CN111285927B

CN111285927B - 植物耐逆性相关蛋白SiWRKY78及其编码基因与应用

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Publication number: CN111285927B
Application number: CN201811391287.XA
Authority: CN
Inventors: 马有志; 徐兆师; 石文艳; 张惠媛; 祖倩丽; 赵书平; 陈明; 陈隽
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN111285927A

Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关蛋白SiWRKY78及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：本发明的SiWRKY78可以提高植物的耐旱和耐盐性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白SiWRKY78及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物耐逆性相关蛋白SiWRKY78及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解谷子对逆境条件的应答与信号传导机制，提高谷子品种的抗逆性，成为谷子遗传研究及谷子品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。目前发现植物的耐盐抗旱胁迫信号网络中主要有植物激素信号途径、脂质体信号途径、SnRK2(sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2)和MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号途径、ROS(reactive oxygen species)信号途径以及气孔信号途径。这些信号网络系统将植物的激素调节、新陈代谢、能量供应以及生长发育密切联系在一起。这说明植物对高盐干旱等胁迫的适应，不仅依赖于耐逆相关基因的表达，还依赖于由干旱和高盐等胁迫诱导引发的各种信号通路的综合调控作用。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在调节植物胁迫相关基因表达的过程中起着重要作用。当非生物胁迫来临时，转录因子在植物体内活性的变化，使其调控的靶基因的活性也发生相应的改变，即在转录及蛋白水平的表达量发生改变。也就是说，在非生物胁迫刺激植物体的时候，在细胞膜外二级信号分子就会产生，然后该信号分子会刺激细胞内膜使磷酸化蛋白分子相继产生，继而启动转录因子，使其活性增加来调控功能基因。

典型的植物转录因子的结构是由DNA结合域、转录调控域、寡聚化位点及核定位信号构成。DNA结合区(DNA-binding domain)是指转录因子识别DNA顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子DNA结合区的氨基酸序列较为保守。转录调控域(Transcription Regulation Domain)包括两类，一类为转录激活域；一类为转录抑制域，它们决定着转录因子的功能的差异。寡聚化位点(oligomerization site)是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与DNA结合区相连并形成一定的空间构象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关的蛋白。

本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白来源于谷子(Setaria italica)，名称为SiWRKY78，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质SiWRKY78，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质SiWRKY78可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质SiWRKY78的编码基因可通过将序列2自5’端第50-865位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与SiWRKY78蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与SiWRKY78蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码SiWRKY78蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列2自5’端第50-865位所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SiWRKY78蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码SiWRKY78蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiWRKY78的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiWRKY78的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiWRKY78且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码SiWRKY78的核酸分子的表达盒(SiWRKY78基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SiWRKY78的DNA，该DNA不但可包括启动SiWRKY78转录的启动子，还可包括终止SiWRKY78转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子及豌豆rbcS E9终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述SiWRKY78基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体为将上述SiWRKY78基因插入16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体中得到的重组载体或为将上述SiWRKY78基因重组到pCAMBIA1305载体中得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了SiWRKY78蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了SiWRKY78蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高。

本发明还提供了SiWRKY78蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了SiWRKY78蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述提高植物耐逆性具体体现在如下(1)-(7)中任一种：(1)在盐胁迫条件下，提高植物根长；(2)在盐胁迫条件下，提高植物鲜重；(4)在盐胁迫条件下，增加植物株高；(4)在盐胁迫条件下，提高植物体内脯氨酸含量；(5)在干旱胁迫条件下，提高植物生命活力；(6)在干旱胁迫条件下，提高植物存活率；(7)在干旱胁迫条件下，提高植物鲜重。所述干旱胁迫为控水处理；所述控水处理的时间具体可为5天。所述盐胁迫为NaCl胁迫；所述NaCl质量分数具体可为0.7％。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻。所述水稻品种具体可为日本晴。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中SiWRKY78蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中SiWRKY78蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达SiWRKY78蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将SiWRKY78蛋白质的编码基因导入受体植物；所述SiWRKY78蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2自5′端第50-865位所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，SiWRKY78蛋白质的编码基因通过含有SiWRKY78蛋白质的编码基因的重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78导入受体植物中。所述重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78为将序列2自5′端第50-865位所示的DNA片段重组到pCAMBIA1305载体的BamH1酶切位点后得到的载体。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(5)中任一种：(1)转基因植物的根长长于受体植物；(2)转基因植物的株高高于受体植物；(3)转基因植物的鲜重大于受体植物；(4)转基因植物的存活率大于受体植物；(5)转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiWRKY78基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻。所述水稻品种具体可为日本晴。

本发明将SiWRKY78基因导入水稻中得到转SiWRKY78水稻，实验结果表明：转SiWRKY78水稻对盐和干旱逆境的抗性明显高于野生型水稻。本发明提供的SiWRKY78基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为SiWRKY78基因的扩增。SiWRKY78基因大小为816bp。

图2为SiWRKY78受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。A：脱落酸；B：茉莉酸甲酯；C：赤霉素；D：水杨酸；E：冷胁迫(4℃)；F：过氧化氢；G：NaCl(100mM)；H：10％PEG6000。

图3为SiWRKY78在拟南芥原生质体中的定位结果。上面为16318hGFP空载体对照；下面为SiWRKY78定位图，由图可知SiWRKY78定位于细胞核中。

图4为转基因水稻耐盐性鉴定。以日本晴作为对照，将受体水稻和三个T3代转基因水稻株系的种子，用0.7％过氧化氢浸泡过夜，第二天用清水清洗三遍后于37℃培养两天至露白芽，移至96孔板上，清水培养一周，加营养液培养一周，直至水稻两叶一心时，对照正常生长，实验组用0.7％NaCl处理至表型明显。由图可知转SiWRKY78水稻比受体具有更高的耐盐性。

图5为转基因水稻耐盐性鉴定的生理指标测定结果(根长、株高、鲜重、脯氨酸)。结果说明转SiWRKY78水稻在根长、株高、鲜重方面都优于受体水稻日本晴，脯氨酸含量测定结果说明相比于受体对照，转SiWRKY78水稻提高了水稻耐盐性。

图6为转基因水稻抗旱性鉴定。以日本晴作为对照，将受体水稻和三个T3代转基因水稻株系的种子，用0.7％过氧化氢浸泡过夜，第二天用清水清洗三遍后于37℃培养两天至露白芽，移至96孔板上，清水培养一周，加营养液培养一周，直至水稻两叶一心时，对照正常生长，实验组用控水5天处理至表型明显。结果显示转SiWRKY78基因水稻比受体水稻日本晴抗旱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所使用的试剂配方如下：

表1、纤维素酶解液配方

表2、PEG4000溶液配方

表3、W5溶液配方

表4、MMG溶液配方

表5、WI溶液配方

Cellulase R10(YaKult Honsha)纤维素酶(Yakult，C6270-1g)

Mecerozyme R10(YaKult Honsha)果胶酶(荣兴生物，RX-L0042-100mg)

mannitol甘露醇(北京梦怡美商贸中心，M0122-500g)

KOH(北京溪洋汇智科技有限公司，XYHZ-2017-05185)

KCl(北京宝瑞杰科技有限公司，7447-40-7)

MES(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-E169-100g)

CaCl₂(北京拜尔迪生物技术有限公司，031-00435)

NaCl(北京拜尔迪生物技术有限公司，7647-14-5)

MgCl₂(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-0288-500g)

Glucose(北京拜尔迪生物技术有限公司，049-31165)

PEG4000(北京拜尔迪生物技术有限公司，BR-0084)

BSA牛血清蛋白(北京泽平科技有限责任公司，0219989980.)

β-Mercaptoethanol巯基乙醇(北京瑞德百奥生物科技有限公司，0482-100ML)

16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体记载于文献“谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定[J].中国农业科学,2015,48(5):851-860.”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCAMBIA1305载体记载于文献“Wang C,Wang Y,Cheng Z,et al.The role ofOsMSH4in male and female gamete development in rice meiosis[J].Journal ofExperimental Botany,2015,67(5):1447.”，，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、SiWRKY78蛋白及其编码基因的获得及SiWRKY78表达特性分析

一、SiWRKY78蛋白及其编码基因的获得

取正常生长7天大的谷子(豫谷1号)幼苗，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Trizol法(TianGen)提取谷子叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA。以谷子cDNA为模板，以SiWRKY78-F：CCTTGAATCTTCCACTCATGG和SiWRKY78-R：CAGCGGCAAGTTCATAGAG为引物进行PCR扩增，得到PCR产物。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。

通过5’RACE和3’RACE的方法获得SiWRKY78基因，其开放阅读框架为序列表的序列2自5′端第50-865位所示的核苷酸，SiWRKY78基因编码的SiWRKY78蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。SiWRKY78的基因组DNA序列如序列表的序列3所示。

二、实时荧光定量PCR分析SiWRKY78的表达特性

1、胁迫处理

对正常生长7天大的谷子(豫谷1号)幼苗进行以下处理：

(1)ABA处理(图2A)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM ABA溶液喷施其叶片，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)MeJA处理(图2B)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM MeJA溶液喷施其叶片，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)GA处理(图2C)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM GA溶液喷施其叶片，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)SA处理(图2D)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM SA溶液喷施其叶片，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)冷处理(图2E)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，放到低温培养箱(4℃)，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)H₂O₂处理(图2F)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM H₂O₂溶液浸泡其根部，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(7)NaCl处理(图2G)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用100μM NaCl溶液浸泡其根部，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(8)PEG处理(图2E)：挑选长势一致的盆栽谷子幼苗，用10％PEG溶液浸泡其根部，培养30分钟、0小时、1小时、6小时、24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(9)对照处理：直接取未经任何处理的谷子幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

2、mRNA的分离

采用Trizol法(TianGen)提取生长7天大的谷子幼苗叶片总RNA。

3、反转录为cDNA

将纯化的mRNA反转录为cDNA，具体方法参考反转录试剂盒(TransGen，China)说明书。

4、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作qRT-PCR的模板。用基因3′端非编码区的特异引物对对样品进行qRT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin做内参。qRT-PCR在ABI

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.Actin)_{Time x}－(C_T.Target－C_T.Actin)_{Time 0}。Time x表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。定量引物序列如下：

SiWRKY78qRT-F：TTACATATTGGAGGAGGAAC；

SiWRKY78qRT-R：GACACCCTTGCCCTTTACT；

SiActin-F：CTGACGCGAGGATCCA；

SiActin-R：GCCTTGACCATACCAGTTCCA。

结果见图2。由图2可知，SiWRKY78对脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸、冷胁迫(4℃)、过氧化氢、NaCl(100mM)和PEG等胁迫条件都有响应，尤其是对脱落酸胁迫，在6h时，其表达量到达80倍，其次，在茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸、过氧化氢、NaCl(100mM)和PEG处理条件下其表达量也明显上升。但对冷胁迫其表达量上升不明显。

实施例2、SiWRKY78亚细胞定位分析

一、重组表达载体的构建

1、以谷子(豫谷1号)cDNA为模板，采用SiWRKY78-GFP-F/SiWRKY78-GFP-R进行PCR扩增，得到SiWRKY78片段。引物序列如下(下划线表示酶切位点)：

SiWRKY78-GFP-F：TATCTCTAGAGGATCCATGAACATCCTTGAAT；

SiWRKY78-GFP-R：TGCTCACCATGGATCCTGCCCATATATCTTCAG。

2、将SiWRKY78片段插入16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体的BamH I酶切位点间，得到重组载体。

二、拟南芥原生质体的转化

1、土培室种植拟南芥。

2、生长良好情况下，在未开花前取叶片制备原生质体。

3、剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。

4、将切好叶条放入预先配好的酶解液中(每5-10mL酶解液大约需10-20片叶子)。用镊子使叶子完全浸入酶解液。

5、真空泵于黑暗中(锡箔纸包裹)抽真空30分钟。此时可配制PEG4000溶液，200μl和1000μl枪头去尖，使操作时吸打缓和，PEG4000溶液一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量。

6、在室温中无须摇动，继续黑暗条件下酶解至少3h(50rpm 28℃摇)。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。此时预冷一定量W5溶液。

7、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50μm。

8、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

9、先用W5溶液润湿35-75μm的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

10、用30ml的圆底离心管100g，4℃离心1-2min，沉淀原生质体，尽量去除上清。然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。

11、在冰上静至原生质体30分钟。

以下操作在室温23℃下进行：

12、100g离心8-10min，使原生质体沉淀。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1m)重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。

13、加入10μl或者20μl DNA(10-20微克约5-10kb的步骤一制备的质粒DNA)至2mlEP管中。

14、加入100μl原生质体(2×10⁴个)，轻柔混合。

15、加入110μl PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。

16、诱导转化混合物20-30min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长转化时间)。

17、室温下用400-440μl W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好，以终止转化反应。

18、室温下100g离心2min，然后除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min去上清。

19、用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。

20、室温下(20-25℃)诱导原生质体18小时以上。之后在激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。

三、拟南芥原生质体的镜检

将暗培养18h之后的原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。结果见图3。结果表明：SiWRKY78定位于细胞核中。

实施例3、转SiWRKY78水稻的获得及其耐逆性分析

一、转SiWRKY78水稻的获得

1、重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78的构建

(1)重组载体pLB-SiWRKY78的构建

以谷子cDNA为模板，采用SiWRKY78-F：ATGAACATCCTTGAAT和SiWRKY78-R：TGCCCATATATCTTCAG为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收纯化816bp左右的条带。将PCR扩增产物连接到pLB载体(TianGen，China)上，得到重组载体pLB-SiWRKY78。

(2)重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78的构建

①用同源重组的方法合成带有BamH1酶切序列的引物：SiWRKY78-1305-F：CGGTCCCGGGGGATCCATGGGCGAGGGCGC和SiWRKY78-1305-R：TGCTCACCATGGATCCGTAGACCTTGAAGCTGG。以pLB-SiWRKY78载体为模板，采用SiWRKY78-1305-F和SiWRKY78-1305-R进行PCR扩增，得到带酶切接头的片段，回收纯化的PCR产物；

②用限制性内切酶BamH1酶切pCAMBIA1305载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。

测序结果表明，重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78为将序列2自5′端第50-865位所示的DNA片段重组到pCAMBIA1305载体的BamH1酶切位点后得到的载体。

2、重组菌的构建

(1)将步骤1获得的重组载体pCAMBIA1305-SiWRKY78转化农杆菌EHA105(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明该质粒为pCAMBIA1305-SiWRKY78，证明该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为EHA105/pCAMBIA1305-SiWRKY78。

3、转SiWRKY78水稻的获得

将pCAMBIA1305-SiWRKY78转入水稻Nipponbare(Oryza sativa)(以下简称日本晴)胚的愈伤组织中，具体步骤如下：

(1)用含50μmol/L卡那霉素的液体LB培养基悬浮重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1305-SiWRKY78，得到OD600nm≈0.5的菌悬液。

(2)取野生型日本晴水稻的成熟胚愈伤组织与步骤(1)得到的菌悬液混合，侵染30min，用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基(含0.03924mg/L乙酰丁香酮的固体N6培养基)上，24℃培养3天。

(3)将步骤(2)得到的愈伤接种至含150mg/L G418的固体N6培养基上，24℃培养16天。

(4)取步骤(3)得到的健康愈伤组织，接种至含200mg/L G418的固体N6培养基上，24℃培养，每15天继代一次。

(5)取步骤(4)得到的健康愈伤组织，接种至分化培养基(含150mg/L G418、2mg/L激动素、0.05mg/L萘乙酸的固体N6培养基)上，24℃培养45天(此时植株地上部分高度约为15cm)，打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为T0代转基因植株。

(6)将T0代转基因植株自交，收获种子并培育为植株，即为T1代转基因植株。

(7)提取T0代转基因植株和T1代转基因植株的基因组DNA。

(8)分别以步骤(7)得到的T0代转基因植株和T1代转基因植株的基因组DNA为模板，以SiWRKY78-1305-F/R为引物进行PCR鉴定，条带大小为816bp。引物序列如下：

SiWRKY78-1305-F：CGGTCCCGGGGGATCCATGGGCGAGGGCGC；

SiWRKY78-1305-R：TGCTCACCATGGATCCGTAGACCTTGAAGCTGG。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1305转入水稻日本晴，得到T1代转空载体水稻植株。

分别将T1代转基因水稻和T1代转空载体水稻播种、自交，直到得到T3代转基因水稻和T3代转空载体水稻。

(9)PCR检测水稻阳性植株

用CTAB法提取获得的T3代转基因水稻和野生型水稻的基因组DNA，以SiWRKY78-1305-F/R为引物进行阳性检测，挑取条带大小正确的DNA所对应的水稻植株进行后续抗逆实验。

(10)qRT-PCR检测SiWRKY78表达量

采用Trizol法(TianGen)提取生长10天大的水稻幼苗叶片总RNA。将纯化的mRNA反转录为cDNA，具体方法参考反转录试剂盒(TransGen，China)说明书。将cDNA稀释50倍后用作qRT-PCR的模板。用基因3′端非编码区的特异引物对对样品进行qRT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以OsActin做内参。qRT-PCR在ABI

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Time x－(CT.Target－CT.Actin)Time 0。Time x表示任意时间点，Time 0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。定量引物序列如下：

SiWRKY78qRT-F：TTACATATTGGAGGAGGAAC；

SiWRKY78qRT-R：GACACCCTTGCCCTTTACT；

OsActin-F：GCAGAAGAACGGCATCAAGGT；

OsActin-R：CTTCTCGTTGGGGTCTTTGCT。

最终选取表达量较高的T3代阳性转SiWRKY78水稻#1，#2，#3株系进行后续抗逆实验。

二、转SiWRKY78水稻耐盐性分析

将T3代阳性转SiWRKY78水稻#1，#2，#3株系、T3代转空载体水稻和野生型水稻日本晴(对照)的种子用0.7％过氧化氢浸泡过夜，第二天用清水清洗三遍后于37℃培养两天至露白芽，移至96孔板上，清水培养一周，加营养液培养一周，直至水稻两叶一心时(对照正常生长)进行盐胁迫处理。处理方法如下：用质量分数为0.7％NaCl水溶液进行单次浇灌。盐胁迫处理7后，统计根长、株高、鲜重和脯氨酸含量(脯氨酸含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(北京))。每个株系24棵，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图5所示，盐胁迫处理前转SiWRKY78水稻在根长、株高、鲜重方面就已经有了差异，转SiWRKY78水稻的根长明显比野生型水稻长。经NaCl处理后，转SiWRKY78水稻株系的长势均优于野生型，且根长、株高、鲜重、脯氨酸含量也均显著高于野生型水稻。转pCAMBIA1305载体水稻(转空载体水稻)的表型与野生型水稻无显著性差异。

上述结果表明转SiWRKY78水稻的耐盐性高于野生型水稻，说明SiWRKY78蛋白在植物耐盐性方面具有重要作用。

三、转SiWRKY78水稻耐旱性分析

将T3代阳性转SiWRKY78水稻#1，#2，#3株系、T3代转空载体水稻和野生型水稻日本晴(对照)的种子，用0.7％过氧化氢浸泡过夜，第二天用清水清洗三遍后于37℃培养两天至露白芽，移至96孔板上，清水培养一周，加营养液培养一周，直至水稻两叶一心时(对照正常生长)进行干旱胁迫处理。干旱胁迫处理方法为控水处理5天。干旱胁迫处理后，观察植株表型并统计存活率和鲜重。每个株系24棵，实验重复三次，结果取平均值。

结果见图6。从图中可以看出：经干旱处理后，野生型水稻植株大部分都已萎蔫，没有生命活力，转pCAMBIA1305载体水稻(转空载体水稻)的表型与野生型水稻无显著性差异。而转SiWRKY78水稻依然生长旺盛，存活率和鲜重统计结果也显示：转SiWRKY78水稻的存活率和鲜重显著大于野生型植株。

上述结果表明转SiWRKY78水稻比受体日本晴更能耐旱，说明SiWRKY78蛋白在植物耐旱性方面具有重要作用。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白SiWRKY78及其编码基因与应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>271

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Asn Ile Leu Glu Ser Ser Thr His Gly Gly Cys Gln Ala Val Ile

1 5 10 15

Asn Glu Ile Glu His Gln Arg Ala Leu Met Met Asp Leu His Asp Leu

20 25 30

Ile Leu Pro Ile Leu Asp Pro Tyr Ser Gly Gln Glu Lys Leu Val Gln

35 40 45

Gln Leu Phe Gln Asp Ile Phe Ser Cys Ser Ser Lys Val Ile Ser Phe

50 55 60

Leu Glu Leu Gly Asp Asn Asn Ser Gly Lys Gln Ala Asn Leu Ile Lys

65 70 75 80

Tyr Lys Arg Lys Gly Ser Lys Asn Asn Met Glu Gly Tyr Ile Leu Glu

85 90 95

Glu Glu Pro Lys Glu Val Gly Asn Lys Arg Arg Lys Asn Ala Gln His

100 105 110

Ile Gly Ser Val Val Thr Gln Ala Pro Tyr Phe Asp Gly Tyr Gln Trp

115 120 125

Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Trp Ile Ser Lys Ala Lys His Phe Arg Ser

130 135 140

Tyr Tyr Arg Cys Ala Asn Ser Lys Gly Gln Gly Cys Leu Ala Thr Lys

145 150 155 160

Thr Val Gln Gln Lys Glu Thr Asp Gly Ser Gly Lys Val Arg Leu Phe

165 170 175

Asn Val Asp Tyr Tyr Gly Gln His Ile Cys Lys Lys Asp Gly Ile Ile

180 185 190

His Pro Tyr Val Val Glu Thr Thr Ser His Ser Val Pro Ile Val His

195 200 205

Asp Asn Gln Ser Ser Ile Ser Thr Phe Val Asn Asn Asp Val His Gly

210 215 220

Ile Gln Asp Glu Ser Tyr Glu Asn Leu Phe Val Val Pro Asp Met Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Phe Thr Asp Phe Thr Asp Ile Glu Met Ala Arg Ala Leu Glu

245 250 255

Ile Thr Ser Met Asn Leu Pro Leu Ile Ser Glu Asp Ile Trp Ala

260 265 270

<210>2

<211>865

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

caactctgtc aatccgacat tatagctact tatattgaaa acccatccaa tgaacatcct 60

tgaatcttcc actcatggtg gctgccaagc ggtgatcaac gagattgaac accaaagggc 120

tctcatgatg gacctacatg accttatctt accaatactt gatccctata gtgggcagga 180

gaagcttgtt cagcaactct ttcaggacat attcagttgc tcaagtaagg ttatctcttt 240

tctagaactt ggtgataata atagtgggaa acaggccaat cttatcaaat ataagagaaa 300

aggcagtaag aataacatgg agggttacat attggaggag gaacccaagg aagttggaaa 360

taagagaagg aagaatgcac agcacatagg ttcagtcgtg acacaagcac catactttga 420

tggatatcaa tggaggaagt atggacagaa gtggatctcc aaagcaaagc attttaggag 480

ctactataga tgtgccaata gtaaagggca agggtgtctt gcaaccaaga cagtgcaaca 540

gaaggaaacc gatggaagtg gaaaggtgag gctgttcaat gttgactatt atggccagca 600

catttgcaag aaggatggca taattcatcc atatgttgtt gagacaacaa gtcatagcgt 660

accaattgtc catgataacc aaagcagtat ctcaactttt gttaataacg atgtccatgg 720

aattcaggat gaaagctatg aaaatttatt tgtggtgcct gatatgccag aatattttac 780

agatttcaca gatattgaaa tggcaagggc acttgagatt acctctatga acttgccgct 840

gatctctgaa gatatatggg cataa 865

<210>3

<211>1004

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

caactctgtc aatccgacat tatagctact tatattgaaa acccatccaa tgaacatcct 60

tgaatcttcc actcatggtg gctgccaagc ggtgatcaac gagattgaac accaaagggc 120

tctcatgatg gacctacatg accttatctt accaatactt gatccctata gtgggcagga 180

gaagcttgtt cagcaactct ttcaggacat attcagttgc tcaagtaagg ttatctcttt 240

tctagaactt ggtgataata atagtgggaa acaggccaat cttatcaaat ataagagaaa 300

aggcagtaag aataacatgg agggttacat attggaggag gaacccaagg aagttggaaa 360

taagagaagg aagaatgcac agcacatagg ttcagtcgtg acacaagcac catactttga 420

tggatatcaa tggaggaagt atggacagaa gtggatctcc aaagcaaagc attttaggag 480

ctactataga tgtgccaata gtaaagggca agggtgtctt gcaaccaaga cagtgcaaca 540

gaaggaaacc gatggaagtg gaaaggtgag gctgttcaat gttgactatt atggccagca 600

catttgcaag aaggatggca taattcatcc atatgttgtt gagacaacaa gtcatagcgt 660

accaattgtc catgataacc aaagcagtat ctcaactttt gttaataacg atgtccatgg 720

aattcaggat gaaagctatg aaaatttatt tgtggtgcct gatatgccag aatattttac 780

agatttcaca gatattgaaa tggcaagggc acttgagatt acctctatga acttgccgct 840

gatctctgaa gatatatggg cataaagaag tgagaaacga agtcctttga tttcacagat 900

atgaaaatca gctggcatgg catcatgagt tctgaaagaa aaggacatgt atgctaccaa 960

taagtctaaa aagggacatg tgcattgtgt ccgaccgtcc atca 1004

Claims

1.蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；

所述植物为水稻；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

所述蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

b）在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

与所述蛋白质相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码所述蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列2自5’端第50-865位所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；

2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1中所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

3.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物；

所述植物为水稻；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

所述提高受体植物中权利要求1中所述的蛋白质的表达量的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的蛋白质，所述过表达的方法为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下（1）-（5）中任一种：

（1）在干旱或盐胁迫下，转基因植物的根长长于受体植物；

（2）在干旱或盐胁迫下，转基因植物的株高高于受体植物；

（3）在干旱或盐胁迫下，转基因植物的鲜重大于受体植物；

（4）在干旱或盐胁迫下，转基因植物的存活率大于受体植物；

（5）在干旱或盐胁迫下，转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2自5’端第50-865位所示的DNA分子。