CN107312077B - 蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白及其在花期调控中的应用。本发明提供的蜡梅CpSOC1蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码该蛋白的基因。本发明首次克隆获得蜡梅CpSOC1基因，并通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因的功能，结果表明，转基因拟南芥花期较对照提前，转基因拟南芥中表达量高的株系和表达量中等的株系花萼的宿存时间较对照显著延长，为植物的花期调控和观赏价值提升提供了可能。

Description

蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅CpSOC1基因及其在花期调控中的应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox(L.)Link)，属于蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus Lindl.)，是我国特有的名贵观赏花木。蜡梅是少有的冬季开花植物，先花后叶，花朵甜美，花色金黄，花瓣蜡质，花香馥郁，是冬季最好的切花材料。蜡梅在园林观赏方面得到了广泛应用，其药用和食用价值也得到了开发和利用。蜡梅是丛生灌木，可高达3至4米。落叶，叶对生，半革质；花着生于叶腋；最外轮的花被片成褐色鳞片状，向内过渡为黄色；花期12月至第二年3月；果期8月至9月，属于聚合瘦果。

在世界范围内将蜡梅科植物分为4个属，10个种。这四个属分别是位于澳大利亚昆士兰的椅子树属(Idiospermun Blake)，美国东南部和加利福尼亚州生长的美国蜡梅属(Calycantus L.)，还包括原产中国温带的夏蜡梅属(Sinocalycanthus Cheng)及蜡梅属(Calycantus L.)。李烨(1998)通过研究蜡梅各属之间的演化及发展关系，又把蜡梅科分为了两个亚科，分别是椅子树亚科(Idiospermoideae)及蜡梅亚科(Calycanthoideae)，其中蜡梅亚科包括夏蜡梅属、蜡梅属及美国蜡梅属，而椅子树亚科只有椅子树属。四个属中演化水平最高的属是椅子树属，而最原始的属是蜡梅属。

蜡梅属是4个属中我国特有的属，张若蕙(1999)曾在《世界蜡梅》中提到蜡梅属有6种1变种。六个种包括西南蜡梅(C.campanulatus R.H.Chang et C.S.Ding)位于我国云南的东北部，柳叶蜡梅(C.salicifolius S.Y.Hu)分布于江浙一带，浙江蜡梅(C.zhejiangensis M.C.Liu)产于我国的浙江南部及福建北部，山腊梅(C.niten Oliv.)生长在广西东北部、湖北南部及湖南南部，蜡梅(C.praecox(L.)Link)分布在我国的中部，突托蜡梅(C.grammatus M.C.Liu)目前只生长在江西安远，一个变种是分布在贵州兴义的贵州蜡梅(C.campanulatus R.H.Chang et C.S.Ding var.guizhouensis R.H.Chang,var.nov.)，是由西南蜡梅(C.campanulatus R.H.Chang et C.S.Ding)演变发展而来。

随着现代分子生物学的发展，生物技术已经广泛应用于植物、动物和微生物的研究中。有关蜡梅的分子生物学研究主要分为品种分类和基因功能两部分。目前RAPD、ISSR等分子标记技术已熟练地用于蜡梅的品种分类和群居遗传结构分析等。杜灵娟(2012)等人采用RAPD技术对南京地区38个蜡梅品种自然居群遗传变异进行了分析，发现群内每个单株之间的遗传差异比较大，而居群间的遗传距离较近，因此得出遗传变异主要发生于群居内，这与形态学分类结果相符合。赵明晓等(2011)分别将蜡梅成熟叶及嫩叶的基因组进行提取检测比较，为后人利用AFLP技术对蜡梅品种分类及自然居群遗传多样性分析进行了铺垫。而赵冰等人建立有关蜡梅的AFLP分子标记体系，为AFLP技术用于研究蜡梅系统发育及遗传多样性打下基础(赵冰，2007)；杨佳(2012)采用了EST-SSR技术对蜡梅的遗传结构和遗传多样性进行分析，对蜡梅的遗传结构特征及遗传多样性水平进行了初步探讨。

此外，眭順照(2006)构建了第一个蜡梅花cDNA文库，且对蜡梅开花过程中的基因进行了表达分析，在其基础上先后克隆出不同功能相关的基因，并对其进行了系统的研究；如Cpcor413pm1(秦华，2006)与蜡梅的抗寒性相关，将其转入烟草，对转基因烟草进行处理发现转基因烟草的耐低温能力提高；CpAP3与花瓣状器官发育形成有关；CpPEX22与抗衰老、抗氧化存在一定关系；将CpAGL6转入拟南芥中，与野生型拟南芥相比出现提前开花、植株矮化、雄蕊的形态及数目都发生了变化；CpKTI胰蛋白酶抑制基因，将其转入烟草超量表达，发现转基因烟草的抗虫性提高；Cpchia(谢树章，2009)几丁质酶基因；CpPR-4(秦朝，2012)病程相关蛋白基因等。上述蜡梅基因功能的初步研究，为以后蜡梅分子生物学研究做出一定贡献。

花发育相关基因中大部分都来自一个保守的转录因子基因家族—MADS-box基因家族。MADS的名称来源于MCM1(Minichromosome maintenance gene)(来自啤酒酵母)(Passmore et al.1988)、AG(来自拟南芥)(Yanofsky et al.1990)、DEF(DEFICIENS)(来自金鱼草)(Schwarz-Sommer et al.1992)和SRF(Serum response factor)(来自现代人)(Norman et al.1988)四个最早被鉴定的该家族成员的首字母。

人们已经从被子植物各大类群中分离到了大量的MIKC^c型MADS-box基因，并对这些基因的系统发育关系进行了重建，研究表明被子植物中的这些MADS-box基因可被划归到12个主要的基因亚家族(gene subfamilies)中去：AP1/SQUA、AP3/PI、AG/STK、SEP、AGL6、GGM13、SVP/STMADS11、SOC1/TM3、AGL12、AGL17、AGL15和FLC(Becker and Theissen 2003)。在许多双子叶植物如拟南芥、番茄和金鱼草中,大多数SVP基因在花分生组织的确定和控制开花时间中起作用。SOC1是MADS-box基因家族SOC1/TM3亚家族中的一员，在植物生长发育过程发挥重要作用，尤其是在植物成花诱导过程中。SOC1可以诱导植物从营养生长转变为生殖生长。植物开花过程十分复杂，但是开花信号在网络途径传播中最终还是将开花信号集中与开花整合子的转录调控上。SOC1在植物营养生长阶段被FLC和SVP形成的复合体所抑制，但在成花过程中GA途径，自主途径等都会下调FLC及SVP的表达水平，从而消除对SOC1抑制作用，促进植物开花(Tao et al.,2012)。目前已克隆了多个SOC1的同源基因，例如大豆(Glycine max)中GMGAL1，甜橙(Citrus sinensis)中CsCL1和CsSL2，矮牵牛(Petuniahybrid)中UNS等。但蜡梅中还未有相关报道，所以本实验在前人的基础上对蜡梅CpSOC1的功能进行研究。

蜡梅作为少有的冬季开花植物，且花香浓郁，具有较高经济和观赏价值。因此对其花发育研究十分有意义。而SOC1基因是与花发育相关的重要基因，所以，对蜡梅中CpSOC1基因功能分析可以为进一步研究蜡梅开花机制提供一些有价值的参考，并且为植物分子育种提供基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpSOC1基因及其在花期调控中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的蜡梅CpSOC1蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供蜡梅CpSOC1蛋白的编码基因，即CpSOC1基因的cDNA序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明还提供含有CpSOC1基因的载体、宿主细胞及工程菌。

本发明还提供CpSOC1基因在调控植物花期中的应用。所述植物为拟南芥。

本发明还提供CpSOC1基因在延长植物花萼宿存时间中的应用。

本发明还提供CpSOC1基因在制备转基因植物中的应用。

本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有CpSOC1基因的载体转入植物组织中，筛选转基因植株。

本发明具有以下优点：

本发明首次克隆获得蜡梅CpSOC1基因，并通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因的功能，结果表明，转基因拟南芥花期较对照提前，转基因拟南芥中表达量高的株系和表达量中等的株系花萼的宿存时间较对照显著延长，为植物的花期调控和观赏价值提升提供了可能。

附图说明

图1为蜡梅CpSOC1蛋白序列比对(A)及系统发育树(B)；其中，Cp：蜡梅Chimonanthus praecox；Mv：弗吉尼亚木兰Magnolia virginiana(ACV88635.1)；Nu：荷花Nelumbo nucifera(XP_010272601.1)；AtRr：无油樟Amborella trichopoda(XP_006829116.1)；Jr：胡桃Juglans regia(XP_018820387.1)；Gm：大豆Glycine max(NP_001236377.1)；Vv：葡萄Vitis vinifera(XP_010661478.1)；Cc：山核桃Carya cathayensis(AHI85950.1)；C：黄麻Corchorus capsularis(OMO78683.1)；Ph：矮牵牛Petunia xhybrida(AAK21253.1)；Nt：烟草Nicotiana tabacum(CAA53782.1)；Pt：美洲山杨Populustremuloides(AAP46287.1)；Pm：车前Plantago major(CAJ38368.1)；Md：苹果Malusdomestica(NP_001280844.1)；Ta：小麦Triticum aestivum(ABF57922.1)；Hv：大麦Hordeumvulgare(BAJ99551.1)；Os：水稻Oryza sativa(XP_015630979.1)；Cs：甜橙Citrussinensis(ABS84660.1)；G：非洲菊Gerbera hybrid(CBX45125.1)；Eg：桉树Eucalyptusgrandis(NP_001289658.1)；At：拟南芥Arabidopsis thaliana，SOC1(NP_182090.1)、SVP(OAP09055.1)和AGL24(NP_194185.1)。Mi：杧果Mangifera indica(AKJ85721.1)；Zm：玉米Zea mays(AIR75259.1)。

图2为CpSOC1实时定量PCR分析结果，Actin基因作为内参。

图3为35S::CpSOC1#超量表达转化野生型拟南芥(Col-0)T2代在长日照(14小时光照/10小时黑暗)条件下实时定量PCR检测结果；CpSOC1相对表达量。三个重复，Actin作为内参。

图4为35S::CpSOC1超量表达转化野生型拟南芥(Col-0)T2代的表型分析结果。

图5为35S::CpSOC1超量表达转化野生型拟南芥(Col-0)T2代在长日照(14小时光照/10小时黑暗)条件下实时定量PCR检测结果；TFL1(5A)、FLC(5B)、SVP(5C)、GA(5D)、FT(5E)、CO(5F)、SOC1(5G)、LFY(5H)、AP1(5I)相对表达量。三个重复，Tubulin作为内参。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 蜡梅CpSOC1基因的克隆及表达分析

1 蜡梅CpSOC1基因克隆

1.1 总RNA的提取

(1)取罄口蜡梅(Chimonanthus praecox)(种植于重庆市北碚区天生路2号西南大学校园内第四运动场旁边，常规养护管理)花芽、花蕾(4、5、7、9月份)、盛开、衰败及叶片混合样品。RNA提取所用的玻璃器皿、研钵、研杵、剪刀、镊子、药勺等均用0.1％DEPC水溶液在37℃下浸泡处理12h，然后用锡纸包裹于180℃烘箱中干热灭菌4h后冷却备用。

RNA提取采用北京天根公司生产的RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒，提取过程根据说明书略有改动，具体操作如下：

(1)取500μL裂解液RL转入1.5mL离心管中，加入1％β-巯基乙醇，混匀备用。液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入离心管中，加入上述RL 500μL,立即用涡旋振荡器剧烈震荡混匀，使其充分裂解。

(2)将溶液于12,000rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-free离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为250μL)，混匀(此时可能出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(4)DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。

(5)向吸附柱CR3中央加入80μL DNase I工作液，室温放置15min。

(6)向吸附柱CR3中央加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(7)向吸附柱CR3中央加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇)，室温静置2min，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复该步骤一次。

(8)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(9)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-100μL RNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。

1.2 3’RACE技术克隆CpSOC1基因3’末端cDNA

本实验根据与蜡梅亲缘关系较近物种的SOC1基因保守部分序列设计3'RACE简并引物，以蜡梅cDNA为模板进行PCR扩增，得到蜡梅CpSOC1的部分3'RACE cDNA序列，在获得的序列5'端用软件Primer primer 5.0设计两轮RACE的特异引物进行PCR扩增，将获得5'端的序列与原来序列进行电子拼接得到蜡梅CpSOC1全长cDNA序列，通过分析蜡梅CpSOC1全长cDNA序列，用软件Primer primer 5.0在跨最大开放阅读框的两端设计1对特异引物进行PCR扩增。引物的序列(见表1)：

表1 蜡梅CpSOC1基因克隆引物

注：R：A/G；S：G/C；Y：C/T；K：G/T；W：A/T；引物后F代表上游，R代表下游。

(1)3'RACE第一链cDNA的反转录合成

以上面提取的蜡梅花芽、花蕾、盛开、衰败及叶片总RNA混合样为模板，用引物3'-RACE CDS Primer A(表1)，使用美国Clontech公司的SMARTer RACE 5'3'Kit试剂盒进行3'RACE cDNA第一链合成。按照说明书步骤进行，具体反转录体系与程序如下：

反转录体系：

蜡梅总RNA 1-11μL

3'-CDS Primer A 1μL

Sterile H₂O 0-10μL

充分混匀，短暂离心。42℃，温育90min，72℃加热10min。-20℃放置可保存3个月。

(2)3'RACE PCR扩增第一轮

以反转录合成的第一链cDNA为模板，以3'RACE上游简并引物和UPM(UniversalPrimer Mix)进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系：

PCR反应程序：

94℃变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，3个循环；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，3个循环；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，3个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，3个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，3个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，15个循环72℃延伸10min。

电泳检测：取5μL扩增产物用琼脂糖凝胶(1％)电泳，用凝胶成像系统(Bio-RadMolecμLar Imager Gel Dox XR+紫外与可见分析系统)进行观察，拍照。

(3)3'RACE PCR扩增第二轮

3'RACE PCR扩增第二轮以稀释50倍的第一轮的产物为模板，正向引物为3'RACE第二轮简并引物，反向引物用Nested Universal Primer A，反应体系，PCR程序及其他同3'RACE PCR扩增第一轮相同。

(4)结果检测：取PCR产物5μl，电泳检测。

1.3 5’RACE技术克隆CpSOC1基因5’末端cDNA

以上面提取的蜡梅花芽、花蕾、盛开、衰败及叶片总RNA的混合样为模板，用引物5'-CDS Primer A和SMARTer II A Oligonucleotide引物的序列，使用美国Clontech公司的SMARTer RACE 5'3'Kit试剂盒进行5'RACE cDNA第一链的合成。按照说明书的步骤进行操作，具体反应体系及PCR程序如下：

反转录体系：

充分混匀，短暂离心。72℃，温育3min，42℃冷育2min。

充分混匀，短暂离心。42℃，温育90min，72℃加热10min。-20℃放置可保存3个月。用时加Tricine EDTA Buffer稀释。

1.4 5'RACE PCR扩增

(1)5'RACE PCR扩增第一轮

以反转录合成的5'RACE cDNA第一链为模板，正向引物为UPM(Universal PrimerMix)，反向引物为5'RACE第一轮引物进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系：

PCR反应程序：

94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃延伸10min。

电泳检测：取5μL扩增产物用琼脂糖凝胶(％)电泳，用凝胶成像系统(Bio-RadMolecμLar Imager Gel Dox XR+紫外与可见分析系统)进行观察，拍照。

(2)5'RACE PCR扩增第二轮

5'RACE PCR扩增第二轮以稀释50倍的第一轮的扩增产物为模板，正向引物为Nested Universal Primer A，反向引物为5'RACE第二轮特异引物，反应体系，PCR程序及其他同5'RACE PCR扩增第一轮相同。

1.5 PCR回收产物的纯化

PCR扩增获得的产物用l％的琼脂糖凝胶进行检测，将3’RACE扩增产物中大小为800-1000bp之间的条带和5’RACE特异条带切下来，进行回收，并按照天根公司普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒说明书对目的DNA片段进行回收。

1.6 PCR回收产物的连接

连接反应体系见表3。

表3 连接反应体系

4℃过夜,进行连接反应。

1.7 CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞

(1)从新活化的大肠杆菌平板上挑取一单菌落，接种于3-5mL LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100-1：50转接于50mL LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，至OD600为0.4-0.6时停止培养。

(2)将培养液倒入在冰上预冷好的无菌50mL离心管中，冰上放置10min，于4℃，4,100rpm，离心10min。

(3)倒净上清培养液，在无菌滤纸上倒置1min，用30mL冰上预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，4℃，4,100rpm，离心10min。

(4)弃去上清液，加入2mL冰上预冷的0.1mo1/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞。冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀分装后用液氮浇于其上迅速结冻后于-80℃保存。

1.8 连接产物的转化

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

(1)将大肠杆菌感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。将连接产物于70℃水浴锅中灭活10min。

(2)将连接产物或待转化的质粒，按照每200μL感受态细胞加入100ng已纯化质粒的标准，加入到感受态细胞中，轻轻混匀后在冰上静置30min。

(3)42℃水浴中热激90s，迅速取出后立即置于冰上2min。

(4)加入600μL 37℃预热的无抗LB液体培养基，混匀后于37℃，130rpm震荡培养1h。

(5)室温下10,000rpm离心1min，弃掉400μL上清液，将剩余的200μL菌夜重悬，用无菌的涂棒将重悬菌液均匀涂在含有相应抗生素的LB固体平板上，37℃倒置培养12-14h。

1.9 阳性克隆培养与PCR鉴定

单克隆通过IPTG/X-GAL筛选，取无菌的1.5mL离心管，加入0.5mL含50mg/L Amp的LB液体培养基，从转化过的平板上用无菌牙签轻轻挑取单菌落置于离心管中，37℃200rpm摇床中振荡培养8-10h，待菌液浑浊后，以其作为模板进行PCR鉴定。

菌液PCR扩增体系：

PCR反应程序：

94℃变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃延伸10min。

1.10 测序及序列分析

选择插入片段大小与预期接近且特异的阳性克隆进行测序。蜡梅CpSOC1基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

蜡梅CpSOC1基因cDNA全长917个核苷酸，包含1个12bp(1-12bp)的5'-UTR区(5'-untranslated region)，1个678bp(13-690bp)的完整开放阅读框(Opening Read Frame，ORF)和1个227bp(691-917bp)的3'-UTR区(3'-untranslated region)。编码区由241个A、169个G、131个C、和137个T组成，A+T含量约为55.75％，G+C含量约为44.25％。

将蜡梅CpSOC1蛋白与荷花、木兰、大豆、葡萄、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的SOC1蛋白进行多重序列比对。结果(如图1A)，蜡梅CpSOC1蛋白与其他SOC1蛋白具有较高的相似性，相似度约59.29％，结构比较保守。与其他同源蛋白一样，蜡梅SOC1蛋白具有最保守的M区，半保守的K区，保守性相对较差的I区及最不保守的C末端。

蜡梅CpSOC1各类基因的系统发育分析除了来自于本发明所获得的基因及蛋白序列之外，其他数据均来自NCBI中公开发表的数据。基于MIKC结构域的蛋白质序列用MEGA4.0构建的NJ树(Tamura et al,2007)。结果如图1B，图中可以看出不同物种的SOC1同源基因聚为一支，拟南芥的AtSVP和AtAGL24聚为一支；单子叶植物的SOC1同源基因聚为一支，双子叶植物的SOC1同源基因聚为一支，且蜡梅与无油樟、荷花、木兰聚为一支亲缘关系较近，说明其进化地位比较低。

2 蜡梅CpSOC1基因表达分析

对蜡梅CpSOC1基因在不同月份的花序原基或花序中表达分析，发现该基因在4月(4IM)，5月(5IM)，7月(7FM)和9月(9FM)中均有表达，但表达水平有较大差异(图2)。该基因在5IM时期表达量最高，是其他月份中表达量的6倍以上，其他月份中表达量相差不大(图2)。

实施例2 农杆菌介导的蜡梅CpSOC1基因转化(拟南芥)

1 表达载体的构建

根据实验要求，本实施例中利用了载体pCAMBIA2301g上的多克隆酶切位点特性，将克隆载体上的cDNA片段酶切后连接到表达载体当中。

2 农杆菌GV3101和EHA105电激感受态细胞的制备和表达载体的转化

(1)挑取新鲜的农杆菌GV3101和EHA105单菌落于10mL LB液体培养基中，28℃振荡培养至对数晚期；

(2)取1mL菌液加入100mL新鲜LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5-1.0；

(3)将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30分钟；

(4)4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体，弃上清；

(5)沉淀用50mL预冷的HEPES灭菌蒸馏水重悬；

(6)4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体，弃上清；

(7)重复操作(5)、(6)两次，每次HEPES减半；

(8)用含10％甘油的灭菌蒸馏水重悬菌体，按每管50μl体积分装至1.5mlEppendorf管中，即为农杆菌感受态细胞，分装后直接使用或于-70℃保存备用；

(9)取50μl上述制备的感受态细胞，加入0.5μg质粒，轻轻混匀，置于冰上；

(10)2500伏电击5ms，立刻加入500μl LB液体培养基；

(11)28℃，150rpm，恢复培养4个小时；

(12)涂布适量的细胞于筛选LB固体培养基平板上，超净台吹干表层液体，28℃培养2-3天。

3 农杆菌介导的拟南芥转化(花芽浸泡法)

待拟南芥花序抽苔约1cm高时，剪去主花序。待植株发出侧生花序，并生长至花蕾未展开时，进行转化实验。接种含有表达载体的农杆菌克隆于5mL LB液体培养基(Gen：50mg/L，Kan：50mg/L)中，28℃，200rpm中振荡培养过夜；按1:50的比例转接到200mL LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养5小时；5000rpm，离心15分钟，收集菌体；重悬于缓冲液(5％蔗糖，0.03％Silwet L-77)中，调OD₆₀₀至0.8。将花序倒置放入混好的农杆菌菌液中10秒，用保鲜膜覆盖整个花序，24小时后取下保鲜膜，继续培养于培养室(22℃，14小时光照/10小时黑暗)，直至收获种子(Clough and Bent,1998)。

4 拟南芥阳性苗的筛选

(1)将收获的转化拟南芥种子在70％乙醇中浸泡2分钟，去上清；

(2)次氯酸钠溶液浸泡5分钟进一步进行消毒处理，用无菌水漂洗3－5次；

(3)将拟南芥种子播于含50μg/mL抗生素Kan的1/2MS培养基平板上；

(4)如果穿梭载体上具Kan抗性的报告基因，将培养平板置于光照培养室(22℃，16小时光照/8小时黑暗)培养7-10天；选择经过Kan筛选后长势良好，真叶叶片及生长点呈深绿色且根部可以扎入培养基的植株，初步确定为阳性苗，移栽入土中。

5 实时定量RT-PCR

以转基因拟南芥T2代和以蜡梅各器官为材料，用Trizol试剂盒提取总RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)进行cDNA第一链的反转录。将cDNA第一链稀释10倍后作为模板进行PCR反应。然后利用SYBR Premix Ex Taq(Bio-Rad,USA)反应试剂盒，在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)上完成反应。分析所获得的数据并计算样品中目的基因浓度。PCR反应体系为10μl，共设置3个重复，反应条件为40个循环，95℃60秒，95℃5秒，60℃34秒。

6 转基因拟南芥株系CpSOC1基因表达分析

(1)转基因拟南芥表达量检测

为了可以进一步验证CpSOC1基因在转基因的拟南芥中的表达水平，提取野生型拟南芥和转基因拟南芥较嫩叶片的总RNA，进行cDNA第一链反转录，将反转录的cDNA第一链做为模板，把拟南芥Actin基因作为内参基因，对转基因拟南芥中CpSOC1基因的表达量进行检测及分析，荧光定量PCR结果(图3)。野生型的拟南芥中几乎没有检测到CpSOC1基因的表达，在检测的11个转基因的拟南芥单株中，CpSOC1基因的表达水平差异较大，其中5号株系的表达量最高，16号株系中高，8号株系表达量次之，其余单株系的表达量较低。在后期对转基因的拟南芥分析时，根据荧光定量的结果，选取表达量最高的5-30号、表达量中等的16-27号和表达量稍低的8-27号代表不同表达量的转基因株系进行表型观察。

7 转基因拟南芥表型分析

(1)花期提前：野生型拟南芥作为对照，对纯合的转基因拟南芥T₂株系进行表型观察，结果发现，转基因拟南芥株系的显蕾时间、抽葶时间、第一朵花开的时间和第一个果荚出现时间均比野生型拟南芥植株早，但是现蕾时间CpSOC1/8-27与WT之间没有显著差异，而CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30与WT相比具有显著差异；抽葶时间CpSOC1/8-27和CpSOC1/16-27与WT之间没有显著差异，而CpSOC1/5-30与WT相比具有显著差异；第一朵花开的时间CpSOC1/8-27，CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30与WT相比三者都具有显著差异；第一个果荚的时间CpSOC1/8-27与WT之间没有显著差异，而CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30与WT相比且具有显著差异；转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比莲座叶的数量均比野生型的减少，其中CpSOC1/8-27与WT之间差异不显著(莲座叶平均数为10.08和11.02片)，而CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30(莲座叶平均数为6.53和6.33片)与WT相比具有显著差异；转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比，CpSOC1/5-30茎生叶数量比野生型的增多，而其他两个株系都比野生型的少，其中CpSOC1/5-30与WT之间差异不显著，而CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30与WT相比具有显著差异；转基因三个株系的叶片总数都比野生型减少，其中CpSOC1/8-27与WT之间差异不显著，而CpSOC1/16-27和CpSOC1/5-30与WT相比具有显著差异(表2，图4)。

(2)株高变高、花萼宿存：转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比株高都变高了，其中CpSOC1/8-27和CpSOC1/16-27与野生型相比具有显著差异，而CpSOC1/5-30与野生型相比则具有极显著差异(表2，图4)。转基因拟南芥还发现了表达量高的株系和表达量中等的株系花萼的宿存时间延长，表达低的株系和野生型的拟南芥却不会有花萼宿存的现象。

表2 35S::CpSOC1/拟南芥T2代株系表型相关指标观察

每组数为平均值±标准差；a、b、c、d表示P<0.05水平上差异显著；

可以看出，表达量越高显蕾时间、抽葶时间、开花时间越提前，其莲座叶和叶片总数的数量越少。由于植物由营养生长向生殖生长转化的时间提前，导致其营养生长时间变短，所以莲座叶和叶片总数的数目变少，开花时间提前等。由以上的结果可以得出CpSOC1基因具有促进植物开花和促进植物生长的功能。

8 转基因拟南芥内源基因的实时荧光定量PCR检测

为了研究转入拟南芥的CpSOC1基因的超表达对其自身开花基因的影响，分别对转基因株系及野生型拟南芥提取RNA，进行荧光定量PCR检测，结果表明拟南芥中转入CpSOC1会使其自身的AP1和LFY表达量升高，对其他基因的表达量影响较小(图5)。拟南芥开花过程受到FLC、AP1、SOC1和LFY等基因的共同调节，其中FLC对FT和SOC1起到抑制作用，SOC1和AP1等基因可以促进植物开花，FLC对植物开花起到抑制作用。由此可以推测出CpSOC1的超量表达使植物开花的AP1基因和LFY基因的表达量上调，从而促使转基因拟南芥的开花时间提前。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白和应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 917

<212> DNA

<213> 蜡梅（Chimonanthus praecox）

<400> 1

acatgggtga ggatggtgag agggaaaacg cagatgcggc ggatagagaa cgcggcgagc 60

aggcaagtaa ccttctccaa gcggaggaat gggctgttga agaaggcgtt cgagctctcc 120

gttctctgcg atgctgaggt cgctcttatt gtcttctctc cgaggggcaa gctctacgaa 180

ttcgccagct ccagcatacc aaagacgata gaacgttacc gaggccaatc gaaagaagta 240

agcatcaaca acaaaacagt ggaacaaagc atgcagcatt tgaaatatga agctacacac 300

cttgtgaaga agatggagct tcttgaactc tccaaaagga aacttttggg tgaaaatctg 360

gattcatgtt ctgttgagga actgcaacac atagaaaacc agttggaaag aagtgttagc 420

aacattagaa gaagaaagac tcaattatat aaggatctga tcgaacaact aaaagagaag 480

gaaagaattc tatcagaaga aaatgcaata ttatgcaaga aggcagaaga gcaatcaatc 540

attcagaagg aaactgccac ccacaatcat ggtgacaaag aaattgcccc ctgccatcat 600

cacaacagta ctggagagtc tgatgtggag actggattgt atataggaag gccagaaaga 660

ggaagaactc gctatgcatt gcaagattga tctgtgcggt gaccatactg caaggatcgc 720

aaatacaact cttagaaggg aagctgattc cgttgtttat ttatttcaaa tcatgtgtgt 780

acgacactct taagctttga ttttaatgat tcttagtgaa ataatttaca gagaagaaaa 840

atgtatgagt ttggaagatt ttattcagag aaacagctac cttgtaatgc aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaagt 917

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> MVRGKTQMRRIENAASRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVALIVFSPRGKLYEFASSSIPKTIERYRGQSKEVSINNKTVEQSMQHLKYEATHLVKKMELLELSKRKLLGENLDSCSVEELQHIENQLERSVSNIRRRKTQLYKDLIEQLKEKERILSEENAILCKKAEEQSIIQKETATHNHGDKEIAPCHHHNSTGESDVETGLYIGRPERGRTRYALQD

<400> 2

Met Val Arg Gly Lys Thr Gln Met Arg Arg Ile Glu Asn Ala Ala Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Phe Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Pro Arg Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Ala Ser Ser Ser Ile Pro Lys

50 55 60

Thr Ile Glu Arg Tyr Arg Gly Gln Ser Lys Glu Val Ser Ile Asn Asn

65 70 75 80

Lys Thr Val Glu Gln Ser Met Gln His Leu Lys Tyr Glu Ala Thr His

85 90 95

Leu Val Lys Lys Met Glu Leu Leu Glu Leu Ser Lys Arg Lys Leu Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Asp Ser Cys Ser Val Glu Glu Leu Gln His Ile Glu

115 120 125

Asn Gln Leu Glu Arg Ser Val Ser Asn Ile Arg Arg Arg Lys Thr Gln

130 135 140

Leu Tyr Lys Asp Leu Ile Glu Gln Leu Lys Glu Lys Glu Arg Ile Leu

145 150 155 160

Ser Glu Glu Asn Ala Ile Leu Cys Lys Lys Ala Glu Glu Gln Ser Ile

165 170 175

Ile Gln Lys Glu Thr Ala Thr His Asn His Gly Asp Lys Glu Ile Ala

180 185 190

Pro Cys His His His Asn Ser Thr Gly Glu Ser Asp Val Glu Thr Gly

195 200 205

Leu Tyr Ile Gly Arg Pro Glu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Leu Gln

210 215 220

Asp

225

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

aagcagtggt atcaacgcag agtactvn 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cargtsacct tytgcaarcg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcygtkctyt gtgatgcwg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgaatgatt gattgctctt ctgcc 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgttctatcg tctttggtat gctggag 27

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgggtgagga tggtgagag 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtatggtcac cgcacagat 19

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcggataac aatttcacac agg 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

Claims (10)

1.蜡梅CpSOC1蛋白，其为：由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的应用。

7.权利要求2或3所述基因在延长植物花萼宿存时间中的应用。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

9.权利要求2或3所述基因在制备转基因植物中的应用。

10.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求4所述的载体转入植物组织中，筛选转基因植株。