CN116769795A - 一种甜瓜CmADF1基因及其克隆方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物分子生物学技术领域，具体公开了一种甜瓜CmADF1基因及其克隆方法和应用，所述甜瓜CmADF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甜瓜CmADF1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与现有技术相比，在低温胁迫下，本发明的甜瓜CmADF1基因过表达的遗传材料的种子还具有较高的萌发率，本发明的甜瓜CmADF1基因过表达的遗传材料的植株还具有较好的生长情况，说明本发明的甜瓜CmADF1基因能够用于调控低温对甜瓜CmADF1基因遗传材料的种子萌发和遗传材料生长。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，特别是一种甜瓜CmADF1基因及其克隆方法和应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)在全世界广泛栽培，其生产规模居世界十大水果前列，口感香甜，营养丰富，具有很高的食用价值和经济价值。中国栽培甜瓜历史悠久，总栽培面积和年产量都居世界首位，在我国北方设施内，甜瓜已成为主栽作物之一。甜瓜起源于热带，喜温耐热不抗寒，是典型的低温敏感植物。近几年，保护地栽培技术的迅速发展带来了甜瓜种植效益的大幅提升，在我国北方设施内，甜瓜已成为主栽作物之一。反季节栽培，带来了高收益，但受北方地区环境、气候和设施条件限制，冬春季设施栽培和早春露地栽培极易受到低温影响，生长发育受阻，严重影响食用品质和商用价值，不仅增加生产成本，也限制了甜瓜的提早上市，影响了经济效益的大幅提高。低温已成为影响北方寒冷地区设施甜瓜生产的主要非生物胁迫因素之一。因此，挖掘耐低温基因，进而为甜瓜耐低温品种的选育提供新基因资源，具有重要意义。
植物对寒冷等外部刺激的感知，始于质膜上的蛋白质受体。主要包括植物细胞骨架、钙信号传导和光敏色素的感知。低温胁迫下，植物细胞骨架发生变化，微管和微丝成束(orvar等，2001)。已有研究表明，微丝骨架重组在植物响应低温胁迫方面有重要作用，而微丝骨架的解聚对于植物细胞中低温诱导的基因表达是必需的。在植物细胞中，微丝骨架在面对细胞自身生命活动的需要以及外界环境胁迫、病原微生物的入侵时，通过具有特定功能(Huanget等，2011；Hussey，2006)的不同肌动蛋白结合蛋白(ABPs)对其精准快速的有序调控，传递信息，促使细胞作出一系列快速有效的反应(Porter and Day，2016；Porteret等，2012；Tianet等，2009；Day B，2011)。肌动蛋白解聚因子(Actin depolymerizingfactor,ADF)被认为是一类重要的ABP(Actinbinding protein)，通过剪切和解聚微丝来调控微丝的结构和动态，参与植物生长发育及生物和非生物应答反应(Fu等，2014)。然而在甜瓜中ADF家族基因少有报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种甜瓜CmADF1基因及其克隆方法和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明第一个目的是要提供一种甜瓜CmADF1基因，所述甜瓜CmADF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甜瓜CmADF1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二个目的是要提供一种甜瓜CmADF1基因的克隆方法，包括以下步骤：
提取薄皮甜瓜材料LT-6叶片的总RNA，反转录成cDNA后以其为模板利用设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系20μL，其中：2×Mix为10ul，cDNA模板1ul，上/下游引物各1ul，ddH2O为7ul；PCR扩增程序：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，反应35个循环，72℃延伸2min；使用胶回收试剂盒回收扩增片段，即得甜瓜CmADF1基因。
进一步地，设计的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明第三个目的是要提供一种甜瓜CmADF1基因在调控低温对甜瓜CmADF1基因遗传材料的种子萌发和遗传材料生长中的应用。
与现有技术相比，在低温胁迫下，本发明的甜瓜CmADF1基因过表达的遗传材料的种子还具有较高的萌发率，本发明的甜瓜CmADF1基因过表达的遗传材料的植株还具有较好的生长情况，说明本发明的甜瓜CmADF1基因能够用于调控低温对甜瓜CmADF1基因遗传材料的种子萌发和遗传材料生长。
附图说明
图1为CmADF1结构功能域的分析。
图2为CmADF1沉默植株中CmADF1的相对表达量。
图3为CmADF1转基因拟南芥中CmADF1的相对表达量。
图4为CmADF1-GFP植株中CmADF1的亚细胞定位。
图5为正常条件(22℃)和低温胁迫(14℃)拟南芥WT、CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8的种子萌发情况。
图6A为正常条件(22℃)下14d苗龄的WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8植株的生长情况；6B为低温胁迫(14℃)下14d苗龄的WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8植株的生长情况。
图7为4℃低温处理基因沉默植株TRV-CmADF1和TRV-006h和12h后的植株叶片萎蔫程度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
1、甜瓜CmADF1基因克隆
(1)从甜瓜基因组网站(https://www.melonomics.net/)获取试验所需基因全长和启动子序列，用primer 5设计引物序列，以薄皮甜瓜材料LT-6的cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因片段。本试验中用到的引物、PCR扩增体系和程序如下：
表1 CmADF1基因编码序列克隆引物
表2 CmADF1基因编码序列克隆PCR反应体系
(2)PCR产物回收：使用胶回收试剂盒回收目的片段，经测序CmADF1基因序列为420bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该CmADF1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
通过对CmADF1基因氨基酸序列分析表明CmADF1基因编码139个氨基酸，具有非常保守的ADF-H结构域(4-138bp)和关键功能位点，含有2个G-actin结合位点(氨基酸6和7)和5个F-actin结合位点(氨基酸81、83、97、124和127)，其中N端第6位的丝氨酸位点在ADF家族基因中非常保守(参照图1)，这个丝氨酸位点的磷酸化和去磷酸化可调节ADF的活性；
(3)连接T载：按照T载试剂盒说明书进行连接；
(4)转化大肠杆菌感受态(DH5α)：取50μL DH5α感受态在冰上融化10min，向感受态中加入5μL连接产物，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置2min，然后在超净台上加入500μL LB液体培养基，37℃摇床活化1h后，取50μL涂在Amp抗性LB培养基上，37℃培养箱倒置培养1d；
(5)菌落PCR：挑取单菌落加入20μL ddH2O中，吸打混匀后作为模板进行PCR。PCR体系各试剂加入量为克隆体系加入量的一半，PCR反应程序见(1)；
(6)提质粒：将阳性克隆菌接入含Amp抗性的LB培养基中，37℃摇床中摇菌过夜。按照质粒提取试剂盒提取质粒；
(7)测序：将质粒送上海生工生物有限公司测序；
(8)测序成功后，双酶切目的片段和载体，酶切体系如下表：
表3双酶切体系
(9)目的片段连接表达载体(CmADF1ADF1-pSuper1300-GFP和CmADF1-pCAMBIA1300-221)，体系如下表：
表4目的片段与载体连接体系
(10)转化大肠杆菌感受态(DH5α)：同(4)；
(11)菌落PCR：同(5)；
(12)提质粒：同(6)；
2、甜瓜CmADF1基因转拟南芥过表达植株的筛选和鉴定
(1)过表达载体转化农杆菌感受态(GV3101)：取50μL GV3101感受态在冰上融化，向感受态中加入5μL连接产物，在冰上放置5min，液氮中5min，28℃水浴5min，冰浴5min，然后在超净台上加入500μL LB液体培养基，28℃摇床活化2h后全部涂在抗性LB培养基上，28℃培养箱倒置培养2d。
(2)菌液PCR：挑取单菌落于1mL LB培养基中，28℃摇菌2d，以菌液为模板进行PCR检测，PCR反应体系和程序同3.1.4.1(1)。
(3)浸染：选取阳性菌再次过夜摇4mL菌，5000rpm离心2min集菌。以0.15g蔗糖和0.9μL silweet-77溶于3mL ddH2O中配制浸染液，避光保存。用浸染液重悬菌体，CmADF1-pCAMBIA1300-221和CmADF1-p Super1300-GFP菌液浸染WT花序构建CmADF1-OE和CmADF1-GFP转基因植株，避光平放24h后摆正，浇水。
(4)Tl代转化植株筛选：浸染苗(T0代)的种子(T1代)收获后，均匀接种于含潮霉素B(Hygroscopious B)抗性的1/2MS培养基上，放4℃环境中春化2～3d后，置于22℃，光/暗周期为16h/8h的光照培养箱中进行培养，约10d后选取根生长正常且有真叶的幼苗，即T1代植株移入土里，单株收取种子记为T2代种子。
(5)T2代转基因植株的筛选：方法同上，接种10d后在含潮霉素抗性培养基上选取正常生长：不正常生长为3：1的株系(line)中生长正常的植株移入土中，单株收取T3代种子。
(6)T3代转基因植株的筛选：方法同上，10d后选取全部正常生长的株系(line)中的幼苗移入土中，单株收取T4代种子，其中T3代可以全部萌发且正常生长的株系即为筛到的纯合株系。
3、病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建及农杆菌介导的病毒侵染
利用VIGS体系，获得沉默CmADF1的甜瓜植株。具体过程如下：针对CmADF1的保守区域设计两端加入相应酶切位点(EcoRI/KpnⅠ)的引物，序列如下：TRV2-CmADF1-F：tgagtaaggttaccgaattcTGATTCAAAGGTCAGAAGCAAGATG；TRV2-CmADF1-R：gcgtgagctcggtaccTCAGTTGGCACGGCTTCGAAT。利用PCR扩增出CmADF1片段并进行酶切，PCR产物纯化后，连接到pTRV2相应的酶切位点上。测序结果正确后将构建好的载体转化到农杆菌感受态GV3101中。甜瓜种子播种后6d左右，子叶完全展开时，侵染子叶。以空载p TRV2为对照，将pTRV1和pTRV2的农杆菌菌液按1：1混合进行侵染。具体步骤：a)取构建的含沉默载体p TRV2-CmADF1和空载体pTRV2-0的农杆菌分别于5mL LB液体培养基中(含50mg/L Rif和50mg/L Kan)，在28℃摇床中220rpm振荡培养过夜。b)按照1:10(V/V)取活化菌液于50mL LB液体培养基中(包含相应抗生素，10mM MES，pH 5.7，20μMAS)，在28℃摇床中220rpm振荡培养，使菌浓度OD600为1.0左右。c)5000rpm离心，收集菌体，于注射液(含10mM MgCl2，100μMAS，10mM MES，pH 5.7)重悬至OD600为0.9，避光静置3h后将p TRVl和p TRV2-CmADF1以及p TRVl和p TRV2-0分别等体积混合即为侵染液。d)用去针头的1ml注射器注射甜瓜幼苗子叶直至侵染液浸透整个子叶。然后置于暗处培养24h之后正常培养，获得CmADF1沉默的甜瓜植株。培养至“2叶1心”大小，取第二片真叶进行qRT-PCR检测VIGS体系创制的不同CmADF1沉默植株中CmADF1的表达水平，结果显示，8株被测甜瓜幼苗中，1-6号植株的CmADF1表达水平为对照的40-60％，而7、8号植株中CmADF1表达水平为对照的70％以上(参照图2)，表明成功创制了CmADF1沉默植株。
实施例2
以野生型植株(Columbia-0型，WT)为对照，18s为内参，以WT和T3代CmADF1-OEs纯合植株的cDNA为模板，检测目的基因CmADF1的相对表达量(参照图3)。实时定量结果显示，对照拟南WT中无CmADF1表达，而在CmADF1-OE转基因株系的植株中均有达，其中CmADF1表达量最高的株系为CmADF1-OE#8，而表达量最低的株系为CmADF1-OE#3。因此，选取CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8用于后续实验。
实施例3
为了探究CmADF1蛋白的亚细胞位置及与微丝的结合情况，在拟南芥中异源表达CmADF1-GFP，并筛选获得T3代纯合植株，共聚焦显微镜观察，如图4所示，对照组叶片里的同一细胞中CmADF1-GFP绿色荧光蛋白形成大量的微丝丝束结构(图4C-D)。为了确定CmADF1定位于微丝，使用微丝解聚药剂LatB进行处理，CmADF1-GFP表达形成的丝束被解聚了，几乎不能观察到完好的微丝丝束(图4B)；为了进一步确认CmADF1定位于微丝而不是微管，使用微管解聚药剂Oryzalin对植株进行处理，可以看到CmADF1-GFP转基因植株叶片细胞中的丝束结构没有变化(图4D)，说明CmADF1定位于微丝骨架上。
实施例4
为探究低温对CmADF1遗传材料种子萌发的影响，本试验对22℃正常条件和14℃低温胁迫下拟南芥WT、CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8的种子萌发情况进行了统计，如图5所示，正常条件下CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8与WT种子的萌发率在第1d时有差异，CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8种子的萌发率显著高于WT，随着时间的延长，萌发率在第3、4d时基本持平。受14℃低温胁迫后，WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8的种子萌发均受到抑制，且三种材料的种子萌发率差异显著。第1d和第2d时，CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8种子的萌发率显著高于WT，第3、4d时，3种种子的萌发率趋于一致。
为探究低温对CmADF1遗传材料生长的影响，本试验对过表达拟南芥材料和基因沉默材料进行了处理观察。
过表达拟南芥材料：正常条件(22℃)和低温胁迫(14℃)下14d苗龄的WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8植株的表型情况。将点播在1/2MS培养基上于22℃下生长4d的WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8幼苗移到新的1/2MS培养基中，分别放到正常(22℃)和低温(14℃)培养箱中生长到14d，观察各材料植株生长情况(参照图6A、6B)。
由图6A、6B可看出，受低温胁迫(14℃)后，14d苗龄的WT、CmADF1-OE#6和CmADF1-OE#8植株的生长被明显抑制了，长势显著弱于正常条件(22℃)下的长势。在相同条件下，不论是正常条件(22℃)，还是低温胁迫(14℃)，CmADF1转拟南芥过表达植株CmADF1-OE#6、CmADF1-OE#8都较WT植株表型好。
基因沉默材料：4℃低温处理基因沉默植株TRV-CmADF1和TRV-00，分别处理6h和12h后，由图7可看出，TRV-CmADF1植株叶片萎蔫程度较TRV-00严重，表明CmADF1正调控甜瓜对低温胁迫的耐受性。
综上所述，本发明的甜瓜CmADF1基因能够用于调控低温对甜瓜CmADF1基因遗传材料的种子萌发和遗传材料生长。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种甜瓜CmADF1基因，其特征在于，所述甜瓜CmADF1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述甜瓜CmADF1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的甜瓜CmADF1基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取薄皮甜瓜材料LT-6叶片的总RNA，反转录成cDNA后以其为模板利用设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系20μL，其中：2×Mix为10ul，cDNA模板1ul，上/下游引物各1ul，ddH2O为7ul；PCR扩增程序：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，反应35个循环，72℃延伸2min；使用胶回收试剂盒回收扩增片段，即得甜瓜CmADF1基因。
3.根据权利要求1所述的甜瓜CmADF1基因的克隆方法，其特征在于：设计的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.一种如权利要求1所述的甜瓜CmADF1基因在调控低温对甜瓜CmADF1基因遗传材料的种子萌发和遗传材料生长中的应用。
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