CN110713994B

CN110713994B - 一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用

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Publication number: CN110713994B
Application number: CN201810678201.5A
Authority: CN
Inventors: 徐兆师; 杜勇涛; 何冠华; 崔晓玉; 赵梦洁; 陈隽; 陈明; 周永斌; 马有志
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: CN110713994A

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。实验证明：将TaMAPK3基因导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，其对干旱、高盐和病害的抗性均高于野生型拟南芥，本发明提供的蛋白和基因将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

Description

一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，蛋白激酶在植物胁迫信号的感知、传递的调控中起着重要作用。

到目前为止，已发现的蛋白激酶约有300种左右。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中，蛋白激酶形成了纵横交错的网络。这类酶催化从ATP转移出磷酸并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而改变蛋白质、酶的构象和活性。根据蛋白激酶的磷酸化氨基酸残基的种类，蛋白激酶可以分为Ser/Thr蛋白激酶，Tyr蛋白激酶以及双特异性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MACDPK1，CDCDPK1，JNK等。这种类型的蛋白激酶目前研究的较多，并且在信号传导途径中起重要作用。而酪氨酸蛋白激酶分为两类，一类是非受体型酪氨酸蛋白激酶，以src基因产物为代表，此外还有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Ab1等；另一类是受体型酪氨酸蛋白激酶，根据它们的结构不同，受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型。在动物细胞中，酪氨酸蛋白激酶往往参与程序性细胞死亡、癌变等重要细胞行为。

蛋白激酶在植物响应逆境胁迫的信号传导途径中占有重要的地位。蛋白激酶通过自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通过磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活性，然后底物蛋白又调控下游基因的酶活，形成一个级联调控途径。如RAS信号调控途径，在细胞受体酪氨酸蛋白激酶感受到配体的信号后，形成二聚体并发生自身磷酸化，激活RAS，然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的级联反应。这种级联调控是一种很精密很复杂的调控网络，蛋白激酶可能在上游作为一种开关在行使其功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关的蛋白。

本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白来源于麦类小麦属(Triticumaestivum L.)，名称为TaMAPK3，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由369个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质TaMAPK3，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质TaMAPK3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质TaMAPK3的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与TaMAPK3蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与TaMAPK3蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码TaMAPK3蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第349-1458位所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaMAPK3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaMAPK3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaMAPK3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaMAPK3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaMAPK3且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码TaMAPK3的核酸分子的表达盒(TaMAPK3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaMAPK3的DNA，该DNA不但可包括启动TaMAPK3转录的启动子，还可包括终止TaMAPK3转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子及豌豆rbcS E9终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述TaMAPK3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体为将上述TaMAPK3基因插入pBI121载体中得到的重组载体，具体为将pBI121载体的SmaI和SpeI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1第349-1458位所示的TaMAPK3基因，且保持pBI121载体的其他序列不变后得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料在调控植物抗病性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高。

本发明还提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高和/或抗病性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料在参与BR信号转导途径中的应用。

本发明还提供了TaMAPK3蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；所述抗病性为抗病原菌PstDC3000侵染引起的病害。

所述提高植物耐旱性和/或耐盐性或参与BR信号转导途径具体体现在如下(1)-(5)中任一种：(1)在干旱或盐或BR处理下，提高植物发芽率；(2)在干旱或盐或BR处理下，提高植物总根长；(3)在干旱或盐或BR处理下，提高植物存活率；(4)在干旱或盐或BR处理下，提高植物下胚轴长度；(5)在干旱或盐或BR处理下，提高植物抗病相关基因表达量；所述抗病相关基因具体为PR1和/或PR2和/或PR5和/或ICS1。所述干旱处理为PEG处理或控水处理；所述PEG处理的浓度具体为3％、6％或9％。所述盐处理为NaCl处理；所述NaCl处理的浓度具体为75mM、100mM、125mM或250mM。所述BR处理的浓度具体为0.01μΜ、0.1μΜ或0.2μΜ。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高和/或抗病性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高和/或抗病性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中TaMAPK3蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中TaMAPK3蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达TaMAPK3蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将TaMAPK3蛋白质的编码基因导入受体植物；所述TaMAPK3蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第349-1458位所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，TaMAPK3蛋白质的编码基因(即序列1第349-1458位所示的核苷酸)通过含有TaMAPK3蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pBI121-TaMAPK3导入受体植物中。所述重组载体pBI121-TaMAPK3为将pBI121载体的SmaI和SpeI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1第349-1458位所示的TaMAPK3基因，且保持pBI121载体的其他序列不变后得到的载体。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述抗病性为抗病原菌PstDC3000侵染引起的病害。

所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(4)中任一种：(1)转基因植物的发芽率高于受体植物；(2)转基因植物的总根长长于受体植物；(3)转基因植物的存活率高于受体植物；(4)转基因植物的下胚轴长度长于受体植物。

所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物体现在转基因植物的抗病相关基因表达量高于受体植物或转基因植物叶片的黄化面积低于受体植物。所述抗病相关基因具体为PR1和/或PR2和/或PR5和/或ICS1。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaMAPK3基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

通过实验证明：本发明发现的TaMAPK3基因在高盐、干旱、BR的诱导下表达，且将TaMAPK3基因导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，其对干旱、高盐和病害的抗性均高于野生型拟南芥，本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为转TaMAPK3拟南芥在盐胁迫处理下的萌发实验、根长实验及后期生长情况。

图2为转TaMAPK3拟南芥在PEG胁迫处理下的萌发实验、根长实验及后期干旱胁迫处理下的生长情况。

图3为转TaMAPK3拟南芥在BR和BRZ处理下的下胚轴长度的统计结果。

图4为转TaMAPK3拟南芥的抗病性检测。

图5为转TaMAPK3拟南芥的抗病相关基因的表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

下述实施例中的普通小麦(Triticum aestivum L.)品种小白麦记载于文献“孙海桃等，小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011,44(22)：4740-4747.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；公众也可从国家种质资源库获得(编号为ZM242)。

实施例1、TaMAPK3的克隆

一、植物材料的处理

将水培生长10天左右的小白麦(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai)三叶期整株幼苗用浓度为100mM的NaCl水溶液浸泡处理2小时，并将处理后的幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。

二、总RNA的提取

采用Trizol法(TianGen)提取步骤一获得的处理后的小白麦幼苗叶片的总RNA。

三、cDNA的获得

第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。通过5’RACE和3’RACE的方法获得序列表中的序列1。上述序列1也可以通过人工合成的方式获得。

将序列表中序列1所示的基因命名为TaMAPK3基因，其开放阅读框架为自序列表的序列1的5′端第349-1458位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为TaMAPK3蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，由369个氨基酸残基组成。

实施例2、转TaMAPK3拟南芥的获得及其耐逆性分析

一、转TaMAPK3拟南芥的获得

1、重组表达载体的构建

(1)TaMAPK3基因的克隆

提取小白麦叶片总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA模板，采用引物对TaMAPK3-121F和TaMAPK3-121R进行扩增，得到PCR产物。引物序列如下(引物末端分别引入Sma I和Spe I酶切识别位点，如下划线序列所示)：

TaMAPK3-121F：5'-TTACCCGGGATGGCGATGATGGTGGATC-3'(序列3)；

TaMAPK3-121R：5'-AGAACTAGTCATATTCACCATCCTGGCGGC-3(序列4)。

将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为1.1kb。并将该PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1，即为TaMAPK3基因。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收纯化大小为1.1kb的PCR产物。

(2)用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切步骤(1)回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切pBI121载体(Clontech公司)，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物。

(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化TOP10菌株(Tiangen，CB104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。

测序结果表明，该质粒为将pBI121载体的Sma I和Spe I酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1第349-1458位所示的TaMAPK3基因，且保持pBI121载体的其他序列不变后得到的重组载体，并将其命名为pBI121-TaMAPK3。

2、重组菌的构建

(1)将步骤1获得的重组质粒pBI121-TaMAPK3转化农杆菌C58(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明该质粒为pBI121-TaMAPK3，证明该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为C58/pBI121-TaMAPK3。

3、转TaMAPK3拟南芥的获得

(1)将重组农杆菌C58/pBI121-TaMAPK3接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。

(2)将步骤(1)获得的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml利福平)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)。

(3)收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为1.0。

(4)将拟南芥哥伦比亚生态型Col-0(美国拟南芥信息资源网，以下简称为野生型拟南芥，购自SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤(3)获得的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，混收T₀代转TaMAPK3拟南芥种子。将T₀代转TaMAPK3拟南芥种子播种到含有50mg/ml卡那霉素的MS培养基上培养，得到7株T₁代转TaMAPK3拟南芥幼苗。

采用同样的方法将空载体pBI121转入野生型拟南芥，得到T₁代转空载体拟南芥。

分别将T₁代转TaMAPK3拟南芥和T₁代转空载体拟南芥播种、自交，直到得到T₃代转TaMAPK3拟南芥和T₃代转空载体拟南芥。

提取T₃代转TaMAPK3拟南芥植株的DNA，以TaMAPK3-121F和TaMAPK3-121R为引物进行PCR检测，得到条带为1.1kb的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥植株。选取T3代转TaMAPK3拟南芥纯合株系MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3用于下一步的耐逆性分析。

二、转TaMAPK3拟南芥的耐盐性分析

1、高盐胁迫下的种子萌发实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK拟南芥种子、T₃代转空载体拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子(mpk1突变体是TaMAPK3对应拟南芥中的同源基因AtMAPK1的突变体，突变体种子从ABRC(Arabidopsis Biological ResourceCenter)订购，种子编号为SALK_063847)和野生型拟南芥种子(WT)播种在含有不同浓度NaCl(0mM、75mM、100mM和125mM)的1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，连续观察培养12、24、36、48、60、72小时后的各植株的萌发情况并统计发芽率。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1A和图1B所示，从图中可以看出，T₃代转TaMAPK3拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)在75mM、100mM和125mM NaCl处理下，发芽率均有下降，但是转TaMAPK3拟南芥表现出一定的优势，发芽率高于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

2、高盐胁迫下的根长实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK拟南芥种子、T₃代转空载体拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，正常生长6天后移至含有不同浓度NaCl(0mM、75mM、100mM和125mM)的1/2MS培养基上进行培养，培养7天后统计总根长。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1C和图1D所示，从图中可以看出：T₃代转TaMAPK3拟南芥在75mM、100mM和125mM的NaCl处理下总根长均长于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

3、高盐胁迫下的存活率实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK拟南芥种子、T₃代转空载体拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，培养一周后移至培养盆(蛭石：营养土为1:1)中，在16/8h的光照/黑暗培养室(22℃)培养，2周后用含250mM NaCl的水溶液浇灌(自然渗吸)进行高盐胁迫处理，处理14天后观察各植株的生长状态并统计存活率。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1E和图1F所示，从图中可以看出，编号为MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3的T₃代转TaMAPK3拟南芥的长势明显优于野生型拟南芥，存活率显著高于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

三、转TaMAPK3拟南芥的耐旱性分析

1、PEG处理下的种子萌发实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在含有不同浓度PEG(0％、3％、6％和9％)的1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，连续观察培养12、24、36、48、60、72小时后的各植株的萌发情况并统计发芽率。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图2A和图2B所示，从图中可以看出，T₃代转TaMAPK3拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)在3％、6％和9％PEG处理下发芽率均有下降，但T₃代转TaMAPK3拟南芥仍表现出一定的优势。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

2、PEG处理下的根长实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，正常生长6天后移至含有不同浓度PEG(0％、3％、6％和9％)的1/2MS培养基上培养，培养7天后统计总根长。

结果如图2C和图2D所示，从图中可以看出，T₃代转TaMAPK3拟南芥在3％、6％和9％PEG的处理下总根长均长于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

3、干旱处理下的存活率实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，培养一周后移至培养盆(蛭石：营养土为1:1)中，在16/8h的光照/黑暗培养室(22℃)培养，2周后开始控水(自然干旱)，控水两周后复水三天。干旱处理后观察各植株的生长状态并统计复水后存活率。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图2E和图2F所示，从图中可以看出，编号为MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3的T₃代转TaMAPK3拟南芥的抗旱性明显优于野生型拟南芥，存活率显著高于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

四、转TaMAPK3拟南芥的BR途径分析

1、BR处理下的下胚轴伸长实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在含有不同浓度Brassinosteroids(BRs，油菜素内酯)(0μΜ、0.01μΜ、0.1μΜ和0.2μΜ)的1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常光照条件下进行培养，培养7天后统计下胚轴长度。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图3A和图3B所示，从图中可以看出，编号为MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3的T₃代转TaMAPK3拟南芥(MAPK3)在BR处理下下胚轴长度明显长于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

2、BRZ处理下的下胚轴伸长实验

分别将编号为MAPK31-1、MAPK31-2和MAPK31-3的阳性T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在含有不同浓度Brassinazole(BRZ，油菜素唑)(0μΜ、0.2μΜ、0.5μΜ和1.0μΜ)的1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在黑暗条件下进行培养，培养7天后统计下胚轴长度。每个株系30个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图3C和3D所示。从图中可以看出：编号为MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3的T₃代转TaMAPK3拟南芥(MAPK3)在BRZ处理下下胚轴长度明显短于野生型拟南芥。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

五、转TaMAPK3拟南芥的抗病性分析

1、接菌实验

分别将编号为MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3的T₃代转TaMAPK3拟南芥种子、mpk1突变体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常光照条件下进行培养，培养10天后移至蛭石：营养土为1:1的基质中生长，待生长至四周大时进行接菌。接菌方法如下：将新鲜的病原菌Pst DC3000接种于King's medium B(KB)上，28℃条件下生长48h后，挑取单克隆，用10mM MgCl₂溶液重悬至OD值为0.002。然后将重悬好的菌液用去掉针头的注射器接种到四周大的拟南芥叶片上，每个基因型注射5株，每株注射4-5个叶片，共20-25个叶片。3d后，对注射过菌液的叶片进行观察照相。以仅注射10mMMgCl₂溶液作为对照。

结果如图4所示，从图中可以看出：接种病原菌Pst DC3000后，MAPK3-1、MAPK3-2和MAPK3-3三个过表达株系与野生型拟南芥相比，过表达株系叶片的黄化程度和面积显著低于野生型，而mpk1突变体和野生型拟南芥之间则无明显差异。在注射10mM MgCl₂后，无论是mpk1突变体、野生型还是过表达株系，叶片的黄化程度和面积均没有明显差异。

2、抗病相关基因的表达量检测

分别在接种病原菌Pst DC3000后第12h，24h，36h，48h，60h和72h这六个时间点取样，以接病原菌前为对照(0h)。样品采用Trizol法(TianGen)提取叶片总RNA，然后用

RT/RI Enzyme Mix(全式金)合成第一链cDNA。以拟南芥的Actin作为内参，在7500型号的仪器(Bio-Rad)上进行实时定量PCR(qRT-PCR)，检测抗病相关基因PR1、PR2、PR5、ICS1和EDS1的相对表达量。引物序列如下：

qAtActin2+F1：AAGTCTTGTTCCAGCCCTCG；

qAtActin2+R1：TCTGATCAATTTTTACCTGCTGGA；

RT-PR1-F：TCTAAGGGTTCACAACCAGGC；

RT-PR1-R：CGCTACCCCAGGCTAAGTTT；

RT-PR5-F：CAATTGCCCTACCACCGTCT；

RT-PR5-R：CGCCATCGCCTACTAGAGTG；

RT-PR2F：AAGTCCATCGGACGTTGTGG；

RT-PR2R：ACTGGGAACGTCGAGGATGA；

RT-EDS1F：GAGTGCGGATCATGCTTTTG；

RT-EDS1R：ATCCATTCTCCAAGCATCCC；

RT-ICS1F：TTTTGGTGGCGAGGAGAGTG；

RT-ICS1R：CTTCCAGCTACTATCCCTGTCC。

结果如图5所示，从图中可以看出：在接种病原菌Pst DC3000后，前60h过表达株系PR1的表达量高于野生型；前48h过表达株系ICS1的表达量高于野生型；在24h时，过表达株系PR2和PR5的表达量出现一个高峰，显著高于野生型，并且在48h时，过表达株系PR2的表达量出现另一个显著高于野生型的高峰。过表达株系和野生型在接种病原菌Pst DC3000后，EDS1的表达则没有规律。另一方面，在接种病原菌Pst DC3000后，突变体PR1和ICS1的表达量在36h和48h低于野生型，其余时间点表达量基本相同；突变体PR2的表达量在24h高于野生型，而在36h和48h则低于野生型，其余时间点相差不大；对于PR5这个抗病相关基因，突变体和野生型的表达基本一致，而EDS1的表达，突变体和野生型均没有规律。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1957

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gccttcccca tcatcttcct cagcctgccg cgtgtgccat cgctagctgc ccgccccttc 60

gctgtacctg agcggcaccc atcgccatct tcctcatccc actcccccaa gtccagtgga 120

gctacgtgcg tgcgtacgtt cgttcgttcc ttccttcctt ccccgaaata aaaaatagac 180

agagtgccct cctgctcggt cgctctctct ctctaccttt ggcctccgcc ttcgtctccg 240

cgtgcgctcc ccatcccctt cctcccccgc ccgctcccga acgagctcgg acgtgctctg 300

cttctccaga tccgccgccg acgctgctgc cgccgcgtcc tgaagaatat ggcgatgatg 360

gtggatcctc cgaacggcat gggaaaccac gggaagcact actacaccat gtggcagacc 420

atgttcgaga tcgacaccaa gtacgtgccg atcaagccca tagggagagg agcctacggg 480

atagtttgct cctcgatcaa ccaggagacc aacgagaagg tcgccatcaa gaagataaac 540

aacgtctttg acaaccgcgt ggatgcgctg aggacgctgc gcgaactgaa gctccttcgg 600

cacctgcgcc atgagaatgt cattgccttg aaggatataa tgatgccgat acataggagg 660

agcttcaagg atgtctactt ggtctccgag ctcatggaca cagatctgca tcagattgtc 720

aagtcgtctc agccgctgtc caatgaccac tgccagtatt tcctttttca gctgctccga 780

ggactgaagt accttcattc agcagggata ctccatagag acctgaagcc tgggaacctt 840

ctggtcaatg caaactgtga cctaaagatc tgtgactttg gcctggctcg cacaaataac 900

actaaaggtc agtttatgac tgaatacgtt gtcacccgtt ggtacagagc tcccgagctg 960

ctgctctgct gcgacaacta tggcacctcc atagatgtct ggtctgttgg ctgcatcttt 1020

gctgagctac ttggccgcaa gccgatcttt ccaggaaccg agtgccttaa tcagcttaag 1080

cttatagtca atgttcttgg caccatgagc gaggctgacc tcgcgttcat tgacaacccg 1140

aaagcgcgca actacattaa atcccttcca tacaccccgg ggatgcccct cagtagcatg 1200

tacccacgcg cgcaccctct tgccattgat ctgttgcaga agatgcttgt cttcgaccct 1260

tccaagagga tcagtgtcac ccaggctctg gagcacccct acatgtcccc gctgtatgat 1320

cccagcgcaa accctcctgc tcaggtgccc atcgatctcg acatagatga aaacattggc 1380

acagatatga tccgagaaat gttgtggcag gagatgctcc agtaccaccc tgaggccgcc 1440

aggatggtga atatgtgaca agcaggaatg aacatgtgag agcagtgtgc cacaccaggg 1500

tcttcacatg ttcgttcttg gtataaagct ttaatacaat catcgcaatg ccgtcgagtg 1560

acctgtttat gtaaatatgt gcacaataaa cggcgtatgg atttctctag ctgtgggtca 1620

gtacttggta gtatatatgg actgctgtgt tgtagaagca gaattcggtt attaagaatc 1680

tggttatgaa gaagcttgtg taagttgtaa tcttctattt tttttccctg attgtaagtt 1740

tgtaagctta gccactgctc tatgtatatg gactactgtg ttgtagaagc ggaattcggt 1800

ttattaagaa ttgggttatg aagaagcttg tgtaagttgt aatcttctct tctccccatg 1860

attgtaagtt gtaattttag aagctgctct atgtatggag gtctaaactt tcaagtgacc 1920

ttgttttgct tctaccttca aatttgtctt gtttctt 1957

<210>2

<211>369

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Ala Met Met Val Asp Pro Pro Asn Gly Met Gly Asn His Gly Lys

1 5 10 15

His Tyr Tyr Thr Met Trp Gln Thr Met Phe Glu Ile Asp Thr Lys Tyr

20 25 30

Val Pro Ile Lys Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser

35 40 45

Ser Ile Asn Gln Glu Thr Asn Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn

50 55 60

Asn Val Phe Asp Asn Arg Val Asp Ala Leu Arg Thr Leu Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Leu Leu Arg His Leu Arg His Glu Asn Val Ile Ala Leu Lys Asp

85 90 95

Ile Met Met Pro Ile His Arg Arg Ser Phe Lys Asp Val Tyr Leu Val

100 105 110

Ser Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Val Lys Ser Ser Gln

115 120 125

Pro Leu Ser Asn Asp His Cys Gln Tyr Phe Leu Phe Gln Leu Leu Arg

130 135 140

Gly Leu Lys Tyr Leu His Ser Ala Gly Ile Leu His Arg Asp Leu Lys

145 150 155 160

Pro Gly Asn Leu Leu Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp

165 170 175

Phe Gly Leu Ala Arg Thr Asn Asn Thr Lys Gly Gln Phe Met Thr Glu

180 185 190

Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Cys Cys

195 200 205

Asp Asn Tyr Gly Thr Ser Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe

210 215 220

Ala Glu Leu Leu Gly Arg Lys Pro Ile Phe Pro Gly Thr Glu Cys Leu

225 230 235 240

Asn Gln Leu Lys Leu Ile Val Asn Val Leu Gly Thr Met Ser Glu Ala

245 250 255

Asp Leu Ala Phe Ile Asp Asn Pro Lys Ala Arg Asn Tyr Ile Lys Ser

260 265 270

Leu Pro Tyr Thr Pro Gly Met Pro Leu Ser Ser Met Tyr Pro Arg Ala

275 280 285

His Pro Leu Ala Ile Asp Leu Leu Gln Lys Met Leu Val Phe Asp Pro

290 295 300

Ser Lys Arg Ile Ser Val Thr Gln Ala Leu Glu His Pro Tyr Met Ser

305 310 315 320

Pro Leu Tyr Asp Pro Ser Ala Asn Pro Pro Ala Gln Val Pro Ile Asp

325 330 335

Leu Asp Ile Asp Glu Asn Ile Gly Thr Asp Met Ile Arg Glu Met Leu

340 345 350

Trp Gln Glu Met Leu Gln Tyr His Pro Glu Ala Ala Arg Met Val Asn

355 360 365

Met

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

ttacccggga tggcgatgat ggtggatc 28

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

agaactagtc atattcacca tcctggcggc 30

Claims

1.蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在提高植物耐旱性和/或耐盐性和/或参与BR信号转导途径中的应用；

或，蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

或，蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在培育耐旱性和/或耐盐性提高和/或抗病性提高的转基因植物中的应用；

所述蛋白质为如下a)或b)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

与所述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码所述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

所述抗病性为抗病原菌Pst DC3000侵染引起的病害；

提高植物耐旱性和/或耐盐性和/或参与BR信号转导途径为如下(1)- (5)中任一种：(1)在干旱或盐或BR处理下，提高植物发芽率；(2)在干旱或盐或 BR处理下，提高植物总根长；(3)在干旱或盐或BR处理下，提高植物存活率；(4) 在干旱或盐或BR处理下，提高植物下胚轴长度；(5)在干旱或盐或BR处理下，提高植物抗病相关基因表达量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第349-1458位所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.一种培育耐逆性提高和/或抗病性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性和/或抗病性高于所述受体植物；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

所述抗病性为抗病原菌Pst DC3000侵染引起的病害；

提高植物耐旱性和/或耐盐性体现在如下(1)- (5)中任一种：(1)在干旱或盐处理下，提高植物发芽率；(2)在干旱或盐处理下，提高植物总根长；(3)在干旱或盐处理下，提高植物存活率；(4) 在干旱或盐处理下，提高植物下胚轴长度；(5)在干旱或盐处理下，提高植物抗病相关基因表达量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(4)中任一种：

(1)转基因植物的发芽率高于受体植物；

(2)转基因植物的总根长长于受体植物；

(3)转基因植物的存活率高于受体植物；

(4)转基因植物的下胚轴长度长于受体植物。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物体现在转基因植物的抗病相关基因表达量高于受体植物或转基因植物叶片的黄化面积低于受体植物。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入受体植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第349-1458位所示的DNA分子。

10.根据权利要求4-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。