His Gly Glu Gly His Trp Asn Ala Leu Ala

35 40 45

Lys Cys Ala Gly Leu Lys Arg Thr Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp

50 55 60

Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Asp Ile Lys Arg Gly Asn Leu Thr Pro Gln

65 70 75 80

Glu Gln Leu Leu Ile Leu Glu Leu His Ser Lys Trp Gly Asn Arg Trp

85 90 95

Ser Lys Ile Ala Gln His Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys

100 105 110

Asn Tyr Trp Arg Thr Arg Val Gln Lys Gln Ala Arg Gln Leu Asn Ile

115 120 125

Glu Ser Asn Ser Gln Arg Phe Leu Asp Ala Val Arg Cys Phe Trp Met

130 135 140

Pro Thr Leu Arg Gln Lys Met Glu Gln Thr Ser Leu Ser Leu Asp Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ser Pro Ser Ser Tyr Leu Thr Ser His Ile Ser Ala Ala Pro

165 170 175

Thr Pro Pro Pro Pro Ser Lys Met Val Ser His Val Ser Asp Tyr Ser

180 185 190

Leu Ile Gly Asn Ser Cys Pro Ser His Asn Ser Pro Ser Glu Ser Leu

195 200 205

Ile Ser Gln Leu Pro Gln Ile Pro Glu Gln Pro Ala Ser Ser Ser Tyr

210 215 220

Ala Phe Glu Ala Leu Asn Asp Ser Tyr Tyr Val Asp Tyr Asp Met Gly

225 230 235 240

Gly Leu Val Leu Asp Pro Val Ser Glu Met Ala Ser Phe Asp Ala Ser

245 250 255

Gln Phe Asp Cys Gln Met Thr Glu Ser Asp Trp Met Ser Asn Asn Tyr

260 265 270

Met Thr Asp Thr Leu Trp Asn Met Gln Gly Met

275 280

Claims

1.一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在表达AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因中的应用，所述草莓MYB转录因子FvMYB24基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在拟南芥抗盐中的应用，所述草莓MYB转录因子FvMYB24基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用花序浸染法侵染植物。