CN114369609B - 一种促进植物根系发育的磷脂酶d基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因PeuPLDζ4及其表达载体、细胞系和宿主菌。本发明分离出的胡杨PeuPLDζ4基因，是一种能够作用于细胞膜与细胞核的磷脂酶D。在单子叶与双子叶植物中过表达胡杨PeuPLDζ4基因，其植株根系的发育均出现了显著增强，其对低水位地下水利用效率也出现了进一步的提高，进而增强了其对于高盐、干旱等非生物胁迫的耐受性。该基因的发现对于培养优良的作物品种特别是耐干旱、耐盐作物品种、促进沙漠及干旱地区的植物繁育具有重要的理论及实践意义。

Description

一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因及其应用

本案是原申请的分案专利，原专利号：2020109911744；专利名称：一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因及其应用；申请日：2020/09/20。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因及其应用。

背景技术

根系是植物的重要功能器官。在植物生长发育过程中，根系承担着重要的生物学功能：(1)固定作用：根系可使植物很好地固定在土壤中，防止倒伏；(2)吸收和运输功能：植物的根系可以从周围土壤中吸收水分与多种营养物质，并将其吸收的水分、营养物质和其它生理活性物质向地上部分运输，同时也接收地上部分向下运送的有机物及生理活性物质；(3)合成的功能：根能合成多种氨基酸，运至地上部分，作为形成新细胞的材料，根还能合成烟碱、细胞分裂素等物质影响地上部分的生长发育。

胡杨被誉为“英雄树”，是一种适应干旱性大陆气候，主要分布于内蒙古西部、新疆、甘肃、青海等干旱环境的落叶中型乔木，具有喜光、耐热、耐干旱、耐盐碱、抗风沙等特性，是一种研究非生物胁迫的模式树种。胡杨能够适应于恶劣的生长环境，主要依附于其具有发达的地下根系与强大的根压，能够充分利用浅水层附近地下水，因此成为沙漠中唯一的乔木树种。胡杨能够适应于恶劣的生长环境，主要依附于其具有发达的地下根系与强大的根压，能够充分利用浅水层附近地下水，因此成为沙漠中唯一的乔木树种。深入研究胡杨等植物的抗逆分子机制，挖掘其优良的抗逆遗传资源，为抗干旱、耐盐碱、御风沙等林木树种的分子设计育种提供理论基础和遗传资源，也是现代农林物种分子育种的重要发展方向。

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)基因是植物中最早被发现和克隆的磷脂酶基因，广泛分布于根、茎、叶、花、果实和种子等各个组织。根据基因序列和结构域的不同分为6类：PLDα，PLDβ/γ，PLDδ，PLDε，PLDψ和PLDζ。PLD参与调控多种植物发育与胁迫应答过程。比如PLDα1参与盐胁迫、脱水、活性氧诱导的氧化胁迫、脱落酸反应、气孔关闭、冻害和种子老化等多种胁迫反应；PLDδ涉及冻害、脱水、盐胁迫和干旱等胁迫反应(Wang et al.,2004)；PLDα3介导了植物高渗胁迫应答(Hong et al.,2009)；PLDβ1和PLDδ在植物抵御病害中有发挥重要作用(Zhao et al.,2019,Pinosa et al.,2013)；PLDε参与氮信号的转导过程(Honget al.,2008)；PLDζ2参与磷饥饿(Cruz et al.,2006)、生长素响应和囊泡运输(Li etal.,2007)；PLDγ活性受铝胁迫诱导，在植物耐铝性中起负调控作用(Zhao et al.,2011)。目前研究人员对植物PLD研究均围绕胁迫应答过程，并无研究发现PLD基因具有促进植物根系发育的功能。

发明人在实验过程中意外地从胡杨的基因组中提取分离得到了一个磷脂酶D基因-PeuPLDζ4，该基因与杨属PLDζ3基因同源性极高，且特异性地存在于胡杨中，在杨属其余物种中均不存在。相比于同源基因PeuPLDζ3，该基因PeuPLDζ4具有不同的亚细胞定位与表达模式，并具有较高的催化活性。同时将所述的PeuPLDζ4基因转入植物中能够促进植物的根系发育，使植物更好地利用低水位地下水，提高植物耐非生物胁迫能力，尤其是耐盐和耐旱能力。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因PeuPLDζ4，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明的第二目的是提供含有所述基因PeuPLDζ4的表达载体。

优选地，所述的表达载体为双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pk2GW7、pk7WG2D.1、pCAMBIA3300或其它衍生植物表达载体，携带有本发明相关蛋白编码基因PeuPLDζ4的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

本发明的第三目的是提供含有权利要求1所述基因PeuPLDζ4的细胞系。

本发明的第四目的是提供含有权利要求1所述基因PeuPLDζ4的宿主菌。

本发明的第五目的是提供一种由所述的基因PeuPLDζ4编码的磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明的有益效果是：本发明分离出的胡杨PeuPLDζ4基因，是一种能够作用于细胞膜与细胞核，耐盐与干旱诱导表达的磷脂酶D。通过基因工程手段制备获得的胡杨PeuPLDζ4的转基因单子叶与双子叶植物，其植株根系的发育均出现了显著增强，其对低水位地下水利用效率也出现了进一步的提高，进而增强了其对于高盐、干旱等非生物胁迫的耐受性。该基因的发现对于培养优良的作物品种特别是耐干旱、耐盐作物品种、促进沙漠及干旱地区的植物繁育具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1磷脂酶D系统发育树。利用胡杨、毛果杨、葡萄、拟南芥、以及无油樟磷脂酶D核苷酸序列构建ML(Maximum likelihood)，bootstrap＝1000。

图2磷脂酶D系统发育树。利用胡杨、毛果杨、葡萄、拟南芥、以及无油樟磷脂酶D氨基酸序列构建ML(Maximum likelihood)，bootstrap＝1000。

图3胡杨PeuPLDζ3与PeuPLDζ4蛋白亚细胞定位。利用拟南芥原生质体细胞进行PeuPLDζ3/4蛋白亚细胞定位，使用莱卡激光共聚焦显微镜(TCS SP8)进行拍照，其中DAPi与DIOC6分别用于标记细胞核与细胞膜。

图4胡杨PeuPLDζ3与PeuPLDζ4蛋白表达模式。40天大小的proPeuPLDζ3:GUS与proPeuPLDζ4:GUS转基因新疆杨非生物胁迫(盐胁迫，75mM NaCl；干旱胁迫，5％PEG6000)48h之后GUS染色，每种处理样品量n≧3；

图5胡杨PeuPLDζ3与PeuPLDζ4蛋白酶活。PeuPLDζ3与PeuPLDζ4对磷脂酰胆碱(PC)在25℃催化活性，***表示P<0.001。

图6胡杨PeuPLDζ3与PeuPLDζ4过表达载体示意图。其中pk2GW7-PeuPLDζ3/4用于转基因拟南芥，pk7GW2D.1-PeuPLDζ3/4用于转基因新疆杨，而pCAMBIA3300-PeuPLDζ4用于转基因小麦与水稻。

图7野生型与过表达PeuPLDζ3/4拟南芥根表型及统计。拟南芥在MS培养基上萌发7天后测量其根长。其中n表示重复数量，白色比例尺分别表示10mm，***表示P<0.001。

图8野生型与过表达PeuPLDζ3/4新疆杨根表型及统计。1个月苗龄新疆杨无菌苗移栽至土壤中培养1个月之后，测量其根长月鲜重。其中n表示重复数量，白色比例尺分别表示2.5cm，***表示P<0.001。

图9野生型与过表达PeuPLDζ4水稻(a)与小麦(b)根表型及统计。萌发25天的水稻(a)与7天的小麦(b)根长统计。其中n表示重复数量，白色比例尺分别表示(a、b)30mm，***表示P<0.001。

图10野生型与过表达PeuPLDζ3/4拟南芥在不同浓度盐处理条件下根表型及统计。其中n表示重复数量，白色比例尺10mm，***表示P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的保护范围进行详细说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为胡杨(Populus euphratica)、新疆杨(P.alba var.pyramidalis)、小麦、水稻(Zhonghua 11)与拟南芥(Arabidopsisthaliana，Col-0)(Arabidopsis Biological Resource Center，Stock No.CS28166)。

本发明以下实施例实验过程中使用的pDONR/Zeocin载体、pEarleyGate 101载体来源于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，大肠杆菌DH5α感受态细胞来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，大肠杆菌DB3.1感受态细胞来源于上海酶联生物科技有限公司，农杆菌GV3101来源于北京索莱宝科技有限公司。

本发明以下实施例所述的CTAB是指十六烷基三甲基溴化铵；

本发明以下实施例所述的PVP是指聚乙烯吡咯烷酮；

本发明以下实施例所述的Tris-Cl是指三羟甲基氨基甲烷；

本发明以下实施例所述的YFP是指黄色荧光蛋白；

本发明以下实施例所述的MES是指吗啉乙磺酸；

本发明以下实施例所述的PEG是指聚乙二醇；

本发明以下实施例所述的EDTA是指乙二胺四乙酸；

本发明以下实施例所述的SDS是指十二烷基硫酸钠；

本发明以下实施例所述的DEPC是指焦碳酸二乙酯；

本发明以下实施例所述的Cl溶液是指氯仿：异戊醇＝24:1混合溶液。

实施例1促进根系发育的磷脂酶D基因PeuPLDζ4序列与同源基因PeuPLDζ3的克隆

利用2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，25mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2.0mol/L NaCl，0.5g/L亚精胺。灭菌后加入2％(V/V)β-巯基乙醇)法提取胡杨叶片组织总RNA，其具体方法是：

收集新鲜胡杨叶片组织材料1g，立即置于液氮中研磨成粉末，加入到一个1.5ml离心管中，之后加入800μl 65℃预热的CTAB，充分混匀，65℃水浴8min；加入1ml CI(氯仿：异戊醇＝24:1)溶液，充分混匀，4℃，12000g离心10min；上清水相转移到一个新的1.5ml离心管中，加入1ml CI溶液，充分混匀，4℃，12000g离心10min；上清水相2管转移到一个新的1.5ml离心管中，并加入1/4体积的10mol/L的LiCl溶液，混匀，-20℃沉淀过夜；4℃，13000g离心30min，去上清溶液，加入500μl 60℃预热的SSTE(1.0mol/L NaCl，0.5％SDS，10mmol/LTris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)溶液，60℃水浴3min，沉淀溶解后加入1ml无水乙醇，-20℃沉淀3h；4℃，13000g离心30min，去上清溶液，RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤两次，并用1ml无水乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-80℃保存备用。

从胡杨基因组(Ma et al.，2013)中获取PeuPLDζ3/4全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物：

BP第一步反应

5’端引物：AAAAAAGCAGGCTTCATGGCATCATCAGAGCAATTAATG，(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1部分序列)；

3’端引物：CAAGAAAGCTGGGTCATAAAAAACTTGGGATGCATAATAC，其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB2部分序列)。

BP第二步反应

5’端引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC

3’端引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT

通过反转录及PCR扩增获得PeuPLDζ3/4，具体方法是：依据市售试剂盒Plant RT-PCR Kit 2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl₂ 4μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNase freeWater 8.5μl；dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；Oligo dT-Adaptor 1μl)。混匀后，42℃30min；99℃5min；5℃5min，完成反转录反应。两步PCR反应：1)取1μl反转录产物为模板，利用BP反应第一步引物扩增，：98℃2s后进入扩增程序：98℃10s、55℃5s、72℃3min40s，35个循环后，72℃10min；2)取第一步PCR产物为模板，利用BP反应第二步引物扩增，：98℃2s后进入扩增程序：98℃10s、55℃5s、72℃3min40s，35个循环后，72℃10min。

利用市售试剂盒pMD19-T(TaKaRa，Japan)分离PCR产物中PeuPLDζ3/4。具体方法为：1μl PCR产物中加入1μl pMD19-T Vector*1与3μl dH₂O，并加入5μl SolutionⅠ。混匀后，16℃反应30min，加入200ul DH5V感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min，加入800ul液体LB培养基，37℃振荡培养60min，利用含有50mg/L氨苄青霉素的固体LB培养基进行筛选，并挑取单克隆进行测序，分离PeuPLDζ3与PeuPLDζ4单克隆。测序得到的PeuPLDζ4cDNA序列自起始密码子到终止密码子总长均为3348个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；PeuPLDζ3的核苷酸序列如XM_011008755所示；氨基酸序列如XP_011007057所示。

将上述获得的核苷酸序列进行blast比对，结果显示PeuPLDζ4基因与胡杨PeuPLDζ3(XM_011008755)有99％相似性(3334/3348)，与毛果杨的磷脂酶D PtrPLDζ3(XM_002315450)有98％的同源性，其遗传关系树如图1所示；将获得的PeuPLDζ4蛋白质进行blast比对，结果显示与胡杨PeuPLDζ3(XP_011007057)相似性达到99％(1110/1115)，与毛果杨磷脂酶D蛋白PtrPLDζ3(XP_002315486)有98％的同源性，其关系树如图2所示，确定克隆得到的PeuPLDζ4为胡杨磷脂酶D基因家族成员。

根据the 1997IUPAC standard atomic weights，assuming pH＝7.0计算分子量为126.148kD，根据ExPASy's Compute pI/Mw program计算等电点为6.14。

实施例2 PeuPLDζ3/4基因的亚细胞定位

胡杨PeuPLDζ3和PeuPLDζ4基因分别融合黄色荧光蛋白YFP表达载体的构建：将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应重组到pDONR/Zeocin载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过LR反应将PeuPLDζ3和PeuPLDζ4基因重组到pEarleyGate 101载体上，转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，经50mg/L卡那霉素筛选得到成功重组的过表达载体pEarleyGate 101-PeuPLDζ3和pEarleyGate 101-PeuPLDζ4。

拟南芥原生质体的制备：严格按照Yoo等2007年在Nature Protocal上报道的方法制备拟南芥原生质体，简要的说，即剪取萌发之后4周大的拟南芥叶片10-15片，切成宽度约为0.5-1mm的条状，置于10ml酶液[20mM MES(pH 5.7)1.5％(wt/vol)纤维素酶R10，0.4％(wt/vol)离析酶R10，0.4M甘露醇，20mM氯化钾，10mM氯化钙，0.1％(wt/vol)BSA]消化5-12小时，加入等体积的W5[2mM MES(pH 5.7)，154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl]，用75μm的滤网过滤除去未被消化的叶片，室温100g离心1分钟，弃上清，加入W5使细胞浓度为2×10⁵cell/ml，冰上沉降30分钟，小心吸取上清，用MMG[4mM MES(pH 5.7)，0.4M甘露醇，15mMMgCl₂]溶液重悬使细胞浓度为2×10⁵cell/ml，备用。

原生质体的转化：分别取10μl构建好的pEarleyGate 101-PeuPLDζ3和pEarleyGate101-PeuPLDζ4质粒(10-20μg)，加入到2ml离心管中，分别加入100μl制备好的原生质体，轻柔混匀，然后加入110μl 40％的PEG溶液[(40％(wt/vol)PEG4000，0.2Mmannitol和100mM CaCl₂]，混匀，静置15分钟。加入440μl溶液W5，混匀，100g离心2分钟，弃上清，用1ml溶液WI[4mM MES(pH 5.7)，0.5M甘露醇，20mM KCl]重悬，20℃孵育16小时后用激光共聚焦显微镜观察。

由图3可以，PeuPLDζ3-eYFP荧光与细胞膜特异性性荧光染料DiOC6荧光重合，表明PeuPLDζ3蛋白定位于细胞质膜。PeuPLDζ4-eYFP荧光分别与细胞核特异性荧光染料DAPi、细胞膜特异性性荧光染料DiOC6荧光重合，表明PeuPLDζ4蛋白定位于细胞核和细胞质膜。

实施例3胡杨PeuPLDζ4表达模式鉴定

通过生物信息学的方法进行序列分析，设计PeuPLDζ3与PeuPLDζ4启动子的引物序列。

PeuPLDζ3启动子区引物：

5’端引物：ATCAGTGATCTTCGCAGGTCG

3’端引物：GAATGGTTGGTTTGGGGTTT

PeuPLDζ4启动子区引物：

5’端引物：AGCCACGCTCTGTTGATCTTCC

3’端引物：CGAATGGTTGGTTTGGGGTTT

利用CTAB(2％CTAB(W/V)，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.4mol/L NaCl，1％(V/V)β-巯基乙醇)法提取胡杨叶片组织总DNA，其具体方法是：

收集新鲜胡杨叶片组织材料1g，立即置于液氮中研磨成粉末，加入到一个2.0ml离心管中，之后加入800μl 65℃预热的CTAB，充分混匀，65℃水浴60min，每隔10min颠倒混匀；加入1ml CI(氯仿：异戊醇＝24:1)溶液，室温混匀10min；4℃，12000g离心10min；上清水相转移到一个新的2.0ml离心管中，加入1ml CI溶液，室温混匀10min，4℃，12000g离心10min；取上清液于新的2.0ml EP管中，加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀2h；4℃，12000g离心30min，弃去上清液留下沉淀；用70％乙醇清洗2次，最后用无水乙醇清洗1次；乙醇挥发完后，加入适量水溶解，确保DNA浓度达到50-90ng/μl。

利用PeuPLDζ3/4启动子序列引物，以DNA为模板，进行PCR，扩增胡杨PeuPLDζ3/4启动子序列，参照实施例1。

根据CAMBIA1301载体图谱，设计启动子序列两端加酶切位点引物：

5’BamHIPeuPLDζ3F：CGGGATCCCGATCAGTGATCTTCGCAGGTCG

3’NcoIPeuPLDζ3R：CATGCCATGGCATGGAATGGTTGGTTTGGGGTTT

5’BamHIPeuPLDζ4F：CGGGATCCCGAGCCACGCTCTGTTGATCTTCC

3’NcoIPeuPLDζ4R：CATGCCATGGCATGCGAATGGTTGGTTTGGGGTTT

以前一步PCR产物为模板，分别利用加酶切位点引物进行PCR，在启动子两端分别加上BamHI与NcoI酶切位点。

分别对PCR产物与CAMBIA1301载体进行BamHI与NcoI双酶切，并利用T4连接酶进行连接，转化，分别构建ProPeuPLDζ3::GUS与ProPeuPLDζ4::GUS表达载体。

农杆菌介导的转化：将构建好的过表达质粒通过冻融的方式转化农杆菌GV3101，用10mg/L的利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行PCR验证序列后，用叶盘侵染法(Horsch et al.,1985)侵染新疆杨，获得转基因ProPeuPLDζ3/4::GUS的新疆杨备选株。

诱导愈伤与生芽，并在生根培养过程中提取DNA进行PCR阳性验证，筛选出阳性苗之后，进行扦插扩大培养。

挑选扦插扩繁的一个月苗龄的阳性苗，分别转移到含75mM NaCl(盐诱导)与5％PEG6000(干旱诱导)的MS培养基上，处理2天，之后进行GUS染色，未处理植株作为对照。

GUS染色：参照Mudunkothge等2014年报道的方法，转基因杨树浸泡于GUS染液(1mMX-gluc,50mM NaPO4 buffer,0.4mM K3Fe(CN)6,0.4mMK4Fe(CN)6,0.1％(v/v)Triton X-100)，37℃孵育24h，之后利用乙醇：乙酸＝3:1溶液清洗以去除叶绿素。

结果见图4，对于转ProPeuPLDζ3::GUS杨树，在正常条件、盐诱导与干旱诱导条件下，均在根部检测到在GUS染色，即PeuPLDζ3三种条件下均在根中表达。

对于转ProPeuPLDζ4::GUS杨树，正常条件下，叶片、韧皮部、木质部与根中均未检测到GUS染色，即PeuPLDζ4在正常条件下在各个组织中均不表达或者表达量极低；在75mMNaCl诱导条件下，在叶片中检测到GUS染色，而其余组织中则未检测到染色，表明该基因在盐诱导情况下在叶片中表达；在5％PEG6000诱导条件下，在叶片与根中检测到GUS染色，表明该基因在干旱诱导情况下在叶片与根中表达。综上所述，可以确定PeuPLDζ3为组成性表达，不受盐与干旱诱导；PeuPLDζ4为诱导型表达基因，能够响应盐与干旱等非生物胁迫，并在特定组织进行表达，进而参与胡杨对盐与干旱耐受性响应过程。

实施例4 PeuPLDζ3和PeuPLDζ4酶活性检测

胡杨PeuPLDζ3和PeuPLDζ4基因原核表达载体构建：将测序验证过的实施例1得到的基因通过酶切反应重组到pET-28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选获得阳性克隆，并加入1ml含50mg/L卡那霉素液体LB培养基，37℃振荡培养2h，分别加入至500ml含100ml的液体LB培养基中，16℃振荡培养48h，室温条件下8000rpm离心3min收集菌体并加入适量PBS缓冲液重悬菌体，用超声波将菌体破碎，超声波每工作2min，停止1min，其间菌体保持在冰水混合物上以保持低温。12000rpm离心3min，收集上清，并通过含His标签的镍柱纯化蛋白。

利用酶联免疫法(Huang et al.,1999)分别测定纯化蛋白PeuPLDζ3/4在25℃条件下对底物PC(磷脂酰胆碱)催化活力。

结果见图5，在室温25℃反应条件下，PeuPLDζ4对底物PC的催化活性达到207.63±11.44(nmol/min/mg protein)，显著高于PeuPLDζ3对底物PC的催化活性1.7.4±3.69(nmol/min/mg protein)，表明在同等条件下，PeuPLDζ4能够催化更多的磷脂酰胆碱(PC)产生磷脂酸(PA)，而PA是细胞内重要的第二信使，调控多种生物学过程及胁迫响应过程。因此可以推测PeuPLDζ4可能有助促进植物发育及对非生物胁迫响应。

实施例5转PeuPLDζ3/4基因植株的培育及根表型的测定

胡杨PeuPLDζ3/4基因植物(拟南芥、新疆杨、小麦、水稻)过表达载体的构建：将测序验证过的实施例1得到的基因通过BP反应重组到pDONR/Zeocin载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过LR反应，将PeuPLDζ3/4基因分别重组到pk2GW7(用于转化拟南芥)，pk7WG2D.1(用于转化新疆杨)与pCAMBIA3300(用于转化小麦与水稻)载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体pk2GW7-PeuPLDζ3/4，pk7WG2D.1-PeuPLDζ3/4与pCAMBIA3300-PeuPLDζ4(如图6)。

农杆菌介导的转化：将构建好的过表达质粒通过冻融的方式转化农杆菌GV3101，用10mg/L的利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行PCR验证序列后，分别用蘸花法(Clough et al.,1998)与叶盘侵染法使得拟南芥与新疆杨转化pk2GW7-PeuPLDζ3/4与pk7WG2D.1-PeuPLDζ3/4，利用叶盘法将pCAMBIA3300-PeuPLDζ4成功转化的农杆菌侵染小麦与水稻，分别获得转基因PeuPLDζ3/4的拟南芥、新疆杨及PeuPLDζ4小麦与水稻备选株。

转基因植株的筛选：(1)拟南芥：从转基因拟南芥备选株系收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/L卡那霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的PeuPLDζ4过表达的拟南芥T2代株系(OE-PeuPLDζ3/4)；(2)新疆杨：诱导愈伤与生芽过程中，通过50mg/L卡那霉素进行筛选培养，并在生根培养过程中进行半定量PCR验证，最终筛选得到PeuPLDζ3/4过表达的新疆杨株系；(3)小麦与水稻：诱导愈伤与生芽过程中，通过50mg/L卡那霉素进行筛选培养，并在生根培养过程中进行半定量PCR验证，最终筛选得到PeuPLDζ4过表达的小麦与水稻阳性株系，通过阳性植株自交，最终获得纯合的PeuPLDζ4过表达的小麦与水稻T2代株系。

转基因PeuPLDζ4的拟南芥、新疆杨、小麦、水稻根长测定：1)拟南芥：PeuPLDζ3/4过表达转基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)同时种在MS培养基上，22℃，16h/8h培养，萌发7天后测定拟南芥根长；2)新疆杨：PeuPLDζ3/4过表达转基因与野生型新疆杨(WT)在MS培养基上生根1个月之后，炼苗并移栽至土里，25℃，16h/8h培养30天之后将苗取出，测定根系发育情况，分别测定根长与鲜重；3)水稻：PeuPLDζ4过表达转基因水稻和阴性对照水稻发芽后，用液体MS培养基，在28℃，16h/8h条件下水培25天，测定根系发育情况；4)小麦：PeuPLDζ4过表达转基因小麦和阴性对照小麦发芽后，用液体MS培养基，在25℃，16h/8h条件下水培7天，测定根系发育情况。

表1转基因PeuPLDζ3/4的拟南芥、新疆杨、小麦、水稻根长及鲜重比较

由图7-9及表1可知：(1)7天大小的PeuPLDζ4过表达拟南芥根长显著高于野生对照型植株与PeuPLDζ3过表达植株，P<0.001；(2)2个月大小PeuPLDζ4过表达新疆杨根长显著高于野生对照型植株与PeuPLDζ3过表达植株根长，鲜重显著高于野生对照型植株与PeuPLDζ3过表达植株鲜重，P<0.001；(3)25天大小的PeuPLDζ4过表达水稻水培苗根长显著高于对照型植株根长，P<0.001；(4)7天大小的PeuPLDζ4过表达小麦水培苗根长显著高于对照型植株，P<0.001。综上，PeuPLDζ4过表达的转基因拟南芥、新疆杨、小麦、水稻，其根长显著高于野生对照型植株，且PeuPLDζ4过表达的转基因新疆杨根鲜重显著高于野生对照型植株，说明PeuPLDζ4蛋白的过表达可以显著增强植物的根系发育。

实施例6转PeuPLDζ3/4基因拟南芥耐盐性测定

将实施例5获得的PeuPLDζ3/4过表达转基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)同时种在MS培养基上，22℃，16h/8h培养，萌发5天待其萌发之后，分别转移到普通MS培养基(对照组)、MS+75mM NaCl(低盐胁迫组)、MS+150mM NaCl(高盐胁迫组)培养基，进行耐盐性测定。处理4天之后，分别测定其根长。

表2野生型拟南芥和PeuPLDζ3/4过表达拟南芥在不同盐浓度下的根长

实验结果如图10和表2所示，低盐胁迫对三种拟南芥根部生长均未产生明显的抑制作用。高盐胁迫时，野生型拟南芥与PeuPLDζ3过表达拟南芥根长仅达到对照组条件下根长的49.9％与44.4％，说明高盐胁迫显著抑制了野生型拟南芥与PeuPLDζ3过表达根的生长；而PeuPLDζ4过表达拟南芥高盐胁迫组根长为对照组根长的62.39％，说明高盐胁迫也抑制了PeuPLDζ4过表达拟南芥根的生长，同时，从图10可以看出，高盐胁迫也抑制了野生型拟南芥和PeuPLDζ4过表达拟南芥植株的生长，但是高盐胁迫对野生型拟南芥与PeuPLDζ3过表达拟南芥的影响大于PeuPLDζ4过表达拟南芥，也就是说，PeuPLDζ4过表达拟南芥相较于野生型拟南芥与PeuPLDζ3过表达拟南芥对盐胁迫具有更强的耐受性。

综上所述，本发明分离出的胡杨PeuPLDζ4基因，是一种能够作用于细胞膜与细胞核，在盐胁迫、干旱胁迫下诱导表达的磷脂酶D。通过基因工程手段制备获得的胡杨PeuPLDζ4的转基因单子叶与双子叶植物，其植株根系的发育均出现了显著增强现象，其对低水位地下水利用效率也出现了进一步的提高，进而增强了其对于高盐、干旱等非生物胁迫的耐受性。该基因的发现对于培养优良的作物品种特别是耐干旱、耐盐作物品种、促进沙漠及干旱地区的植物繁育具有重要的理论及实践意义。

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序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3348

<212> DNA

<213> 胡杨(P. euphratica)

<400> 1

atggcatcat cagagcaatt aatgggaggt ggaagtgtcg tcggtggtgg tggtagtggt 60

cccagatacg taaaaatgca atcagagtcg tcaacgccgt tacaaccaca atcatcatca 120

ataatatcgt ccttcttctc tttccgtcaa ggttcgacgc cggaatcctg tcggattttc 180

gatgaattac cgaaaggcac aatcgtctcc gtttctagac ccgacctcag cgatattagc 240

cctgttcaat tatcttacac tatcgaagtt caatacaaac agttcaagtg gacactgttg 300

aagaaagcgg ctcaagtgtt ttatttacat tttgcattga agaaacgatt gtttttcgag 360

gaaattcagg agaagcaaga gcaggttaaa gaatggcttc aaaatctagg aataggagaa 420

catacgccca tggtgcatga tgatgatgat gctgaagatg agactgttcc gttgcatcat 480

gatgaaattg ccaaaaacag agatgttcca tcaagtgctg ctttaccagt tattcgtcca 540

gcattgggaa agcagcattc aatgtcagac gaagcaaagg ttgcaatgca acaatattta 600

aatcactttt tagggaacat ggatattgtt aactcccgag aggtttgcaa gtttttggag 660

gtctcgaaat tgtccttttt accagaatat ggccctaagc tgaaagaaga atatgttatg 720

gtgaagcatc taccacaaat agtgaaaaat gatgattcca ggaaatgtgc ttgctgttgc 780

tttagttgct gtaatgacaa ctggcagaag gtgtgggctg ttttgaaacc aggattcttg 840

gcacttctgg ctgatccttt tgctaccaaa cctttggata taattgtttt tgatgtatta 900

cctacttcag atggaagtgg tgaaggccga gtgccattag cagcagaaat aaaggagagg 960

aatcccttgc ggcacagttt taaggttaca tgtggaaaca gaagcataga tttgagatct 1020

aaaagtggtg ccagagttaa agattgggtt gctgcaatta atgatgctgg acttaggcct 1080

cctgagggtt ggtgttatcc tcatcgcttt ggctcttttg ctcctcctag gggtttgtct 1140

gatgatggta gtcaggctca atggtttata gatggtaggg cagcttttga tgcgattgct 1200

tcatcaattg aggatgctaa atctgagata tttatttgtg ggtggtggct gtgcccagaa 1260

ctttatctaa ggcgtccttt ccgtgatcat gcctcttcta gacttgattc tttgctggaa 1320

atcaaagcta aacaagggat tcagatatat attcttctct ataaagaggt ggctcttgct 1380

ctgaaaataa atagtgtgta tagcaagaga aagcttctta gtattcatga gaatgtgagg 1440

gtactgcggt ctcctgacca cttttcaaca ggtgtttacc tttggtccca ccatgaaaag 1500

cttgtcatcg tggatcacca ggtttgcttt attggaggac tggacctgtg ctttggccgc 1560

tatgacacat gtgaacacag agtgggcgac tgccctcctc aagaatggcc aggaaaggat 1620

tattataacc caagggaatc tgaaccaaat tcatgggaag atatgatgaa agatgaactg 1680

gatcgtggca aatatcctcg aatgccttgg catgatgtcc attgtgctct ttggggaccg 1740

ccttgtcgtg atgtagctag gcactttgtc cagcgttgga actatgccaa gagaaataaa 1800

gctccatatg aggaagcaat tcctctactt atgccccagc agcacatggt tatcccacac 1860

tatatggggc aaaacaaaga gaaggaagtt gaaagaaaag attttgaaga taatgtaaaa 1920

ggcattaaaa ggctggattc gttttcctct agttcatctt tacaagacat ccctcttctt 1980

ttgcctcagg aagctgatgg gcctgatggc tctggtgtag gcccaaaaca aaatgggctg 2040

gagtctaccc ctggcagaag ccacccacat gctttccgga aatccaaaat tgaaccagtt 2100

tttccagaca tgccaatgac aagctttgta gatgaccacg attccttgaa tcttcatgtg 2160

aaaatgtctc cagatttagc agcggagcct ggcatcaaaa cttctgacga cttggaatgg 2220

tgggaatcac aagaaagggt tgatcagatt ggttctgtgg atgaaagtgg gcaagttggt 2280

tctcgtgtct cttgtcattg tcaggtcata aggagtgtga gtcagtggtc tgctggaaca 2340

agccaaattg aagagagcat tcactgtgct tattgttctc ttatcgagaa agcagagaac 2400

tttgtctaca tcgagaatca atttttcata tcaggtcttt caggagatga cattatacag 2460

aatcgtgtgt tagaagcatt gtatcggcgt attatgcgag catttaatga taagaagtgt 2520

ttcagggtta ttattgtcat acctctgctt cctggattcc agggtggtgt agatgatggt 2580

ggtgctgcat ctgtcagagc cataatgcat tggcaatatc gaactatttg cagaggacaa 2640

aattcagtat tgcacaactt atatgatctt cttggtccga aaactcatga ttacatttct 2700

ttctatggcc ttagagctta tggccaactt tttaatggtg gtcctgtggt caccagtcag 2760

gtgtatgtcc atagtaaaat aatgatagtt gatgaccgtg caaccttgat tggatcagct 2820

aatattaatg acaggagttt gcttgggtca cgagattctg agattggggt gcttatcgaa 2880

gacaaggaat ttgtggattc atcaatggga gggaagccct ggaaggctgg aaaatttact 2940

cttagtctcc gcctttcatt gtggtctgaa caccttggtc ttcatgccaa agagatctat 3000

aaagtgattg acccagtaat tgagtcgact tacaaagaca gatggatgtc gactgcaaag 3060

gatgtctttt cttgtgtgcc aagtgatctt atacacacca gagccgcact cagacaaagt 3120

acggcgttct ggaaggatag gcttggccat accaccatcg atttagggat agcccctcaa 3180

aagcttgagt cttaccaaaa tggagacata aaaaacaccg atccgctgga gagactacag 3240

tcggtgcggg ggcatcttgt ttctttccct ctggacttca tgtgcaagga agacttgaga 3300

cctgtgttca atgagagcga gtattatgca tcccaagttt tttattag 3348

<210> 2

<211> 1115

<212> PRT

<213> 胡杨(P. euphratica)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Glu Gln Leu Met Gly Gly Gly Ser Val Val Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Pro Arg Tyr Val Lys Met Gln Ser Glu Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Leu Gln Pro Gln Ser Ser Ser Ile Ile Ser Ser Phe Phe Ser Phe

35 40 45

Arg Gln Gly Ser Thr Pro Glu Ser Cys Arg Ile Phe Asp Glu Leu Pro

50 55 60

Lys Gly Thr Ile Val Ser Val Ser Arg Pro Asp Leu Ser Asp Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Gln Leu Ser Tyr Thr Ile Glu Val Gln Tyr Lys Gln Phe Lys

85 90 95

Trp Thr Leu Leu Lys Lys Ala Ala Gln Val Phe Tyr Leu His Phe Ala

100 105 110

Leu Lys Lys Arg Leu Phe Phe Glu Glu Ile Gln Glu Lys Gln Glu Gln

115 120 125

Val Lys Glu Trp Leu Gln Asn Leu Gly Ile Gly Glu His Thr Pro Met

130 135 140

Val His Asp Asp Asp Asp Ala Glu Asp Glu Thr Val Pro Leu His His

145 150 155 160

Asp Glu Ile Ala Lys Asn Arg Asp Val Pro Ser Ser Ala Ala Leu Pro

165 170 175

Val Ile Arg Pro Ala Leu Gly Lys Gln His Ser Met Ser Asp Glu Ala

180 185 190

Lys Val Ala Met Gln Gln Tyr Leu Asn His Phe Leu Gly Asn Met Asp

195 200 205

Ile Val Asn Ser Arg Glu Val Cys Lys Phe Leu Glu Val Ser Lys Leu

210 215 220

Ser Phe Leu Pro Glu Tyr Gly Pro Lys Leu Lys Glu Glu Tyr Val Met

225 230 235 240

Val Lys His Leu Pro Gln Ile Val Lys Asn Asp Asp Ser Arg Lys Cys

245 250 255

Ala Cys Cys Cys Phe Ser Cys Cys Asn Asp Asn Trp Gln Lys Val Trp

260 265 270

Ala Val Leu Lys Pro Gly Phe Leu Ala Leu Leu Ala Asp Pro Phe Ala

275 280 285

Thr Lys Pro Leu Asp Ile Ile Val Phe Asp Val Leu Pro Thr Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Val Pro Leu Ala Ala Glu Ile Lys Glu Arg

305 310 315 320

Asn Pro Leu Arg His Ser Phe Lys Val Thr Cys Gly Asn Arg Ser Ile

325 330 335

Asp Leu Arg Ser Lys Ser Gly Ala Arg Val Lys Asp Trp Val Ala Ala

340 345 350

Ile Asn Asp Ala Gly Leu Arg Pro Pro Glu Gly Trp Cys Tyr Pro His

355 360 365

Arg Phe Gly Ser Phe Ala Pro Pro Arg Gly Leu Ser Asp Asp Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Gln Trp Phe Ile Asp Gly Arg Ala Ala Phe Asp Ala Ile Ala

385 390 395 400

Ser Ser Ile Glu Asp Ala Lys Ser Glu Ile Phe Ile Cys Gly Trp Trp

405 410 415

Leu Cys Pro Glu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Phe Arg Asp His Ala Ser

420 425 430

Ser Arg Leu Asp Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Lys Gln Gly Ile Gln

435 440 445

Ile Tyr Ile Leu Leu Tyr Lys Glu Val Ala Leu Ala Leu Lys Ile Asn

450 455 460

Ser Val Tyr Ser Lys Arg Lys Leu Leu Ser Ile His Glu Asn Val Arg

465 470 475 480

Val Leu Arg Ser Pro Asp His Phe Ser Thr Gly Val Tyr Leu Trp Ser

485 490 495

His His Glu Lys Leu Val Ile Val Asp His Gln Val Cys Phe Ile Gly

500 505 510

Gly Leu Asp Leu Cys Phe Gly Arg Tyr Asp Thr Cys Glu His Arg Val

515 520 525

Gly Asp Cys Pro Pro Gln Glu Trp Pro Gly Lys Asp Tyr Tyr Asn Pro

530 535 540

Arg Glu Ser Glu Pro Asn Ser Trp Glu Asp Met Met Lys Asp Glu Leu

545 550 555 560

Asp Arg Gly Lys Tyr Pro Arg Met Pro Trp His Asp Val His Cys Ala

565 570 575

Leu Trp Gly Pro Pro Cys Arg Asp Val Ala Arg His Phe Val Gln Arg

580 585 590

Trp Asn Tyr Ala Lys Arg Asn Lys Ala Pro Tyr Glu Glu Ala Ile Pro

595 600 605

Leu Leu Met Pro Gln Gln His Met Val Ile Pro His Tyr Met Gly Gln

610 615 620

Asn Lys Glu Lys Glu Val Glu Arg Lys Asp Phe Glu Asp Asn Val Lys

625 630 635 640

Gly Ile Lys Arg Leu Asp Ser Phe Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Asp

645 650 655

Ile Pro Leu Leu Leu Pro Gln Glu Ala Asp Gly Pro Asp Gly Ser Gly

660 665 670

Val Gly Pro Lys Gln Asn Gly Leu Glu Ser Thr Pro Gly Arg Ser His

675 680 685

Pro His Ala Phe Arg Lys Ser Lys Ile Glu Pro Val Phe Pro Asp Met

690 695 700

Pro Met Thr Ser Phe Val Asp Asp His Asp Ser Leu Asn Leu His Val

705 710 715 720

Lys Met Ser Pro Asp Leu Ala Ala Glu Pro Gly Ile Lys Thr Ser Asp

725 730 735

Asp Leu Glu Trp Trp Glu Ser Gln Glu Arg Val Asp Gln Ile Gly Ser

740 745 750

Val Asp Glu Ser Gly Gln Val Gly Ser Arg Val Ser Cys His Cys Gln

755 760 765

Val Ile Arg Ser Val Ser Gln Trp Ser Ala Gly Thr Ser Gln Ile Glu

770 775 780

Glu Ser Ile His Cys Ala Tyr Cys Ser Leu Ile Glu Lys Ala Glu Asn

785 790 795 800

Phe Val Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Phe Ile Ser Gly Leu Ser Gly Asp

805 810 815

Asp Ile Ile Gln Asn Arg Val Leu Glu Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Met

820 825 830

Arg Ala Phe Asn Asp Lys Lys Cys Phe Arg Val Ile Ile Val Ile Pro

835 840 845

Leu Leu Pro Gly Phe Gln Gly Gly Val Asp Asp Gly Gly Ala Ala Ser

850 855 860

Val Arg Ala Ile Met His Trp Gln Tyr Arg Thr Ile Cys Arg Gly Gln

865 870 875 880

Asn Ser Val Leu His Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Pro Lys Thr His

885 890 895

Asp Tyr Ile Ser Phe Tyr Gly Leu Arg Ala Tyr Gly Gln Leu Phe Asn

900 905 910

Gly Gly Pro Val Val Thr Ser Gln Val Tyr Val His Ser Lys Ile Met

915 920 925

Ile Val Asp Asp Arg Ala Thr Leu Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Asp

930 935 940

Arg Ser Leu Leu Gly Ser Arg Asp Ser Glu Ile Gly Val Leu Ile Glu

945 950 955 960

Asp Lys Glu Phe Val Asp Ser Ser Met Gly Gly Lys Pro Trp Lys Ala

965 970 975

Gly Lys Phe Thr Leu Ser Leu Arg Leu Ser Leu Trp Ser Glu His Leu

980 985 990

Gly Leu His Ala Lys Glu Ile Tyr Lys Val Ile Asp Pro Val Ile Glu

995 1000 1005

Ser Thr Tyr Lys Asp Arg Trp Met Ser Thr Ala Lys Asp Val Phe Ser

1010 1015 1020

Cys Val Pro Ser Asp Leu Ile His Thr Arg Ala Ala Leu Arg Gln Ser

1025 1030 1035 1040

Thr Ala Phe Trp Lys Asp Arg Leu Gly His Thr Thr Ile Asp Leu Gly

1045 1050 1055

Ile Ala Pro Gln Lys Leu Glu Ser Tyr Gln Asn Gly Asp Ile Lys Asn

1060 1065 1070

Thr Asp Pro Leu Glu Arg Leu Gln Ser Val Arg Gly His Leu Val Ser

1075 1080 1085

Phe Pro Leu Asp Phe Met Cys Lys Glu Asp Leu Arg Pro Val Phe Asn

1090 1095 1100

Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Ser Gln Val Phe Tyr

1105 1110 1115

Claims (5)

1.一种促进植物根系发育的磷脂酶D基因PeuPLDζ4，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID No：1所示。

2.含有权利要求1所述基因PeuPLDζ4的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pk2GW7、pk7WG2D.1、pCAMBIA3300。

5.一种由权利要求1所述的基因PeuPLDζ4编码的磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

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