CN107022011B - 一种大豆转录因子GmDISS1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大豆转录因子GmDISS1及其编码基因与应用。本发明将编码蛋白GmDISS1的DNA分子导入植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根、转基因毛状根的萎蔫程度低于转空载体毛状根；在PEG模拟的干旱胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根。说明GmDISS1蛋白及其编码基因GmDISS1与植物耐旱和耐盐相关，能显著提高植物的耐盐性和耐旱性。本发明的耐盐/耐旱相关蛋白及其编码基因对培育耐旱/耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

一种大豆转录因子GmDISS1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种大豆转录因子GmDISS1及其编码基因与应用。
背景技术
环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫。其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。
大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，弄清其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白；本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为GmDISS1，为如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中，序列2由173个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述c)中的蛋白质GmDISS1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质GmDISS1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质GmDISS1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1由522个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmDISS1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmDISS1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmDISS1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码GmDISS1的核酸分子的表达盒(GmDISS1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmDISS1的DNA，该DNA不但可包括启动GmDISS1转录的启动子，还可包括终止GmDISS1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP″，Chao等人(1999)Plant PhVsiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(BeachV等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313：810；Rosenberg等人(1987)Gene，56：125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262：141；Proudfoot(1991)Cell，64：671；Sanfacon等人Genes Dev.，5：141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2：1261；Munroe等人(1990)Gene，91：151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.，15：9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GmDISS1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述生物材料在调控植物抗逆性中的应用。
上述应用中，所述调控为提高。
上述应用中，所述抗逆性为抗盐胁迫和/或抗旱胁迫。
上述提高植物抗逆性具体体现为将编码蛋白GmDISS1的DNA分子通过含有编码蛋白GmDISS1的DNA分子的重组载体导入植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根、转基因毛状根的萎蔫程度低于转空载体毛状根；在干旱胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根。其中，所述转空载体毛状根为将pROKII载体转入植物得到的转空载体毛状根。所述含有编码蛋白GmDISS1的DNA分子的重组载体为重组载体pROKII-GmDISS1；所述重组载体pROKII-GmDISS1为将GmDISS1基因(序列1)正向插入pROKII植物表达载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，且保持pROKII植物表达载体的其他序列不变得到的载体。
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述大豆可为大豆南农1138-2或大豆科丰1号等品种。
本发明将编码蛋白GmDISS1的DNA分子导入植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根、转基因毛状根的萎蔫程度低于转空载体毛状根；在PEG模拟的干旱胁迫下，转基因毛状根相对生长率高于转空载体毛状根。说明GmDISS1蛋白及其编码基因GmDISS1与植物耐旱和耐盐相关，能显著提高植物的耐盐性和耐旱性。本发明的耐盐/耐旱相关蛋白及其编码基因对培育耐旱/耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为GmDISS1在耐盐和盐敏大豆品种中的表达特性。
图2为GmDISS1表达受高盐和干旱胁迫诱导。
图3为转基因毛状根的分子鉴定。
图4为转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)在正常条件下和盐胁迫条件下的表型和相对生长率。图4A为转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)在正常条件下的表型；图4B为转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)在100mM NaCl条件下的表型；图4C为转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)在80mM NaCl条件下的相对生长率。
图5为转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根的在干旱胁迫下的相对生长率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
下述实施例中的大豆科丰1号(Glycine max L.Merr.Kefeng 1)在文献“W.K.Zhang，Y.J.Wang，G.Z.Luo，J.S.Zhang，C.Y.He，X.L.Wu，J.Y.Gai，S.Y.Chen，QTLmapping of ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L..Merr.)geneticmap and their association with EST markers，Theor.Appl.Genet，2004，108：1131-1139”中公开过，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
下述实施例中的大豆南农1138-2(Glycine max(L.)Merr)购买于南京农业大学国家大豆改良中心种质库，公众可从南京农业大学国家大豆改良中心获得。
下述实施例中的pROKII载体(双元表达载体)在文献“D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologicallyactive viral satellite RNA from the nuclear genome of transformedplants.Nature 321(1986)，pp.446-449”中公开过，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
下述实施例中的pZH01载体是Stratagene公司的产品。
下述实施例中的发根农杆菌K599在文献“Attila Kereszt，et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of rootbiology，Nature Protocols，2007，2(4)，549-552)”中公开过，公众可从Peter M Gressnon教授，The University of Queensland，St Lucia，Queensland 4072，Australia获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、大豆GmDISS1基因的获得
一、大豆GmDISS1基因的获得
以科丰1号(盐敏)和南农1138-2(耐盐)为亲本的重组自交系为定位群体，在染色体上定位了大豆耐盐区域。在该区域所涉及到的基因中，筛选到位点名为Glyma.03G173100(Locus name：Glyma.03G173100)的基因，该基因是含锌指结构的ZAT11类的转录因子，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GmDISS1，GmDISS1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的氨基酸序列命名为GmDISS1蛋白。
二、GmDISS1基因在耐盐和盐敏大豆品种中的表达特性
在正常条件下，检测了GmDISS1基因在耐盐和盐敏大豆品种中的表达特性。具体步骤如下：
1、将大豆耐盐品种南农1138-2(1138)和盐敏品种科丰1号(KF)种子分别种在盆中，光照培养，生长2个星期后取幼苗的根、茎和叶，分别提取RNA。
2、以步骤1获得的RNA为模板，采用逆转录酶反转录合成cDNA。
3、以步骤2获得的cDNA为模板，采用QRT-F2-1和QRT-R2-1引物进行Real Time-PCR，引物序列如下：QRT-F2-1：5’GGTCGAAACTTGAGGGAGATGAAC；QRT-R2-1：5’GAAGAAAAATCTTCGTTAATGGTTGTC。大豆Tublin基因为内参基因，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA。
Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的Real Time PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。
Real-Time PCR检测结果如图1所示：GmDISS1基因在耐盐和盐敏亲本的茎中表达无显著性差异；GmDISS1基因在耐盐和盐敏亲本的根和叶中表达有明显差异，耐盐亲本南农1138-2(1138)的根和叶中的GmDISS1基因的表达量明显高于盐敏亲本科丰1号(KF)。
三、逆境胁迫处理下大豆GmDISS1基因的表达特征
分别将大豆耐盐品种南农1138-2(1138)和盐敏品种科丰1号(KF)种子种在盆中，生长2个星期后，取幼苗分别进行干旱胁迫和高盐胁迫处理，然后通过Real-TimePCR检测在胁迫处理后的GmDISS1基因表达情况。具体步骤如下：
1、将豆苗根部小心的吸去水分，置于滤纸上暴露于室温空气(干旱胁迫)中，或置于1％NaCl溶液(高盐胁迫)中，于0、3、6、9小时分别收集新鲜的根部和叶片各1g，分别提取总RNA。
2、以步骤1获得的RNA为模板，用逆转录酶反转录合成cDNA。
3、以步骤2获得的cDNA为模板，采用QRT-F2-1和QRT-R2-1引物进行Real Time-PCR，引物序列如下：QRT-F2-1：5’GGTCGAAACTTGAGGGAGATGAAC；QRT-R2-1：5’GAAGAAAAATCTTCGTTAATGGTTGTC。大豆Tublin基因为内参基因，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA。
Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的Real Time PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。
Real-Time PCR检测结果如图2所示：在科丰1号(KF)和南农1138-2(1138)根中，与未处理对照(0时)比较，在干旱或高盐处理3小时，GmDISS1基因的转录迅速上升，上升直至9小时；而在南农1138-2叶中，于处理3小时时到达峰值，之后下降，但仍高于0时。除盐胁迫南农1138-2根中外，南农1138-2中GmDISS1基因受干旱/高盐处理的诱导幅度均大于科丰1号。
实施例2、转GmDISS1基因大豆毛状根的获得及抗逆性分析
一、转GmDISS1基因大豆毛状根的获得
1、GmDISS1基因植物表达载体的构建
(1)提取南农1138-2幼苗的总RNA，以获得的RNA为模板，采用逆转录酶反转录合成cDNA。
(2)根据在PlantGDB的大豆基因组序列中GmDISS1全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下(下划线代表酶切位点)：
GmDISS1-up：5’CGGGATCCATGAAGAGACAGAGAGATTTCGAG；
GmDISS1-dp：5’GGGGTACCCTATAAAGAATCAACTAAGGCACCAG。
(3)以步骤(1)获得的cDNA为模板，采用上述步骤(2)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为GmDISS1基因。
(4)GmDISS1超表达载体pROKII-GmDISS1的构建
将步骤(3)获得的GmDISS1基因(序列1)正向插入pROKII植物表达载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，且保持pROKII植物表达载体的其他序列不变，得到重组载体pROKII-GmDISS1。
(5)GmDISS1RNAi表达载体的构建
a)pZH01-GmDISS1-RNAi-1载体
以大豆基因组DNA为模板，采用33050Ri-F1和33050Ri-R1引物进行PCR扩增，得到大小为401bp的DNA片段；将大小为401bp的DNA片段插入到pZH01载体的Sal I和Xba I酶切位点间，且保持pZH01载体的其他序列不变，得到含有GmDISS1-RNAi的植物表达载体pZH01-GmDISS1-RNAi-1(图3)。引物序列如下：
33050Ri-F1：TGCTCTAGAGAGCTCGACTATTAATTCGTGGGAGCGTCT；
33050Ri-R1：ACGCGTCGACGGTACCGCTTTGAGTTCATCTCCCTCAAG。
b)pZH01-GmDISS1-RNAi-2载体
以大豆基因组DNA为模板，采用33050Ri-F2和33050Ri-R2引物进行PCR扩增，得到大小为448bp的DNA片段；将大小为448bp的DNA片段插入到pZH01载体的Sal I和Xba I酶切位点间，且保持pZH01载体的其他序列不变，得到含有GmDISS1-RNAi的植物表达载体pZH01-GmDISS1-RNAi-2(图3)。引物序列如下：
33050Ri-F2：TGCTCTAGAGAGCTCCATGAGAAGGCACAGGACAAC；
33050Ri-R2：ACGCGTCGACGGTACCTCAACCAAATATATCAATCCGTCT。
2、重组农杆菌的获得
将上述得到的重组表达载体pROK II-GmDISS1、pZH01-GmDISS1-RNAi-1和pZH01-GmDISS1-RNAi-2分别通过电击法导入发根农杆菌K599，分别得到重组农杆菌。将含有上述质粒的重组农杆菌分别命名为K599/pROKII-GmDISS1、K599/pZH01-GmDISS1-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS1-RNAi-2。
将pROK II载体通过电击法导入发根农杆菌K599，得到K599/pZH01。
3、转GmDISS1基因大豆毛状根的获得
本发明将文献“Attila Kereszt，et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediadedtransformation of soybean to study of root biology，Nature Protocols，2007，2(4)，549-552”中的发根农杆菌侵染法略加改进，具体步骤参考文献“Wang，Fang；Chen，Hao-Wei；Li，Qing-Tian；Wei，Wei；Li，Wei；Zhang，Wan-Ke；Ma，Biao；Bi，Ying-Dong；Lai，Yong-Cai；Liu，xin-Lei；Man，Wei-Qun；Zhang，Jin-Song；Chen，Shou-Yi，GmWRKY27interactswith GmMYB174 to reduce expression of GmNAC29 for stress tolerance in soybeanplants，2015，The Plant Journal，83，224-236”或授权专利“陈受宜等，植物耐逆性相关转录因子GmWRKY78及其编码基因与应用，授权号：ZL2011 1 0053083.7，授权日2013.10.09”中的方法，分别将上述步骤2获得的重组农杆菌K599/pROK II-GmDISS1、K599/pZH01-GmDISS1-RNAi-1和K599/pZH01-GmDISS1-RNAi-2接种于生长6天含两片真叶的大豆科丰1号幼苗，接种后保湿生长(光照16小时，温度25℃，湿度50％)。生长2周后，长出的毛状根即为转基因毛状根，分别获得123个转GmDISS1大豆毛状根(OE)、119个转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、117个转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)，将其进一步用于转基因鉴定和耐逆性检测。
将上述重组菌替换成K599/pZH01，其他步骤不变，得到122个转空载体毛状根根系。
4、转基因毛状根的分子鉴定
分别提取上述步骤3获得的转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)的总RNA，反转录获得cDNA。以cDNA为模板，采用QRT-F2-1：5’GGTCGAAACTTGAGGGAGATGAAC和QRT-R2-1：5’GAAGAAAAATCTTCGTTAATGGTTGTC进行荧光定量PCR，检测GmDISS1基因表达量。以大豆GmTubulin基因为内参基因。实验重复三次，结果取平均值±标准差。
检测结果图3所示：GmDISS1在转GmDISS1大豆毛状根(OE)中的表达量明显高于转空载体毛状根，而在转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)中则明显低于转空载体毛状根。
二、转GmDISS1基因毛状根和转GmDISS1-RNAi毛状根的耐盐和耐旱性检测
1、耐盐性检测
分别将上述步骤一获得的转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)、转空载体毛状根(对照)和野生型大豆(南农1138-2)毛状根按照处理条件不同分成如下三组(各组取约10个株系)：第一组，经100mM NaCl水溶液处理5天(25℃)；第二组，经80mM NaCl水溶液处理3天(25℃)；第三组，浸入水中作为对照(25℃)。实验重复三次，结果取平均值±标准差。处理后对植株和叶片进行拍照观察并统计相对生长率。每一根毛状根的相对生长率＝(处理后根长-处理前根长)/处理前根长，然后取平均值±标准差。
100mM NaCl水溶液处理5天后，拍照观察。转空载体毛状根和3个转基因毛状根的植株及叶表型的拍照结果如图4所示：从图中可以看出，水处理(正常条件)条件下，转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)的表型无显著差异(图4A)；在100mM NaCl处理下，转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)有显著差异，转GmDISS1毛状根(OE)植株和叶片的萎蔫程度显著低于转空载体毛状根对照的植株和叶片，而转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)和转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)植株和叶片的萎蔫程度明显高于对照(图4B)。
80mM NaCl水溶液处理3天，拍照观察。转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和转空载体毛状根(对照)的相对生长率统计结果如图4C所示。从图中可以看出：在80mMNaCl处理3天后，转空载体毛状根(对照)、转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)的相对生长率分别约为38％、55％、19％和26％，转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)与转空载体毛状根(对照)的差异呈极显著。GmDISS1的过表达提高了植株的耐盐性，而干扰GmDISS1的表达的植株的耐盐性也相应下降。说明GmDISS1具有调控植物耐盐性的功能。
2、耐旱性检测
将转空载体毛状根、转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)和野生型大豆(南农1138-2)毛状根分别浸入5％(体积百分含量)PEG(聚乙二醇6000)处理3天(25℃)，以在水中生长为对照，处理后统计相对生长率。每个植株处理的根系各约为10个。实验重复三次，结果取平均值。
5％PEG水溶液处理3天的转空载体毛状根(对照)、转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)的根相对生长率统计结果如图5所示。从图中可以看出：5％PEG处理3天后，转空载体毛状根(对照)、转GmDISS1大豆毛状根(OE)、转GmDISS1-RNAi-1大豆毛状根(Ri-1)、转GmDISS1-RNAi-2大豆毛状根(Ri-2)的相对生长率分别约为55％、78％、61％和48％，转GmDISS1大豆毛状根(OE)的相对生长率显著高于转空载体毛状根(对照)，而Ri-1和Ri-2毛状根相对生长率明显低于OE毛状根，但是与对照没有显著差异。GmDISS1的过表达提高了植株的耐旱性，然而干扰GmDISS1的表达的植株的耐旱性没有下降。说明GmDISS1具有调控植物耐旱性的功能，但是其机制与对耐盐性的调控有所区别。
综上所述，GmDISS1蛋白及其编码基因GmDISS1与植物耐旱和耐盐相关，能显著提高植物的耐旱性和耐盐性。

Claims (2)

1.如下任一所述的相关生物材料在提高植物抗逆性中的应用；
1）蛋白质，是氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
2）编码1）所述的蛋白质的核酸分子；
3）含有2）所述核酸分子的表达盒；
4）含有2）所述核酸分子的重组载体；
5）含有3）所述表达盒的重组载体；
6）含有2）所述核酸分子的重组微生物；
7）含有3）所述表达盒的重组微生物；
8）含有4）所述重组载体的重组微生物；
9）含有5）所述重组载体的重组微生物；
所述抗逆性为抗盐胁迫和/或抗旱胁迫；
所述植物为大豆。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为其编码序列是SEQ IDNO.1所示的cDNA分子。
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