CN113717265B - 一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用 - Google Patents

一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子克隆与基因工程领域，具体涉及一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10‑1及其应用。所述基因PalZAT10‑1定位于细胞核，在新疆杨中过表达基因PalZAT10‑1，能促进植物分支，根系发育和气孔关闭，提高抗氧化活性，光合速率和水分利用效率；在新疆杨中敲除PalZAT10‑1基因获得的palzat10‑1lines，其表型则与PalZAT10‑1OE lines完全相反；该基因对于预防植物水分损失，培养优良抗逆树种方面具有重要的意义，为促进我国对杨树树木资源的深入研究和开发利用奠定基础。

Description

一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用
技术领域
本发明属于分子克隆与基因工程领域，特别涉及一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用。
背景技术
非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，对于主要作物植物降低超过50％的平均产量，每年引起价值数百万美元的损失。非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长和产率的形态学、生理学、生物化学和分子上的变化。非生物胁迫包括高盐胁迫、干旱胁迫、渗透胁迫、氧化胁迫、强光胁迫、低温胁迫等。其中干旱和高盐引起的土壤水分亏缺是最重要的环境胁迫，严重限制了植物的生长、产量和分布。高盐度，尤其是钠离子(Na+)，可以消散膜电势，对细胞代谢是有毒的，对一些植物的酶的机能具有有害作用。此外，高浓度的Na+引起渗透失衡、膜组织破坏、生长降低、抑制细胞分裂/扩展，可以导致光合作用和活性氧簇生产量的降低；干旱条件破坏正常的膜的双层结构，除膜损伤之外，当脱水时，细胞溶质蛋白和细胞器蛋白会表现出降低的活性或甚至会经历完全的变性，干旱也可以引起细胞的代谢瓦解并减少营养生长，尤其是芽生长。
植物可以在多个层面对缺水做出积极响应，例如，植物能够调节气孔孔径以减少蒸腾作用；其中，转录因子(TF)，例如水稻中的HD-Zip(OsTF1L)、GATA(PdGNC)、杨树中的bZIPs(ABFs)，植物激素，例如，ABA、乙烯和Jas；Ca2+信号和与ABA激素信号通路相关的MAPK蛋白激酶都参与了植物通过调节气孔关闭来提高胁迫耐受性；此外，信号分子，包括保卫细胞中积累的H2O2、NO和H2S，也参与调节气孔运动。尽管这种响应干旱胁迫的气孔运动研究已经进行了很长时间，但总信号转导途径仍不清楚。
C2H2蛋白属于锌指蛋白(ZFP)TF家族，在形态发生、转录激活和应激反应中发挥重要作用。C2H2-ZFP包含由大约30个氨基酸组成的锌指结构，具有保守序列X2-CX(2-4)-CX12-HX(2-8)-H(X代表任何氨基酸)。在植物基因组中，C2H2-ZFP经历了广泛的谱系特异性扩增或收缩，并包含一个特别保守的QALGGH基序和特定的DNA结合域，它们在植物的表型多样性和环境适应性。C2H2-ZFP代表了来自矮牵牛、大豆、拟南芥、水稻和马铃薯中鉴定的一类重要的真核TF。在矮牵牛中，ZPT2-3在干旱和寒冷胁迫下上调，其过表达可以增强植物对干旱胁迫的耐受性；水稻中的ZFP252已被证明参与维持细胞内渗透压的稳态以及增强盐和干旱胁迫耐受性；甘氨酸大豆过表达品系中的GsZFP1也与小气孔相关并损害ABA诱导的气孔关闭；在拟南芥中ZAT10的组成型表达增加了植物对渗透、盐度和热胁迫的耐受性；此外，作为拟南芥中的阳性TF，STZ/ZAT10可以被丝裂原活化蛋白激酶3/6(MPK3/6)磷酸化，以增强渗透胁迫耐受性。这些结果表明，C2H2型锌指参与植物中盐分、低温、强光和广泛氧化的各种胁迫响应。但是木本植物中的C2H2-ZFP的鉴定和功能却只有较少的研究。
新疆杨(Populus alba var.pyramidalis)是白杨(Populus alba var.alba)的一种变种，只见雄性。因其生长快、缺乏絮状种子、茎直立、生物量高等特点，被广泛栽培用于城市绿化、生态修复和木材利用。在中国北方，从新疆到北京都可以栽培新疆杨。先前的研究表明，该品种是通过选择、驯化和克隆分布在中亚干旱地区的一个或多个个体雄性白杨获得的。新疆杨总是被人工扦插栽培，容易存活，所以可以大规模繁殖；同时，新疆杨生长在西北地区，对盐和干旱胁迫有一定的耐受性。
本发明首先从新疆杨的基因组中分离出了PalZAT10-1基因；同时发现盐处理新疆杨后的PalZAT10-1基因在根，木质部，叶片中的表达被显著的上调；其次，本发明通过转基因技术和敲除技术研究发现过表达新疆杨PalZAT10-1基因在水分亏缺胁迫下，具有提高过氧化物酶活性、提高光合作用、提高合适浓度的H2O2含量，增加相对含水量、降低电解质渗漏、降低丙二醛含量、降低气孔导度等功能，并使转基因新疆杨成为根系发达，分支较多，水分损失减少，气孔关闭，抗盐和抗旱能力提高的优良品质。对促进我国杨树树木资源的深入研究和开发利用具有重要意义。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1，所述基因PalZAT10-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一种含有上述第一方面所述基因PalZAT10-1的表达载体。
优选地，所述表达载体包括毕赤酵母表达载体、双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。
优选地，所述的毕赤酵母表达载体可用于酵母LiCl转化的载体。
优选地，所述的可用于酵母LiCl转化的载体为pPIC9K，所述载体携带有上述第一方面所述的基因PalZAT10-1后，通过LiCl、电导等常规生物学方法转化到酵母细胞中，步骤如下：
(1)将基因PalZAT10-1通过酶切连接方法分别连接到表达载体pPIC9K，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化连接PalZAT10-1的pPIC9K载体的大肠杆菌DH5α经50mg/L的氨苄青霉素筛选初步获得阳性克隆；
(2)进一步挑取单克隆通过PCR扩增，测序验证，最终得到融合PalZAT10-1基因的表达载体的阳性菌株；
(3)从步骤(2)获得的阳性菌株中提取连接成功的质粒，转化到感受态的毕赤酵母菌GS115中，经1mg/mL遗传霉素初步筛选阳性克隆菌株。
优选地，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pCXSN，pYLCRISPR/Cas9-DH和pCXDG，所述载体携带有上述第一方面所述的基因PalZAT10-1后，通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
第三方面，本发明提供了一种含上述第一方面所述基因PalZAT10-1的细胞系和宿主菌。
第四方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的基因PalZAT10-1在促进植物生长中的应用，所述基因能够促进植物分支和根系生长。
第五方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的基因PalZAT10-1在提高植物非生物胁迫耐受性的应用；所述的基因PalZAT10-1能够提高抗氧化物酶的活性；提高相对含水量；提高光合作用能力；降低气孔导度；降低丙二醛的含量；提高H2O2含量；增强植物抗逆能力。
优选地，所述非生物胁迫耐受性包括高盐胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、氧化胁迫耐受性。
优选地，所述植物为木本植物。
优选地，所述木本植物包括新疆杨、毛果杨、胡杨、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃树、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、山杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树、枫香树、柏树、道格拉斯冷杉、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉、紫杉。
优选地，所述的木本植物为新疆杨。
第六方面，本发明提供了一种构建含有所述基因PalZAT10-1过表达新疆杨育种苗和含有所述基因PalZAT10-1的Cas9靶点的敲除新疆杨育种苗的方法，其步骤如下：
(1)将所述的基因PalZAT10-1和将选好的PalZAT10-1基因的Cas9敲除靶点通过酶切连接方法分别连接到过表达载体pCXSN和敲除载体pYLCRISPR/Cas9-DH二元表达载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆；
(2)进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合PalZAT10-1基因的过表达载体的阳性菌株；
(3)从步骤(2)获得的阳性菌株中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株；
(4)挑取步骤(3)得到的阳性单克隆菌株，通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨，最终获得新疆杨过表达阳性苗PalZAT10-1OE lines和新疆杨敲除阳性苗palzat10-1 lines。
第七方面，本发明提供了一种上述第一方面所述基因PalZAT10-1编码的蛋白质PalZAT10-1，所述蛋白质PalZAT10-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种分离自广泛存在于中国北方并能提高植物水分胁迫耐受性的新疆杨基因PalZAT10-1，其定位于细胞核；在新疆杨中过表达基因PalZAT10-1，能提高过氧化物酶活性、提高光合作用、提高合适浓度的H2O2含量，增加相对含水量、降低电解质渗漏、降低丙二醛含量、降低气孔导度等功能，并使转基因新疆杨成为根系发达，分支较多，水分损失减少，气孔关闭，抗盐和抗旱能力提高的优良品质。该基因的发现对对促进我国杨树树木资源的深入研究和开发利用具有重要理论及实践意义。
附图说明
图1新疆杨PalZAT10-1基因的鉴定，其中a为系统发育树；b为染色体定位及共线性分析结果；c为氨基酸序列比对分析结果；
图2新疆杨PalZAT10-1基因上游启动子区元件分析结果；
图3新疆杨PalZAT10-1基因(PAYT007874.1)抗盐能力分析，其中a为20个同时含有两个C2H2 domain的PalZAT10s基因在盐胁迫处理新疆杨后不同组织中的表达模式；b为不同浓度NaCl处理后的新疆杨野生型中PalZAT10-1基因的相对表达水平；c为转基因GS115酵母在不同盐梯度下的耐盐性检测；
图4构建的表达载体示意图，其中a为pPIC9K酵母表达载体示意图；b为融合绿色荧光蛋白GFP的表达载体示意图；c为pCXSN过表达载体示意图；d为pYLCRISPR/Cas9-DH敲除载体示意图；
图5新疆杨PalZAT10-1蛋白的亚细胞定位；
图6新疆杨胁迫耐受性PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨，Cas9敲除基因新疆杨和野生型新疆杨WT；其中a为PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)的组培苗和生根情况；b为新疆杨胁迫耐受性PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨的两个株系PalZAT10-1OE line1、PalZAT10-1OE line4，Cas9敲除基因新疆杨两个株系palzat10-1 line3、palzat10-1 line11和野生型新疆杨WT的土培苗；c为PalZAT10-1 OE和palzat10-1的相对定量PCR分析；
图7 PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)在盐和渗透胁迫下相关生理指标测定；其中a为200mMNaCl处理3天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1之间的表型差异；b为200mM NaCl处理3天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1叶片光合色素的胁迫相关生理指标；c为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的电解质渗漏(EL)的定量测量；d为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的丙二醛(MDA)含量分析；e为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的脯氨酸(Pro)含量分析；f为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的过氧化氢(H2O2)水平分析；g为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的超氧化物歧化酶(SOD)的活性分析；h为75mM NaCl处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的过氧化物酶(POD)的活性分析；i为在纯净水和200mMNaCl分别处理3天后，通过用DAB组织化学染色测量的WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1中H2O2的原位积累情况；j为150mM Sorbitol模拟的渗透处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的MDA含量的分析；k为150mM Sorbitol模拟的渗透处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的Pro含量的分析；l为150mM Sorbitol模拟的渗透处理7天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1中的H2O2水平分析；m为150mM Sorbitol模拟的渗透处理7d后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1中SOD活性分析；n为150mM Sorbitol模拟的渗透处理7d后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1中POD活性分析；
图8 PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)、和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)在盐胁迫下气孔开闭情况的观察，其中a为通过扫描电子显微镜(SEM)在200mM NaCl处理7天后的WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的叶片中捕获的气孔开闭结果；b为使用Image J软件进行长度、宽度测量，并根据长度和宽度的测量值进行面积分析结果；
图9 PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)、和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)在ABA胁迫下气孔开闭情况的观察；其中a-b为杨树苗用5M ABA处理0、1.5和3小时后气孔关闭情况及对应的统计结果；c为DAB染色显示150M的ABA诱导不同时间WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的叶子中的H2O2产生情况；
图10 PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)、和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)在短期干旱胁迫下相关表型的测定，其中a为短期干旱处理后的形态差异；b为qRT-PCR验证了在干旱处理0、3、6、9和12h后PalZAT10-1基因的表达水平；c为WT、PalZAT10-1OE、palzat10-1在正常和5天干旱胁迫条件下叶片相对含水量(RWC)的测量；d为WT、PalZAT10-1OE、palzat10-1在正常和2-5天干旱胁迫条件下叶片的气孔导度(Gs)-干旱时间曲线；e为WT、PalZAT10-1OE、palzat10-1在正常和2-5天干旱胁迫条件下叶片的净光合速率(Pn)-干旱时间曲线；f为WT、PalZAT10-1OE、palzat10-1在正常和2-5天干旱胁迫条件下叶片的蒸腾速率(Tr)-干旱时间曲线；g为WT、PalZAT10-1OE、palzat10-1在正常和2-5天干旱胁迫条件下叶片的水分利用效率(WUE)-干旱时间曲线；
图11 PalZAT10-1基因过表达转基因新疆杨(PalZAT10-1OE)、野生型新疆杨(WT)和Cas9敲除基因新疆杨(palzat10-1)在干旱胁迫下相关生理指标的测定，其中a为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的电解质渗漏(EL)的定量测量；b为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的丙二醛(MDA)含量分析；c为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的脯氨酸(Pro)含量分析；d为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的过氧化氢(H2O2)水平分析；e为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的超氧化物歧化酶(SOD)的活性分析；f为正常条件和干旱处理5天后WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1的过氧化物酶(POD)的活性分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为新疆杨(P.alba var.pyramidalis)和毕赤酵母GS115；使用的pPIC9K、pCXSN、pYLCRISPR/Cas9-DH和pCXDG载体来源于四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，大肠杆菌DH5α感受态细胞来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，农杆菌GV3101来源于北京索莱宝科技有限公司。
本发明以下实施例所述的GFP是指绿色荧光蛋白，Green Fluorescent Protein；所述的YPDA培养基是指Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；所述的MES是指吗啉乙磺酸；所述的MgCl2是指氯化镁；所述的LiCl是指氯化锂；所述的Methanol是指甲醇；所述的Sorbitol是指山梨糖醇；所述的DAPI是指4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测，作细胞核Marker。
实施例1新疆杨PalZAT10-1基因的鉴定及系统发育分析
PalZAT10s的所有序列数据均来自新疆杨基因组；其他物种的直系同源序列从JGI(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索和下载；通过RAxML软件构建了ML系统发育树，结果如图1中a所示；新疆杨PalZAT10s及其在其他杨树中的同源基因定位在不同的染色体上，是不同重复产生，结果如图1中b所示；使用MEGA v.6.0.6和GeneDoc进行C2H2蛋白的氨基酸序列比对，结果如图1中c所示。
实施例2新疆杨PalZAT10-1基因上游启动子元件分析
PalZAT10-1启动子中的顺式作用元件通过在线软件plantcare预测(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。分析PalZAT10-1基因上游1349bp启动子区，结果如图2所示，分析得到了许多与非生物胁迫相关的顺式作用原件：ABRE，ABA反应元件；CRT/DRE，冷和脱水响应元件；SP1，光敏元件；HSE，热应力响应元件；GARE-基序，赤霉素反应元件；MBS，MYB转录因子识别位点；TCA-元件，水杨酸反应元件；W-box，WRKY转录因子。
实施例3新疆杨PalZAT10-1基因在盐胁迫中的作用
根据不同浓度NaCl处理新疆杨后获得的不同组织(根、叶、木质部和韧皮部)的转录组数据。分析了20个同时含有两个C2H2 domain的PalZAT10s基因在盐胁迫处理新疆杨后不同组织中的表达模式，结果如图3中a所示，PalZAT10-1基因(PAYT007874.1)在四个组织中都有较高的表达，且在根，叶和木质部中PalZAT10-1基因的表达量随盐浓度的升高而上升；qRT-PCR的结果进一步证明了上述结果(图3，b，其中每组数据从左至有分别为叶、根、木质部、韧皮部)；在毕赤酵母中表达了该基因，载体构建示意图如图4中a所示，并在加了Methanol的YPDA培养基上对酵母菌株进行盐处理，结果进一步表明PalZAT10-1基因在响应盐胁迫的过程中具有重要的作用(图3，c)。
实施例4新疆杨PalZAT10-1基因序列的克隆
利用RNA提取分离试剂Trizol，提取新疆杨叶片组织的总RNA，其具体方法是：称取新鲜的新疆杨叶片组织0.1g，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1ml Trizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5mL的离心管中，室温静置5min；继续加入0.2mL氯仿，剧烈混匀15s；室温放置2-3min；4℃，12000r/min离心15min，取上清到新的1.5mL离心管中，弃中下层；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃，12000r/min离心10min沉淀RNA，弃上清；加入75％的乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃，7500r/min离心2min；弃上清，晾干沉淀，溶解于50μL的DEPC水中，并加入0.5μL的Recombination RNase Inhibitor(RRI)，-80℃保存备用。
根据新疆杨基因组(Ma et al.,2018)获取PalZAT10-1基因的全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物：
上游引物：5’-ATGGCTCTTGAAGCTCTGAA-3’；
下游引物：5’-TTACGAAGAACCCATATCGG-3’；
通过反转录及PCR扩增获得PalZAT10-1基因序列，具体方法是：依据试剂盒PlantRT-PCR Kit 2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μL)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl2 4μL；10×RNA PCR Buffer 2μL；RNase Inhibitor 0.5μL；RNasefree Water 8.5μL；dNTP Mixture 2μL；Reverse Transcriptase 1μL；Oligo dT-Adaptor1μL)。混匀后，42℃30min；99℃5min；4℃5min，完成反转录反应。吸取1μL反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃5min后进入扩增程序，94℃50s，55℃50s、72℃45s，38个循环后，72℃10min。经过上述流程，扩增得到PalZAT10-1基因的CDS序列，并且扩增得到的PalZAT10-1序列自起始密码子到终止密码子总长759个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例5新疆杨PalZAT10-1基因的亚细胞定位
每个基因翻译的蛋白在细胞中的定位不同，其相应的功能有可能也不相同，发挥的作用也完全不同。因此，本实施例检测新疆杨PalZAT10-1蛋白的亚细胞定位。
根据pCXDG载体序列信息，然后利用生物信息学技术，设计以下GFP-PalZAT10-1阳性克隆菌株鉴定引物：
上游引物：5’-GACTCAGATCTCGAGCTCAAG-3’；
下游引物：5’-ATTCGAGCTGGTCACCTGT-3’。
新疆杨PalZAT10-1基因融合绿色荧光蛋白GFP表达载体的构建：将测序验证过的实施例3得到的PalZAT10-1基因的CDS片段通过酶切连接方法连接到pCXDG表达载体上(结构示意图如图4，b所示)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合GFP的表达载体35S::GFP-PalZAT10-1和阳性菌株。提取融合GFP的质粒，转化农杆菌GV3101感受态中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
新疆杨叶片的瞬时表达：将含35S::GFP-PalZAT10-1质粒转化成功的GV3101阳性菌株在LB培养基中28℃，200r培养至OD值约0.6左右，4000r离心10min收集菌体；在MS重悬液(10mM MgCl2，10mM MES，150μM乙酰丁香酮，pH5.6)中重悬后，黑暗培养3小时；将打好的1cm2新疆杨叶盘放入注射器管中，并吸入适量重悬菌液，一手堵住管口，另一只手抽拉塞子约4-5次(叶片在重悬菌液中由漂浮状态变成悬浮状态即可)；将浸好的叶片铺在MS固体培养基上(150μM乙酰丁香酮，pH5.6)，暗培养3天后用激光共聚焦显微镜观察荧光。
结果如图5所示，新疆杨PalZAT10-1基因编码的蛋白定位于细胞核，DAPI为细胞核的Marker。
实施例6过表达PalZAT10-1转基因新疆杨和Cas9敲除PalZAT10-1基因新疆杨的获得及阳性植株的鉴定
新疆杨PalZAT10-1基因过表达载体的构建：将测序验证过的实施例3得到的基因片段通过酶切连接方法连接到pCXSN二元表达载体上(构建示意图如图4，c所示)；将选好的PalZAT10-1基因的Cas9敲除靶点通过酶切连接方法连接到pYLCRISPR/Cas9-DH二元表达载体上(构建示意图如图4，d所示)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合PalZAT10-1基因的表达载体的阳性菌株和含有选好的PalZAT10-1基因的Cas9敲除靶点的表达载体的阳性菌株。从阳性菌种中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株，进一步挑取阳性单克隆菌株，通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
农杆菌介导的叶盘转化法：将含构建好的过表达载体质粒和敲除载体质粒转化成功的GV3101阳性菌株在LB培养基中28℃200rpm培养至OD值约0.5左右，5000rpm离心10min收集菌体，在重悬液(150μM乙酰丁香酮，pH5.6)中重悬后，重悬液黑暗培养3小时备用。取长势良好的新疆杨无菌组培苗叶片，在超净工作台中用无菌打孔器打成叶盘，将打好的叶盘放入黑暗培养后的重悬液中，浸泡10分钟，每隔2分钟摇晃一次。
转基因新疆杨不定芽的获得：取出上述步骤浸泡后的叶盘，放入愈伤诱导培养基中，暗培养10-15天，待愈伤组织长出后放入生芽培养基，培养2-3个月后诱导出不定芽，待不定芽长至1-2cm后从基部剪掉，接入生根培养基中(图6，a)。以上愈伤组织培养基，不定芽诱导培养基和不定根诱导培养基中均加入20mg/L的潮霉素进行筛选。
根据pCXSN载体序列信息，然后利用生物信息学技术，设计以下过表达PalZAT10-1转基因新疆杨阳性苗鉴定引物：
上游引物：5’-TCATCGCAAGACCGGCAACA-3’；
下游引物：5’-ACCTCGACCTCAACACAACA-3’。
根据pYLCRISPR/Cas9-DH载体序列信息，然后利用生物信息学技术，设计以下Cas9敲除PalZAT10-1基因新疆杨阳性苗鉴定引物：
上游引物：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’；
下游引物：5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACCG-3’。
根据新疆杨基因组获取PalZAT10-1基因的CDS全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下qRT-PCR引物：
上游引物：5’-CTTCTTACCAGGCTCTCGGC-3’；
下游引物：5’-GCCCTCATAGTGACAACGCT-3’。
转基因新疆杨阳性植株的鉴定和表达量的验证：上述步骤诱导产生的不定芽在生根培养基中培养1-2个月后，取叶片0.1g提取DNA，PCR扩增PalZAT10-1目的片段，测序验证；将测序合适的阳性苗的叶片剪下，提取RNA(具体方法见实施例3)，通过反转录及qRT-PCR验证阳性苗的表达量，具体方法是：依据试剂盒Plant qRT-PCR Kit(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μL)和Kit的各种反转录试剂混合(5×gDNA Eraser Buffer2μL；gDNA Eraser 1μL)加RNase free Water至10μL。混匀后，42℃2min；4℃5min，完成反转录第一步反应；将第一步反应中的产物和Kit的各种反转录试剂混合(Primerscript RT Enzyme1μL；5×Primerscript Buffer 4μL；RNase free Water 4μL；RT Primer Mix 1μL)，混匀后，37℃15min；85℃5s；4℃5min，完成反转录第二步反应。吸取5μL反转录产物和Kit的各种反转录试剂混合(正向引物：1μL；反向引物：1μL；SYBR：10μL；无菌水：3μL)，进行qRT-PCR反应：95℃30s后进入扩增程序，95℃5s，60℃35s，40个循环后进入采集荧光程序，95℃1min，55℃30s，95℃30s。将验证好表达量的阳性苗植株经过炼苗后移栽到土壤中，在光周期为16小时光照/8小时黑暗，25℃的温室中生长，土培转基因新疆杨及其表达量如图6中b和c所示，与野生型相比，获得的过表达转基因新疆杨PalZAT10-1OE表现出更多的分支和更发达的根系，而敲除的新疆杨palzat10-1则表现相反(图6，b)。根据基因的表达水平，挑选了表达量最高的PalZAT10-1OE line1和表达量最低的palzat10-1 line11进行非生物胁迫相关生理指标的测定。
实施例7过表达PalZAT10-1OE转基因和敲除的palzat10-1新疆杨的抗盐胁迫和抗渗透胁迫的相关生理指标测定
取苗龄为2个月的组培苗，由实施例5中获得的NaCl或Sorbitol处理的PalZAT10-1OE，palzat10-1和野生型新疆杨的从上往下数第八片叶片在提取液中磨碎、提取并测量MDA，Pro，H2O2的含量和SOD，POD的活性。所使用的提取液购买自苏州科铭生物技术有限公司(Comin Biotechnology，China)，测量方法严格按照试剂盒说明书(www.cominbio.com)所描述。结果如图7中a所示，200mM NaCl WT和palzat10-1树苗出现严重损伤，而PalZAT10-1OE树苗几乎没有损伤。在盐处理下，在PalZAT10-1OE中发现叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)、总叶绿素(Ct)和Pro含量最高，其次是WT和palzat10-1(图7中b和e)，而在palzat10-1中发现了最大程度的EL和最高的MDA和H2O2含量，其次是WT和PalZAT10-1OE(图7中c、d、f)。此外，对抗氧化酶POD和SOD活性的分析表明，在PalZAT10-1OE中发现两种抗氧化酶的活性最高，其次是盐胁迫下的WT和palzat10-1(图7中g-h)。通过用DAB进行组织化学染色来确定H2O2的积累，结果如图7中i所示，正常条件下palzat10-1、PalZAT10-1OE和WT杨树之间没有明显差异，而在盐处理下，palzat10-1叶片呈现最深的褐色斑点，表明H2O2在palzat10-1中积累较高，而不是在WT和PalZAT10-1OE中。发明人还在渗透胁迫下研究了这些参数。WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1杨树幼苗用150mM Sorbitol溶液处理，测定相关生理指标，包括MDA、Pro、H2O2、SOD和POD。结果表明杨树植物在渗透胁迫下的表型与在盐胁迫下观察到的表型相似(图7中j-n)。这些结果表明，过表达的PalZAT10-1OE新疆杨显著提高了抗盐和抗渗透胁迫能力；其中图7中b-h及j-n中每一组数据从左至有分别为WT、PalZAT10-1OE、PalZAT10-1。
上述实施例表明，PalZAT10-1基因主要通过调控新疆杨的各种生理指标，保护细胞膜的渗透能力，提高植物的抗氧化能力，光合作用的能力等，进而提高植物的抗盐能力，而新疆杨属于典型的木本植物。因此，发明人推断除了新疆杨之外，PalZAT10-1基因对其他渗透胁迫生态环境较为严峻的地区的木本植物均具有提高抗盐胁迫的作用，可以将PalZAT10-1基因通过基因工程的方法转化到其他木本植物中，也可以促进其他木本植物的耐盐能力。
实施例8过表达PalZAT10-1OE转基因和敲除的palzat10-1新疆杨盐处理后气孔扫描电镜观察
由于实施例6中的生理指标，如叶绿素含量，H2O2含量等以及盐胁迫和渗透胁迫耐受性与气孔有很大的关系，因此本实施例研究盐胁迫下气孔的状态。
扫描电镜观察：200mM NaCl处理土培2个月新疆杨7天后，选择从上往下数的第八片叶子用液氮速冻30s，立刻抽真空后至于扫描电镜观察气孔。
结果如图8所示，盐处理后过表达PalZAT10-1OE新疆杨显著使气孔关闭(图8中a-b)。表明，PalZAT10-1基因主要是调控气孔开闭来响应非生物胁迫。
实施例9过表达PalZAT10-1OE转基因和敲除的palzat10-1新疆杨ABA处理后叶片气孔扫描电镜观察，以及DAB染色观察
在PalZAT10-1的启动子区域中发现了ABA响应元件ABRE(图2)。土培2个月的杨树苗用5M ABA处理0、1.5和3小时。与在气孔开放溶液(OS)条件下获得的结果相比，新疆杨在用ABA处理1.5小时后，WT和PalZAT10-1OE的气孔面积均减小，而palzat10-1没有显着变化；处理3小时后，PalZAT10-1OE气孔基本闭合，WT的气孔面积也减小，但不显著，palzat10-1的气孔开始关闭(图9，a-b)。
为了研究H2O2对ABA诱导的气孔孔径的参与，通过喷洒150M ABA(0、1.5和3小时)处理离体的新疆杨叶片，并用DAB染色，结果如图9中c所示，PalZAT10-1OE叶片的棕色比WT叶片深，而palzat10-1叶片呈现最浅的棕色。结果表明，PalZAT10-1OE通过H2O2积累明显促进了ABA诱导的气孔关闭。
实施例10过表达PalZAT10-1OE转基因和敲除的palzat10-1新疆杨干旱处理后气孔导度、相对含水量以及水分利用效率的测定
由于在PalZAT10-1启动子中鉴定了脱水反应元件(DRE)(图2)，发明人研究了PalZAT10-1在响应干旱胁迫时的反应。在干旱处理后，在palzat10-1中检测到最严重的损伤，其次是WT和PalZAT10-1OE，并且PalZAT10-1的表达是由干旱胁迫诱导的(图10，a-b)。正常情况下，RWC、MDA、Pro和H2O2的含量无显着差异，但PalZAT10-1OE中SOD和POD的活性显着升高。然而，在干旱胁迫后，PalZAT10-1OE的叶片RWC值最高，而palzat10-1的RWC最低；PalZAT10-1OE的EL，MDA和H2O2含量最低，Pro含量和SOD、POD活性最高，而palzat10-1表现出与PalZAT10-1OE相反的生理指标数值(图10中c，图11，每一组数据从左至有分别为WT、PalZAT10-1OE、PalZAT10-1)；Gs、Pn和Tr数据表明WT、PalZAT10-1OE和palzat10-1对干旱胁迫的反应发生了改变。总体而言，随着处理时间的增加，PalZAT10-1OE的Gs和Tr值低于WT，而palzat10-1的Gs和Tr值高于WT；PalZAT10-1OE的Pn和WUE值最高，其次是WT，palzat10-1的Pn和WUE值最低(图10，d-g)。
综上所述，本发明发现了一种提高水分胁迫耐受性的基因PalZAT10-1，其定位于细胞核。在新疆杨中过表达基因PalZAT10-1，能促进植物分支，根系发育和气孔关闭，提高抗氧化活性，光合速率和水分利用效率；在新疆杨中敲除PalZAT10-1基因获得palzat10-1lines，其表型则与PalZAT10-1OE lines完全相反。该基因对于预防植物水分损失，培养优良抗逆树种方面具有重要的意义，为促进我国对杨树树木资源的深入研究和开发利用奠定基础。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 新疆杨(P. alba var. pyramidalis)
<400> 1
atggctcttg aagctctgaa ctctcctaca acagccgctc ctttaaatta tgaagaaaca 60
tggattaaga ggaaacgctc taagagacct cgtagtgagt ccccttctac cgaggaagaa 120
tacctcgctt tttgccttat catgcttgct cgtggcggct ccactgccgc aaccgccaaa 180
aaaaccgctt ccgcctcccc tgcaccaccc caaccaccaa ctttggatct ttcttacaag 240
tgtacggttt gcaacaaggc tttctcttct taccaggctc tcggcgggca caaagccagt 300
cacaggaaat cctcctccga gtcaaccgtc gccacagccg ccgaaaaccc atcagcctcc 360
accacaacta acacaaccac cacgaccacc aatggtagga ctcatgagtg ctctatctgc 420
cacaagactt tccttactgg acaggcctta ggcggacaca agcgttgtca ctatgagggc 480
acaattggag gcaacaacag cagcagtgct agcgctgcaa tcaccacctc agacggtggt 540
gctgttggag gcggtggcgt gagccagagt aaaagtcaaa gaagcggtgg tgggtttgac 600
tttgacctga acctgcctgc tttgcctgaa tttgaaggtc caagaatcag tcaacaagca 660
ctctacggtg atcaagaagt ggaaagtcct ttgccaggga aaaagccaag attaatgttt 720
tcgcttaagc aagaaaagac cgatatgggt tcttcgtaa 759

Claims (1)

1.基因PalZAT10-1在提高新疆杨非生物胁迫耐受性中的应用，所述非生物胁迫耐受性为高盐胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、氧化胁迫耐受性；所述基因PalZAT10-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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