CN115820662A - 大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用，所述GmHDL56基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示，所述GmHDL56基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明所述GmHDL56基因能够特异结合ABA信号通路中与渗透胁迫相关基因GmERD1启动子上的ATTAATTA序列，可直接调控并促进GmERD1的表达。过表达GmHDL56可提高大豆毛状根中内源ABA的含量，可提高大豆毛状根对NaCl胁迫的耐受力。本发明为耐盐分子机制奠定理论基础，同时也为大豆耐盐分子育种提供理论依据和基因资源。

Description

大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用。

背景技术

土壤盐渍化是影响植物正常生长发育的主要非生物环境胁迫因素之一。当土壤的电导率达到4dSm^-1时，土壤就被归类于具有高浓度可溶性盐的土壤，并且在世界范围内通常认为4dSm^-1(相当于40mM NaC1)为植物遭受盐胁迫的临界值，因为这一水平将影响大多数作物的产量。由于自然环境的变化和人们的不合理的灌溉方式，全世界盐渍化土地面积以每年10％的速度增长。据联合国粮农组织(FAO)2015年不完全统计全世界范围内约有10亿公顷的盐渍化土地。预计到2050年，将会有超过50％的耕地被盐渍化。

盐胁迫主要通过渗透效应、离子毒性效应和氧化应激效应影响植物的生长发育，而植物也通过维持离子稳态，合成与积累渗透调节物质，增强抗氧化机制，以及转录因子的调控等机制来进行抗盐以维持正常的生长发育。

HD-Zip转录因子是植物中特有的一类转录因子，是由Homeodomain和一个与之紧密连接leucine zipper结构域组成，主要参与逆境应答反应。例如，烟草中HD-ZipI家族的基因可以在烟草的各个组织中表达并且响应ABA和冷胁迫。异源表达玉米的HD-Zip转录因子Zmhdz10可增强转基因拟南芥植株对盐胁迫的耐受性，并且能提高ABA响应基因：P5CS1、RD22、RD29B和ABI1的表达来增强植株对盐胁迫的耐性。向日葵中的HaHB1和AtHB13可以通过诱导能够稳定细胞膜的蛋白质来提高拟南芥植株对干旱、盐的耐受性。

拟南芥中AtERD1，AtLEA14、AtRD29A，AtKIN1、AtCOR15A是与非生物胁迫反应相关的基因。研究表明在拟南芥中ATERD1受干旱和盐胁迫的诱导，水稻中一个与拟南芥ATERD1同源的基因OsClpD1受干旱、NaCl及ABA的诱导，并且过表达OsClpD1基因的拟南芥植株相比野生型更具有耐盐性。GmERD1是大豆中与ATERD1同源的基因，研究证实了GmERD1受渗透胁迫的诱导。

大豆是重要的粮食和经济作物之一，属于中等耐盐作物，但当土壤盐度值达到6.7dSm^-1时，大豆植株就会死亡。培育耐盐大豆新品种是解决土壤盐渍化问题经济有效的方法之一，但是利用传统常规的育种技术培育耐盐大豆新品种存在周期长、耐盐资源有限等局限，因此挖掘耐盐基因、研究大豆的耐盐的分子机理，采用基因工程等方法选育耐盐大豆品种，对于有效利用盐碱地、提高土地利用率，提高大豆产量具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用，所述GmHDL56基因可直接调控并促进与渗透胁迫相关基因GmERD1的表达，过表达GmHDL56可提高大豆毛状根对NaCl胁迫的耐受力，为耐盐分子机制奠定理论基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了大豆GmHDL56基因，所述GmHDL56基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了大豆GmHDL56基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明提供了过表达上述大豆GmHDL56基因的表达载体，包括初始表达载体和GmHDL56基因。

进一步地，所述初始表达载体为表达载体pCAMBIA3301。

本发明提供了过表达上述大豆GmHDL56基因的表达载体的构建方法包括以下步骤：

(1)线性化表达载体pCAMBIA3301；

(2)GmHDL56目的片段扩增；

(3)将步骤(2)得到的GmHDL56目的片段插入步骤(1)中的线性化后的表达载体pCAMBIA3301中得到过表达所述大豆GmHDL56基因的载体pCAMBIA3301-GmHDL56。

本发明还提供了上述大豆GmHDL56基因、上述表达载体在提高作物耐盐能力中的应用。

进一步地，大豆GmHDL56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高大豆毛状根对盐胁迫的耐受力。

本发明还提供了一种提高作物耐盐能力的方法，将上述GmHDL56基因或上述表达载体转入作物植株中。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明所述GmHDL56基因能够特异结合ABA信号通路中与渗透胁迫相关基因GmERD1启动子上的ATTAATTA序列，可直接调控并促进GmERD1的表达，过表达GmHDL56可提高大豆毛状根中内源ABA的含量，可提高大豆毛状根对NaCl胁迫的耐受力。

2.本发明的大豆GmHDL56为提高大豆耐盐性提供了一种新的调控基因资源，可用于耐盐大豆材料的培育和改良，为耐盐分子机制奠定理论基础，同时也为大豆耐盐分子育种提供理论依据和基因资源。

附图说明

图1为GmHDL56基因的PCR扩增，其中，泳道M：DNAmarker，DL2000，泳道1：目标条带长度为939bp的GmHDL56基因；

图2为本发明实施例GmHDL56转录活性验证；

图3为本发明实施例GmHDL56过表达载体的构建示意图；

图4为GUS检测GmHDL56-OE转基因大豆毛状根；

图5为PCR检测GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根；

图6为本发明实施例ChIP-qPCR分析GmHDL56直接结合GmERD1的启动子ATTAATTA序列；

图7为本发明实施例GmERD1启动子的克隆及报告重组载体的构建；

图8为本发明实施例烟草双荧光素酶系统检测试验；

图9为本发明实施例GmHDL56基因在大豆根、茎、叶、子叶中的表达量分析结果；

图10为本发明实施例GmHDL56在NaCl诱导下的表达量分析结果；

图11为本发明实施例GmHDL56在干旱诱导下的表达量分析结果；

图12为本发明实施例GmHDL56在ABA诱导下的表达量分析结果；

图13为GmHDL56转基因大豆毛状根中内源ABA含量的测定；

图14为NaCl处理7d GmHDL56转基因大豆毛状根生长状态；

图15为NaCl处理下GmHDL56转基因大豆毛状根根长及鲜重的测定；

图16为NaCl处理下GmHDL56转基因大豆毛状根中SOD活性的测定；

图17为NaCl处理下GmHDL56转基因大豆毛状根中POD活性的测定；

图18为GmHDL56转基因大豆毛状根中盐胁迫相关基因的表达量分析(a：0mM NaCl处理；b：100mM NaCl处理)。

具体实施方式

本发明提供了大豆GmHDL56基因，所述GmHDL56基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了大豆GmHDL56基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明中，所述大豆GmHDL56基因能够特异性结合ABA信号通路中与渗透胁迫相关基因GmERD1启动子上的ATTAATTA序列，并且正调控GmERD1的表达。特异性结合的GmERD1启动子序列如SEQ ID NO.3所示，其上的ATTAATTA基序及侧翼序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了过表达上述大豆GmHDL56基因的表达载体，包括初始表达载体和GmHDL56基因。

在本发明中，所述初始表达载体为表达载体pCAMBIA3301。

本发明提供了过表达上述大豆GmHDL56基因的表达载体的构建方法包括以下步骤：

(1)线性化表达载体pCAMBIA3301；

(2)GmHDL56目的片段扩增；

(3)将步骤(2)得到的GmHDL56目的片段插入步骤(1)中的线性化后的表达载体pCAMBIA3301中得到过表达所述大豆GmHDL56基因的载体pCAMBIA3301-GmHDL56。

本发明还提供了上述大豆GmHDL56基因、上述表达载体在提高作物耐盐能力中的应用。

在本发明中，大豆GmHDL56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高大豆毛状根对盐胁迫的耐受力。

本发明还提供了一种提高作物耐盐能力的方法，将上述GmHDL56基因或上述表达载体转入作物植株中。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供了大豆GmHDL56基因的克隆，包括以下步骤：

1.试验材料的培养

挑选饱满且无病斑的“东农50”种子(购自黑龙江省广民种业有限责任公司)播种在装有蛭石的塑料方钵中，放入温度为25℃，16h光照/8h黑暗的温室培养箱进行培养，每天浇一次水，待大豆幼苗生长至V2期，取大豆幼苗的三出复叶速冻于液氮中后放入-80℃冰箱保存，用作RNA的提取。

2.Trizol法提取大豆总RNA及cDNA的合成

(1)试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，反转录试剂盒购于购自TOYOBO公司。

3.GmHDL56基因的克隆

(1)试剂

HiFi PCR SuperMix购自TIANGEN公司，pMDTM18-T载体购自TaKaRa公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，胶回收试剂盒购自OMEGA公司，大肠杆菌E.coli DH5α购自唯地生物公司，测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

(2)GmHDL56全长序列获得

1)引物设计

GmHDL56F(SEQ ID NO.5)：5’-ATGAAGAGACTTGGCAGTTCT-3’；

GmHDL56R(SEQ ID NO.6)：5’-TTAACTCCATTCCTCTGAACA-3’。

2)目的片段的扩增

以步骤2合成的cDNA为模板，进行PCR扩增以获取GmHDL56全长片段。PCR的反应体系(50μL)：模板：1μL；

HiFi PCR SuperMix：25μL；上游引物F：1μL；下游引物R：1μL；Nuclease-free Water：22μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；变性、退火、延伸经过30次循环；最终72℃延伸7min；4℃终止反应。

3)目的片段PCR产物的回收

使用目的片段进行电泳(见图1)，将含有目的片段的琼脂凝胶切下，根据OMEGA公司胶回收试剂盒说明书对目的片段进行纯化回收，利用超分辨分光光度计(购买自赛默飞世尔科技有限公司)进行回收产物浓度的测定，其余保存于-20℃冰箱，用作与T载体的连接。

4)T载体的连接反应

根据TaKaRa公司pMDTM18-T载体连接试剂盒使用手册，将GmHDL56全长连接至pMDTM18-T载体上，连接反应体系(10μL)：SolutionI：4μL；pMDTM18-T：1μL；胶回收产物：5μL；充分混匀后，16℃反应4h。

5)连接产物的转化

根据唯地生物公司E.coli DH5α感受态说明书进行连接产物的转化。

6)转化克隆的菌液PCR鉴定

挑取LB固体培养基上饱满的单斑放入含有氨苄抗性的LB液体培养基中，放置于37℃大肠杆菌摇床，振荡培养4-6h；

7)测序

将菌液进行测序鉴定(由北京睿博兴科生物技术有限公司完成)。将测序后无突变的菌液与30％甘油按1：1比例混合以保存大肠菌种。

实施例2

本实施例提供了酵母双杂交系统验证GmHDL56转录活性，包括以下步骤：

1.载体的构建

参照实施例1中步骤3的方法构建pGBKT7-GmHDL56重组载体，引物序列如下：

GmHDL56-BDF(SEQ ID NO.7)：5’-GAATTCATGAAGAGACTTGGCAGTTCT-3’

GmHDL56-BDR(SEQ ID NO.8)：5’-GGATCCAACTCCATTCCTCTGAACAGTAC-3’

2.酵母菌感受态的制备及转化

根据试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(The EpigeneticsCompany，USA)说明书进行酵母细胞感受态的制备及转化。

3.GmHDL56转录活性验证

按照表1的组合进行AH109酵母转化，将转化后的感受态涂布在SD/-Trp-Leu筛选固体培养板上，倒放在30℃培养箱培养3d后，用SD/-Trp-Leu液体培养基接种挑取的单菌落，置于30℃200rpm的摇床中扩繁16h，然后分别取3μL菌液点种于SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade和SD/-Trp-His-Ade/X-α-Gal平板上，倒放在30℃培养箱培养3d后，观察菌落生长情况。

表1分组情况表

结果如图2所示：共转pGBKT7-GmHDL56(BD-GmHDL56)和pGADT7的酵母菌可以在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade平板上正常生长，并且也能在SD/-Trp-His-Ade(+X-α-Gal)固体培养基平板上显现蓝色，说明GmHDL56是一个转录激活子。

实施例3

本实施例提供了转基因大豆毛状根的获得，包括以下步骤：

1.GmHDL56基因植物表达载体的构建

参照实施例1中步骤3的方法构建过表达重组载体p35S:GmHDL56和干扰重组载体GmHDL56-RNAi，其中过表达载体使用pCAMBIA3301载体，植物干扰表达载体使用pFGC5941载体。引物序列见表2：

表2引物序列

按照图3对植物的过量表达载体pCAMBIA3301-GmHDL56进行构建，在pCAMBIA3301载体的左臂35S启动子前插入Flag标签基因和GmHDL56基因。

2.冻融法转化发根农杆菌

参照唯地生物的K599感受态说明书进行发根农杆菌的转化。

3.农杆菌转化重组质粒的鉴定

用无菌的白色枪头将在筛选固体培养基长出的单克隆斑挑至10mL含有相应抗性的LB液体培养基，28℃，220rpm培养24h，参照实施例1中步骤3进行菌液PCR鉴定。

4.大豆毛状根的转化

(1)无菌豆苗的获得：挑选健康饱满无病斑的大豆种子，放入至干燥器中，氯气灭菌16h。将灭菌后的大豆种子种在装有B5盐固体萌发培养基的锥形瓶中，置于25℃，光照16h/黑暗8h的培养箱培养7d。

(2)取50μL保存的K599甘油菌，加入至含有相应载体抗性的LB液体培养基，28℃，220rpm培养过夜后，抽出50μL菌液进行二次活化，待菌液的OD₆₀₀为0.6时，将其转至50mL离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，保留菌体。

(3)侵染液的制备：配制100mL的10mM MgCl₂溶液，将其进行高温高压灭菌后冷却至室温。向离心管中加入2mLMgCl₂溶液重悬管底部菌体，侵染液制备完成。

(4)侵染大豆子叶及发根：用手术刀将大豆苗的胚芽部分完全去除，在子叶的背部创造一个适当大小的伤口。将处理好的子叶摆放在1/2MS根诱导培养基(含125mg/L的头孢克肟250mg/L的羧卞霉素)，在伤口处滴入20μL的侵染液，将大皿封好，置于25℃，光照16h/黑暗8h的培养箱培养约20d。

5.转基因毛状根的检测

待毛状根从侵染部位长出，对毛状根进行检测与鉴定，确定出过表达GmHDL56和干扰GmHDL56的阳性转基因毛状根，用以下一步耐盐表型鉴定试验。

(1)采用biosharp公司的GUS染色试剂盒对转GmHDL56-3301重组载体毛状根进行GUS组织化学染色。

1)配制GUS染色工作液：取10mL GUS染色缓冲液和200μL X-gluc溶液(50×)加入至15mL离心管中混匀，锡纸包好避光。

2)用手术刀片截取毛状根的一小部分放入至200μL PCR离心管中，吸取适量GUS染色工作液加入至管中，将待检测的毛状根完全浸入GUS染色工作液中，锡纸包好室温放置3h或过夜。

结果如图4所示：非阳性毛状根未被染色(图4中的a)，阳性毛状根被染为蓝色(图4中的b)，说明过表达GmHDL56(GmHDL56-OE)重组载体已经成功转入大豆毛状根中。

(2)PCR对转GmHDL56-PFGC5941重组载体毛状根中的外源bar基因检测

1)用SDS小量法提取毛状根的DNA：取一小部分毛状根放入至1.5mL EP管中，液氮速冻研磨，加入400μL SDS裂解液(50mM EDTA，PH＝8.0；100mM Tris-HCl，PH＝8.0；10mM巯基乙醇；500mM NaCl)65℃水浴0.5h；加入100μL 5M的醋酸钾剧烈震荡，冰浴0.5h；加入500μL氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，4℃11000rpm离心15min；将上清转移至新的EP管中，加入等体积的冷异丙醇，-20℃静置0.5-1h后12000rpm离心15min；用1mL无水乙醇洗涤沉淀两次后室温风干；加入20μL去离子水，室温溶解，-20℃保存。

2)进行外源bar基因的PCR检测。其引物序列为

bar F(SEQ ID NO.15)：5’-ATATCCGAGCGCCTCGTGCAT-3’

bar R(SEQ ID NO.16)：5’-GGTCTGCACCATCGTCAACCACT-3’

3)以提取的毛状根DNA为模板，对bar基因进行PCR检测，参见实施例1中步骤3进行PCR扩增。

结果如图5所示：PCR产物与阳性对照条带大小相同的为成功转入GmHDL56 RNA干扰(GmHDL56-RNAi)载体的阳性毛状根(M：DL2000 DNA Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-21：GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根)。

实施例4

本实施例提供了采用染色质免疫共沉淀法(ChIP-qPCR)验证GmHDL56基因与GmERD1基因的关系，包括以下步骤：

1.试验药品的配制

(1)MC缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(PH＝7.0)，50mM氯化钠(NaCl)，0.1M蔗糖(Sucrose)；(2)M1缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(PH＝7.0)，0.1M氯化钠(NaCl)，1M己二醇(hexylene glycol)，10mMβ-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol)；(3)M2缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(PH＝7.0)，1mM氯化镁(MgCl₂)，0.1M氯化钠(NaCl)，0.50％Trition X-100，10mMβ-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol，1M己二醇(hexylene glycol)；(4)M3缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(PH＝7.0)，0.1M氯化钠(NaCl)，10mMβ-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol)；(5)超声缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(PH＝7.0)，0.1M氯化钠(NaCl)，10mM乙二胺(EDTA，PH＝0.8)，0.50％十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)；(6)IP缓冲液：50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes，PH＝7.5)，150mM氯化钾(KCl)，50mM氯化镁(MgCl₂)，10μM硫酸锌(ZnSO₄)，1％Trition X-100；0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)；(7)洗脱缓冲液：50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes，PH＝7.5)，10％十二烷基硫酸钠(SDS)，1M Tris-HCl(PH＝8.0)，0.5M乙二胺(EDTA)。

2.具体步骤

(1)将1g新鲜的过表达GmHDL56和转空载体的转基因大豆毛状根放入含有1％甲醛的MC缓冲液，放入真空槽中抽真空渗透样品，固定样品30min后，加入0.41662g甘氨酸粉末(甘氨酸粉末的终浓度为0.15M)，终止固定反应。将MC缓冲液去除，加入新的预冷的MC缓冲液洗涤样品3次。迅速将样品放到滤纸上将其表面的MC缓冲液吸干，将样品装入50mL离心管中放到液氮中速冻后保存到-80℃，用作核蛋白-DNA的抽提。

(2)配制含PMSF的M1缓冲液(PMSF终浓度为1mM)置于冰上预冷。将样品置于液氮中研磨，将样品磨成细细的粉末状后用配制好的M1缓冲液充分重悬样品，将重悬后的样品转移至2mL的EP管中，4℃下12000rpm，离心3min。配制M2缓冲液并且加入PMSF(使PMSF的终浓度为1mM)置于冰上预冷，用M2缓冲液彻底重悬沉淀，4℃摇20min后，在4℃下12000rpm，离心3min；去除上清。重复几次，直至上清接近透明无色。配制含PMSF的M3缓冲液(PMSF终浓度为1mM)置于冰上预冷，用M3缓冲液彻底重悬沉淀，4℃下12000rpm，离心3min。将上清弃去，重复步骤一次。

(3)配制超声缓冲液(含1mM的PMSF和1倍的蛋白酶抑制剂)，用500μL超声缓冲液重悬样品沉淀。将重悬后的样品放置于冰上，超声破碎10min(超声程序为：超声15s，停歇15s，频率为20％)。将超声后的样品进行4℃，12000rpm，5min的离心，抽取上清液至新的EP管中。用250μL超声缓冲液继续重悬沉淀，使沉淀与超声缓冲液成为匀浆后，4℃下12000rpm，离心5min，抽取上清置于新的EP管中，总计750μL的样品。从获得的样品中抽取75μL作为Input样品，-20℃冷冻保存，用于DNA分析。

(4)配制IP缓冲液(含1mM的PMSF和1倍的蛋白酶抑制剂)置于冰上预冷。将超声之后的样品加入等体积的IP缓冲液和30μL的含有相应抗体的蛋白琼脂糖珠(Protein A/Gagarose)，放置在4℃的环境中旋转混匀8-16h，使样品与Protein A/G agarose充分结合。4℃下2500rpm离心2min，将上清去除留下Protein A/G agarose。加入1mL IP缓冲液(含有1倍的蛋白酶抑制剂)重悬Protein A/G agarose，在4℃的环境下旋转混匀5min，重复3次。4℃下2500rpm离心2min，将上清去除后加入200μL洗脱缓冲液剧烈涡旋混匀，放置于65℃水浴锅中保温15min，之后在25℃下12000rpm离心1min，将上清转移至新的1.5mL的EP管中。向离心后的沉淀加入150μL洗脱缓冲液，重复两次。25℃下12000rpm离心洗脱样品(500μL)2min，吸取25μL上清用于Western Blot分析，其余的用作DNA分析。

(5)逆交联反应，向洗脱样品中加入5M NaCl(使NaCl的终浓度为0.3M)，放置于65℃的水浴锅中保温过夜。加入1-2μL RNA酶(RnaseA)，放置于37℃水浴锅中保温30min。加入终浓度为0.5mg/mL蛋白酶K(Proteinase K)；放置于45℃水浴锅中保温1h。加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混匀后，12000rpm离心10min。抽取上清于新的1.5mL EP管中并且加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，-20℃过夜。4℃下14000rpm离心20min。用70％的乙醇清洗两次沉淀，吹干后加入50μL的ddH₂O将DNA溶解。

3.qRT-PCR检测靶标基因

(1)引物序列见如下：

GmERD1-chipF(SEQ ID NO.17)：5’-GGTAGATTCATTATCCCTTTCAGA-3’

GmERD1-chipR(SEQ ID NO.18)：5’-CATCAATCCAGAAAGCAACG-3’

(2)qRT-PCR检测：

1)反应体系(20μL)：ddH₂O：5.6μL；Primer F：1.2μL；Primer R：1.2μL；2×SYBRGreen：10μL；cDNA：2μL。

2)扩增条件为：95℃3min；95℃15sec，60℃30sec，40个循环。结果用2^^(-△△Ct)法进行定量计算。

ChIP-qPCR分析结果如图6所示：在GmHDL56-OE转基因毛状根中，GmHDL56蛋白与GmERD1启动子富集量显著高于在EV毛状根中的富集量(^**P<0.01，是EV毛状根的2.9倍)说明GmHDL56可以直接结合GmERD1的启动子，因此确定GmERD1是GmHDL56的下游靶基因。

实施例5

本实施例提供了烟草双荧光素酶系统检测试验方法，包括以下步骤：

1.GmERD1启动子的克隆及载体的构建

根据GmERD1转录起始位点上游2000bp序列设计引物，扩增GmERD1的启动子，引物序列如下：

GmERD1aP-LUC F(SEQ ID NO.19)：5’-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTCCCCAACTACCTCCA-3’；

GmERD1aP-LUC R(SEQ ID NO.20)：5’-GGCTTTACCAACAGGGATCCTCTAGAGGAAAGGGCTAAAGGC-3’。

实验室前期已经对pBI121载体进行改造，将35S启动子后的GUS报告基因用LUC报告基因进行替代，本试验将用GmERD1ap的启动子替代35S启动子来启动下游LUC报告基因。载体的构建方法参见实施例1，将重组质粒pBI121-LUC-GmERD1ap转化到农杆菌GV3101中，方法参见实施例3。

2.农杆菌注射烟草叶片

(1)烟草的培养：将本氏烟草的种子均匀撒在装有蛭石与草炭土按1：1比例混合的塑料方钵中，放入温度为25℃，16h光照/8h黑暗的温室培养箱进行培养，每两天浇一次水，培养至有6片叶子展开时，选取生长状态良好的叶片进行农杆菌的注射。

(2)配制含有10mM MgCl₂，1mM MES，150μM乙酰丁香酮，PH＝5.7的渗透缓冲液。

(3)农杆菌注射烟草

1)抽取50μL转入pBI121-LUC-GmERD1ap重组质粒的GV3101甘油菌，置于50mL含50mg/L卡那和25mg/L利福平的YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜后继续抽取50μL进行活化，待菌液的OD₆₀₀值为0.8，将菌液转移至50mL的离心管中。

2)8000rpm离心10min，将上清去除收集离心管底部的菌体。

3)用10mL渗透缓冲液重悬农杆菌的菌体，8000rpm离心5min，将上清去除，重复三次。

4)用渗透缓冲液将烟草侵染液OD₆₀₀值调为0.6，黑暗室温静置3h复苏。

5)将含有pCAMBIA3301-Flag-HDL56和pCAMBIA3301的农杆菌侵染液分别与含有PBI121-ERD1-LUC的农杆菌侵染液按照1:1的比例混合，将两组混合好的农杆菌侵染液注射到生长状态良好的烟草叶片中。

6)将注射后的烟草植株用不透明的纸箱罩住避光，放在室温下培养3d。

7)配制1mM的荧光素(Luciferin)于小喷壶中，将Luciferin喷在整个烟草叶片上，黑暗放置10min。

8)用化学发光成像系统(天能5500)进行分析。

(4)LUC活性的检测

利用Dual Luciferase assay试剂盒(Promega公司)对烟草叶片中的LUC活性进行检测。

本发明克隆出GmERD1的启动子(见图7中的a)并构建了报告载体pGmERD1：LUC(见图7中的b)，使用LUC作为报告基因，融合1500bp GmERD1启动子进行瞬时表达测定。首先将报告载体pGmERD1：LUC、重组载体p35S：GmHDL56-Flag和35S启动子效应载体转入GV3101菌株中(见图7中的c和图7中的d)。其次将p35S/pGmERD1：LUC和p35S：GmHDL56-Flag/pGmERD1：LUC组合转化到健康的本氏烟草的健康叶片中。如图8中的a所示，注射p35S：GmHDL56-Flag/pGmERD1：LUC组合的烟草中报告基因LUC的亮度强过注射对照p35S/pGmERD1：LUC组合，并且p35S：GmHDL56-Flag/pGmERD1：LUC组合中LUC的相对酶活性显著高于对照组(见图8中的b)，以上结果证实了GmHDL56促进GmERD1的表达。

实施例6

本实施例提供了大豆GmHDL56基因表达分析，包括以下步骤：

1.试验材料的培养与处理

组织特异性表达：挑选饱满且无病斑的“东农50”种子播种在装有蛭石的塑料方钵中，放入温度为25℃，16h光照/8h黑暗的温室培养箱进行培养，每天浇一次水，待大豆幼苗生长至V1期，别取大豆幼苗的根、茎、子叶及对生真叶速冻于液氮中后放入-80℃冰箱保存，用作提取RNA。

组织特异性表达：分别取大豆幼苗的根、茎、子叶及对生真叶速冻于液氮中后放入-80℃冰箱保存，用作提取RNA。

盐和干旱胁迫处理：配制200mM NaCl溶液和25％PEG4000溶液浇灌到塑料方钵中直至溶液从钵底部渗出，在处理的0、1、3、6、9、12、24h取下幼苗的三出复叶速冻于液氮后放入-80℃冰箱保存，用作提取RNA。

ABA激素处理：配制100μM的ABA溶液装入至喷壶中，均匀喷洒在大豆植株的叶片表面上，将喷洒后的植株用保鲜膜罩住，避免ABA溶液的蒸发，在处理的0、1、3、6、9、12、24h取下幼苗的三出复叶速冻于液氮后放入-80℃冰箱保存，用作提取RNA。

2.Trizol法提取RNA及cDNA的合成

具体步骤如实施例1中的步骤2所述。

3.实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测

(1)试剂

Green Realtime PCR Master Mix-Plus试剂盒购自TOYOBO公司。

(2)引物设计

根据实施例1克隆获得GmHDL56基因全长序列，利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计定量PCR引物，进行GmHDL56基因表达水平的定量分析。大豆基因持家GmEF1β(GenBank accession no.NM_001248778)作为组织特异性表达试验的内参；大豆持家基因GmActin4(GenBank accession no.AF049106)作为各种胁迫处理下的内参，定量引物序列见表3：

表3引物序列

(3)qRT-PCR步骤：

1)反应体系(20μL)：ddH₂O：5.6μL；Primer F：1.2μL；Primer R：1.2μL；2×SYBRGreen：10μL；cDNA：2μL。

2)扩增条件为：95℃3min；95℃15s，60℃30s，变性和延伸进行40个循环。结果用2^^(-△△Ct)法进行定量计算。

结果如图9所示：GmHDL56在根中表达量最高，在子叶中次之，在茎和叶中表达量较低；如图10所示在NaCl处理后，GmHDL56的表达量在0-3h内逐渐增加，在3-6h迅速增加，在6h达到最高值(是对照组的32.3倍)，之后又迅速下降，表明GmHDL56的表达受NaCl的诱导；如图11所示在PEG4000模拟干旱处理下，GmHDL56的表达量整体呈现上升趋势，在处理后的1h、9h和24h表达量均显著高于对照组，且在处理后的24h达到最大值(是对照组的6.19倍)；如图12所示在ABA处理后1-12h，GmHDL56的表达量逐渐升高，在12h达到最高值(是对照组的9.33倍)，之后又缓慢下降。

实施例7

本实施例提供了GmHDL56转基因大豆毛状根中内源ABA的测定，包括以下步骤：

1.材料

选取实施例3获得的长势相同(根长约为1cm)EV、GmHDL56-OE及GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根分别移至根诱导培养基培养7d。

2.转基因大豆毛状根内源ABA的测定

采用苏州科铭生物技术公司的ABA试剂盒测定毛状根的内源ABA含量。

结果如图13所示：GmHDL56-OE转基因毛状根中的ABA含量显著高于EV毛状根，而GmHDL56-RNAi转基因毛状根中的ABA含量显著低于EV毛状根。以上结果表明过表达GmHDL56可以提高大豆毛状根中内源ABA的含量。

实施例8

本实施例提供了转基因大豆毛状根在盐胁迫下的表型分析，包括以下步骤：

1.材料及处理

选取实施例3获得的长势相同(根长约为1cm)EV、GmHDL56-OE及GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根分别移至含有0mM、50mM、100mM和150mM NaCl浓度的根诱导培养基培养7d。

2.转基因大豆毛状根根长及鲜重的测定

利用刻度尺对各转基因毛状根主根(最长的根)的长度(单位为：cm)进行测量以及使用普通分析天平对各转基因毛状根主根的鲜重(单位为：g)进行称量。然后对不同NaCl浓度处理下的转基因毛状根的长度及鲜重进行比较分析。

结果如图14和图15所示：过表达GmHDL56可提高大豆毛状根对NaCl胁迫的耐受力，并且100mM NaCl处理浓度是鉴定EV、GmHDL56-OE和GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根耐盐能力差异的最适浓度。

实施例9

本实施例提供了转基因大豆毛状根SOD和POD活性的测定，包括以下步骤：

1.材料及处理

选取实施例3获得的长势相同(根长约为1cm)EV、GmHDL56-OE及GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根分别移至含有0mM、50mM、100mM NaCl浓度的根诱导培养基培养7d。

2.转基因大豆毛状根SOD和POD活性的测定

采用苏州科铭生物技术公司的SOD和POD试剂盒测定试剂盒测定毛状根的SOD和POD活性。

结果如图16和图17所示：100mM NaCl处理下GmHDL56-OE转基因毛状根的SOD和POD活性显著高于EV毛状根，而GmHDL56-RNAi转基因大豆毛状根的SOD和POD活性显著低于EV毛状根。说明盐胁迫下过表达GmHDL56可以通过提高大豆毛状根中的SOD和POD的活性来增强大豆毛状根的耐盐能力。

实施例10

本实施例提供了GmHDL56转基因大豆毛状根中盐胁迫相关基因表达量的检测，包括以下步骤：

1.提取大豆毛状根RNA及cDNA合成

参照实施例6方法对0mM NaCl处理和100mM NaCl处理下的转基因大豆毛状根进行RNA的提取及cDNA的合成。

2.盐胁迫相关基因表达量的检测

参照实施例6利用qRT-PCR分析在0mM和100mM NaCl处理下GmHDL56转基因大豆毛状根中这9个基因表达量的变化(分别是超氧化物歧化酶基因GmSOD1、过氧化物酶基因GmPOD、脯氨酸合成酶基因GmP5CS1和Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因GmSOS1，渗透胁迫应答基因GmRD22和GmERD1以及大豆中耐盐的三个转录因子GmWRKY27、GmbZip2和GmNAC11)，引物序列如下所示：

GmERD1-qPCR F(SEQ ID NO.27):CGTCCAGAATTGCTCAACAG；

GmERD1-qPCR R(SEQ ID NO.28):TGGGGTTATAGCCTTGTTGG；

GmP5CS1-qPCR F(SEQ ID NO.29):CGAAGTGGGAATGGGCTTCT；

GmP5CS1-qPCR R(SEQ ID NO.30):CAACTGTGCATGCCAACGAA；

GmRD22-qPCR F(SEQ ID NO.31):AATGCCGAAAGCCATTACAG；

GmRD22-qPCR R(SEQ ID NO.32):GCTTTGTTTTCCCTGCGTTA；

GmSOD1-qPCR F(SEQ ID NO.33):CGTAACTGGATCTCTTGCTG；

GmSOD1-qPCR R(SEQ ID NO.34):CAGAATCAGCATGGACAACA；

GmPOD-qPCR F(SEQ ID NO35):TGCTTTGTTCAAGGTTGTGA；

GmPOD-qPCR R(SEQ ID NO.36):CTCAGGTCCAAATTGGTGAG；

GmSOS1-qPCR F(SEQ ID NO.37):TTACACTACCTTGGCATGGA；

GmSOS1-qPCR R(SEQ ID NO.38):CAGTCACATAGAGGCTCAGA；

GmbZip2-qPCR F(SEQ ID NO.39):GAACCTCACGAGCCAACTGA；

GmbZip2-qPCR R(SEQ ID NO.40):AGGGCAACGGATTCGGATTT；

GmWRKY27-qPCR F(SEQ ID NO.41):GTAACAACAGGTTCCAACCGTTCA；

GmWRKY27-qPCR R(SEQ ID NO.42):CTTCTGGTGATTCAGTTTTGGGATT；

GmNAC11-qPCR F(SEQ ID NO.43):TGCAAGGAGGAGCACAAGAGAGC；

GmNAC11-qPCR R(SEQ ID NO.44):TCCGGCACAGAACCCAGTCGT。

结果如图18所示：0mM NaCl处理下，在GmHDL56-OE根系中GmPOD、GmbZip2、GmWRKY27、GmERD1的表达量显著高于对照EV毛状根系，在GmHDL56-RNAi根系中GmPOD、GmbZip2和GmERD1的表达量显著低于对照根系；其余基因在转基因根系中的表达量和对照根系无显著差异。100mM NaCl处理下，GmSOD1、GmPOD、GmP5CS1、GmERD1、GmbZip2、GmRD22、GmNAC11和GmWRKY27在GmHDL56-OE的转基因根系的表达量均显著高于对照根系，而在GmHDL56-RNAi转基因根系中的表达量均显著低于对照根系。由以上结果可推测GmHDL56能够调控抗氧化系统中的相关基因GmSOD1、GmPOD和GmP5CS1，渗透胁迫响应基因GmERD1、GmRD22及相关耐盐的转录因子GmWRKY27、GmbZip2、GmNAC11的表达从而提高大豆毛状根的耐盐性。

由以上实施例和实验例可知，本发明提供了大豆GmHDL56基因及其编码蛋白在盐胁迫中的应用，所述GmHDL56基因可直接调控并促进与渗透胁迫相关基因GmERD1的表达，过表达GmHDL56可提高大豆毛状根对NaCl胁迫的耐受力，为耐盐分子机制奠定理论基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.大豆GmHDL56基因，其特征在于，所述GmHDL56基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.大豆GmHDL56基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.过表达权利要求1所述大豆GmHDL56基因的表达载体，其特征在于，包括初始表达载体和GmHDL56基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述初始表达载体为表达载体pCAMBIA3301。

5.过表达权利要求4所述的大豆GmHDL56基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)线性化表达载体pCAMBIA3301；

(2)GmHDL56目的片段扩增；

(3)将步骤(2)得到的GmHDL56目的片段插入步骤(1)中的线性化后的表达载体pCAMBIA3301中得到过表达所述大豆GmHDL56基因的载体pCAMBIA3301-GmHDL56。

6.权利要求1所述大豆GmHDL56基因、权利要求3或4所述的过表达大豆GmHDL56基因的表达载体在提高作物耐盐能力中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，大豆GmHDL56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高大豆毛状根对盐胁迫的耐受力。

8.一种提高作物耐盐能力的方法，其特征在于，将权利要求1所述的GmHDL56基因或权利要求3或4所述的表达载体转入作物植株中。

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