CN108277227A

CN108277227A - 一种甘蓝型油菜中的nac82转录因子基因及其应用

Info

Publication number: CN108277227A
Application number: CN201810308324.XA
Authority: CN
Inventors: 江元清; 杨博; 郭小华; 李烨; 赵培玉
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-04-08
Filing date: 2018-04-08
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因及其应用，甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了所述甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因在调控抗病过程中的应用。本发明首次发现油菜的NAC82基因能正调控对于丁香假单胞菌番茄致病变种Pst DC3000的抗病能力，并且与活性氧的稳态平衡有关，因此在调控作物的抗病方面具有重要的应用价值。

Description

一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因及其应用。

背景技术

农作物的产量和质量受到多种病原物的极大影响，包括细菌、真菌以及病毒等。甘蓝型油菜作为重要的油料作物，鉴定调控抗病能力的基因，增强其抗病能力，提高产量具有重要意义。

超敏反应(hypersensitive response，HR)是一种程序性的细胞死亡(programmedcell death,PCD)，以感染部位细胞快速死亡为特征。超敏反应是植物成功对抗病原菌的免疫反应过程。在HR过程中，通过把细胞的PCD限制在感染部位，能够有效地起到对植物的保护作用。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是植物体内一种重要的具有双重作用的不稳定的分子，在调控生长、发育以及抗逆、抗病过程中发挥着重要的作用。在病原菌侵染后，ROS能够诱导组织出现局部细胞死亡和防御相关基因的表达，产生超敏反应，并且通过扩散可以诱导邻近组织的防卫反应。利用分子生物学与遗传学方法，挖掘油菜中调控ROS稳态平衡以及抗病的基因并阐明它们在增强油菜抗病性上的应用，以此指导油菜的抗病育种，具有重要的意义与应用前景。

NAC转录因子基因家族为植物所特有，是较大的转录因子家族之一。迄今为止，有关多种植物中NAC基因的功能研究较多，大多集中在生长、发育以及抵抗非生物逆境方面，对于其在抗病过程中的功能与作用机制的报道很少。比如，拟南芥中ataf1-1(anac002)突变体对白粉病菌的抗性明显减弱,说明ATAF1是防御白粉病害所必需的(Jensen et al.,2007)。拟南芥的NAC蛋白TIP(ANAC091)可以结合芜菁萎缩病毒(turnip crinkle virus,TCV)的衣壳蛋白,这种互作介导植株对TCV产生高敏反应和系统抗性(Ren et al.,2000)。水稻中OsNAC6(又名SNAC2)的过表达能够显著提高对于稻瘟病的抗性(Nakashima et al,2007)。但是，有无NAC转录因子通过ROS来调控抗病性尚未见报道。而且，有关NAC转录因子基因的功能研究目前主要集中于模式植物拟南芥及水稻，在油菜中的研究还很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因及其应用。在前期开展的有关甘蓝型油菜中NAC转录因子基因的鉴定与分析基础上，首先根据测序的油菜基因组信息，设计了基因特异性引物，从油菜cDNA中克隆获得NAC82转录因子全长cDNA，并且在拟南芥中进行了功能验证。

其具体技术方案为：

一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因，甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因的核苷酸如SEQ ID NO:1所示，氨基酸如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因在调控抗病过程中的应用。

进一步，利用本发明所述的甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因提高抗病性的方法，是将NAC82构建到双元载体p35SFC,然后导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到抗病能力提高的植株。

进一步，所述宿主植物为拟南芥和油菜。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首次发现油菜的NAC82基因能正调控对于丁香假单胞菌番茄致病变种(PstDC3000)的抗病能力，并且与活性氧的稳态平衡有关，因此在调控作物的抗病方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1是甘蓝型油菜NAC82基因的RT-PCR扩增产物的电泳检测，其中，1,油菜NAC82基因的扩增；M，1kb DNA分子量标准(Fermentas)。

图2是油菜NAC82转录因子的转录活性分析；将pGBKT7-NAC82融合质粒转化入酵母AH109感受态细胞中，酵母菌在SD-WL、SD-WLH+3-AT及SD-WLHA三种氨基酸缺陷培养基平板上都正常生长，X-gal染色呈阳性。黑色三角代表酵母菌稀释梯度。右图为pGBKT7空载体质粒的对照。

图3是油菜NAC82的表达诱导超敏反应和ROS累，油菜原生质体分别转染NAC82与GUS的瞬时表达质粒，18h以后分别进行FDA与H2DCFDA染色，其中，图3A是油菜NAC82的表达诱导细胞死亡的二乙酸荧光素(FDA)染色分析，油菜原生质体分别转染NAC82与GUS的瞬时表达质粒，18h以后进行染色并拍照。左、中、右视野分别表示可见光、FDA染色后的荧光以及叶绿素自发荧光视野。标尺＝50μm。图3B油菜NAC82的表达诱导ROS累积的染色分析，油菜原生质体分别转染NAC82与GUS的瞬时表达质粒，18h以后进行2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酯(H₂DCFDA)染色。左、中、右视野分别表示可见光、H₂DCFDA染色后的荧光以及叶绿素自发荧光视野。标尺＝50μm。

图4是油菜NAC82基因的过表达株系的抗病性鉴定，过表达油菜NAC82基因的转基因T3代植株与野生型(Col-0生态型)在生长5周后接种密度为10⁶cfu/ml的丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst DC3000)，3天后菌落计数比较。数值表示3次重复后的平均值±标准方差。不同小写字母表示统计分析后的差异显著(P<0.05,one-way ANOVA)。

图5是双荧光素酶报告系统检测NAC82激活ROS及抗病相关基因的转录示意图，其中，图5A是双荧光素酶报告系统中的双报告基因质粒、效应子质粒示意图。双报告基因质粒包括由CaMV35S启动子启动表达的REN及由相关基因启动子与萤火虫荧光素酶融合表达的报告基因LUC。效应子质粒是由CaMV35S启动驱动表达的GFP或NAC82质粒。图5B是NAC82可与经典的NAC结合元件NACRS结合。图5C是NAC82可激活RbohF基因的表达。图5D是NAC82可激活PR5基因的表达。图5E是NAC82可激活HIN1基因的表达。转录因子激活报告基因LUC的能力是由LUC/REN来表示的。实验数据是三个生物学重复的平均值±S.E。不同字母代表差异的显著性(P≤0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明提供了一种甘蓝型油菜中NAC82转录因子基因及其编码蛋白在抗病上的应用。

本发明涉及的油菜基因，名称为NAC82，其基因座位号是BnaC09g47170D，编码的蛋白含有432个氨基酸残基。

含有本发明基因的表达载体、转基因植株也在本发明的保护范围之内。

本发明的保护范围还包括基因NAC82在调控抗病中的应用，该植物为拟南芥和油菜。

利用该NAC82基因提高抗病性的方法，是将NAC82构建到双元载体p35SFC,然后导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到抗病能力提高的植株。

以上所说的植物宿主为拟南芥和油菜。

以下实施例中如无特殊说明均为常规方法。

实施例1油菜NAC82基因cDNA序列的克隆与序列测定

根据已经公布的甘蓝型油菜的测序基因组的序列信息，设计基因特异性的两对引物，分别以甘蓝型油菜cDNA为模板扩增基因的编码区，引物序列为：NAC82-F:ttaggtcATGATCGGGAAAACTGAGCTGGCT；NAC82-R:cgcgtcgacTCTCTGGTCCGTATTGTCC

采用Plant RNA kit(Omega)提取一周大的油菜幼苗的总RNA，经过NanoDrop1000定量后，各取2.5μg总RNA，采用RevertAid RNase H-First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)进行逆转录反应，按说明书进行。

2.PCR反应体系(50μL)

5X PrimeStar buffer 10μL

cDNA模板：1μL

dNTPs(10mM each)1μL

Primer F(20μΜ)1μL

Primer R(20μΜ)1μL

PrimeStar(TaKaRa)0.5μL

ddH₂O加至终体积50μL

3.PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，50℃复性lmin，72℃延伸1min20sec，循环35次；72℃延伸10min。

4. 1％琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1.2kb处有一条目的条带如附图1所示。

5.扩增片段的回收、酶切以及与pJET1.2载体的链接

对扩增条带采用博日公司(杭州)的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。

对回收片段，通过平末端克隆的方法，克隆入pJET1.2载体(Fermentas)，按照CloneJET PCR cloning kit(Fermentas)的说明书进行。

本实验所用的pJET1.2载体的多克隆位点的上游有T7启动子、下游有pJET1.2-R引物结合的序列，所以可以用这两个引物序列对重组质粒进行双向测序。结果表明，我们获得了油菜的NAC82基因的cDNA序列。因为该基因与拟南芥的ANAC082的同源性最高，故得名。

实施例2 NAC82转录因子的转录活性分析

设计基因特异性的正反向引物，正向引物

NAC82_BspHI_F(5’ttaggtcATGATCGGGAAAACTGAGCTGGCT3’)，反向引物为NAC82_SalI_R(5’cgcgtcgacTCTCTGGTCCGTATTGTCC3’),进行高保真PCR扩增。

PCR反应体系(50μL)

10X Pfu buffer 5μL

pJET1.2-NAC82质粒模板：0.5μL

dNTPs(10mM each)1μL

正向引物(20μΜ)1μL

反向引物(20μΜ)1μL

Pfu(Bioer)0.5μL

ddH₂O加至终体积50μL

PCR反应程序同前。

用PCR产物纯化试剂盒纯化上述PCR产物，经过BspHI与SalI双酶切后，用T4DNA连接酶与预先用NcoI与SalI酶切的pGBKT7载体片段连接。转化大肠杆菌DH5α的感受态细菌，涂于LB+50mg/ml Kan的培养基平板。

利用pGBKT7载体的多克隆位点两端的引物序列(正向引物：

TCATCATCGGAAGAGAGTAGTAAC；反向引物：TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC)，进行菌落PCR，筛选阳性克隆。摇菌提取质粒。

将上述重组质粒pGBKT7-NAC82以及pGADT7空载体质粒经醋酸锂法转化入酵母AH109感受态细胞中，30℃培养2天，通过二缺平板(缺乏色氨酸与亮氨酸)筛选得到阳性克隆。参照Clontech公司的酵母操作手册Yeast Protocol Handbook进行。

将获得的阳性克隆通过液体YEPD培养液过夜培养后收集菌体，用无菌水稀释至OD600为0.5，然后进行梯度稀释(1/10，1/100，1/1000)，取2μl稀释液分别滴定于二缺(缺乏色氨酸与亮氨酸，SD-WL)，三缺(缺乏色氨酸、亮氨酸以及组氨酸并添加5mM的3-AT，SD-WLH+5mM 3-AT)以及四缺(缺乏色氨酸、亮氨酸、组氨酸以及半硫酸腺嘌呤，SD-WLHA)固体培养基表面，30℃培养5d后，拍照记录菌落生长状况。

将上述各个培养基平板的菌落通过影印发转移至9cm圆形滤纸上，液氮速冻1min后，进行X-gal染色，染色液成分为38.5mMβ-Mercaptoethanol，39.8mM NaH₂PO₄，60mMNaHPO₄，1mM MgSO₄，10mM KCl，0.817mM X-gal，染色12h，取出晾干滤纸，拍照记录染色情况。结果如图2所示。表明NAC82是一个转录激活子。

瞬时表达质粒的构建

通过类似前述的酶切克隆的方法，将NAC82及对照GUS基因的编码区克隆到pUC19-GFP载体上，取代原有的GFP基因。用无内毒素的质粒大量提取试剂盒(康为世纪)提取质粒，测定浓度。

油菜原生质体的分离

根据拟南芥叶肉细胞原生质体的分离方法从温室生长5周的油菜的叶片分离原生质体。然后利用光学显微镜(DM750,Leica)以及血球计数板计算原生质体的密度，并将密度调整成2x10⁵/ml。

油菜原生质体的转染

利用PEG4000介导的转化方法将20μg大提质粒转入制备好的原生质体中，22℃黑暗培育18h。

原生质体的染色与拍照

吸取等量的原生质体，分别进行二乙酸荧光素(FDA)以及2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯(H₂DCFDA)染色，染色液成份分别是0.01％FDA(溶于丙酮)与25mM H2DCFDA(溶于10mM Tris,50mM KCl,pH 7.2)，染色条件为25℃、10分钟。接着对原生质体进行漂洗，利用荧光显微镜(BX53；Olympus)在激发光488nm和发射光525nm下观察荧光信号并拍照。从图3A可见，表达NAC82的原生质体的经过FDA染色后，发光强度明显弱于对照GUS，说明NAC82的表达会导致发生程序性细胞死亡。而图3B的H₂DCFDA染色实验表明，转染了NAC82瞬时表达质粒的原生质体的荧光强度显著高于转染了GUS对照质粒发光，说明ROS的累积更加明显。

植物过表达载体的构建

植物表达载体p35SFC是含有CaMV35S启动子和HPT II(潮霉素)植物选择标记基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶NcoI和SalI等位点。用限制性内切酶NcoI和SalI双酶切载体p35SFC；同时，用BspHI和SalI对重组质粒pJET1.2-NAC82进行双酶切释放出目的基因片断。完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与双酶切的目的基因片段连结，构建获得植物表达载体p35SFC-NAC82。

(I)质粒p35SFC空载体和目的基因片断双酶切体系如下：

NcoI(或者BspHI) 0.5μL

SalI 0.5μL

p35SFC双元载体或pJET1.2-NAC82重组质粒 8μL

10x Cutsmart Buffer 1.5μL

ddH₂O To 15μL

酶切产物的电泳与回收:双酶切完成后，以1xTAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下p35SFC泳道的载体的11kb大片段以及pJET1.2-NAC82泳道的1.2kb的插入片段，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(博日公司)分别回收目的条带。

连接：经酶切的p35SFC载体片段和目的基因片段以摩尔比1:3的比例进行16℃连接2小时；

采用常规的CaCl₂介导的热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞之后，通过菌落PCR筛选阳性克隆，

本研究所用的p35SFC载体，是根据pCsGFPBT改造而来，携带有3xFLAG标签，根据GenBank中的pCsGFPBT登录号(DQ370426)设计了上下游测序引物，所以可以用这两个引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；

PCR程序：94℃预变性1min；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸lmin20sec，循环35次；72℃延伸5min；

PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，然后挑取两个阳性克隆摇菌，用质粒小量提取试剂盒(Omega)提取质粒。重组质粒送至上海生工生物工程公司采用ABI3730仪器双向测序验证无误。

农杆菌感受态的制备与转化

采用CaCl₂法制备根癌农杆菌GV3101的感受态细胞，采用冻融法将上述p35SFC-NAC82重组质粒转入农杆菌细胞。涂于含34μg/ml利福平、25μg/ml庆大霉素、50μg/ml Kan的YEB培养基平板上，28℃倒置暗培养2天。

菌落PCR鉴定验证重组质粒确已转入农杆菌。

菌体PCR所用引物以及扩增条件等同上述。

转基因功能验证一拟南芥转化、筛选及表型分析

拟南芥的遗传转化

首先小量培养转化后的农杆菌，然后转入大量(330ml)培养，直至OD600达到1.2。离心收集菌体，等量重悬于含有5％蔗糖、1/2x MS以及0.03％Silwet L-77的溶液中，将约5周的处于盛花前期的野生型拟南芥Col-0倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动蘸花30sec，取出花盆侧放于托盘中，盖盖，将托盘置暗处放置14h,然后取出营养钵并直立放置,恢复光照,继续培养植株至成熟并收获种子。

阳性植株的筛选：T1代种子用稀释的次氯酸钠溶液(包括0.03％Tween-20)消毒后，点播在1/2xMS选择培养板(含有30mg/L潮霉素)上，于4℃下层积2天，移入培养室中培养，7天后挑选潮霉素抗性植株(长出真叶对，根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中，培养直至种子成熟，采用同样的方法筛选T2代种子得到T3代植株，并在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，继续繁殖并获得纯合T3代株系，然后进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定；

转基因拟南芥的RT-PCR鉴定与高表达株系的筛选

采用Plant RNA kit(Omega bio-tek)提取T2代植物叶片的总RNA，经过NanoDrop1000定量后，各取2.5μg总RNA，采用RevertAid RNase H-First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)进行逆转录反应，按说明书进行。

定量RT-PCR筛选高表达株系

以10倍稀释的cDNA为模板，进行定量PCR反应，采用SYBR Green I Premix(康为世纪)试剂盒，按照说明书推荐的配比，在CFX96(Bio-Rad)仪器上进行。引物如下

AtUBQ10-F：5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’

AtUBQ10-R:5’-AGAAGTTCGACTTGTC ATTAGAAAGAAA-3’

NAC82-qF:5’-CACTCGCACCGCCTCAAAAC-3’

NAC82-qR：5'-CCCATGGACGCAGAAAAGAATAAG-3'

qPCR体系

2X SYBR Green I mix 5μL

Primer qF(20μΜ)0.2μL

Primer qR(20μΜ)0.2μL

ddH₂O 4.6μL

cDNA模板2μL

Total Volume 10μL

qPCR程序

95℃x 15min；94℃x 30s；60℃x 1min；35cycles。

根据内参基因AtUBQ10的扩增情况，计算目的基因在30余个转基因株系中的表达倍数。

转基因植株的抗病性鉴定

Pst DC3000的培养

Pst DC3000生长在含有25mg/L的利福平(Rif)的KB培养基上，28℃黑暗培养两天后活化菌株。用牙签将活化的Pst DC3000在含有Rif的KB平板上划线，继续28℃培养2～3d，再用牙签挑取菌落边缘的新鲜菌体，无菌水稀释菌落成10²cfu/mL菌液，待用。

Pst DC3000的接种

挑选5周龄生长良好、叶片平展且较嫩、未抽苔的拟南芥不同基因型的叶片，做好标记，每株选3～4片叶片用于接种。用lmL去针头的注射器将准备好的菌液从叶片背面注射到拟南芥的叶片里，注满为止。黑暗保湿过夜，然后在不同的时间点取样，以注射无菌蒸馏水的叶片作为对照。

Pst DC3000的计数

采用平板稀释法对病原菌的cfu值进行统计。对每个时间点上处理的叶片用直径为5mm的打孔器获得相同大小的叶盘，将叶盘样品放入2mL离心管中，在无菌条件下，将叶片用无菌水浸泡2min，然后冲洗2～3次，将叶盘转入新的无菌的2mL离心管中，加入100μl的无菌水将叶盘研磨匀浆，用400μl无菌水冲洗杵头，该冲洗液一并混入100μl的无菌水中，混匀后进行10倍的梯度稀释。取100μl稀释液涂布于含25mg/L利福平的固体KB培养基上，28℃培养2d后计数菌落数量。每个试验重复3次，试验数据用SPSS软件进行统计分析。结果如图4所示，表明NAC82基因的过表达能够显著减少接种丁香假单胞杆菌病原物后的存活数量，即提高了对于这个细菌病害的抗病性。

实施例3双荧光素酶报告检测

从已经测序的油菜基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中，根据拟南芥同源基因进行分析、比对，然后取得分最高的序列(tophit)进行启动子引物的设计。

油菜基因组DNA的提取：

采用2％CTAB法提取。收获约50mg的幼嫩油菜叶片于2ml离心管中，加入液氮研磨充分，加入300μL含0.2％巯基乙醇的2％CTAB缓冲液(1.4M NaCl,2％(w/v)CTAB,20mM EDTA(pH8.0),100mM Tris-HCl(pH 8))，混匀，65℃水浴5min，冷却至室温，加入300μL氯仿/异戊醇混合液(体积比为24：1)，混匀后12500rpm离心10min，转移上层清液至新的离心管中。加入210μL异丙醇，混匀后12000rpm离心10min，弃清液。加入700μL 70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液，风干后加入20μL含RNase A酶的1x TE buffer，溶解gDNA。

启动子的扩增

取1μL上述基因组DNA为模板，进行高保真PCR反应。引物由上海生工合成。PCR体系为：10μL 5x PrimeStar buffer，1μL 10mmol/l dNTP，20μmol/l正向引物以及反向引物各1μL，0.5μL PrimeStar DNA polymerase，1μL gDNA及36.5μL ddH₂O。程序为94℃x 3min；94℃x 30s，50℃x 30s，72℃x 1.5min，35个循环；最后72℃保温10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒(博日)进行回收。

启动子的克隆

将上述回收得到的启动子序列，经过KpnI-NcoI双酶切后，克隆进载体pGreenII0800-LUC中萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase，LUC)报告基因的上游并双向测序验证无误，此为报告质粒。

烟草的培养与农杆菌介导的瞬时表达

先用70％乙醇对本氏烟草种子消毒1min，再用漂白剂(含0.03％Tween20的2.6％的次氯酸钠)消毒1min，无菌水水洗5-6次，获得表面消毒的种子，将其播种在1/2MS培养基上，4℃黑暗环境层积2-3d，转移到温室生长7天后移苗至土壤基质。温室条件为：22℃，相对湿度为60％-70％，光周期为14h光照(光强约为150μmol m^-2s^-1)，10h黑暗。

将上述报告质粒以及由CaMV35S启动子驱动的海肾荧光素酶(Renillaluciferase，REN)报告基因作为内参，p35SFC-NAC82为效应子质粒，pYJGFP(含有GFP表达框架)作为对照质粒。分别通过冻融法转化农杆菌GV3101，28C培养2天后，挑取单菌落，过夜振荡培养摇菌，5000rpm离心5min收集菌体后，用新鲜配制的含有乙酰丁香酮的缓冲液(10mMMES-KOH，10mM MgCl₂，0.15mM Acetosyringone)重悬，将转化了报告基因质粒与效应子质粒的菌液按照1：9(v/v)的比例混匀后共注射温室生长30d的烟草叶片。继续在温室培养。

双荧光素酶报告分析

在不同的时间点，用打孔器从烟草的注射点取叶圆片，转入2ml离心管，用液氮充分研磨成粉末，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)试剂盒操作说明书来定量测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。使用仪器为GloMax 20/20Luminometer(Promega公司)，每个试验3个生物学重复。结果如图5所示，说明油菜NAC82可能通过上调RbohF、PR5以及HIN1等ROS生成以及防御反应相关的基因的表达、激发系统获得抗性(SAR)，来增强植物的抗病性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggaaaa ctgagctggc tcctgggttt cggtttcatc ctactgatgt tgaactcgtg 60

agatattacc tgaagaggaa agtgttgggt aaaaagcttc tcgttgatgc tattgctgat 120

cttgacattt acaagttcga accctctgac ttgcctgata agtcctatat aaagagtggt 180

gatcttaagt ggcacttctt ctgcccaagg gagaagaaat atgcaaccgg tgttagagct 240

aaccgtgcaa ctgagtgtgg ttactggaaa accacaggga aggagagagc cgttctctgc 300

aatggtgaat ctgtcggaaa gattaagact ctggtttacc acgttggcaa gtcgcctcgt 360

ggggagcgta ctgattgggt tatgcatgaa tacaggctcg aggacaacgt gctgacacag 420

aagaatattc ctcaggatac ttatgtcctg tgtgttctgt tcaagaaaga tggaccggga 480

cctagaaatg gagctcaata tggagctcct ttcaaggaag aggactggag cgatgaggaa 540

catcgtactg gtgttgatgt tccttctacc agcaatgcct caatcttcct tcatgggcct 600

aacgcagaac caagtctggc tgtggctccc tcactccccc ctaataagga ttgttttggt 660

ggcatgatat ctgaatcatg cgtctctgat ttcccaccag ctacagctac taccaacgtg 720

actgatgcag ctaatgctcc tatgcctgca ccacttgttg atcctagtag cagcgcttct 780

ttggcgcaaa cccttcaggc ccctaacgac gatgatgact tgtatgcaat gttggatctg 840

tttgttgatg aggatgagtt cttgcctctc tctgagccca acaccaacgt ggcaagacat 900

gttcccaatg tctcagctcc aatttcctta ggagaggaag tgatattcga cgacctaccc 960

gactttagca atatgcataa caacaacatc atgccaagga caccctctga cgacctgatt 1020

gaaaactcgg agctatactt ggagctccag gatctcacaa ctccgttagc accaccccat 1080

gtttggaatg tcagcgactc ttacctgaca gttccactcg caccacctca agtagggaat 1140

gtcagcgact cttacctgac agctccactc gcaccgcctc aaaacgggaa tgtcagtgag 1200

ccttttctga gccatcaagg ccactttgat ttctccgctg ctgcgaatga tgatccttat 1260

tcttttctgc gtccatggga caatacggac cagagatga 1299

<210> 2

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Lys Thr Glu Leu Ala Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp

1 5 10 15

Val Glu Leu Val Arg Tyr Tyr Leu Lys Arg Lys Val Leu Gly Lys Lys

20 25 30

Leu Leu Val Asp Ala Ile Ala Asp Leu Asp Ile Tyr Lys Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Asp Leu Pro Asp Lys Ser Tyr Ile Lys Ser Gly Asp Leu Lys Trp

50 55 60

His Phe Phe Cys Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Ala Thr Gly Val Arg Ala

65 70 75 80

Asn Arg Ala Thr Glu Cys Gly Tyr Trp Lys Thr Thr Gly Lys Glu Arg

85 90 95

Ala Val Leu Cys Asn Gly Glu Ser Val Gly Lys Ile Lys Thr Leu Val

100 105 110

Tyr His Val Gly Lys Ser Pro Arg Gly Glu Arg Thr Asp Trp Val Met

115 120 125

His Glu Tyr Arg Leu Glu Asp Asn Val Leu Thr Gln Lys Asn Ile Pro

130 135 140

Gln Asp Thr Tyr Val Leu Cys Val Leu Phe Lys Lys Asp Gly Pro Gly

145 150 155 160

Pro Arg Asn Gly Ala Gln Tyr Gly Ala Pro Phe Lys Glu Glu Asp Trp

165 170 175

Ser Asp Glu Glu His Arg Thr Gly Val Asp Val Pro Ser Thr Ser Asn

180 185 190

Ala Ser Ile Phe Leu His Gly Pro Asn Ala Glu Pro Ser Leu Ala Val

195 200 205

Ala Pro Ser Leu Pro Pro Asn Lys Asp Cys Phe Gly Gly Met Ile Ser

210 215 220

Glu Ser Cys Val Ser Asp Phe Pro Pro Ala Thr Ala Thr Thr Asn Val

225 230 235 240

Thr Asp Ala Ala Asn Ala Pro Met Pro Ala Pro Leu Val Asp Pro Ser

245 250 255

Ser Ser Ala Ser Leu Ala Gln Thr Leu Gln Ala Pro Asn Asp Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Tyr Ala Met Leu Asp Leu Phe Val Asp Glu Asp Glu Phe Leu

275 280 285

Pro Leu Ser Glu Pro Asn Thr Asn Val Ala Arg His Val Pro Asn Val

290 295 300

Ser Ala Pro Ile Ser Leu Gly Glu Glu Val Ile Phe Asp Asp Leu Pro

305 310 315 320

Asp Phe Ser Asn Met His Asn Asn Asn Ile Met Pro Arg Thr Pro Ser

325 330 335

Asp Asp Leu Ile Glu Asn Ser Glu Leu Tyr Leu Glu Leu Gln Asp Leu

340 345 350

Thr Thr Pro Leu Ala Pro Pro His Val Trp Asn Val Ser Asp Ser Tyr

355 360 365

Leu Thr Val Pro Leu Ala Pro Pro Gln Val Gly Asn Val Ser Asp Ser

370 375 380

Tyr Leu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Pro Gln Asn Gly Asn Val Ser Glu

385 390 395 400

Pro Phe Leu Ser His Gln Gly His Phe Asp Phe Ser Ala Ala Ala Asn

405 410 415

Asp Asp Pro Tyr Ser Phe Leu Arg Pro Trp Asp Asn Thr Asp Gln Arg

420 425 430

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaggtcatg atcgggaaaa ctgagctggc t 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgtcgact ctctggtccg tattgtcc 28

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcatcatcgg aagagagtag taac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttttcgtttt aaaacctaag agtc 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttccaatct atgagggata cacgc 25

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaagttcga cttgtcatta gaaagaaa 28

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactcgcacc gcctcaaaac 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccatggacg cagaaaagaa taag 24

Claims

1.一种甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因，其特征在于，甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因的核苷酸如SEQ ID NO:1所示，氨基酸如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因在调控抗病过程中的应用。

3.根据权利要求2所述甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因在调控抗病过程中的应用，其特征在于，利用所述的甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因提高抗病性的方法，是将NAC82构建到双元载体p35SFC,然后导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到抗病能力提高的植株。

4.根据权利要求3所述甘蓝型油菜中的NAC82转录因子基因在调控抗病过程中的应用，其特征在于，所述宿主植物为拟南芥和油菜。