CN114560919B - 一种与植物耐旱相关的转录因子VcMYB108及其编码基因与应用 - Google Patents
一种与植物耐旱相关的转录因子VcMYB108及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物耐旱性相关的MYB转录因子VcMYB108及其编码基因与应用，涉及生物技术领域。本发明提供的VcMYB108蛋白是SEQ ID NO.2所示的蛋白质，VcMYB108蛋白的编码基因是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。本发明通过将新基因VcMYB108导入拟南芥中得到转VcMYB108拟南芥植株，通过实验证明，VcMYB108转基因拟南芥植株在萌发期和苗期的耐旱性均显著高于野生型株系和转空载体株系，且未对植物生长发育和果荚产量产生影响，表明VcMYB108是一种植物响应逆境胁迫的正调控转录因子，能够在不改变花期和产量的情况下提升植物的耐旱能力。暗示通过在受体植物中表达VcMYB108基因或其同源基因后所产生的转基因品系能够在不牺牲植物生长量的条件下提升植物的耐旱能力。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及与植物耐旱性相关的转录因子VcMYB108及其编码基因与应用。
背景技术
蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)是一种重要的多年生经济作物，其果实富含花青素，具有极高的经济价值和保健价值。蓝莓栽培遍及北美洲、南美洲、欧洲及亚洲等全球多个地区，我国自20世纪80年代引进到2001年实现产业化建园生产，目前在山东、贵州、辽宁、云南、陕西等多个省市均有栽培，市场潜力巨大。但蓝莓属于浅根系植物，根系纤细且不发达，没有根毛，容易受到干旱胁迫的危害，导致生长减缓、产量下降。筛选蓝莓自身耐旱基因，通过基因工程改良品种，提升其耐旱性可以有效地减少干旱对植株生长及产量的影响。
植物为了适应干旱等不利环境条件形成了一系列复杂的响应逆境胁迫的调控机制。已有研究表明，植物抗旱的机制虽然复杂，但是可以被调控。虽然目前有大量关于植物耐旱性的相关研究，但蓝莓中与耐旱有关的基因资源仍有待挖掘。因此，鉴定蓝莓耐旱相关基因及其机制，通过基因工程对蓝莓自身品种及其他物种的抗逆性改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐旱性相关转录因子VcMYB108及其编码基因在植物耐旱中的应用。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐旱性相关蛋白。
本发明所提供的蛋白质，来源于蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)，命名为VcMYB108，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
c)与a)或b)具有80％或80％以上的同源性且具有耐旱性相关的蛋白质；
d)在a)、b)或c)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，SEQ ID NO.2由315个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述b)中的蛋白质VcMYB108，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述b)中的蛋白质VcMYB108可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述b)中的蛋白质VcMYB108的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明又提供了与VcMYB108蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与VcMYB108蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码VcMYB108蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码植物耐旱相关蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码植物耐旱相关蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有80％及以上同一性且编码植物耐旱相关蛋白质的DNA分子。
上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQ ID NO.1由948个核苷酸组成，编码SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
本领域相关技术人员能够通过使用已知的如定向进化和点突变等实验方法，对本发明的编码VcMYB108的核苷酸序列进行突变。凡是经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的VcMYB108的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码VcMYB108且具有相同功能，即属于本发明的保护范围。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述80％或80％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码VcMYB108的核酸分子的表达盒(VcMYB108基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达VcMYB108的DNA，该DNA不但可包括启动VcMYB108转录的启动子，还可包括终止VcMYB108转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述VcMYB108基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。使用VcMYB108基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素、氯霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
扩增上述VcMYB108基因全长序列或部分序列或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体可为在PHB载体的HindIII和XbaI位点间插入上述VcMYB108基因(SEQ ID NO.1)得到的重组表达载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌为GV3101。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供VcMYB108蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了VcMYB108蛋白质或上述生物材料在调控植物耐旱性中的应用。
本发明还提供了VcMYB108蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。
上述应用中，所述VcMYB108基因为植物耐旱性正调控转录因子，所述培育高耐旱性的转基因植物的方法可为在转基因植物中过表达VcMYB108基因或其同源基因从而提高植物耐旱性。
上述应用中，所述耐旱性为对干旱胁迫的耐受性。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
为验证VcMYB108蛋白提高植物耐旱性性的功能，本发明提供的与野生型植物相比对非生物胁迫更为敏感的转基因植物的方法包括提高受体植物中VcMYB108蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的对于干旱的耐受能力均高于所述受体植物。
上述方法中，所述提高受体植物中VcMYB108蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达VcMYB108蛋白。
上述方法中，所述过表达的方法为将VcMYB108蛋白的编码基因导入受体植物；所述VcMYB108蛋白的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
在本发明的一个试验方法中，VcMYB108蛋白的编码基因(即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)通过含有VcMYB108蛋白的编码基因的表达盒的重组载体PHB-VcMYB108导入农杆菌GV3101中。所述重组载体PHB-VcMYB108为将序列表中SEQ ID NO.1所示的VcMYB108插入表达载体PHB的HindIII和XbaI酶切位点间，且保持PHB载体的其他序列不变后得到的载体。所述重组载体PHB-VcMYB108表达VcMYB108蛋白。
本发明具有以下有益效果：
上述转基因植物在高浓度甘露醇的胁迫下种子萌发率和/或幼苗根长和/或存活率高于所述受体植物。上述干旱环境具体可以是100mM、200mM、300mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境，也可以是停止浇水19天的干旱处理环境。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述VcMYB108基因导入受体植物得到的第一代转基因植物同时包括其子代，也包括通过如RNAi基因沉默技术、CRISPR-Cas9基因敲除技术等方式沉默受体植物中的VcMYB108基因及其同源基因后所得到的第一代转基因植物同时包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)。
本发明首先筛选出VcMYB108，然后将其导入拟南芥中得到转VcMYB108拟南芥，并发现转VcMYB108拟南芥对于干旱的耐受能力显著高于原受体植株，证明该基因为植物抵御逆境胁迫过程中的正调控因子。其具体表现如下：转VcMYB108拟南芥的种子在100mM、200mM、300mM的甘露醇条件下，转基因品系的根长显著长于野生型；在200mM、300mM的甘露醇条件下转基因品系中发芽率显著高于野生型的发芽率。在培养基质中停止浇水19天，野生型明显出现萎蔫，复水3天后野生型的萎蔫情况没有得到缓解，而转基因植株经过干旱后复水的存活率显著高于野生型和转空载体株系。上述结果表明，VcMYB108或其编码的蛋白具备调控植物耐旱性的功能。
附图说明
图1为VcMYB108基因在蓝莓各组织中的表达情况。
图2为VcMYB108基因在蓝莓正常(CK)、中度干旱(MD)及重度干旱(SD)处理下在叶片和根系中的表达情况。
图3为VcMYB108转基因拟南芥分子检测结果。
图4为VcMYB108转基因拟南芥和野生型拟南芥种子在不同浓度甘露醇处理下萌发率及测定结果。
图5为VcMYB108转基因拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度甘露醇的平板生长8天的根长观察结果及根长数值统计。
图6为VcMYB108转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗在干旱处理19天，复水3天后的观测结果。
图7为VcMYB108转基因拟南芥和野生型拟南芥植株在正常条件下植株生长量比较。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的具体实施方法进行详细的描述。
下述实施例中如无特殊注明具体条件，按照常规条件或制造商建议条件进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获取。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下结合实施例对本发明的特征和特性进行详细的描述。
实施例1
本实施例进行VcMYB108及其编码基因的获得，包括以下步骤：
本实验在通过对蓝莓响应干旱的转录组数据筛选之后，获得了蓝莓VcMYB108基因的编码区序列，采用5’-ATGGAAGTATATGAAAGCAGAGGTAA-3’和5’-TTACATGCTGTTAAGCTGCTGCTGTA-3’为引物，以蓝莓中提取的cDNA为模板，克隆得到VcMYB108的开放阅读框序列，连接到pEASY-T1载体上并对其进行测序。
测序结果表明：cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1，由948个核苷酸组成，将其所示的基因命名为VcMYB108，VcMYB108编码的蛋白命名为VcMYB108，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2，由315个氨基酸组成。
实施例2
本实施例通过荧光定量PCR分析VcMYB108基因的组织及逆境胁迫下表达情况，包括以下步骤：
分别提取蓝莓花、根、茎、叶、果实、种子各组织的RNA，利用反转录试剂盒反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，以5’-ATTCTGATTCCCTAACCAGCCC-3’和5’-CTGCTGTAAGAACCAAATGTCCTCA-3’为RT引物进行PCR扩增，检测VcMYB108基因在蓝莓不同组织中的表达情况。同时以蓝莓VcUBC28基因作为内参基因，扩增VcUBC28基因的正向引物为：5’–CCATCCACTTCCCTCCAGATTATCCAT-3’，反向引物为：5’-ACAGATTGAGAGCAGCACCTTGGA-3’。
选取长势相对一致的蓝莓幼苗，移栽到塑料盆中，每盆3株，共计30盆，进行干旱处理。每天特定时间通过称重测定相对含水量，连续观察和测定45d。确定三个处理条件，对照组(CK)，SWC为75-80％；中度干旱组(MD)，SWC为55-60％；重度干旱组(SD)，SWC为30-35％。干旱处理在温室条件下进行，每盆3株，3个处理，每个处理27盆，随机区组。缓苗15d后开始进行不浇水处理。进行不浇水处理后第9、21和40d时，CK、MD和SD三个处理组分别达到预定水平。采集样品，迅速放入液氮内速冻30min，最后将取好的样放入-80℃冰箱内，储藏待测。每个处理三个生物学重复，每个生物学重复采用6株随机混合采样。分别提取上述材料的RNA，反转录合成cDNA，然后分别以上述各胁迫处理后蓝莓的cDNA为模板，以5’-ATTCTGATTCCCTAACCAGCCC-3’和5’-CTGCTGTAAGAACCAAATGTCCTCA-3’为RT引物进行PCR扩增，检测VcMYB108基因在蓝莓不同程度干旱处理下的表达情况。同时以蓝莓VcUBC28基因作为内参，扩增VcUBC28基因的正向引物为：5’–CCATCCACTTCCCTCCAGATTATCCAT-3’，反向引物为：5’-ACAGATTGAGAGCAGCACCTTGGA-3’。
VcMYB108基因在各组织中的表达情况如图1所示。结果表明，VcMYB108在所有组织中均有表达，其在根中表达量最高，其次是在叶中有较高的表达量，在其他组织中的表达量相对较低。
VcMYB108基因对干旱胁迫有响应。如图2所示，不同程度干旱处理下，VcMYB108表达量差异显著，特别是叶片中VcMYB108表达量显著升高，在SD时表达水平最高，达到了对照组的78倍左右。
实施例3
本实施例验证VcMYB108基因在调控植物耐旱性中的作用。
本发明通过以模式植物拟南芥作为材料，对VcMYB108基因的功能进行分析和验证。
一、VcMYB108转基因拟南芥的获得
1、VcMYB108基因的获得
本实验以5’-ATGGAAGTATATGAAAGCAGAGGTAA-3’和5’-TTACATGCTGTTAAGCTGCTGCTGTA-3’为引物，以蓝莓中提取的cDNA为模板，克隆得到VcMYB108的开放阅读框序列，连接到pEASY-T1载体上并对其进行测序。
测序结果表明：cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1，由948个核苷酸组成，将其所示的基因命名为VcMYB108，VcMYB108编码的蛋白命名为VcMYB108，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2，由315个氨基酸组成。
2、重组表达载体的获得
制备下述引物对：
VcMYB108-HindIII-F-pHB：
5’-CCCAAGCTTATGGAAGTATATGAAAGCAGAGGTAA-3’；
VcMYB108-XbaI-R-pHB：
5’-TGCTCTAGATTACATGCTGTTAAGCTGCTGCTGTA-3’。
以上述连接有VcMYB108序列的pEASY-T1的质粒为模板进行PCR扩增，后将PCR产物与经相同内切酶酶切的PHB载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，PCR检测阳性单克隆并送测序。
测序结果表明，质粒为将序列表中SEQ ID NO.1所示的VcMYB108插入表达载体PHB的HindIII和XbaI酶切位点间得到的重组载体，将其命名为PHB-VcMYB108。
3、VcMYB108转基因拟南芥的获得及鉴定
1)VcMYB108转基因拟南芥的获得
将上述步骤2制备的重组载体PHB-VcMYB108转化农杆菌GV3101的感受态细胞(购置于上海唯地生物技术公司)，得到重组菌GV3101/PHB-VcMYB108。与50％甘油按1：1混合，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存备用。
将重组菌GV3101/PHB-VcMYB108单克隆接种于含50ug/ml卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养一天。6000rpm离心一分钟收菌，所得农杆菌沉淀用转化Buffer吹打均匀，重悬至OD600＝1.0左右。
采用花絮浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)，收获当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)，在含有卡那霉素(Kanamycin，50ug/ml)的MS培养基进行筛选，传代，直到获得T3代纯合的转VcMYB108拟南芥植株种子。实验中选择了三个独立的稳定纯合的VcMYB108-OE-1(OE1-108)、VcMYB108-OE-2(OE2-108)和VcMYB108-OE-3(OE3-108)T3代品系用于下述耐旱性实验，野生型株系(WT)和转空PHB载体的转基因株系(PHB)作为对照。
2)VcMYB108转基因拟南芥的分子检测
分别提取VcMYB108转基因拟南芥T3代植株(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、野生型株系(WT)和转空PHB载体的转基因株系(PHB)的RNA，反转录合成cDNA，然后分别以上述各株系的cDNA为模板，以5’-ATTCTGATTCCCTAACCAGCCC-3’和5’-CTGCTGTAAGAACCAAATGTCCTCA-3’为RT引物进行PCR扩增。同时以蓝莓VcUBC28基因作为内参，扩增VcUBC28基因的正向引物为：5’–CCATCCACTTCCCTCCAGATTATCCAT-3’，反向引物为：5’-ACAGATTGAGAGCAGCACCTTGGA-3’。
VcMYB108基因在各株系中的表达情况如图3所示。结果表明在VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)中VcMYB108基因大量表达，而在野生型株系(WT)和转空PHB载体的转基因株系(PHB)则没有检测到VcMYB108基因的表达。
二、VcMYB108转基因拟南芥抗旱性评价
1、失水逆境对种子萌发的影响
实验中取VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)种子经过消毒后，播种在MS培养基及含有100mM、200mM和300mM的甘露醇的MS培养基上，经过3天春化，置于恒温恒湿光照培养箱中进行种子萌发实验。每个株系播种100粒种子，实验重复3次，结果取平均值，并计算标准差。培养箱光照条件为光照16h，黑暗8h，温度设为22℃，相对湿度为70％左右。实验进行9天并统计各株系种子的萌发率结果。
结果如图4所示，WT表示野生型拟南芥，PHB表示转空载体拟南芥，OE1-108、OE2-108和OE3-108表示VcMYB108转基因拟南芥植株T3代。图4中的A为分别在MS培养基及含有100mM、200mM和300mM的甘露醇的MS培养基上VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)种子的萌发情况；图4中的B-E为播种后每天的萌发率统计结果；图4中的F为各处理在MS培养基及含有100mM、200mM和300mM的甘露醇的MS培养基上的萌发率统计结果，MS培养基作为对照。结果表明，在MS和100mM甘露醇培养基上，OE1-108、OE2-108和OE3-108种子的萌发率与其对照组(WT、PHB)相比没有显著差异。但在含有200mM和300mM的甘露醇模拟干旱胁迫的MS培养基上，VcMYB108转基因拟南芥植株(OE1-108、OE2-108和OE3-108)的萌发率明显高于WT和PHB组(图4)，约高出40％。野生型拟南芥(WT)和过表达空载体拟南芥植株(PHB)的结果无显著差异。
2、失水逆境对根长的影响
实验中取VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)种子经过消毒后，播种于MS培养基上，经过3天春化后移到培养箱培养7d，挑选长度一致的VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)幼苗，在无菌环境下分别移到MS培养基及含有100mM、200mM和300mM的甘露醇的MS培养基上，培养8天，统计各株系的根长。每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。培养箱光照条件为光照16h，黑暗8h，温度设为22℃，相对湿度为70％左右。统计各株系的根长结果。结果如图5所示，在以MS作为对照的培养基上，VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)幼苗根长无显著差异；但在MS培养基及含有100mM、200mM和300mM的甘露醇的MS培养基上，转VcMYB108拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)的根长要显著长于转空载体拟南芥及野生型拟南芥，约高出50％。
3、土壤失水对转基因植株抗旱性的影响
实验中取VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)种子经过消毒后，播种在MS培养基上，经过3天春化，置于恒温恒湿光照培养箱中培养13天。培养箱光照条件为光照16h，黑暗8h，温度设为22℃，相对湿度为70％左右。将各株系的拟南芥幼苗移至营养土：蛭石为1:1的培养基质中，在培养基质中生长13天后，使其吸水至饱和，停止浇水19天，复水3天后统计存活率，观察各株系表型并拍照。
实验结果如图6所示(WT表示野生型拟南芥，PHB表示转空载体拟南芥，OE1-108、OE2-108和OE3-108表示转VcMYB108拟南芥植株T3代)，其中A图所示为VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)在正常生长条件下、干旱处理19天及复水后3天后，拟南芥植株的生长情况；图B为各株系离体叶片的失水率变化统计结果；图C为干旱处理复水后各株系的存活率。如图6A所示，在正常生长条件下，过表达株系和空载体株系及野生型株系的生长情况基本一致；失水后空载株系和野生型株系的长势明显弱于过表达株系；复水后的表型实验统计显示，转VcMYB108拟南芥株系存活率较转空载株系和野生型株系高出80％左右，达到显著水平。以上结果中野生型拟南芥(WT)和空载株系(PHB)的结果无显著差异。
上述结果表明，植物中VcMYB108基因的过表达能够提高拟南芥对干旱胁迫的耐受能力，VcMYB108基因起到正调控植物耐旱性的功能。
实施例3
过表达VcMYB108基因对植物生长发育的影响，包括以下步骤：
实验中取VcMYB108转基因拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108)、转空载体拟南芥(PHB)以及野生型拟南芥(WT)种子经过消毒后，播种在MS培养基上，经过3天春化，置于恒温恒湿光照培养箱中培养13天。培养箱光照条件为光照16h，黑暗8h，温度设为22℃，相对湿度为70％左右。将各株系的拟南芥幼苗移至营养土：蛭石为1:1的培养基质中，正常条件下培养28天后，对各株系的株高、莲座叶、叶片、果荚及开花时间等进行观测。
实验结果如图7所示(WT表示野生型拟南芥，PHB表示转空载体拟南芥，OE1-108、OE2-108和OE3-108表示VcMYB108转基因拟南芥植株T3代)。图7中的A-E分别为野生型拟南芥(WT)、过表达空载体拟南芥(PHB)和过表达VcMYB108拟南芥(OE1-108、OE2-108和OE3-108代表三个T3代过表达纯和株系)；图7中的F为各株系株高、叶片长度、果荚长度和开花时间的统计结果。由结果可知，在正常生长条件下，各株系的株高、叶片大小、果荚长度及开花时间基本一致，并无明显差异。这些结果表明，虽然VcMYB108基因作为正调控植物耐旱性的转录因子能够显著提高植物在干旱胁迫下的耐受能力，但过表达VcMYB108基因并未对植株的生长发育过程产生影响。因此在理论上，当对受体植物的VcMYB108基因或其同源基因进行过表达时所产生的转基因品系能够在不牺牲植物生长量的条件下提升植物的耐旱能力。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种与植物耐旱相关的转录因子VcMYB108及其编码基因与应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaagtat atgaaagcag aggtaactgc aaccctaacg attattccat taacttgagt 60
gatcaagaag atggtcaaga gcaagatcag atggagatga ggagaggacc atggactgtt 120
gaagaagact taatgctcat gaattatgtg gctaatcatg gcgaaggccg ctggaattct 180
ctcgctcgct gcgcaggtct aaagcgaact ggaaaaagtt gcagattaag gtggctgaat 240
tatctacgcc cagatgttcg acgtgggaat atttcccttg aggaacaact tttgattctc 300
gaacttcatt ctcgttgggg caatcggtgg tcgaaaattg cgcagcattt accgggtagg 360
accgataacg agatcaagaa ctactggcga actcgggttc aaaagcacgc taagcagctc 420
aaatgtgacg tcaacagcaa gcaattcaaa gacaccatgc gttacctctg gatgccaaga 480
ttggtggaga gaattcaggc agcttcggca gcctccggcg gctccaccac caccaccgcc 540
accacaactg ctgccgccgg ccaagtgata ccggcaccgg gggtttttac cggggacttt 600
gggggtgcac aggttaacaa aacttacacc ccggagaact ctagcacggg ggcgtcttcg 660
gactcgtttg gtgcgcaggt ttcgccggcg tctgatttga ctgattatta ctccaattac 720
ccggtgaata gtaattacag taataatcag aattattacc aagtaaatca gggtaattat 780
tctgattccc taaccagccc ctctggttac tttaatcctg gtttagactt ccaagccgtg 840
gagcagaata gccagcagca gttgtttgat gcagcagggg acatatccga caatttgtgg 900
gatgttgagg acatttggtt cttacagcag cagcttaaca gcatgtaa 948
<210> 2
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Val Tyr Glu Ser Arg Gly Asn Cys Asn Pro Asn Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ile Asn Leu Ser Asp Gln Glu Asp Gly Gln Glu Gln Asp Gln Met Glu
20 25 30
Met Arg Arg Gly Pro Trp Thr Val Glu Glu Asp Leu Met Leu Met Asn
35 40 45
Tyr Val Ala Asn His Gly Glu Gly Arg Trp Asn Ser Leu Ala Arg Cys
50 55 60
Ala Gly Leu Lys Arg Thr Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn
65 70 75 80
Tyr Leu Arg Pro Asp Val Arg Arg Gly Asn Ile Ser Leu Glu Glu Gln
85 90 95
Leu Leu Ile Leu Glu Leu His Ser Arg Trp Gly Asn Arg Trp Ser Lys
100 105 110
Ile Ala Gln His Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr
115 120 125
Trp Arg Thr Arg Val Gln Lys His Ala Lys Gln Leu Lys Cys Asp Val
130 135 140
Asn Ser Lys Gln Phe Lys Asp Thr Met Arg Tyr Leu Trp Met Pro Arg
145 150 155 160
Leu Val Glu Arg Ile Gln Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Gly Ser Thr
165 170 175
Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gln Val Ile Pro Ala
180 185 190
Pro Gly Val Phe Thr Gly Asp Phe Gly Gly Ala Gln Val Asn Lys Thr
195 200 205
Tyr Thr Pro Glu Asn Ser Ser Thr Gly Ala Ser Ser Asp Ser Phe Gly
210 215 220
Ala Gln Val Ser Pro Ala Ser Asp Leu Thr Asp Tyr Tyr Ser Asn Tyr
225 230 235 240
Pro Val Asn Ser Asn Tyr Ser Asn Asn Gln Asn Tyr Tyr Gln Val Asn
245 250 255
Gln Gly Asn Tyr Ser Asp Ser Leu Thr Ser Pro Ser Gly Tyr Phe Asn
260 265 270
Pro Gly Leu Asp Phe Gln Ala Val Glu Gln Asn Ser Gln Gln Gln Leu
275 280 285
Phe Asp Ala Ala Gly Asp Ile Ser Asp Asn Leu Trp Asp Val Glu Asp
290 295 300
Ile Trp Phe Leu Gln Gln Gln Leu Asn Ser Met
305 310 315
Claims (10)
1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；或在SEQID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
3.权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于，A1)所述核酸分子为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或权利要求3所述的相关生物材料在正调控植物耐旱性中的应用。
5.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或权利要求3所述的相关生物材料在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。
6.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或权利要求3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。
7.根据权利要求4-6之一所述应用，其特征在于，所述应用包括：在目标受体中提高权利要求1所述的蛋白质的含量，从而提高目标受体的耐旱性。
8.根据权利要求4-6之一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于：在植物受体中导入编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，得到耐旱性提高的转基因植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
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2022
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