CN113151306B - 一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所述的WRKY类转录因子响应低温胁迫，能够提高梅花花瓣、拟南芥和烟草的抗寒性，为培育耐寒性的梅花育种提供了分子工具，并对于拓展梅花应用范围具有重要的意义。

Description

一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用
技术领域
本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用。
背景技术
梅花(Prunus mume)是中国十大传统名花之一，在我国有3000多年栽培历史，在江南地区花期为2月左右，北方花期较晚。梅花适栽范围介于自然分布区和历史分布区之间，北界为西藏经四川至甘肃天水，陕西宝鸡、西安、河南洛阳，最后到山东烟台，通过海岸线与自然分布区相接，以长江流域为集中赏梅地带。在华北、东北和西北等北方地区则不能露地越冬，限制其应用，在江南地区，春季的极端低温(低于-3℃)对花(蕾)伤害很大。随着温度的降低，低温对花瓣的伤害越大(图1)，极大地影响观赏价值，造成经济损失。因此，抗寒育种一直是梅花育种的重要方向。
目前，抗寒梅花育种的主要手段是引种驯化以及品种间杂交和远缘杂交等方式，虽然通过传统的育种获得一批优良的抗寒品种方式，但是此方法耗时长，管理成本较大。随着分子生物技术的发展，通过抗寒基因挖掘和机制解析，转基因育种成为快速获得理想抗寒品种的方式。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的锌指型转录因子，不仅参与植物生长发育以及信号传递等生物学过程，在生物胁迫和非生物胁迫过程中也发挥重要的调控作用，可显著提高植物的抗寒性。目前，尚未有梅花WRKY参与梅花花瓣耐寒性的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57，及其编码的转录因子。
一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的抗寒性的基因PmWRKY57的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
用于克隆本发明所述基因PmWRKY57的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
含有本发明所述基因PmWRKY57的表达载体。
根据本发明所述的表达载体，其中，所述表达载体为植物表达载体。
本发明所述基因PmWRKY57在提高梅花花瓣抗寒能力中的应用。
本发明所述的应用，其中，ABA能够诱导PmWRKY57的表达，PmWRKY57通过相应ABA信号调控梅花花瓣的耐寒性。
本发明所述基因PmWRKY57在植物生长发育中的应用。
本发明所述的应用，其中，所述基因PmWRKY57在拟南芥和烟草根的生长发育中的应用。
本发明提供了一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其编码的转录因子，研究发现，本发明所述的WRKY类转录因子响应低温胁迫，能够提高梅花花瓣的抗寒性，也可以提高拟南芥和烟草的抗寒能力，同时参与了植物的生长发育调控，本发明为培育耐寒性的梅花育种提供了分子工具，并对于拓展梅花应用范围具有重要的意义。
下面结合附图对本发明的提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中低温胁迫影响梅花花瓣的观赏性图；
图2为本发明中梅花PmWRKY57基因扩增条带图；
图3为本发明中低温处理后梅花花瓣中PmWRKY57基因的表达变化图；
图4为本发明中转基因植株DNA阳性检测电泳图；
图5为本发明中低温处理后拟南芥和烟草表型变化图；
图6为本发明中低温胁迫下拟南芥转基因株系生理指标变化图，其中，A：MDA含量；B：SOD活性；C：POD活性；D：脯氨酸含量；
图7为本发明中低温胁迫下烟草转基因植株生理指标变化图，其中，A：MDA含量；B：SOD活性；C：POD活性；D：脯氨酸含量；
图8为本发明中低温和ABA处理对拟南芥根长的影响图；
图9为本发明中低温和ABA处理对烟草根长的影响图；
图10为本发明中ABA处理后转基因植株中PmWRKY57的表达量变化图；
图11为本发明中PmWRKY57基因在烟草中的亚细胞定位图；
图12本发明中PmWRKY57基因转录激活活性分析；A：载体构建图谱；B：酵母中转录激活活性分析；
图13为本发明中植物过表达载体Binary Vector pORE_R4质粒图谱。
具体实施方式
一、基因克隆
I.PmWRKY57基因cDNA全长克隆
基于梅花‘骨红朱砂’(Prunus mume‘Guhongzhusha’)转录本片段，以‘骨红朱砂’花蕾cDNA为模板，使用preme5.0设计特异性引物，利用r-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，将克隆获得的目的片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性筛选后将菌液进行测序，测序结果序列通过比对后得到c DNA全长。
PmWRKY57基因的特异性引物
PmWRKY57-F：5’-ATGGACGACGACAAATACAACCGC-3’
PmWRKY57-R：5’-TCATCGATTACGCATCCCAGGAGG-3’
(1)cDNA第一链的合成
根据PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)(TAKARA)说明书在冰上进行对提取的RNA反转录为cDNA，反应体系为2μL PrimeScript RT Master Mix(PerfectReal Time)，7μL RNase Free dH2O，1μL RNA，反应条件为37℃15min，85℃5s，4℃1min，保存于-20℃备用。
(2)PCR反应体系和步骤20μL体系：上下游引物各1μL、cDNA 1μL、Premix Taq DNA10μL和ddH2O 7μL。
(3)反应程序：
扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min。
II.片段纯化与pMD18-T载体的连接反应
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用TAKARA公司的切胶回收试剂盒回收目的条带，步骤如下:
(1)在紫外灯照射下用刀片将琼脂糖凝胶上的目的片段迅速切下，放入去皮的1.5mL离心管中，称取重量并计算胶块体积，以1mg＝1μL进行计算；
(2)向胶块中加入4倍胶块体积量的溶解液Buffer GM，均匀混合后于震荡机震荡溶解至充分；
(3)将溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，重复倒入再离心一遍提高回收率，弃滤液。
(4)加入700μL的Buffer WB(已加指定体积乙醇)，室温12000rpm离心30s，弃滤液；重复操作此步骤一遍。
(5)空瓶离心1min去除多余液体；于通风橱内吹风2min。
(6)将柱子安置于新的1.5mL的离心管上，在柱子膜中央加入20μL ElutionBuffer，室温静置1min(Elution Buffer于60℃加热使用，有利于提高洗脱效率)。
(7)室温12000rpm离心1min洗脱DNA，4℃保存。
III.大肠杆菌转化：
将目的片段与pMD18-T载体连接，反应体系为：回收产物4μL，pMD18-T 1μL，SolutionⅠ5μL，条件为16℃过夜(约12h左右)。
重组质粒转化大肠杆菌的具体步骤为：
(1)取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，于冰上待融化后将连接产物打入并吸打混匀，冰浴30min；
(2)提前42℃预热水浴锅，将冰浴好的感受态细胞放于水浴锅中热击90s后，将离心管转至冰上冰浴2min；
(3)向离心管中加入500μL LB液体培养基，37℃摇床培养1h；
(4)吸取一定量的菌液与40μL X-gal和7μL IPTG混匀均匀涂抹在LB固体培养基上，37℃倒置培养10-16h。
IV.阳性克隆筛选及测序比对
(1)提前对超净工作台进行灭菌，用10μL枪头挑取单个白色菌落放入加有1000μLLB液体培养基的1.5mL离心管中，封口膜封好；
(2)将离心管放于37℃恒温培养箱中，200rpm摇菌4-6h；PCR检测菌液是否含有目的片段，将含有目的片段的菌液送于测序公司进行检测。
结果：
利用特异性引物进行PCR扩增，结果如图2所示，经过连接、转化、测序后获得编码CDS序列。测序结果显示：PmWRKY57CDS长为993bp，编码330个氨基酸，蛋白质分子量为36.02KD，理论等电点为6.00。不稳定系数为53.99，脂肪指数为48.52，预测它们为不稳定蛋白。总平均亲水系数(GRAVY)为-0.844，属于亲水性蛋白。
二、表达特性分析
I.表达模式检测
(1)采用实时荧光光定量PCR(Real Time PCR)技术，对不同胁迫处理下的PmWRKY57表达模式进行检测。根据cDNA序列设计引物：
正向引物：GACGGCTCCAGACCCGACGGCTTTT
反向引物：CTCGGTATCTCGGGCGGTGGTTTGC
(2)从经过0、24、48、72h低温(2℃)处理的花蕾中提取RNA，RNA提取采用购自天津诺禾致源公司的UltraClean Polysaccharide and phenol Plant RNA PurificationKit，方法参照试剂盒的提取说明书。cDNA的获得根据TAKARA PrimeScriptTM RT MasterMix(Perfect Real Time)说明书在冰上进行；RT-PCR分析使用的Light Cycler 480II(Roche，瑞士)，反应体系为SYBR Premix Ex Taq(Takara，日本)10μL，cDNA模板(反转录cDNA稀释10倍)2μL，上下游引物(10μm/L)各0.8μL，ddH2O 6.4μL，每个样品设置3次重复，反应程序为两步法：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃复性30s，共40个循环；然后以95℃持续5s，60℃持续1min，95℃持续15s作为溶解曲线分析程序，最后根据2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。
II.亚细胞定位
利用WOLFPSORT在线软件(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测PmWRKY57基因的亚细胞定位情况，结果显示该基因定位于细胞核内。
具体操作步骤如下：
(1)选择保存的农杆菌菌液放入含抗生素的YEB液体培养基中，28℃培养箱200rpm培养至OD600达到1.0-1.5之间；
(2)取1mL 1 000g，10min，收集菌体，弃上清，加1mL渗透液，悬浮菌体；
(3)再取少量悬浮菌液进行稀释，至OD600为0.01-0.1，即可用于侵染烟草；
(4)侵染前将烟草放于白色荧光灯下1h，使气孔张开，然后使用去掉针头的注射器将侵染液注射到烟草叶片的背部，并做标记，注射完后将烟草放在培养箱中培养；
(5)2-3天后，取注射部位进行清洗，DAPI染色，在激光共聚焦显微镜下进行观察。
III.转录活性分析
(1)构建pGBKT7-PmWRKY57载体，设计上下游引物时分别加入pGBKT7载体上的酶切位点NdeI、NcoI。
表1构建载体所需引物
Figure BDA0003107284870000061
下划线为NdeI、NcoI酶切位点。
(2)根据设计好的引物进行PCR扩增，切胶回收，载体酶切体系为10x buffer 5μL、DNA3μL、酶各1μL、ddH2O 42μL，产物酶切体系为10x buffer 3μL、DNA 1μL、酶各1μL、ddH2O14μL；进行载体连接，连接体系为产物酶切6μL、载体酶切2.5μL、T4连接酶0.5μL、T4 Ligasebuffer 1μL。转化大肠杆菌、挑菌送测，提取质粒等保存质粒用于酵母感受态细胞AH109的转化。
(3)挑取SD/-Trp板子上生长圆润的单菌落，进行稀释并点菌到SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal的固体培养基上，30℃倒置培养3-5d，观察菌落生长及变色情况。
结果：
1)低温诱导PmWRKY57基因的表达
在低温处理24h后，PmWRKY57基因的表达量显著上调，在48h时表达量最高，为0h的14倍左右(图3)，说明PmWRKY57基因在花瓣中显著响应低温胁迫表达，可能参与调控花瓣的耐寒性。
2)PmWRKY57基因在细胞核内表达
在线预测软件得到PmWRKY57基因定位于细胞核，通过侵染烟草叶片进行亚细胞观测，如图11所示，在激光共聚焦显微镜下观察染色情况，结果显示35S∷PmWRKY57-GFP的荧光信号出现在细胞核内，与预测结果一致，属于核蛋白。
3)PmWRKY57基因具有转录激活活性
将pGBKT7-PmWRKY57转入到AH109中观察菌株的生长情况，结果如图12所示，pGBKT7空载与pGBKT7-PmWRKY57均能在SD/-Trp培养基上生长，但空载不能在SD/-Trp-His-Ade和SD/-Trp-His-Ade+x-α-gal培养基上生长，而pGBKT7-PmWRKY57可以在SD/-Trp-His-Ade中生长且能在SD/-Trp-His-Ade+x-α-gal上变蓝，说明PmWRKY57基因全长具有转录激活活性；为了明确具体有激活活性的区域，将PmWRKY57基因进行分段分别构建BD载体，结果显示N端能在SD/-Trp-His-Ade中生长且能在SD/-Trp-His-Ade+x-α-gal上变蓝，而C端不能在三缺板上生长，说明PmWRKY57基因的转录活性区域为N端。
三、功能验证实验
I.PmWRKY57基因超表达载体构建
将已克隆成功的目的基因的菌液提为质粒作为植物表达载体构建的cDNA模板。目的基因片段的扩增使用Prime 5.0对基因序列进行引物设计，使用Bio XM6.0对目的基因的序列进行酶切位点的分析；在上游引物和下游引物中分别加入NheI和XhoI酶切位点：
PmWRKY57-F：GCTAGCATGGACGACGACAAATACAACCGC
PmWRKY57-R：CTCGAGTCATCGATTACGCATCCCAGGAGG
PCR反应体系为50μL，上下游引物各2.5μL，cDNA模板2.5μL，rTap 25μL，ddH2O17.5μL。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min。
PCR扩增产物与植物表达载体Binary Vector pORE_R4(图谱信息见图13)经NheI和XhoI酶切，酶切体系为模板10μL，NheI 1μL，XhoI 1μL，10×M buffer 5μL，ddH2O 3μL，反应时间37℃酶切3h；之后与T4连接酶16℃连接12-16h，连接体系为：酶切产物20μL，质粒酶切产物3μL，T4连接酶3.5μL，T4 Ligase buffer 5μL，ddH2O 18.5μL。将连接好的重组质粒转化大肠杆菌，用含卡那霉素培养基筛选阳性菌落，经PCR鉴定含有目标条带后送至公司进行测序。
II.遗传转化
将测序成功的菌液提为质粒转化农杆菌，吸取菌液50-200μL均匀地涂于含50mg/Lkana、50mg/L利福平Rif的LB培养基，于28℃倒置培养2-3d，挑取单个饱满的菌落于培养基上，于28℃200rpm摇菌16h，进行菌落PCR检测，选取条带正确的菌液进行保存，为后续的实验做准备。将准备好的阳性农杆菌菌液转入含50mg/L kana、50mg/L Rif的LB液体培养基中28℃200rpm振荡培养至OD600达到1.5-2.0，于4℃5000rpm离心10min，倒掉上清收集菌体；以同样体积的侵染液重悬菌体，加入50μL silwet充分混匀。
(1)将已经抽薹开花、生长健康的拟南芥上表现为含苞待放以上的花朵和已经形成果荚都剪去；将拟南芥花梗浸入侵染液中，期间晃动数次，保证花梗与侵染液充分接触，持续1min。侵染完后将拟南芥置于不透光的环境中培养24h，之后放于光照培养箱中远离其他植物材料进行培养；7d后再重复侵染一次，提高侵染转化效率。保证植株的水分充足，等待果荚成熟，收集种子放于37℃培养箱中烘干。
(2)选取生长状态良好的野生型烟草组培苗，挑选植株中部完全展开的健壮叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小，剪去主脉及叶柄部分，放入无菌广口瓶中。向广口瓶中倒入准备好的菌液，浸泡8-10min，其间轻轻摇晃广口瓶数次，使菌液与植物材料充分接触，取出叶片，置于无菌滤纸上吸去多余菌液。将叶片接种于共培养培养基MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA上，在培养基上垫一层滤纸。于28℃黑暗条件下共培养3d。将叶片转入筛选培养基进行抗性芽的筛选分化，每15d更换一次培养基。筛选培养基MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+100mg/L KM+400mg/L Cef(或500mg/L Carb)。当叶片在筛选培养基上长出比较明显的抗性芽时，将抗性芽切下，转入壮芽培养基中MS+0.1mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+100mg/LKM+400mg/L Cef(或500mg/L Carb)。抗性芽成苗后转到生根培养基，进行抗性苗的生根培养，生根培养基MS+100mg/L KM+400mg/L Cef(或500mg/L Carb)。
III.阳性株系筛选及表型观察
(1)将转化的拟南芥种子播于含50mg/L kana 1/2MS培养基中，4℃春化2-3d，放于光照下培养，观并筛选能够在培养基中健康生长转基因阳性苗。之后通过采集已经初筛选的转基因阳性苗的叶片，提取DNA进行PCR特异性引物鉴定转基因株系是否为含有目标基因的阳性苗。将转基因拟南芥置于-2℃培养箱进行处理观察，拍照并统计其表型特征。
(2)观察烟草生根培养基上抗性苗的长势，当根系密集呈发散状布满瓶底时，移栽至花盆。选取阳性植株的叶片，提取DNA进行PCR验证。将转基因烟草分别置于2℃培养箱进行处理观察，拍照并统计其表型特征。
IV.ABA处理转基因植株表型观察
将转基因拟南芥和烟草种子消毒，播种于不含抗生素的1/2MS方形培养基上，拟南芥于4℃低温春化2-3d后放于光照下培养。待转基因拟南芥和烟草全部发芽后选取生长情况一致的苗转移至添加ABA(100μM)1/2MS及对照1/2MS培养基上，拟南芥于5d后进行根长统计，烟草于15d后进行根长统计。其中一部分转基因拟南芥待长到四片真叶时移栽到营养土中进行培养，用于后期胁迫处理；四周后进行低温和喷施ABA处理，取各处理之后的叶片进行抗性生理指标的测定。烟草移栽于土壤一个月后进行ABA处理，并进行生理指标统计。
结果：
1)PmWRKY57基因提高转基因植株的耐寒性
共鉴定出拟南芥阳性植株11株，烟草6株。鉴定电泳图目的基因扩增条带单一，长度正确，且清晰可见，无杂带(图4)，证明目的基因已成功转入拟南芥和烟草，分别选择拟南芥转基因#2和#3株系以及烟草#1株系进行低温处理实验。在正常温度条件下，转基因拟南芥和烟草与其野生型植株没有什么差异。当低温处理三周后，如图5所示，野生型拟南芥植株的叶片颜色出现了褐化、枯黄等现象，受害现象明显，而拟南芥转基因株系(OX-AT#2和OX-AT#3)并没有出现这种现象，表现出较强的耐寒性。对于烟草来说，低温处理野生型烟草叶片枯黄、下垂，出现明显的寒害现象，而烟草转基因株系(OX-NT#1)叶片上挺，表现出较强的耐寒性。综上说明，分别转入PmWRKY57基因均可提高拟南芥和烟草的耐寒性。
2)低温胁迫下转基因植株的生理指标变化
如图6所示，低温处理后，野生型拟南芥的MDA含量3.11μmol/g，明显高于转基因拟南芥MDA含量2.21和2.48μmol/g，说明野生型拟南芥的膜系统受害程度相对较深。低温处理后，SOD、POD与脯氨酸的含量都有所上升，转基因株系的SOD含量为149.48和198.80U/g，高于对照SOD含量139.31U/g，且存在显著差异；转基因株系的POD含量为1224和1263.1U/(g*min)，显著高于对照POD含量1071.33U/(g*min)；转基因株系的脯氨酸含量为323.22和329.05μg/g，显著高于野生型的脯氨酸含量297.58μg/g。如图7所示，低温处理后，在烟草低温处理后得到了同样的结果，烟草转基因株系的MDA含量为2.79μmol/g，显著低于对照4.05μmol/g；转基因烟草中SOD、POD及脯氨酸含量含量分别为151.27U/g、1337.1U/(g*min)和315.62μg/g，分别显著高于对照121.23U/g、988.65U/(g*min)和303.54μg/g。综上说明，PmWRKY57基因超表达后能够显著提高转基因拟南芥和烟草的耐寒性。
3)低温与ABA可以影响转基因植株根的生长发育
对进行低温、ABA处理5d后的拟南芥(OX-AT#2和OX-AT#3)进行根长统计。结果表明，如图8和图9所示，正常条件下，转基因拟南芥与野生型拟南芥的根长都在35mm以上，无明显差异。胁迫处理下的拟南芥根长都受到了影响，有明显的降低(图8A)。低温处理下，转基因拟南芥的根长高于野生型且存在明显差异(P<0.05)；100μM ABA处理下，转基因拟南芥根长低于野生型，但侧根数量明显高于野生型(图8B)。烟草转基因株系OX-NT#1进行低温和ABA处理后也出现了类似的现象，低温处理下转基因株系主根长度显著长于对照(图9A)，ABA处理后转基因株系的侧根数量增多(图9B)。说明了PmWRKY57基因可以参与转基因拟南芥和烟草根的生长发育。
4)ABA促进PmWRKY57基因的表达
在喷施ABA后采取0、1、2、4、8、12h的叶片进行PmWRKY57基因的表达量分析(图10)。在ABA处理后转基因株系的PmWRKY57基因的表达量发生了一定的变化。在拟南芥转基因株系OX-AT#2和OX-AT#3中，PmWRKY57基因在处理1h后迅速上调，整体呈现先上升后下降的趋势，上调幅度不尽相同；OX-AT#2株系出现了两次峰值，分别在1h与8h，最高值达到了13倍左右，之后呈现下降的趋势。在烟草转基因株系OX-NT#1中，ABA处理后PmWRKY57基因表达趋势与拟南芥转基因株系中表达一致，同样的在1h后迅速上调，整体呈现先上升后下降的趋势，总体来看，ABA能够诱导PmWRKY57基因的表达，说明PmWRKY57基因响应ABA信号调控梅花花瓣耐寒性。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用
<130> 2021-5
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 梅花(Prunus mume)
<400> 1
atggacgacg acaaatacaa ccgcgatcca gctagtacga ccgagttcac aactcagtcc 60
acctggccac tcgacccgga cagcgcctac ttcttcgcca gccacgacgt cagagacaac 120
acactcctca ccgaattcgg ctggaacttc cacccggacg gctccagacc cgacggcttt 180
tcagaacttg acccgatcgg aacccgcgac atgtccgatt tggcggcaac tagtagccag 240
cttgttgcgg actgcttacg acccgccgac agcagcagca gcagcaccgc ggcgtttcgg 300
agctccgacc cggcccccgc cgtcggatcc gcgtcgacga acccgtccgt ttcttcgacc 360
tccagcgagg atccgccgga gaaatctacg gggtccggcg gcaaaccacc gcccgagata 420
ccgagtaagg ttaaaaagaa ggggcagaag agaatccggc agccacgatt tgcatttatg 480
actaagagtg aagttgatca tcttgaggat ggctaccgct ggcggaaata tggacagaaa 540
gctgtcaaaa acagcccctt tccaaggagc tactatcgct gcacaaatag caaatgcaca 600
gtgaagaaaa gggttgaacg ttcctctgaa gatcccacaa ttgtaattac cacgtacgaa 660
ggccaacact gtcatcacac tgttgcattc ccccggggcg gagtgattgc tcaagaatct 720
ggctttgcag gccaccattt ggcgcagctg cctccagtca gctcacactt catgtattat 780
cctgcaattc aacccagaga gcgagttagt cctgttaact tgacacgaac gacttcgcac 840
caattagcat ccccacgtgg tgatgatgat gatgatgatg atcaagctgc aggagcagga 900
tcatcccact gccttgatcc acagacaact tcagttcctg cagatgaagg gcttcttggg 960
gacattgtac ctcctgggat gcgtaatcga tga 993
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 梅花(Prunus mume)
<400> 2
Met Asp Asp Asp Lys Tyr Asn Arg Asp Pro Ala Ser Thr Thr Glu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Gln Ser Thr Trp Pro Leu Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Phe Phe
20 25 30
Ala Ser His Asp Val Arg Asp Asn Thr Leu Leu Thr Glu Phe Gly Trp
35 40 45
Asn Phe His Pro Asp Gly Ser Arg Pro Asp Gly Phe Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Pro Ile Gly Thr Arg Asp Met Ser Asp Leu Ala Ala Thr Ser Ser Gln
65 70 75 80
Leu Val Ala Asp Cys Leu Arg Pro Ala Asp Ser Ser Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Ala Ala Phe Arg Ser Ser Asp Pro Ala Pro Ala Val Gly Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Asn Pro Ser Val Ser Ser Thr Ser Ser Glu Asp Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Ser Thr Gly Ser Gly Gly Lys Pro Pro Pro Glu Ile Pro Ser Lys Val
130 135 140
Lys Lys Lys Gly Gln Lys Arg Ile Arg Gln Pro Arg Phe Ala Phe Met
145 150 155 160
Thr Lys Ser Glu Val Asp His Leu Glu Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys
165 170 175
Tyr Gly Gln Lys Ala Val Lys Asn Ser Pro Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr
180 185 190
Arg Cys Thr Asn Ser Lys Cys Thr Val Lys Lys Arg Val Glu Arg Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Pro Thr Ile Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Gln His Cys
210 215 220
His His Thr Val Ala Phe Pro Arg Gly Gly Val Ile Ala Gln Glu Ser
225 230 235 240
Gly Phe Ala Gly His His Leu Ala Gln Leu Pro Pro Val Ser Ser His
245 250 255
Phe Met Tyr Tyr Pro Ala Ile Gln Pro Arg Glu Arg Val Ser Pro Val
260 265 270
Asn Leu Thr Arg Thr Thr Ser His Gln Leu Ala Ser Pro Arg Gly Asp
275 280 285
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gln Ala Ala Gly Ala Gly Ser Ser His Cys
290 295 300
Leu Asp Pro Gln Thr Thr Ser Val Pro Ala Asp Glu Gly Leu Leu Gly
305 310 315 320
Asp Ile Val Pro Pro Gly Met Arg Asn Arg
325 330
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atggacgacg acaaatacaa ccgc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tcatcgatta cgcatcccag gagg 24

Claims (9)

1.一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的抗寒性的基因PmWRKY57的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 用于克隆权利要求1所述基因PmWRKY57的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
4. 含有权利要求 1所述基因PmWRKY57的表达载体。
5. 根据权利要求 4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为植物表达载体。
6.权利要求1所述基因PmWRKY57在提高梅花花瓣、拟南芥和烟草抗寒能力中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：PmWRKY57通过调控非生物胁迫响应途径中与胁迫相关基因的表达来参与低温胁迫。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：ABA能够诱导PmWRKY57的表达，PmWRKY57通过相应ABA信号调控梅花花瓣的耐寒性。
9.权利要求1所述基因PmWRKY57在促进拟南芥和烟草根的生长发育中的应用。
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