CN109576282A

CN109576282A - 月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用

Info

Publication number: CN109576282A
Application number: CN201811549304.8A
Authority: CN
Inventors: 周晓锋; 马男; 李永红; 李禹琪; 刘妍妍; 雷诗瑶
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN109576282B

Abstract

本发明涉及月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用。具体地说，本发明提供了RhMYB4基因，其特征在于，所述基因包含如SEQ ID NO.23第263～1039bp所示的编码区核苷酸序列。本发明还提供了由所述基因编码或者具有如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的蛋白。本发明还提供了所述基因在植物花器官发育以及耐低温能力调节中的应用。基于目前发现的转录因子RhMYB4的功能，该基因将可以应用于植物的花器官发育例如花瓣重瓣化、花瓣异形化、雄蕊败育和耐低温能力调节。

Description

月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用。

背景技术

月季(Rosa hybrida)蔷薇科蔷薇属常绿或半常绿灌木，是世界上最古老的花卉之一，不仅具有极高的观赏价值，还可食用、药用。切花、盆花和庭院花卉是月季的主要用途，经济价值巨大，2017年月季的平均每月供货量高达为六千多万支。需要指出的是，切花月季的花型是月季重要的观赏性状之一，其受损会严重降低切花月季的品质及其商品价值。

在月季切花的周年生产中，传统节日春节以及情人节，月季的需求量达到最大值，但在冬季生产月季最容易受到低温胁迫。生产中低温(＜10℃)对切花月季产量和品质的影响越来越突出，如低温胁迫引起的生育期延长、花朵发育畸形等，使生产遭受巨大经济损失。早期的研究发现，月季在低温导致过度重瓣化，在低温环境下花芽分化推迟、花器官发育缓慢。冬季生产中，低温会导致月季花器官发育畸形并且出现随着温度的降低，花瓣数增加，雄蕊数减少的趋势。总之，低温会严重降低切花的品质，带来巨额经济损失。

植物在经历低温时，会诱导响应基因的表达，其产物可以直接保护植株免受胁迫或进一步控制其他靶基因的表达。为了应对低温胁迫，植物在长期的进化过程中已经从生理和分子水平形成了相应的适应性，通过调整它们的代谢来最大限度地提高耐寒性。早期的研究发现植物细胞膜对植物感知外界低温信号起到至关重要的作用。细胞膜感应低温后，将低温信号通过钙离子、ABA等第二信使向下游传导，相关基因就会被转录因子所调控，达到植物自身抵抗低温的效果。

现在与低温调控相关的研究主要集中在依赖与不依赖转录因子CBF/DREB的途径。CBF基因受上游组成型转录因子ICE1的调控，ICE1感受到低温后被激活，继而诱导CBF的表达。在ICE1的过表达拟南芥中发现，过表达植株比野生型具有更高的冷冻耐受性，ICE1主要影响CBF3/DREB1A的表达，ICE2(ICE1同源基因；At1g12860)编码的蛋白质主要影响CBF1/DREB1B的表达，但对CBF3/DREB1A的影响很小。因此，ICE1和ICE2在转录调控中发挥关键作用。CBF/DREB1基因低温诱导转录因子CBFs的表达，CBFs再与CORs(COLD REGULATED GENES)的顺式作用元件结合，然后促进CORs的表达，提高植物对低温的耐受力。另一方面随着ROS含量的提高，MYB家族、MADS家族、NAC家族等转录因子参与保护蛋白质的合成和维持新陈代谢的正常进行。在拟南芥中，MYB家族转录因子PAP2调节类黄酮生物合成途径。此外，DREB1迅速而短暂地反应，而MYBS3对冷胁迫反应缓慢。在拟南芥中MYBC1的转录不受CBF1，CBF2和CBF3过表达的影响，这表明MYBC1没有被这些CBF家族成员下调。

对植物低温反应相关的报道有很多，但是从目前掌握的资料来看，其反应的机理非常复杂，其确切的分子机理仍然有待于深入研究。

关于MYB家族，据报道，MYB家族、MADS家族、NAC家族等转录因子参与保护蛋白质的合成和维持新陈代谢的正常进行。在拟南芥中，发现MYB家族转录因子PAP2调节类黄酮生物合成途径，但是在拟南芥中MYBC1的转录不受CBF1，CBF2和CBF3过表达的影响，认为MYBC1没有被这些CBF家族成员下调。

MYB家族转录因子(TF)的特点是都含有保守MYB结构域，并且按照保守域的个数分类。MYB转录因子广泛存在于所有动物、植物等真核生物中。早在1941年就在白血病病毒中发现MYB基因，此后，许多MYB基因在动物，植物和真菌中相继被发现。有人认为，MYB基因在玉米中参与花青素合成(Paz-Ares J,Ghosal D,Wienand U,et al.The regulatorycllocus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogeneproducts and with structural similarities to transcriptional activators.EMBOJournal,1987,6(12):3553-3558)。在植物中常见的转录因子有MYB家族、MADS家族、AP2家族和bZIP家族等，MYB家族是植物中转录因子数量最多，功能最广泛的家族之一。截止2018年3月，NCBI中正式载入的MYB基因已有54273个。在拟南芥中，目前研究发现存在198个MYB基因。植物中的MYB家族通常含有一至四个不完全重复序列(R)。MYB类转录因子可以根据R数目的多少分为四个不同的亚科：存在一个R的为1R-MYB；含有两个R的为R2R3-MYB，大部分MYB类转录因子属于此类；含有三个R的为R1R2R3-MYB；含有四个R的是4R-MYB。4R-MYB亚家族是MYB家族中最少且研究功能最少的一组，在植物中，其每个成员含有四个R1/R2重复序列。R1R2R3-MYB(3R-MYB)亚族在进化中比较保守。R2R3-MYB(2R-MYB)亚家族是该家族中最大的一组，植物中的2R-MYB亚家族有超过120名成员，在拟南芥中约90个成员。1R-MYB家族是MYB家族的第二大群体，在拟南芥中，存在64个成员属于1R-MYB家族，水稻中存在70个成员属于该家族。

低温引起花朵畸形和切花品质下降是月季切花反季节生产中急需解决的问题。MYB类转录因子在低温影响月季花器官发育方面的作用还没有明确。本发明通过分析低温处理的月季花蕾转录组数据，发现RhMYB4表达量受低温胁迫显著下调，同时参与低温反应和花器官的发育，由此完成了本发明。

发明内容

本发明人基于RhMYB4基因能够影响植物的耐低温性能以及参与花器官发育的发现来完成的。

在第一方面，本发明提供了RhMYB4基因，所述基因包含如SEQ ID NO.23第263～1039bp所示的编码区核苷酸序列(CDS，coding sequence)。

优选的是，所述基因还包括SEQ ID NO.23第1～262bp所示的5'UTR(5'-Untranslated Region，5'-端非翻译区)核苷酸序列和/或SEQ ID NO.23第1040～1250bp所示的3'UTR(3'-Untranslated Region，3'-端非翻译区)核苷酸序列。

进一步优选的是，所述基因由SEQ ID NO.23第263～1039bp所示的核苷酸序列组成。

进一步优选的是，所述基因由SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列组成。

本发明在第二方面提供了一种蛋白，所述蛋白由权利要求1至4所述的基因编码或者具有如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，更优选的是，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.24所示。

本发明在第三方面提供了本发明第一方面所述的基因在调节植物耐低温胁迫能力中的应用。

优选的是，所述应用为通过使植物的所述RhMYB4基因过表达的方式来提高植物耐低温胁迫能力。

本发明在第五方面提供了本发明第一方面所述的基因在调节花器官发育中的应用。

优选的是，所述调节花器官发育是通过使植物的所述RhMYB4基因沉默(例如瞬时沉默)的方式来使：(1)花瓣重瓣化；(2)花瓣异形化；(3)雄蕊败育或数量减少；(4)有性繁殖后代数量减少；优选的是，所述调节花器官发育是通过使植物的所述RhMYB4基因沉默的方式来使雄蕊瓣化来实现花瓣重瓣化、花瓣异形化、和/或雄蕊败育或数量减少。

在一些更优选的实施方式中，所述植物为蔷薇科植物，进一步优选为月季，最优选为切花月季。

低温引起花朵畸形和切花品质下降是月季切花反季节生产中急需解决的问题。本发明人首次发现RhMYB4基因参与植物的非生物胁迫调节尤其是低温胁迫耐性的调节，而且还参与植物花器官发育。本发明通过解析RhMYB4参与并调控低温影响月季耐低温性能和花器官发育的分子机制，为采用基因工程手段解决月季切花反季节栽培中低温导致花朵畸形的生产问题提供理论和技术依据；而且，具有新奇形状的花卉(即所谓的奇花异草)是观赏植物的重大观赏价值所在，重瓣化和花瓣异形化是很多花卉领域的重要育种目标，因此，RhMYB4参与花器官发育这一发现也将会让RhMYB4能够在花卉育种中发挥重大的作用；另一方面，在杂交育种中，为了避免不期望的自然受粉的发生，经常需要人工去掉雄蕊，这是植物育种中庞大且繁杂的工作，由于RhMYB4沉默可以导致雄蕊瓣化而败育，使得可以通过使RhMYB4基因沉默而省却去雄这样繁杂的工作，节省大量的劳动力。

附图说明

图1为月季低温下花蕾差异表达基因中各TFs的比例。

图2为RhMYB4的进化树。

图3为在常温和低温条件下RhMYB4表达量的qRT-PCR检测分析。在常温和低温条件下RhMYB4表达量的qRT-PCR检测分析，差异显著性通过t-test分析，*P<0.05。

图4为RhMYB4在一天中不同时间点的表达量差异。

图5为RhMYB4基因在不同花器官中的表达特性。半定量RT-PCR检测月季不同开花级数花朵各花器官中RhMYB4基因的表达。Pe，花瓣；Se，萼片；Re，花托；St，雄蕊，图中图片是3次生物学重复的代表图片。

图6为RhMYB4在月季RhMYB4VIGS植株中的表达分析。

图7为RhMYB4沉默植株的花瓣表型。

图8为TRV2和TRV2-RhMYB4沉默植株中的花器官数目。对照组和基因沉默组中植株的花器官数目。差异显著性通过t test分析，n＝23，*P<0.05，**P<0.01。

图9为pSuper 1300C-GFP-RhMYB4在烟草中的定位。

图10为RhMYB4的转录活性分析。

图11为酵母双杂液中的“米奇头”。

图12为酵母双杂筛库结合(mating)效率的检测。

图13为RAG51588与RhMYB4酵母互作验证。

图14为RHL18496与RhMYB4酵母互作验证。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

下文将以实施例的形式对本发明的技术方案进行举例说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。

一、试验材料

植物材料：VIGS试验所用的材料是月季品种‘Samantha’，其组培苗由本实验室扩繁。双分子荧光互补试验材料选用的是野生型烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)。

试验菌株和载体如下表1所示：

常用菌株或质粒	型号或名称
		大肠杆菌	top10
农杆菌	GV3101
		酵母菌	Y2H GOLD(黄金酵母)、AH109
克隆载体	pMD18-T
		过表达载体	Super1300-GFP(C)
VIGS载体	pTRV1、pTRV2
		酵母载体	pBD-GAL4、pGBKT7、pGADT7(Clontech公司)

试验仪器：PCR仪、水浴锅、金属浴、Eppendorf移液枪、pH计、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、冷冻离心机、常温离心机、Sartorius电子天平和pH计、Milli-Q纯水仪、Nanodrop 2000微量分光光度计、Nikon T1激光共聚焦显微镜、ZEALWAY立式自动压力蒸汽灭菌器等。

试验试剂耗材：试验中所用主要试剂：抗生素：卡那霉素(Kana)、氨苄青霉素(Amp)、利福平(Rif)。植物激素：ABA、6-BA、GA。化学试剂：无水乙醇、乙酰丁香酮(AS)、蛋白酶抑制剂、X-α-gal等购于Amresco、Sigma、Thermo公司。试验中所用的引物由生工(上海)合成，测序由擎科(北京)和生工(上海)完成。

试验中所用主要试剂盒主要有：庄盟生物的微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒，用于DNA片段液体回收或者切胶回收。AXYGEN的质粒小提试剂盒，用于大肠杆菌质粒的提取和酵母质粒的提取。Maychmaker^TM Gold Yeast Two-Hybrid System，用于酵母双杂筛库。HiScript Q RT SuperMix for qPCR，用于提取RNA后的反转录。常用培养基的配制除酵母培养基外都是121℃，20min高温高压灭菌，酵母培养基115℃，15min高温高压灭菌)。

实施例中使用到的培养基如下表2～4所示：

表2

表3

表4

注：(1)酵母N源为不含氨基酸的酵母N源；(2)表2和3中的pH均为5.8，体积为1L。

二、试验方法

载体构建

根据月季转录组数据库(Rose Transcriptome Database)中已有的序列信息，设计克隆的引物，以cDNA为模板进行PCR。反应体系和反应程序如下表5所示。

将得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶进行验证，确认后单一条带进行液体回收，回收使用庄盟生物的微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒(V-ELUTE Gel Mini Purification Kit)进行。然后对TRV2载体和上步回收的PCR片段分别进行双酶切，切1μg。双酶切体系如下表6所示：

片段酶切反应体系在37℃切4h左右，液体回收目的片段；载体酶切反应体系在37℃切4h左右，80℃20min变性，液体回收。

然后，用T4连接酶将上步回收的酶切产物和载体连接，然后将连接产物转入大肠杆菌感受态(DH5α)中进行转化，选取测序验证转化成功的菌液进行在50mL离心管中培养过夜。之后使用AXYGEN的质粒小提试剂盒抽提大肠杆菌中的质粒并保存备用。

实验中所用引物、RhMYB4基因序列及其编码的相应蛋白序列如下表7所示。

月季组培苗VIGS侵染方法

在无菌工作台涂Kan/Rif-LB板，将1μg质粒转入农杆菌感受态(GV3101)中。挑取Kan/Rif-LB板上的单菌落，三个基因(pTRV1,pTRV2-RHMYB4和pTRV2-Empty(空质粒))各6个单克隆，过夜培养，菌落PCR检测。将pTRV2-RHMYB4菌液和pTRV1菌液、pTRV2-Empty菌液和TRV1菌液1︰1混合。将月季组培苗分别完全浸泡于pTRV2-RHMYB4和pTRV2-Empty两个菌液中。真空抽至0.8atm后，保压5min，缓慢放气5min，重复抽吸两次。将抽真空过后的组培苗清洗3次，在8℃培养箱培养2天。将处理后的组培苗种植于基质中，用保鲜膜覆盖，放至培养室中培养。14天左右穿破保鲜膜，植株透气；7天后摘除保鲜膜，观察植株生长。

月季总RNA的提取和qRT-PCR

采用Hot Borate法提取月季总RNA，，经反转录获得cDNA，然后用诺唯赞反转录试剂盒以cDNA为模板根据说明书进行反转录。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用KAPA SYBRFAST qPCR KIT试剂盒和ABI公司的PRISM Step ONE Plus Real-time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)仪器进行qRT-PCR分析，计算各基因的相对表达量。每个实验包括三次生物学样品重复和三次技术性重复。

VIGS瞬时沉默效果检测

为了确定VIGS试验中基因是否沉默，用RT-PCR进行VIGS沉默效果检测。PCR程序根据不同的引物有不同的退火温度，内参基因RhUBI循环圈数28循环，目的基因检测循环圈数34循环。

烟草中的瞬时表达和转录激活的验证

转化农杆菌，3天后挑点摇菌，做完菌液PCR鉴定为阳性克隆之后，向菌液加入Kan/Rif的液体LB中过夜培养，28℃，200rpm，离心集菌，用当天配制的烟草侵染液，稀释重悬沉淀菌块。挑选烟草自下而上第四片叶子，将农杆菌液从叶背面注入，每个基因至少注射3株烟草(三次重复)。将注射过菌液的烟草置于暗处培养1天，光下培养2天，3天后用共聚焦显微镜观察荧光。

根据RHMYB4的结构分析，将其分为4段分别构进pGBKT7载体中。然后进行酵母感受态的制备及转化，具体步骤如下：取AH109酵母菌株，在YPDA板上30℃倒置培养2-3天。挑取5-10个单克隆于YPDA培养基中，28℃摇菌过夜。离心集菌，灭菌水清洗沉淀，将酵母菌等分1mL到离心管中，离心集菌。加6μL鲑鱼精DNA。加1μL目的载体及对照，轻轻混合。涡旋混匀，30℃水浴30min，42℃热激25min，冰上冷却5min。在SD/-Trp培养基上涂板，30℃培养2-3天。用水稀释，点到SD/-Trp、SD/-Trp-His、SD/-Trp-His/X-α-gal板上，30℃培养2-3天，观察结果。

酵母双杂交(Y2H)筛库

酵母菌感受态的制备和转化：将Y2H Gold菌株在YPDA板上于30℃培养2-3天。挑取单克隆于YPDA培养基中28℃摇菌过夜，离心集菌，加入1mL无菌水重悬，按照60μL加到每管中去，然后按照顺序加入如下表8所示的溶液：

50％PEG	240μL
		1M LiAc	36μL
ssDNA(5mg/mL)	10μL
		重组质粒	1μL

然后涡旋混匀，于30℃水浴30min，42℃热激25min，离心后弃上清再加入200μL0.9％NaCl溶液重悬，涂相应的缺素板，30℃培养3-5天。

诱饵载体毒性和自激活性检测

(1)检测诱饵载体毒性：将空载BD与重组质粒按照2.2.7.1中的方法转入Y2H Gold菌株再涂SD/-Trp板，30℃培养3-5天后，观察空载BD与重组质粒在SD/-Trp板上单克隆的长势(大小和数量)。

(2)检测诱饵载体自激活性：将空载BD与重组质粒按照2.2.7.1中的方法转入Y2HGold菌株再涂SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal板，30℃培养3-5天后，观察重组质粒在SD/-Trp/X-α-gal板上有无变色，若有变蓝则需要从SD/-Trp板上挑点，再涂到含有不同浓度梯度的SD/-Trp/X-α-gal/AbA板上，从而筛选出一个合适的AbA浓度，以便之后的筛选。

(3)Y2H mating筛库流程：诱饵载体转化Y2H Gold菌株后检测毒性与自激活性。挑取含有Bait的菌株克隆到50mL SD/-Trp液体培养基中，30℃过夜培养。离心，用4-5mL SD/–Trp重悬细胞，室温水浴锅中融化AD菌液，取10uL稀释100×、1000×、10000×涂布SD/–Leu板。将1mL AD菌液和4-5mL pGBKT7-RhMYB4菌液加到2L的锥形瓶中。加45mL(含有50ug/mLKan)的2×YPDA液体培养基，30℃培养20h后，在40×下观察杂交液是否出现米奇头。离心并0.5×YPDA(含有50ug/mL Kan)液体培养基重悬菌体，梯度稀释1/10，1/100，1/1,000，和1/10,000后涂SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/X/A。30℃培养3-5天后统计各板菌落数，计算结合效率。将在二缺板上长出的点转移，用水稀释后点到四缺板和显色板上，30℃培养3-4天，观察结果。

(4)酵母质粒的提取和互作验证

使用TIANGEN的TIANprep Yeast Plasmid DNA Kit根据说明书提取筛选到的酵母质粒，用Nano Drop测定质粒浓度。互作验证采用酵母回转验证方式，先把候选质粒和pGBKT7-RhMYB4质粒共同转入Y2H Gold菌株中，然后验证候选基因是否为阳性。

三、结果与分析

低温下影响花发育的MYB类转录因子的初选

本发明人对利用低温下月季花芽分化初期花蕾的转录组进行比较分析，发现表达量降低2倍以上的差异基因有1958个，其中37个是转录因子，MYB类转录因子有6个(图1)。本发明研究了其中差异较大的ARHL23930。通过基因结构分析发现，ARHL23930为MYB类转录因子，在月季转录组数据库获取基因编码区序列，以月季‘Samantha’月季组培苗叶片cDNA为模板进行PCR扩增。测序结果表明，月季ARHL23930基因编码区全长为777bp(参见SEQ IDNO.23，全长为1250bp，第263～1039bp为5'UTR，第263～1039bp为编码区，第1040-2025bp为3'UTR)，编码258个氨基酸(参见SEQ ID NO.24)，另外5'UTR有262pb，有211bp，使用NCBI软件分析表明，该序列具有作为MYB转录因子相对保守的功能结构域并且属于R2R3类型的MYB转录因子。使用MEGA6.0将其氨基酸序列与拟南芥中的MYB类基因的氨基酸序列建立进化树(图2)，结果表明与拟南芥中的MYB4最同源，所以将其命名为RhMYB4。

RhMYB4在‘Samantha’中常温和低温条件下的表达差异

将30株生根的组培苗‘Samantha’从组培苗中取出，炼苗2天后，种植在营养土中，放在22℃培养室中生长。45天左右刚露出小花蕾时，15株在常温(22℃)下直接取样，15株在低温(4℃)处理7天后取样，提取小花蕾RNA后反转录，通过qRT-PCR检测常温和低温条件下RhMYB4的表达量。结果显示与常温条件相比，在低温条件下RhMYB4表达量降低(图3)。这与低温转录组库中测定结果一致，证明RhMYB4的表达响应低温信号，因而参与低温影响月季花器官发育的调控。

RhMYB4在一天中不同时间点的表达量差异

将15株生根的组培苗‘Samantha’从组培苗中取出，炼苗2天后，种植在营养土中，放在22℃培养室中生长。45天左右刚露出小花蕾时，在同一天中取不同时期的各5个小花蕾，提取小花蕾RNA后反转录，通过RT-PCR检测在一天中不同时间点的RhMYB4的表达量。结果显示，RhMYB4的表达量有昼夜节律(参见图4)。

RhMYB4在月季中的组织特异性表达分析

为了明确RhMYB4在月季花发育中的作用，对RhMYB4在月季不同级数花器官的表达特性进行分析。如图5所示，RhMYB4在1级花器官和5级花器官中的表达量较低，在3级花器官中表达量较高。花瓣、花托和雄蕊中RhMYB4表达量都在3级花中达到最高；萼片中RhMYB4表达量在1级达到最高，然后下降。这说明RhMYB4可能参与了月季花器官的生长发育。

月季RhMYB4瞬时沉默植株的获得及其花器官发育的表型鉴定

为了探究RhMYB4基因在月季花器官发育中的功能，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对月季中的RhMYB4基因进行了沉默。将RhMYB4基因的3’端和部分ORF区域插入到TRV2中构建RhMYB4-TRV2载体。同时，以TRV空载为负对照，转入到农杆菌GV3101中，采用真空抽吸的方法侵染月季‘Samantha’组培苗。处理后的组培苗在培养室生长40d左右，开始现蕾，对TRV和TRV2-RhMYB4两组新生的叶片进行取样和RT-PCR检测(图6)。选出基因RhMYB4表达量低的植株，进行表型观察。

当植株完全开花时，对沉默组和对照组的花的生长发育及花的各个器官进行统计观察(见下表9)。统计可知，RhMYB4沉默植株的花瓣总数是对照组的1.39倍，RhMYB4沉默植株雄蕊数量对照组是沉默组的1.24倍，RhMYB4沉默植株畸形花瓣是对照组的2.06倍(图8)。由此可知，沉默RhMYB4可使月季花的花瓣雄蕊瓣化，花瓣总数增加(图7)。

转录因子RhMYB4的生化特性检测

为了确定RhMYB4的亚细胞定位，将RhMYB4的ORF构建到pSuper1300C-GFP，进行烟草侵染。结果表明负对照pSuper1300C-GFP空载在烟草中核膜都亮(图9)，而pSuper1300C-GFP-RhMYB4在烟草中只有细胞核显色，表明RhMYB4定位于细胞核内，符合转录因子在细胞核内行使功能的特性(图9)。

RhMYB4作为转录因子，除了核定位以外，另一个生化特性是具有转录活性功能。把RhMYB4的ORF段在NCBI上进行结构分析，发现RhMYB4具有两个含MYB的结构域，分别是14-61aa和66-122aa(图10的图A)。根据此结构，将4段连在pGBKT7上，分别为pGBKT7-RhMYB4^full、pGBKT7-RhMYB4^1-61、pGBKT7-RhMYB4^1-122、pGBKT7-RhMYB4^66-259(图10)。转化酵母可知，作为正对照的pGBKT7-GAL4在缺乏His和Trp的情况下正常生长且在X-α-gal上显色明显，作为负对照的pGBKT7在缺乏His和Trp上不能正常生长。pGBKT7-RhMYB4^1-61和pGBKT7-RhMYB4^1-122在缺乏His和Trp上不能正常生长，且在X-α-gal环境下无显色反应；pGBKT7-RhMYB4^66-259在缺乏His和Trp的情况下正常生长且在X-α-gal上显色明显；包含完整ORF在缺乏His和Trp的情况下生长较弱并且在X-α-gal下微微变蓝。结果表明RhMYB4具有转录激活活性，并且转录激活域在R3结构上。

RhMYB4互作蛋白的筛选

在室温水浴锅中融化AD菌液，然后稀释10μL涂布到100×、1000×、10000×的SD/–Leu一缺板上，10000×SD/–Leu板上存在大于200个克隆，证明文库菌的活力满足筛库条件。

因为RhMYB4存在转录激活活性，为了保障筛库的效率足够高，通过AbA来抑制RhMYB4的转录激活活性。因此使用125ng/mL、150ng/mL、200ng/mL和250ng/mL的AbA浓度梯度来进行筛选。将负对照pGBKT7、重组质粒pGBKT7-RhMYB4和正对照S23转入到Y2H Gold中，结果表明250ng/mL的AbA浓度能够抑制RhMYB4的转录激活活性。

将pGBKT7-RhMYB4转到Y2H Gold和AD文库菌液Y187进行结合(mating)，20小时后在40×下观察杂交液中出现米奇头(图11)，然后将结合的酵母菌液分别涂布到梯度稀释1/10，1/100，1/1,000和1/1,0000的SD/-Trp一缺培养基、SD/-Leu一缺培养基和SD/-Leu/-Trp二缺培养基上(图12)，根据公式筛选克隆数＝二倍体(cfu/mL)×重悬液体积(mL)，计算得到筛选到的二倍体克隆数。经计算，结合效率为3％，大于2％，可继续进行下一步。

利用月季花芽文库，对RhMYB4进行互作蛋白的筛选工作。将在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal四缺培养基上变蓝的酵母单克隆进行摇菌，提取质粒并设计引物进行PCR检测，选取阳性克隆测序，通过NCBI、拟南芥库和月季库比对测序结果，确定筛选到了目标蛋白。在本次试验中共筛选到263个酵母单克隆，将这263个酵母单克隆转移到的SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal四缺培养基上，共发现178个变蓝的酵母单克隆。测序发现共筛选出33个RhMYB4互作蛋白。

表10.RhMYB4互作蛋白比对分析结果

RhMYB4与候选蛋白的互作验证

从筛选出来的蛋白中，根据蛋白功能，选择两个RAG51588和RHL18496进行进一步验证。首先对候选基因进行回转验证，将筛选出的基因与pGBKT7/RhMYB4共转酵母Y2H Gold中，在验证RAG51588与RhMYB4的互作试验中，正对照pGBAD-T/pGBKT7-53在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal中正常生长并且显色明显，负对照pGBAD-T/pGBKT7-Lam、RAG51588/pGBKT7和RhMYB4-BD/pGBAD在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal均不能正常生长，RhMYB4-BD/RAG51588在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal中正常生长并且显色明显，表明RAG51588与RhMYB4互作(图13)。

在验证RHL18496与RhMYB4的互作试验中，正对照pGBAD-T/pGBKT7-53在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal中正常生长并且显色明显，负对照pGBAD-T/pGBKT7-Lam和RhMYB4-BD/pGBAD在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal均不能正常生长，但是负对照RHL18496/pGBKT7在SD-trp-leu-his-ade情况上长势较弱，在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal上微微变蓝，表明RHL18496有微弱的自激活活性，为了更好地验证其生化特性，设置了一系列的AbA浓度梯度得四缺显色板，结果表明在125ng/mLAbA的SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal板上不能生长，RhMYB4-BD/RHL18496在SD-trp-leu-his-ade/X-α-gal中正常生长并且显色明显，表明RHL18496与RhMYB4互作(图14)。

四、讨论和结论

低温严重降低了切花月季的观赏品质和产量，导致月季过度重瓣化。本发明人在表达量降低2倍以上的差异基因中，MYB类转录因子占多数(图1)，表明MYB家族转录因子参与调控月季花器官发育。为了进一步探究月季MYB类基因是否参与低温调控花器官的发育，选择了低温胁迫下表达量降低较多的RhMYB4作为候选基因进行下一步的研究，结果发现RhMYB4和AtMYB4基因亲缘关系最近，推测RhMYB4可能通过次生代谢物的积累从而在月季响应低温胁迫中发挥重要作用。

RhMYB4瞬时沉默后雄蕊瓣化严重，花瓣总数增加。AG基因是ABCE模型中的C类基因，控制雄蕊的发育，推测RhMYB4可能通过与相关蛋白的结合来调控AG的表达，进而对月季花器官的发育起调控作用。

通过烟草定位可知RhMYB4蛋白定位于细胞核中。酵母单杂实验表明RhMYB4蛋白具有转录激活活性，不同的片段有不同的特性，其中R3部分表现出比蛋白全长更强的转录活性，而R2区域没有转录激活活性，推断RhMYB4的氨基端存在一个转录抑制区域，而R3部分存在一个转录激活域，因此蛋白全长上表现为相对较弱的转录激活活性。

本研究筛库共筛选出39个RhMYB4互作蛋白，包括调控细胞周期蛋白、泛素化蛋白、物质运输蛋白、生长调节蛋白以及分子伴侣等，最终挑选了候选基因RAG51588和RHL18496进行下一步验证。RAG51588是参与活性DNA去甲基化基因，推测与RhMYB4通过互作来介导月季在低温胁迫中对环境的应答。RHL18496与花器官发育ABCE模型中的AG和AP3有关，推测通过与RhMYB4互作来调控月季花器官发育C类基因AG的表达，进而影响月季的花器官发育。这两个基因在月季里的都没有相关报道，在其他物种中也没有他们的同源基因与MYB类转录因子的互作。

综上所述，本发明人发现，月季转录因子RhMYB4瞬时沉默使月季雄蕊瓣化；RhMYB4具有转录激活活性，与其互作蛋白RAG51588和RHL18496互作共同调控低温引起月季花器官的发育畸形。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用

<130> MP1832588Z

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctctagagt gtccagattt gaatctcga 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggtacctc agagagctct caagggat 28

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catcatcaag ctccatagcc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcaaagac tcagctggt 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacaggtta tttgggctag 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgggttcaa ttccttatc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggagatga tacgctgtt 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctaaaactt cagacacg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacaagcacg caaaccctat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggagcatgag ccaaatggag 20

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctctagaat ggggagatct ccttgc 26

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggggtacctt tcatctccaa gcttctgta 29

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggatccat ggggagatct ccttgctg 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaattctta tttcatctcc aagcttc 27

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgggatccat ggggagatct ccttgctg 28

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaattcgag gtagttgatc caccgca 27

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggatccat ggggagatct ccttgctg 28

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaattcgtc aatacctctt gtcaaaa 27

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgggatccat ggggagatct ccttgctg 28

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaattctta tttcatctcc aagcttc 27

<210> 23

<211> 1250

<212> DNA

<213> Rosa hybrida

<400> 23

aacctgtctc accaactcgc atctagaagc aattagggtc ccttctctct ccctctcccc 60

ctctctccct ctcttttagt caaaagccta taaaatcata cgccaagtcc tccacaaggg 120

ccggccttta tgtttcagca aatacaaata gcaactcctc taccatttcc agtttccatc 180

accactctgc tacaataaaa ataaaaaacc aaagccaaca acaacagcta cttccaactc 240

tccaaactct tgaacttgct taatggggag atctccttgc tgtgaaaagg ctcacacgaa 300

caaaggagct tggaccaaag aagaagatga tcgcctcatt gcttatatcc gagctcacgg 360

cgaaggctgc tggcgctctc tgcctaaagc agccggcctt cttcgctgcg gcaagagctg 420

taggctgcgg tggatcaact acctcagacc ggacctcaag cgcggaaatt tcactgaaga 480

agaagatgag ctcatcatca agctccatag cctcctcggg aacaaatggt ctttgattgc 540

tgggagacta ccgggaagaa cagacaatga gataaagaac tactggaata cccatataag 600

aaggaagctt ttgacaagag gtattgaccc tgcaactcac agaccactca atgaaacacc 660

tcaggactct gccacaacca ccactatctc ttttgctgct tcttctgcta ttattaaaga 720

agaagatcag aaaatcagca ccagtattgg gattgtgggc agcaaagact caaaaaaccc 780

agttcaagag aagtgtccag atttgaatct cgagcttaga attagtcctc ctagccaggc 840

caaaccagct gagtctttga agagtggggg aagaggtgtc tgcttttctt gcagtttggg 900

gttaaaggac tcaaagagtt gcactagctg tgggattgat aatattggtg ccacaagtgc 960

cggcactagt aatattgctt atgatttctt gggattgaaa aatggggtgt tggattacag 1020

aagcttggag atgaaataag attgattagt tggagtcatg aaattgtaat atgtagttct 1080

aagttgagtg ggggagaaat cagatgggga ttgctgatat taatcccttg agagctctct 1140

gaggggtacc cctgttttcc ctctttatgt ctctaatttt tattgactat tagagcatat 1200

ttagtataat accagtacag ctgattgggg aaattccttt gatcatttat 1250

<210> 24

<211> 258

<212> PRT

<213> Rosa hybrida

<400> 24

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Ile Ala Tyr Ile Arg Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Arg Arg Lys Leu Leu Thr Arg Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro

115 120 125

Leu Asn Glu Thr Pro Gln Asp Ser Ala Thr Thr Thr Thr Ile Ser Phe

130 135 140

Ala Ala Ser Ser Ala Ile Ile Lys Glu Glu Asp Gln Lys Ile Ser Thr

145 150 155 160

Ser Ile Gly Ile Val Gly Ser Lys Asp Ser Lys Asn Pro Val Gln Glu

165 170 175

Lys Cys Pro Asp Leu Asn Leu Glu Leu Arg Ile Ser Pro Pro Ser Gln

180 185 190

Ala Lys Pro Ala Glu Ser Leu Lys Ser Gly Gly Arg Gly Val Cys Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Leu Gly Leu Lys Asp Ser Lys Ser Cys Thr Ser Cys Gly

210 215 220

Ile Asp Asn Ile Gly Ala Thr Ser Ala Gly Thr Ser Asn Ile Ala Tyr

225 230 235 240

Asp Phe Leu Gly Leu Lys Asn Gly Val Leu Asp Tyr Arg Ser Leu Glu

245 250 255

Met Lys

Claims

1.RhMYB4基因，其特征在于，所述基因包含如SEQ ID NO.23第263～1039bp所示的编码区核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因还包括SEQ ID NO.23第1～262bp所示的5'UTR核苷酸序列和/或SEQ ID NO.23第1040～1250bp所示的3'UTR核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ ID NO.23第263～1039bp所示的编码区核苷酸序列组成。

4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列组成。

5.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1至4所述的基因编码或者具有如SEQID NO.24所示的氨基酸序列。

6.权利要求1至4中任一项所述的基因在调节植物耐低温胁迫能力中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为通过使植物的所述RhMYB4基因过表达的方式来提高植物耐低温胁迫能力。

8.权利要求1至4中任一项所述的基因在调节花器官发育中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调节花器官发育是通过使植物的所述RhMYB4基因沉默的方式来使：(1)花瓣重瓣化；(2)花瓣异形化；(3)雄蕊败育或数量减少；(4)有性繁殖后代数量减少；优选的是，所述调节花器官发育是通过使植物的所述RhMYB4基因沉默的方式来使雄蕊瓣化来实现花瓣重瓣化、花瓣异形化、和/或雄蕊败育或数量减少。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为蔷薇科植物，更优选为月季。