CN109929019A

CN109929019A - 一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109929019A
Application number: CN201910294964.4A
Authority: CN
Inventors: 丁晓东; 于星宇; 冯旭; 刘圆明; 尤宏光; 于汇琳; 潘洪玉
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN109929019B

Abstract

本发明公开了一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用。该蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白质或在上述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质或将上述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。试验证明：GsERF7是具有DNA结合和转录功能的转录因子蛋白，该蛋白与野生大豆蛋白激酶GsSnRK1具有互作关系，GsERF7和GsSnRK1两基因在大豆毛状根中表达可增加毛状根对盐及碱胁迫的耐性，GsERF7蛋白在GsSnRK1蛋白的调控下具有提高植物耐盐碱胁迫能力的潜质，对农业分子育种工作具有重要应用价值。

Description

一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

中国的盐碱地面积约占耕地面积的10％，而且每年都呈增长趋势。土地盐碱化严重制约了我国东北地区乃至全国的农业生产，是限制农作物产量和质量的主要因素之一。为确保我国粮食供给的安全,全国耕地面积必须保证在18亿亩以上,但实际上我国的耕地面积却逐年减少,目前已逼近这一红线。因此，开发利用盐碱地，挖掘逆境农业生态区生产潜力，是我国乃至世界农业发展所面临的重大问题。

大豆富含植物蛋白和油脂，是我国尤其是黑龙江省的一种重要作物。栽培大豆在漫长的进化过程中丢失了很多与环境适应相关的重要基因，比如很多栽培大豆对盐碱很敏感，因此培育优质抗盐碱大豆品种的工作尤为重要。相比于传统的大豆育种工作，分子育种具有时间、定向和高效的优势，但对抗盐碱相关基因的挖掘是分子育种工作的前提。与栽培大豆相比，野生大豆的遗传多样性高，野外生存能力强，能很好地适应盐碱地环境，是基因挖掘和栽培育种的理想种质资源。将野生大豆中能够适应盐碱生长环境的基因重新引入到栽培大豆中，是大豆品种改良的快捷方法。这种将野生种优良性状基因转入到栽培种从而加速作物改良的策略已经在多种作物育种研究中获得成功。

随着分子生物学的快速发展和基因工程技术的日渐成熟，通过转基因分子育种改良作物耐盐碱性、提高作物产量已成为可能。然而，其实现的重要前提是挖掘耐盐碱关键调控基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。

为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为GsERF7，为下述a)、b)和c)中的任意一种蛋白质：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.2由392个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			HA	9	YPYDVPDYA
Myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质GsERF7，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质GsERF7可人工合成，也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质GsERF7的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsERF7蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与GsERF7蛋白相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任意一种：：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其核苷酸序列是如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上的同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由1179个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsERF7蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsERF7蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsERF7蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GsERF7蛋白的核酸分子的表达盒(GsERF7基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsERF7蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsERF7转录的启动子，还可包括终止GsERF7转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”，Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7_硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:0dell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene，56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262:141；Proudfoot(1991)Cell，64:671；Sanfacon等人GenesDev.，5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2:1261；Munroe等人(1990)Gene，91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.l7:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GsERF7基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了GsERF7蛋白质或上述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高。

本发明还提供了GsERF7蛋白或上述相关生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了GsERF7蛋白或上述相关生物材料在作为转录激活因子中的应用；

本发明还提供了GsERF7蛋白或上述相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗盐胁迫和抗碱胁迫。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因材料。

本发明提供的培育抗逆性提高的转基因材料的方法包括在大豆毛状根中过表达GsERF7蛋白，得到大豆毛状根的步骤；所述转基因大豆毛状根的抗逆性高于受体大豆毛状根。

上述方法中，所述抗逆性为抗盐胁迫和抗碱胁迫。

上述方法中，所述转基因大豆毛状根的抗盐胁迫高于所述受体大豆毛状根体现在：转基因大豆毛状根的根长增长量大于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的根鲜重增加量高于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的侧根数目增长量多于受体大豆毛状根；所述转基因大豆毛状根的抗碱胁迫高于所述受体大豆毛状根体现在转基因大豆毛状根子叶的颜色不发生改变，并且受体大豆毛状根子叶的颜色变黄或发黑或死亡。上述方法中，所述提高受体植物中GsERF7蛋白质的活性的方法为在受体材料中过表达GsERF7蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将GsERF7蛋白的编码基因导入受体材料。所述GsERF7蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述方法中，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。

在本发明的一个实施方式中，GsERF7蛋白的编码基因即序列1所示的核苷酸通过含有GsERF7蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7导入农杆菌K599中。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7为将序列1所示的分子插入pPBEL-BiFC载体的PmlI位点之间，且保持pPBEL-BiFC载体的其他序列不变得到的载体。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7表达GsSnRK1蛋白和GsERF7蛋白，pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7表达GsSnRK1(K49M)蛋白和GsERF7蛋白。

上述方法中，所述抗逆性为抗盐、碱胁迫，所述抗盐胁迫具体为抗NaCl胁迫，所述抗碱胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫。体现为在NaCl胁迫的条件下：转基因大豆毛状根的根长、根重和侧根数均高于受体大豆毛状根及转基因大豆毛状根的生长状态优于受体大豆毛状根。在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因大豆毛状根的生长状态优于受体大豆毛状根。

上述方法中，所述受体大豆毛状根为通过发根农杆菌所诱导的大豆毛状根。

上述方法中，所述转基因大豆毛状根可理解为将所述GsERF7基因转化目的植物子叶得到的转基因毛状根。也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

扩增编码上述GsERF7蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明有益效果：

本发明发现了一种与植物盐、碱胁迫耐性相关的转录因子蛋白GsERF7。通过酵母二元杂交验证了GsERF7蛋白与GsSnRK1蛋白激酶的互作关系，并通过拟南芥原生质体进一步证明了GsERF7蛋白与GsSnRK1蛋白激酶的互作且两个蛋白均定位在细胞核中。进一步研究发现该蛋白具有自激活活性并且能够与DRE和GCC顺式作用元件特异性结合。研究发现GsERF7上S36是GsSnRK1的磷酸化位点，进而确定该位点的磷酸化是GsERF7核定位的必要条件。本发明的试验证明，GsERF7和GsSnRK1两基因在大豆毛状根中表达可增加毛状根对盐及碱胁迫的耐性，GsSnRK1对GsERF7的磷酸化是毛状根抗盐碱的前提条件，证明GsERF7蛋白在GsSnRK1蛋白的调控下具有提高植物耐盐碱胁迫能力的潜质。

附图说明

图1为通过酵母二元杂交验证GsSnRK1与GsERF7的互作关系。

图2为通过拟南芥原生质体验证GsSnRK1与GsERF7的互作关系及在细胞中的定位；图中：(A)为pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体构建的示意图；(B)为GsERF7蛋白与GsSnRK1蛋白的互作及亚细胞定位结果。

图3为酵母细胞中GsERF7蛋白的转录激活活性分析；图中：(A)为酵母载体pGBKT7-GsERF7构建的示意图；(B)为GsERF7蛋白不同缺失片段示意图；(C)为通过检测报告基因HIS活性确定GsERF7转录激活区。

图4为在酵母细胞中GsERF7蛋白与DRE或GCC顺式作用元件的结合特性分析；图中：(A)为用于酵母单杂交分析的DRE元件突变，GCC box突变序列示意图；(B)为酵母单杂交检测GsERF7与DRE元件或GCC box的结合特性。

图5为GsSnRK1对GsERF7的磷酸化分析；图中：(A)为Phos-tag^TM检测GsSnRK1对GsERF7的磷酸化；(B)为western blot检测GsSnRK1对GsERF7的磷酸化；(C)为植物细胞中GsSnRK1对GsERF7磷酸化位置的确定。

图6为转基因大豆毛状根分子鉴定。

图7为转基因大豆毛状根在正常生长条件下的表型。

图8为转基因大豆毛状根在150mM NaCl处理下的表型。

图9为转基因大豆毛状根在30mM NaHCO₃处理下的表型。

图10为转基因大豆毛状根在正常生长条件下及盐碱胁迫下的表型量化数据；图中：A-D分别是pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体、pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体、无质粒K599发根农杆菌及转pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体的大豆毛状根根长数据；(E-H)分别是pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体、pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体、无质粒K599发根农杆菌及转pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体的大豆毛状根根鲜重数据；I-L分别是pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体、pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体、无质粒K599发根农杆菌及转pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体的大豆毛状根侧根数数据。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的野生大豆G07256种子在文献“Yang Yu,Ailin Liu,XiangboDuan,Sunting Wang,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Dan Zhu,Chao Chen,Lei Cao,JialeiXiao,Qiang Li,Zaib_un Nisa，Yanming Zhu,Xiaodong Ding.GsERF6,an ethylene-responsive factor from Glycine soja,mediates the regulation of plantbicarbonate tolerance in Arabidopsis.Planta 2016 244(3):681-698”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的发根农杆菌K599在文献“李慧卿，陈超，陈冉冉，宋雪薇，李佶娜，朱延明，丁晓东。利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应。遗传。2018,40(6):496-507”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109在“孙晓丽，段小红，才华，李勇，柏锡，纪巍，季佐军，朱延明。利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质。中国生物化学与分子生物学报，2010,26(11)1050-1058”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pET-32b、pGADT7及pGBKT7载体在文献“Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaodong Ding,Chao Chen,Dan Zhu,Kuide Yin,Lei Cao,Xuewei Song,Pinghui Zhu,Qiang Li,Zaib_un Nisa,Jiyang Yu,Jianying Du,Yu Song,Huiqing Li,Beidong Liu,Yanming Zhu.A novel AP2/ERF family transcription factor from Glycine soja,GsERF71,is a DNA binding protein that positively regulates alkaline stresstolerance in Arabidopsis.Plant Mol Biol(2017)94:509–530”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pPBEL-BiFC载体在文献“Song Yu,Zhang Hang,You Hongguang,Liu Yuanming,Chen Chao,Feng Xu,Yu Xingyu,Wu Shengyang,Wang Libo,Zhong Shihua,Li Qiang,Zhu Yanming,Ding Xiaodong.Identification of novel interactors andpotential phosphorylation substrates of GsSnRK1from wild soybean(Glycinesoja).Plant,cell&environment 2019,42(1):145-157”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell是全式金公司的产品。

实施例1、大豆转录因子GsERF7基因的克隆

一、植物材料的处理

选取饱满的野生大豆G07256种子，用浓HgSO₄处理10min，无菌水冲洗3-4次后放置于湿润的滤纸上暗培养2-3d催芽。待芽长到1-2cm时，将其转移至盛有l/4Hogland营养液的三角瓶中，瓶口处用太空棉固定，使芽浸入培养液中，置于人工气候箱中培养。取3周龄野生大豆幼苗的根放入EP管，置于-80℃保存。

二、RNA提取

采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)提取上述3周龄野生大豆幼苗的根的总RNA。

三、cDNA的获得

以上述步骤2获得的总RNA为模板，采用TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录得到cDNA。

四、PCR扩增

以上述步骤野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF7-Clone-FW和GsERF7-Clone-RV引物及TransStart TopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

GsERF7-Clone-FW：5'，-ATGTGTGGTGGTGCGATTATCTCCG-3'(SEQ ID NO.3)；

GsERF7-Clone-RV：5'-TCAGAAGACTCCTGCCATGGAAGGC-3'(SEQ ID NO.4)。

PCR扩增体系(50μl)：cDNA 1μl，10×TransStart TopTaq Buffer 5μl，2.5mMdNTPs 4μl，Forward Primer(10μM)1μl，Reverse Primer(10μM)1μl，TransStart TopTaqDNA Polymerase 1μl，ddH₂O 37μl。

PCR扩增条件：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃1min30s，32个循环，72℃1min25s，72℃10min，4℃终止反应。

将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量略大于1kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)回收PCR扩增产物，将其与pEASY-T3CloningKit载体(TRANSGENBIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-T3-GsERF7,并将其转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞后送交测序。

测序结果表明:PCR扩增得到大小为1179bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将其命名为GsERF7基因，ORF为序列1的第1-1179位，GsERF7基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、酵母二元杂交验证GsSnRK1与GsERF7的互作

一、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsERF7表达载体的构建

1.GsSnRK1基因的获得

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsSnRK1-BDS和GsSnRK1-BDAS引物及TransStartTopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列):

GsSnRK1-BDS:5’-CCCGGGGACAGATCAACTGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO.5)；

GsSnRK1-BDAS:5’-GTCGACGAGAACACGTAGCTGTGAAAGG-3’(SEQ ID NO.6)。

PCR扩增体系：cDNA1μl，10×TransStart TopTaq Buffer 5μl，2.5mM dNTPs 4μl，上下游引物(10μM)各1μl，TransStart TopTaq DNA Polymerase 1μl，ddH2O 37μl。

2、重组载体pGBKT7-GsSnRK1的构建

用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsSnRK1重组载体，对pGBKT7-GsSnRK1重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pGBKT7-GsSnRK1重组载体为将pGBKT7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。

3、重组载体pGADT7-GsERF7的构建

以pEASY-T3Cloning Kit-GsERF7质粒为模板，采用GsERF7-AD S和GsERF7-AD AS引物进行PCR扩增，得到1186bp的PCR扩增产物，即为GsERF7基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列):

GsERF7-AD S：5’-CCCGGGTTGTGGTGGTGCGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.7)；

GsERF7-AD AS：5’-GTCGACTCATCAGAAGACTCCTGCCATGG-3’(SEQ ID NO.8)。

用限制性内切酶SmaI和XhoI分别对pGADT7载体(Clontech,VersionNo.PR732196)和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGADT7-GsERF7重组载体，并对重组载体进行测序验证。

测序结果表明:pGADT7-GsERF7重组载体为将pGADT7载体的SmaI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF7基因，且保持pGADT7载体的其他序列不变得到的载体。pGADT7-GsERF7重组载体表达GsERF7蛋白。

二、转化酵母菌AH109

分别将pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsERF7两个载体及pGBKT7空载体和pGADT7-GsERF7两个载体及pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-pLAM5两个载体转化酵母菌AH109，分别得到得到含质粒pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsERF7、pGBKT7和pGADT7-GsERF7、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-pLAM5的酵母菌AH109，酵母感受态细胞的制备(LiAc法)及小量LiAc/PEG法转化酵母感受态细胞的具体步骤参见《分子克隆实验指南》第三版及Clontech YeastProtocols Handbook。

三、GsSnRK1和GsERF7的互作分析

通过检测报告基因HIS和β-半乳糖苷酶的活性进一步分析GsSnRK1与GsERF7的互作关系。将含有pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsERF7、pGBKT7和pGADT7-GsERF7、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-pLAM5的酵母菌AH109分别以滴点的方式接种在SD/-Trp/-Leu/-His(含20mM 3-AT)固体培养基上，以pGBKT7空载体与pGADT7-GsERF7载体的组合为空白对照，以pGBKT7-GsSnRK1与pGADT7-pLAM5载体的组合为负对照，30℃培养3天检测报告基因HIS和β-半乳糖苷酶的活性。

结果如图1所示，在SD/-Trp/-Leu/-His(含20mM 3-AT)培养基上，试验组含有pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsERF7重组载体的酵母菌株能够正常生长，而空白对照组及负对照组的酵母菌株均不能正常生长，X-β-gal染色的结果也进一步验证了这一结果，表明了GsSnRK1蛋白与GsERF7蛋白的互作关系。

实施例3、拟南芥原生质体验证GsSnRK1与GsERF7的互作及定位

一、pPBEL-BiFC载体的构建

1.GsSnRK1基因的获得

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsSnRK1-BIS和GsSnRK1-BIAS引物及TransStartTopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsSnRK1-BIS:5’-CCCGGGGACAGATCAACTGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO.9)；

GsSnRK1-BIAS:5’-GTCGACGAGAACACGTAGCTGTGAAAGG-3’(SEQ ID NO.10)。

2.GsERF7基因的获得

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF7-YS和GsERF7-YAS引物及TransStartTopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF7基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsERF7-YS:5’-CCCGGGTGTGGTGGTGCGATTATCTCCG-3’(SEQ ID NO.11)；

GsERF7-YAS:5’-CCCGGGGAAGACTCCTGCCATGGAAGGC-3’(SEQ ID NO.12)。

3.pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体的构建

1)pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的构建

用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对pPBEL-BiFC载体和上述GsSnRK1基因的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体，对pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体为将pPBEL-BiFC载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pPBEL-BiFC载体的其他序列不变得到的载体。pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。

2)pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体的构建

用SmaI限制性内切酶(New England Biolabs)对上述GsERF7基因的PCR扩增产物和用PmlI限制性内切酶(New England Biolabs)对pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体分别进行单酶切，连接，得到含GsERF7基因的亚细胞定位载体。对含GsERF7基因的亚细胞定位载体进行测序验证。

测序结果表明：含GsERF7基因的亚细胞定位载体为将pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的PmlI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF7基因，且保持pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的其他序列不变得到的载体，命名为pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7。

二、拟南芥原生质体转化

采用聚乙二醇法将上述pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体转化到拟南芥原生质体(具体方法参见中科瑞泰植物原生质体制备及转化试剂盒说明书)，选取转化过pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体和pPBEL-BiFC空载体的拟南芥原生质体，装片，利用激光共聚焦显微镜观察。

结果如图2所示:GsERF7蛋白与GsSnRK1蛋白互作并且定位在细胞核中。

实施例4、野生大豆转录因子GsERF7蛋白的转录激活活性分析

一、GsERF7基因的获得

以pEASY-T3Cloning Kit-GsERF7质粒为模板，采用GsERF7-BD S和GsERF7-BD AS引物进行PCR扩增，得到大小为1186bp的PCR扩增产物，即为GsERF7基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列):

GsERF7-BD S：5’-CCCGGGTTGTGGTGGTGCGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.13)；

GsERF7-BD AS：5’-GTCGACTCATCAGAAGACTCCTGCCATGG-3’(SEQ ID NO.14)。

二、重组载体pGBKT7-GsERF7的构建

用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsERF7重组载体，重组载体的结构图如图3A所示，对pGBKT7-GsERF7重组载体进行测序验证。

测序结果表明:pGBKT7-GsERF7重组载体为将pGBKT7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF7基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-GsERF7重组载体表达GsERF7蛋白。

三、表达目的蛋白GsERF7的酵母菌的获得

将pGBKT7-GsERF7重组载体转化酵母菌AH109，得到含质粒pGBKT7-GsERF7的酵母菌AH109，酵母感受态细胞的制备(LiAc法)及小量LiAc/PEG法转化酵母感受态细胞的具体步骤参见《分子克隆实验指南》第三版及Clontech Yeast Protocols Handbook。

四、GsERF7蛋白不同缺失片段的酵母表达载体构建

本研究还分别设计了五对引物对GsERF7蛋白的不同区域进行扩增，构建了含有GsERF7蛋白不同片段的重组载体。具体构建方法如下:

1.以pEASY-T3Cloning Kit-GsERF7质粒为模板，分别采用如下五对引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，即为GsERF7蛋白的不同区域的编码基因(如图3B所示)。引物设计如下:

GsERF7-BD(1-117)S:5’-CCCGGGTTGTGGTGGTGCGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.15)；

GsERF7-BD(1-117)AS:5’-GTCGACTCAGTTCTTCCTCTTTCTCTTGGCA-3’(SEQ IDNO.16)；

GsERF7-BD(1-181)S:5’-CCCGGGTTGTGGTGGTGCGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.17)；

GsERF7-BD(1-181)AS:5’-GTCGACTCAAGCGCCTGAAGGCTCATC-3’(SEQ ID NO.18)；；

GsERF7-BD(118-392)S:5’-CCCGGGTCAGTATCGCGGAATCCGC-3’(SEQ ID NO.19)；

GsERF7-BD(118-392)AS:5’-GTCGACTCATCAGAAGACTCCTGCCATGG-3’(SEQ IDNO.20)；

GsERF7-BD(182-392)S:5’-CCCGGGTGCTTCCTCAAAACGTCTCAAGG-3’(SEQ IDNO.21)；

GsERF7-BD(182-392)AS:5’-GTCGACTCATCAGAAGACTCCTGCCATGG-3’(SEQ IDNO.22)；

GsERF7-BD(114-191)S:5’-CCCGGGTAAGAGGAAGAACCAGTATCGCG-3’(SEQ IDNO.23)；

GsERF7-BD(114-191)AS:5’-GTCGACTCATGGATTCGCCTTGAGACGTTT-3’(SEQ IDNO.24)。

2.用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和Sal(New England Biolabs)分别对pGBKT7载体和上述各个PCR扩增产物进行双酶切，连接，分别得到如下含有GsERF7蛋白不同片段的重组载体:pGBKT7-GsERF7(1-117)重组载体、pGBKT7-GsERF7(1-181)重组载体、pGBKT7-GsERF7(118-392)重组载体、pGBKT7-GsERF7(182-392)重组载体、pGBKT7-GsERF7(114-191)重组载体。

pGBKT7-GsERF7(1-117)重组载体表达序列2第1-117位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF7(1-181)重组载体表达序列2第1-181位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF7(118-392)重组载体表达序列2第118-392位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF7(182-392)重组载体表达序列2第182-392位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF7(114-191)重组载体表达序列2第114-191位氨基酸所示的蛋白。

五、GsERF7蛋白转录激活区域分析

采用上述步骤3中的方法，分别将获得含有GsERF7蛋白不同片段的重组载体导入酵母菌AH09中，通过检测报告基因HIS的活性进一步分析GsERF7的转录激活区。将含有GsERF7蛋白不同片段的重组载体的酵母菌AH109以滴点的方式接种在SD/-Trp/-His(含10mM 3-AT)固体培养基上，以pGBKT7-AtDREB载体为阳性对照，以pGBKT7空载体为阴性对照，30℃培养3天检测报告基因HIS的活性。

结果如图3C所示:阴性对照不能在双缺的培养基上生长，阳性对照和含pGBKT7-GsERF7以及pGBKT7-GsERF7(118-392)和pGBKT7-GsERF7(182-392)重组载体的酵母菌都能在双缺的培养基上生长，加入10mM 3-AT也没有抑制其生长，说明在这些菌种中报告基因HIS表达。综上，GsERF7蛋白第182-392位氨基酸含有GsERF7蛋白发挥转录激活功能必不可少的区域。

实施例5、GsERF7与DRE或GCC元件的结合特异性分析

一、DRE或GCC元件载体和突变载体的构建

1.DRE或GCC元件载体构建

1)DRE元件载体构建

人工设计合成DRE顺式作用元件，序列如下:

DRE sense:5’-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3’(SEQ ID NO.25)；

DRE anti-sense:5’-CATGTCGGTAATGTCGGTAATCTTCGGTAG-3’(SEQ ID NO.26)；

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(DRE sense:5'-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3'，SEQ ID NO.27)和反义链寡核苷酸(DRE anti-sense:5'-CATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAG-3'，SEQ ID NO.28)配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到DRE顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体(Clontech,Version No.PR732190)上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5'端为EcoR I，3'端为Sac I。然后将lμL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入限制性内切酶EcoR I(New England Biolabs)和限制性内切酶Sac I(New England Biolabs)酶切后的pHIS2载体和DRE顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μL T4DNA连接酶(New England Biolabs)，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态Trans-T1，经酶切鉴定并测序获得含有DRE顺式作用元件的载体pHIS2.1-DRE。

2)GCC元件载体构建

人工设计合成GCC顺式作用元件的序列设计如下:

GCC sense:5’-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3’(SEQ ID NO.29)；

GCC anti-sense:5’-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3’(SEQ ID NO.30)。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(GCC sense:5'-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3'，SEQ ID NO.31)和反义链寡核苷酸(GCC anti-sense:5'-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3'，SEQ ID NO.32)配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到GCC顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5'端为EcoRI，3'端为SacI。然后将lμL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2.1载体和GCC顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入11μLT4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌Trans-T1，经酶切鉴定并测序获得含有GCC顺式作用元件的载体pHIS2.1-GCC。

2.DRE或GCC元件突变体载体的构建

1)DRE元件突变载体构建

以DRE顺式元件ACTCCG为基础，设计突变元件，即将TACCGACAT中的第3位和第4位C突变为A。同样，根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5'端为EcoRI，3'端为SacI。人工设计合成的突变DRE顺式作用元件，序列如下:

mDRE sense:5’-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3’(SEQ ID NO.33)；

mDRE anti-sense:5’-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3’(SEQ ID NO.34)。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(mDRE sense:5'-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3'，SEQ ID NO.35)和反义链寡核苷酸(mDRE anti-sense:5’-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3'，SEQ ID NO.36)配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷至室温，得到mDRE顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5'端为EcoRI，3'端为SacI。然后将lμL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2载体和mDRE顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μLT4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌Trans-T1，经酶切鉴定并测序获得含有DRE顺式作用元件的载体pHIS2.1-mDRE。

2)GCC元件突变载体构建

将GCC元件保守序列AGCCGCC的第二位G突变为A，突变体的序列设计如下：

mGCC sense:5’-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3’(SEQ ID NO.37)；

mGCC anti-sense:5’-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3’(SEQ ID NO.38)。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(mGCC sense:5'-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3'，SEQ ID NO.39)和反义链寡核苷酸(mGCC anti-sense:5'-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3'，SEQ ID NO.40)配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到mGCC顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5'端为EcoRI，3'端为SacI。然后将lμL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoR I和SacI酶切后的pHIS2载体和mGCC顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入lμLT4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌Trans-T1，经酶切鉴定并测序获得含有GCC顺式作用元件的载体pHIS2.1-mGCC。

二、pGADT7-GsERF7酵母表达载体的构建

GsERF7-AD S：5’-CCCGGGTTGTGGTGGTGCGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.41)；

GsERF7-AD AS：5’-GTCGACTCATCAGAAGACTCCTGCCATGG-3’(SEQ ID NO.42)。

三、GsERF7蛋白在酵母细胞内与DRE或GCC元件的结合特异性分析

将重组载体pGADT7-GsERF7分别与含有不同顺式作用元件的载体pHIS2.1-DRE，pHIS2.1-mDRE，pHIS2.1-GCC或pHIS2.1-mGCC及空载体pHIS2.1共转化酵母菌株AH109，分别得到重组酵母GsERF7/DRE，GsERF7/mDRE，GsERF7/GCC，GsERF7/mGCC和GsERF7/pHIS2.1。分别将重组酵母pGADT7/pHIS2.1，GsERF7/pHIS2.1，GsERF7/DRE，GsERF7/mDRE，GsERF7/GCC和GsERF7/mGCC在含50mM 3-AT的SD-Leu-Trp-His平板上划线，30℃培养3-7天。

结果如图4B所示，只有含有GsERF7蛋白和正常的DRE或GCC元件的重组酵母能够正常生长，而其余重组酵母生长都受到明显抑制。该结果表明GsERF7在酵母体内能够特异性结合DRE或GCC元件，从而激活报告基因HIS表达。

实施例6、GsSnRK1对GsERF7的磷酸化分析

一、GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsERF7上GsSnRK1磷酸化位点的预测

通过在线工具(http://ppsp.biocuckoo.org)对GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsERF7上GsSnRK1磷酸化位点的预测

结果显示GsSnRK1蛋白第49位氨基酸赖氨酸(K)为GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸。GsERF7蛋白第36位点处的丝氨酸(S)为GsSnRK1假定的磷酸化位点。

二、蛋白表达载体的构建

1.重组载体pET32b-GsSnRK1的构建

1)GsSnRK1基因的获得

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsSnRK1-PS和GsSnRK1-PAS引物及TransStartTopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsSnRK1-PS:5’-GTCGACGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGGACAGATCAACTGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO.43)；

GsSnRK1-PAS:5’-CTCCAGGAGAACACGTAGCTGTGA-3’(SEQ ID NO.44)。

2)重组载体pET32b-GsSnRK1的构建

用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1重组载体，对pET32b-GsSnRK1重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pET32b-GsSnRK1重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。

2.重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建

1)GsSnRK1(K49M)基因的获得

我们将GsSnRK1基因序列上编码第49位氨基酸的碱基AAG替换为ATG，使GsSnRK1蛋白的第49位氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)，我们重新人工合成了突变过的GsSnRK1基因并命名为GsSnRK1(K49M)，GsSnRK1(K49M)基因编码的GsSnRK1(K49M)蛋白不具有磷酸化的功能。

以GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用GsSnRK1(K49M)-PS和GsSnRK1(K49M)-PAS引物及TransStart TopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSnRK1(K49M)基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsSnRK1(K49M)-PS:5’-GTCGACGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGGACAGATCAACTGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO.45)；

GsSnRK1(K49M)-PAS:5’-CTCCAGGAGAACACGTAGCTGTGA-3’(SEQ ID NO.46)。

PCR扩增体系：模板1μl，10×TransStart TopTaq Buffer 5μl，2.5mM dNTPs 4μl，上下游引物(10μM)各1μl，TransStart TopTaq DNA Polymerase 1μl，ddH2O 37μl。

2)重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建

用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体，对pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体表达GsSnRK1(K49M)蛋白。

3.重组载体pET32b-GsERF7的构建

1)GsERF7基因的获得

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF7-PS和GsERF7-PAS引物及TransStartTopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF7基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsERF7-PS:5’-GTCGACTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTGTGGTGGTGCGATTAT-3’(SEQ ID NO.47)；

GsERF7-PAS:5’-CTCCAGGAAGACTCCTGCCATGGAAGGC-3’(SEQ ID NO.48)。

2)重组载体pET32b-GsERF7的构建

用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsERF7重组载体，对pET32b-GsERF7重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pET32b-GsERF7重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF7基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsERF7重组载体表达GsERF7蛋白。

4.重组载体pET32b-GsERF7(S36A)的构建

1)GsERF7(S36A)基因的获得

我们将GsERF7基因序列上编码第36位氨基酸的碱基TCG替换为GCC，使GsERF7蛋白的第36位氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的GsERF7基因并命名为GsERF7(S36A)，GsERF7(S36A)基因编码的GsERF7(S36A)蛋白不具有被GsSnRK1蛋白磷酸化的能力。

以GsERF7(S36A)基因为模板，采用GsERF7(S36A)-PS和GsERF7(S36A)-PAS引物及TransStart Top Taq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsERF7(S36A)基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列):

GsERF7(S36A)-PS:5’-GTCGACTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTGTGGTGGTGCGATTAT-3’(SEQ ID NO.49)；

GsERF7(S36A)-PAS:5’-CTCCAGGAAGACTCCTGCCATGGAAGGC-3’(SEQ ID NO.50)。

2)重组载体pET32b-GsERF7(S36A)的构建

用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsERF7(S36A)重组载体，对pET32b-GsERF7(S36A)重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pET32b-GsERF7(S36A)重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF7(S36A)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsERF7(S36A)重组载体表达GsERF7(S36A)蛋白。

三、蛋白的表达和纯化

将蛋白表达载体pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsERF7和pET32b-GsERF7(S36A)分别转化大肠杆菌BL21感受态(TRANSGEN BIOTECH)，具体操作步骤详见BL21(DE3)Chemically Competent Cell说明书。分别获得含有pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsERF7和pET32b-GsERF7(S36A)蛋白表达载体的BL21大肠杆菌并诱导蛋白表达。

分别对表达的GsSnRK1、GsSnRK1(K49M)、GsERF7和GsERF7(S36A)蛋白进行纯化，GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)蛋白的纯化采用上海谷研实业有限公司提供的Myc融和蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书；GsERF7和GsERF7(S36A)蛋白的纯化采用康为世纪His-Tagged Protein Purification Kit试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书。

四、Phos-tagTM检测GsSnRK1对GsERF7的磷酸化

采用Phos-tagTM试剂盒分别检测GsSnRK1对GsERF7、GsSnRK1对GsERF7(S36A)、GsSnRK1(K49M)对GsERF7的磷酸化水平，具体操作步骤详见Phos-tagTM试剂盒说明书。

结果如图5A所示：GsSnRK1对GsERF7有磷酸化的作用，而在添加小牛肠碱性磷酸酶(CIP，功能为去除磷酸化)后GsSnRK1对GsERF7的磷酸化作用消失；GsSnRK1对GsERF7(S36A)及GsSnRK1(K49M)对GsERF7均没有磷酸化作用。证明了GsSnRK1蛋白对GsERF7蛋白具有磷酸化作用，且GsSnRK1的第49位氨基酸K是GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸，GsERF7的第36位氨基酸S是GsSnRK1关键的磷酸化位点。

五、western blot检测GsSnRK1对GsERF7的磷酸化

采用western blot分别检测GsSnRK1对GsERF7、GsSnRK1对GsERF7(S36A)、GsSnRK1(K49M)对GsERF7的磷酸化水平。采用pPKDsub抗体检测是否存在磷酸化，采用HA抗体检测GsERF7和GsERF7(S36A)的含量，采用Myc抗体检测GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)的含量。

结果如图5B所示：采用pPKDsub抗体检测到GsSnRK1对GsERF7有磷酸化的作用，而GsSnRK1对GsERF7(S36A)及GsSnRK1(K49M)对GsERF7均没有磷酸化作用。再一次证明了GsSnRK1蛋白对GsERF7蛋白具有磷酸化作用，且GsSnRK1的第49位氨基酸K是GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸，GsERF7的第36位氨基酸S是GsSnRK1关键的磷酸化位点。

六、植物细胞中GsSnRK1对GsERF7磷酸化位置的确定

1.pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7表达载体的构建

1)GsSnRK1(K49M)基因的获得

以人工合成的GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用GsSnRK1(K49M)-BIS和GsSnRK1(K49M)-BIAS引物及TransStart TopTaq DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1(K49M)基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsSnRK1(K49M)-BIS:5’-CCCGGGGACAGATCAACTGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO.51)；

GsSnRK1(K49M)-BIAS:5’-GTCGACGAGAACACGTAGCTGTGAAAGG-3’(SEQ ID NO.52)。

2)pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7表达载体的构建

用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对上述的pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体和上述GsSnRK1(K49M)基因的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7重组载体，对pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7重组载体为将pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体的其他序列不变得到的载体。pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7重组载体表达GsSnRK1(K49M)和GsERF7蛋白。

2.拟南芥原生质体转化

采用聚乙二醇法将上述pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7载体及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体转化到拟南芥原生质体(具体方法参见中科瑞泰植物原生质体制备及转化试剂盒说明书)。

3.拟南芥原生质体蛋白的提取

分别采用Total Extraction Sample Kit试剂盒对转化pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体的拟南芥原生质体的总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白。

4.western blot检测

对上述转化pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7载体的拟南芥原生质体的总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白进行western blot检测。通过HA抗体检测蛋白中GsERF7蛋白的含量，通过H3抗体检测细胞核蛋白内参蛋白组蛋白H3的含量，通过GADPH抗体检测细胞总蛋白内参蛋白GADPH的含量。

结果如图5C所示，在转化pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7的拟南芥原生质体蛋白中检测到GsERF7蛋白在细胞质的含量较高而在细胞核中该蛋白的含量较少，说明在GsSnRK1失去磷酸化活性的条件下GsERF7蛋白主要定位在细胞质中；在转化pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7的拟南芥原生质体蛋白中检测到GsERF7蛋白在细胞核的含量较高而在细胞质中该蛋白的含量较少，说明在GsSnRK1具有磷酸化活性的条件下GsERF7主要定位在细胞核中。进而证明了GsERF7被GsSnRK1磷酸化是GsERF7蛋白核定位的前提条件。

实施例7、转基因大豆毛状根的获得及在其盐碱胁迫下的表型分析

一、表达载体的构建

本试验所用的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1的构建方法均在前文中说明。

二、转化发根农杆菌K599

采用冻融法将表达载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1分别转化至发根农杆菌K599中，具体操作步骤详见唯地生物发根农杆菌K599感受态说明书。

三、转基因大豆毛状根的获得

将分别含有重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7、pPBEL-BiFC-GsSnRK1的K599发根农杆菌菌液及不含任何载体的K599发根农杆菌菌液侵染大豆(东农50)子叶节30min，将侵染过的大豆子叶节置于1/10MS固体培养基上暗培养5天。待农杆菌长满培养皿之后，立即用含有250mg/L的头孢克肟以及50mg/L卡那霉素的1/2MS液体培养基对大豆子叶节进行除菌，然后将其转移到含有150mg/L头孢克肟的1/2MS固体培养基中培养毛状根。

四、转基因大豆毛状根的鉴定

待毛状根在光照培养箱(25℃，光照16h/d)培养至7d左右时，采用2×T5DirectPCR Kit(Plant)试剂盒(TSINGKE)，进行PCR鉴定。具体步骤如下:

取长度为5mm大豆毛状根，放入离心管内并加入35μl Lysis Buffer A,95℃加热10min，静置后取上清液1μl作为PCR反应体系的模板。分别采用Primer-qS和Primer-qAS引物对，通过PCR对pPBEL-BiFC载体携带的特异性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。引物序列如下所示：

Primer-qS:5’-GCCGACATCCCCGACTACT-3’(SEQ ID NO.53)；

Primer-qAS:5’-TGGTGTAGTCCTCGTTGTGGG-3’(SEQ ID NO.54)；

PCR扩增体系(50μl):上述上清液(模板)1μl，2×Taq Plus Master Mix(DyePlus)25μl，上下游引物(10μM)各2μl，ddH2O 20μl。

PCR扩增条件：98℃3min，98℃10s，60℃10s，72℃10s，32个循环，72℃3min，4℃终止反应。

将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图6所示：在随机挑选10条转基因大豆毛状根中均可以扩增出目的条带。表明pPBEL-BiFC载体已顺利整合到大豆毛状根的基因组中。选取其他转基因大豆毛状根用于下一步的表型分析。

五、转基因大豆毛状根在盐、碱胁迫下的表型分析

1.转基因大豆毛状根在正常生长条件下的毛状根表型及根长、根重、侧根数统计

选取生长一周左右的毛状根将其移栽到1/2MS固体培养基上。1周后观察并统计毛状根的长势及根长、根重和侧根数目，所有实验技术重复和生物学重复各3次。

结果如图7及图10所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，control)，转不同载体的大豆毛状根及不含任何载体的K599发根农杆菌诱导的大豆毛状根都有显著增长，根长、根重和侧根数目都明显增加。

2.转基因大豆毛状根在盐处理下的毛状根表型及根长、根重、侧根数统计

选取生长一周左右的毛状根将其移栽到含有150mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基上。1周后观察并统计毛状根的长势及根长、根重和侧根数目，所有实验技术重复和生物学重复各3次。

结果如图8及图10所示：在150mmol/LNaCl胁迫处理条件下，转pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7的大豆毛状根生长并未受到抑制，根长、根重和侧根数目都明显增加，与正常生长条件下的毛状根无明显差异。转pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体大豆毛状根的生长也受到一定抑制，其根长显著增加但增长量小于转pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7的大豆毛状根，且根重及侧根数目均无明显增加。不含任何载体的K599发根农杆菌诱导的大豆毛状根和转pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7大豆毛状根的生长受到明显抑制，其根长、根重和侧根数目无明显增加，且毛状根表面有褐化现象。说明GsERF7和GsSnRK1两基因在大豆毛状根中共表达可增加毛状根对盐胁迫的耐受性，GsSnRK1对GsERF7的磷酸化是毛状根抗盐的前提条件。

3.转基因大豆毛状根在碱处理下的毛状根表型及根长、根重、侧根数统计

选取生长一周左右的毛状根将其移栽到含有30mmol/L NaHCO₃的1/2MS固体培养基上。1周后观察并统计毛状根的长势及根长、根重和侧根数目，所有实验技术重复和生物学重复各3次。

结果如图9及图10所示：在30mmol/L NaHCO₃胁迫处理条件下，转pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsERF7大豆毛状根的生长受到了一定程度的抑制，根长、根重及侧根数无明显增加，但并未致死，且长出了新的真叶。转pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体大豆毛状根的生长也受到显著抑制，根长、根重及侧根数目无明显增加，且子叶褐化变黄。不含任何载体的K599发根农杆菌诱导的大豆毛状根和转pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsERF7大豆毛状根的生长不但受到显著抑制，且子叶严重褐化，全部死亡。说明GsERF7和GsSnRK1两基因在大豆毛状根中共表达可增加毛状根对碱胁迫的耐受性，GsSnRK1对GsERF7的磷酸化是毛状根抗碱的前提条件。

本研究得到国家自然科学基金(No：31670272)、黑龙江省自然科学基金(No：C2017014)、东北农业大学启动基金和东北农业大学农业生物功能基因重点实验室开放式项目资金资助。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种与植物耐盐碱相关蛋白GsERF7及其编码基因与应用

<130> 1

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> GsERF7蛋白质的编码基因

<400> 1

atgtgtggtg gtgcgattat ctccgacttc attccagcgg gtcccgccgg cgaggcgcgg 60

cgcgtgaccg ccgacatcct gtggccgaat ttgaggaagc agttctcgaa gtcgctgctg 120

gacgatgatt tcgaggcagg attcagagaa ttcgaggatg actcggaaat cgaggatgtc 180

gatgatgagg acgatgaaga ggaggaggag ttgaagaaga agaagccctt tgggttctct 240

cgctccaaca acaaggctgc ttctaagcct ctctctcgtg gagcaacaac tgtgaaatct 300

gtggaatcaa aggggcaagc tgagaagtgt gccaagagaa agaggaagaa ccagtatcgc 360

ggaatccgcc agcgtccatg gggaaagtgg gctgctgaga ttcgcgaccc aagaaagggg 420

gttcgtgttt ggcttggaac tttcagcact gctgaagaag ctgcaagagc ttacgatgct 480

gaagcaagga ggatccgtgg caagaaagcc aaggtgaatt tccctgatga gccttcaggc 540

gctgcttcct caaaacgtct caaggcgaat ccagaggctc agccaatgaa gaaaaatctg 600

agctctgtga agccgaaaat aaaccagatg ttcaattttg gtgacaatct tgagggctac 660

tacagcccta tagatcaggt ggaacagaaa ccactggtta accagtatgt taactgtgcc 720

ccgtttgctg gaaatggagt tcaagtctca cctgttactc catctgctga tgttactgct 780

tacttcagct ctgagcattc gagcagctcg tttgattatt ctgacctcgg atggggtgaa 840

caagtcccca agacacccga gatctcatcc atgctttctg ctgctccttt ggacggtgaa 900

tctcagtttg tgcagggtgc tgctgatcag aatcagaaga agaacaacct gctggatatg 960

gcatctgtgc aagatgattc tgcaaaaact ctttctgcgg agcttgcaga cattgaatcc 1020

cagctgaagt tctttgagac cccttcattt cttgatgaag cctgggctga tgctgcatta 1080

gcgtctttgc tcagtgaaga tgcatctcag gatgctgctg gaaaccctat gaacctttgg 1140

agcttcgacg acctgccttc catggcagga gtcttctga 1179

<210> 2

<211> 392

<212> PRT

<213> GsERF7的氨基酸

<400> 2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Phe Ile Pro Ala Gly Pro Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ala Arg Arg Val Thr Ala Asp Ile Leu Trp Pro Asn Leu Arg

20 25 30

Lys Gln Phe Ser Lys Ser Leu Leu Asp Asp Asp Phe Glu Ala Gly Phe

35 40 45

Arg Glu Phe Glu Asp Asp Ser Glu Ile Glu Asp Val Asp Asp Glu Asp

50 55 60

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Lys Pro Phe Gly Phe Ser

65 70 75 80

Arg Ser Asn Asn Lys Ala Ala Ser Lys Pro Leu Ser Arg Gly Ala Thr

85 90 95

Thr Val Lys Ser Val Glu Ser Lys Gly Gln Ala Glu Lys Cys Ala Lys

100 105 110

Arg Lys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly

115 120 125

Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp

130 135 140

Leu Gly Thr Phe Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala

145 150 155 160

Glu Ala Arg Arg Ile Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp

165 170 175

Glu Pro Ser Gly Ala Ala Ser Ser Lys Arg Leu Lys Ala Asn Pro Glu

180 185 190

Ala Gln Pro Met Lys Lys Asn Leu Ser Ser Val Lys Pro Lys Ile Asn

195 200 205

Gln Met Phe Asn Phe Gly Asp Asn Leu Glu Gly Tyr Tyr Ser Pro Ile

210 215 220

Asp Gln Val Glu Gln Lys Pro Leu Val Asn Gln Tyr Val Asn Cys Ala

225 230 235 240

Pro Phe Ala Gly Asn Gly Val Gln Val Ser Pro Val Thr Pro Ser Ala

245 250 255

Asp Val Thr Ala Tyr Phe Ser Ser Glu His Ser Ser Ser Ser Phe Asp

260 265 270

Tyr Ser Asp Leu Gly Trp Gly Glu Gln Val Pro Lys Thr Pro Glu Ile

275 280 285

Ser Ser Met Leu Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gly Glu Ser Gln Phe Val

290 295 300

Gln Gly Ala Ala Asp Gln Asn Gln Lys Lys Asn Asn Leu Leu Asp Met

305 310 315 320

Ala Ser Val Gln Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Ser Ala Glu Leu Ala

325 330 335

Asp Ile Glu Ser Gln Leu Lys Phe Phe Glu Thr Pro Ser Phe Leu Asp

340 345 350

Glu Ala Trp Ala Asp Ala Ala Leu Ala Ser Leu Leu Ser Glu Asp Ala

355 360 365

Ser Gln Asp Ala Ala Gly Asn Pro Met Asn Leu Trp Ser Phe Asp Asp

370 375 380

Leu Pro Ser Met Ala Gly Val Phe

385 390

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> GsERF7-Clone-FW

<400> 3

atgtgtggtg gtgcgattat ctccg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> GsERF7-Clone-RV

<400> 4

tcagaagact cctgccatgg aaggc 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> GsSnRK1-BDS

<400> 5

cccggggaca gatcaactgg ccgtgg 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> GsSnRK1-BDAS

<400> 6

gtcgacgaga acacgtagct gtgaaagg 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-AD S

<400> 7

cccgggttgt ggtggtgcga ttatctc 27

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-AD AS

<400> 8

gtcgactcat cagaagactc ctgccatgg 29

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> GsSnRK1-BIS

<400> 9

cccggggaca gatcaactgg ccgtgg 26

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> GsSnRK1-BIAS

<400> 10

gtcgacgaga acacgtagct gtgaaagg 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> GsERF7-YS

<400> 11

cccgggtgtg gtggtgcgat tatctccg 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> GsERF7-YAS

<400> 12

cccggggaag actcctgcca tggaaggc 28

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-BD S

<400> 13

cccgggttgt ggtggtgcga ttatctc 27

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-BD AS

<400> 14

gtcgactcat cagaagactc ctgccatgg 29

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (1-117) S

<400> 15

cccgggttgt ggtggtgcga ttatctc 27

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (1-117) AS

<400> 16

gtcgactcag ttcttcctct ttctcttggc a 31

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (1-181) S

<400> 17

cccgggttgt ggtggtgcga ttatctc 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (1-181) AS

<400> 18

gtcgactcaa gcgcctgaag gctcatc 27

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (118-392) S

<400> 19

cccgggtcag tatcgcggaa tccgc 25

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (118-392) AS

<400> 20

gtcgactcat cagaagactc ctgccatgg 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (182-392) S

<400> 21

cccgggtgct tcctcaaaac gtctcaagg 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (182-392) AS

<400> 22

gtcgactcat cagaagactc ctgccatgg 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (114-191) S

<400> 23

cccgggtaag aggaagaacc agtatcgcg 29

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> GsERF7-BD (114-191) AS

<400> 24

gtcgactcat ggattcgcct tgagacgttt 30

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> DRE sense

<400> 25

aattctaccg acattaccga cattaccgac atgagct 37

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> DRE anti-sense

<400> 26

catgtcggta atgtcggtaa tcttcggtag 30

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> DRE sense

<400> 27

aattctaccg acattaccga cattaccgac atgagct 37

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> DRE anti-sense

<400> 28

catgtcggta atgtcggtaa tgtcggtag 29

<210> 29

<211> 34

<212> DNA

<213> GCC sense

<400> 29

aattctagcc gccgagccgc cgagccgccg agct 34

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> GCC anti-sense

<400> 30

cggcggctcg gcggctcggc ggctag 26

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> GCC sense

<400> 31

aattctagcc gccgagccgc cgagccgccg agct 34

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> GCC anti-sense

<400> 32

cggcggctcg gcggctcggc ggctag 26

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> mDRE sense

<400> 33

aattctattg acattattga cattattgac atgagct 37

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> mDRE anti-sense

<400> 34

catgtcaata atgtcaataa tgtcaatag 29

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> mDRE sense

<400> 35

aattctattg acattattga cattattgac atgagct 37

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> mDRE anti-sense

<400> 36

catgtcaata atgtcaataa tgtcaatag 29

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> mGCC sense

<400> 37

aattctaacc gccgaaccgc cgaaccgccg agct 34

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> mGCC anti-sense

<400> 38

cggcggttcg gcggttcggc ggttag 26

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> mGCC sense

<400> 39

aattctaacc gccgaaccgc cgaaccgccg agct 34

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> mGCC anti-sense

<400> 40

cggcggttcg gcggttcggc ggttag 26

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> GsERF7-AD S

<400> 41

cccgggttgt ggtggtgcga ttatctc 27

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> GsERF7-AD AS

<400> 42

gtcgactcat cagaagactc ctgccatgg 29

<210> 43

<211> 56

<212> DNA

<213> GsSnRK1-PS

<400> 43

gtcgacgagc agaaactcat ctctgaagag gatctggaca gatcaactgg ccgtgg 56

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> GsSnRK1-PAS

<400> 44

ctccaggaga acacgtagct gtga 24

<210> 45

<211> 56

<212> DNA

<213> GsSnRK1(K49M)-PS

<400> 45

gtcgacgagc agaaactcat ctctgaagag gatctggaca gatcaactgg ccgtgg 56

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> GsSnRK1(K49M)-PAS

<400> 46

ctccaggaga acacgtagct gtga 24

<210> 47

<211> 53

<212> DNA

<213> GsERF7-PS

<400> 47

gtcgactacc catacgatgt tccagattac gctatgtgtg gtggtgcgat tat 53

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> GsERF7-PAS

<400> 48

ctccaggaag actcctgcca tggaaggc 28

<210> 49

<211> 53

<212> DNA

<213> GsERF7(S36A)-PS

<400> 49

gtcgactacc catacgatgt tccagattac gctatgtgtg gtggtgcgat tat 53

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> GsERF7(S36A)-PAS

<400> 50

ctccaggaag actcctgcca tggaaggc 28

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> GsSnRK1(K49M)-BIS

<400> 51

cccggggaca gatcaactgg ccgtgg 26

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> GsSnRK1(K49M)-BIAS

<400> 52

gtcgacgaga acacgtagct gtgaaagg 28

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> Primer-qS

<400> 53

gccgacatcc ccgactact 19

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> Primer-qAS

<400> 54

tggtgtagtc ctcgttgtgg g 21

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述a)、b)和c)中的任意一种蛋白质：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，来自下述A1)至A8)中的任意一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，A1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)所示的基因：

1)其核苷酸序列是如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上的同一性且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关的生物材料在作为转录激活因子中的应用；

或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述抗逆性为抗盐胁迫和抗碱胁迫。

6.一种培育抗逆性提高的转基因大豆毛状根的方法，包括在大豆毛状根中过表达权利要求1所述的蛋白质得到转基因大豆毛状根的步骤；所述转基因大豆毛状根的抗逆性高于所述受体大豆毛状根。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗逆性为抗盐胁迫和抗碱胁迫。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转基因大豆毛状根的抗盐胁迫高于所述受体大豆毛状根体现在：转基因大豆毛状根的根长增长量大于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的根鲜重增加量高于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的侧根数目增长量多于受体大豆毛状根；所述转基因大豆毛状根的抗碱胁迫高于所述受体大豆毛状根体现在转基因大豆毛状根子叶的颜色不发生改变，并且受体大豆毛状根子叶的颜色变黄或发黑或死亡。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于，所述过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

10.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。