CN106119279A - 对于热胁迫具有增强的耐受力的植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在植物中生产一种期望的表现型的方法，通过在所述的植物中进行基因表达的操纵来完成。所述的方法涉及增加MYB‑亚群14多核苷酸或者MYB68多肽的表达水平的方式。所述的方法同样涉及一种核酸序列的表达，其中所述的核酸序列编码一个MYB‑亚群14或者MYB68转录因子。所述的方法着重于提升所述的MYB‑亚群14或者MYB68的表达水平，其中在热胁迫过程中观察到一种期望的表现型例如减少的花朵败育以及增加的产量。本发明同样涉及有效的用于这样的方法之中的核酸序列。

Description

对于热胁迫具有增强的耐受力的植物

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2008年4月18日；申请号：200880020353.0(PCT/IB2008/002381)；发明名称：同上。

相关申请的参考

按照35U.S.C.§119(e)的要求，所述的非临时专利申请要求享有申请日为2007年4月18日的U.S.S.N.60/925312以及申请日为2007年8月20日的U.S.S.N.60/965582的优先权。上述申请中的内容作为整体在本文中被引入作为参考。

发明领域

本发明属于植物分子生物学领域并且涉及具有新的表现型的转基因植物，生产这样的植物的方法以及有效的用于这样的方法之中的多核苷酸以及多肽。更具体的，本发明涉及所述的MYB多核苷酸的使用以及表达这种多核苷酸以及多肽的转基因植物。

背景技术

环境的胁迫是形成农业作物的显著的产量降低的原因。除了先前公开的许多报道之外，在最近的几年中对于整个美国在1982-1998年的时间里气候的变化与玉米以及大豆的产量之间的关系进行了研究(参见Lobell以及Asner于2003年发表的文章)。逐步的温度变化已经对农作物的产量产生了可以测量的影响。已经估算出，当所述的生长温度每超出季节最适宜温度上升一度，玉米以及大豆的产量降低17％。在1990年至2010年间，随着预测温度的增长为1.4℃至5.8℃(联合国政府间气候变化专门委员会(IPCC)工作组I，2001年)，农作物植物对于高温的耐受性的改进已经成为农业生物技术发展的主要焦点中的一个。

单子叶植物以及双子叶植物在开花以及结实的形成过程中对热胁迫均格外敏感，并且因此热胁迫对于种子的产量具有显著的影响(参见Young等人于2004年发表的文章；Sato等人于2002年发表的文章；Angadi等人于2000年发表的文章；Carlson于1990年发表的文章；Wahid A，Gelani S，Ashraf M以及Foolad M.R.于2007年发表的文章)。已经提出植物拥有先天的基础的热耐受性能力以及后天获得的热耐受性，并且在不同的植物品种中存在着共同的热应答(参见Kapoor等人于1990年发表的文章；Vierling于1991年发表的文章；Flahaut等人于1996年发表的文章；Burke等人于2000年发表的文章；Hong以及Vieling于2000年发表的文章；Massie等人于2003年发表的文章；Larkindale等人于2005年发表的文章)。基础的热耐受性允许植物在被暴露于高于最适的生长温度时能够存活，而后天获得的热耐受性是由在一种亚致死的热胁迫条件下进行的短暂的驯化周期所引发的，这使得植物能够在随后的热胁迫条件下存活下来，然而所述的热胁迫条件应当是致命的。为了对在植物的热耐受性中所涉及到的基因以及途径进行识别以及定义，已经进行了大量的研究。例如，热休克转录因子(HSF)以及热休克蛋白(HSP)已经受到了大量的关注，用来阐明这些基因在应答于热胁迫时所发挥的作用以及所产生的功效，从而像存在于植物生长激素例如脱落酸以及乙烯一样。

转录因子是一种DNA结合蛋白，能够与特异性的启动子序列或者增强子序列发生相互作用并且改变所述的相关基因的基因表达。当与所述的转录因子发生结合的所述的特异性序列与一组基因相关联时，整体的途径能够同等的受到各种不同的组分基因的调节，同时发生上调节或者去调节。转录因子可以同等的改变一组基因，从而对一种刺激进行应答，其中所述的刺激是例如一种环境胁迫，营养状况或者病原体侵袭，或者可以是一种信号途径的一个组成部分，其中所述的信号途径是例如一种激素信号途径。转录因子拥有一种模块结构并且主要依据DNA结合结构域为基础被进行了分类。

转录因子的MYB家族由至少198个基因构成(参见Yanhui等人于2006年发表的文章)并且其已经被提议在各种不同的过程中具有调节功能，所述的过程涉及从生长到形成防御应答的范围。植物MYB蛋白根据不完全的MYB重复的存在以及数量进行了分类，其中所述的每个不完全的MYB重复(MYB repeats)由大约52个氨基酸构成。所述的MYB结构域形成了一种螺旋-转角-螺旋构象并且代表着所述的DNA结合结构域。MYB蛋白的三种主要的群体被分为R1R2R3-MYB，R2R3-MYB以及MYB-相关性蛋白。

拟南芥属的R2R3-MYB蛋白家族由125个蛋白组成并且其特征在于在它们的N-末端具有一个R2R3DNA结合结构域(参见Kranz等人于1998年发表的文章，以及Stracke等人于2001年发表的文章)。这些基因在各种生物学过程中都有所涉及，所述的生物学过程包括激素作用的调节，次级代谢(参见Paz-Ares等人于1987年发表的文章)，细胞的形态形成的控制(参见Oppenheimer等人于1991年)，分生组织、花以及种子的形成(参见Kirik等人于1998年发表的文章，Schmitz等人于2002年发表的文章)以及对于各种环境因素的应答(参见Kranz等人于1998年发表的文章；Jin以及Martin于1999年发表的文章；Meissner等人于1999年发表的文章)。

MYB序列已经被进一步划分成各种亚群，所述的划分是以序列为依据的(参见Krantz等人于1998年发表的文章，Stracke等人于2001年发表的文章)。Krantz等人于1998年识别出MYB68落入亚群14的范围之内，而MYB36以及MYB84同样如此。然而，Stracke等人于2001年指出在亚群14中额外包括所述的MYB37，MYB38以及MYB87。Stracke进一步记录了基因的功能保守性的几种情况，其中所述的基因在所述的系统树形图中是集群在一起的。

所述的R2R3-MYB家族的分类已经在拟南芥(At)中识别出125种MYB蛋白。R2R3MYB基因的特征在于MYB结构域，所述的结构域含有两个53个氨基酸(aa)的不完全重复(R2，以及R3)。每个重复(repeat)含有三个螺旋-转角-螺旋结构。所述的R2结构域以及R3结构域位于所述蛋白的N-末端的附近。每个重复之上的最后两个螺旋与它们之间的环一同形成了一种DNA-结合基序结构，这与螺旋-环-螺旋(HLH)蛋白相似。所述的第三个螺旋直接与DNA进行结合，而所述的第一个螺旋以及第二个螺旋为形成所述的螺旋-环-螺旋基序的构象作出了贡献，其中所述的螺旋-环-螺旋基序对于特异性基因靶向的识别而言似乎是重要的(参见Ogata等人于1994年发表的文章；William以及Grotewold于1997年发表的文章；Jia等人于2004年发表的文章)。所述的R2R3-MYB蛋白进一步被定义为22种亚群，这是依照它们的动植物种类间的关系，以除所述的MYB结构域之外的至少一个共享的氨基酸基序为基础来定义的(参见Kranz等人于1998年发表的文章)。AtMYB68，AtMYB84，以及AtMYB36被归类为亚群14之中，这是以存在于所述蛋白的所述C-末端处的两个共享基序为依据的，其中所述的两个共享基序是：S1：SFSQLLLDPN序列识别号(SEQ ID NO)：266以及S2：TSTSADQSTISWEDISEQID NO：267。这些基序的同源性是有限的，例如，AtMYB36仅仅具有20％的同一性。其次，AtMYB87，AtMYB37以及AtMYB38同样被包括在亚群14之中，这是以所述的MYB DNA结构域中的序列保守性：R2以及R3的螺旋-转角-螺旋重复为依据的(参见Stracke等人于2001年发表的文章)。

所述的R2R3结构域可以作为对于特异性的DNA结合的指示，其中所述的结合是经由所述的R3结构域中的所述第三个螺旋的独特的氨基酸序列来进行的，并且次要的构象变化与存在于所述的前两个螺旋的结构间相互作用发生关联。已经提出亚群14的成员可能是功能上多余的直向同源基因。例如，已经在拟南芥的侧生分生组织萌发中进行了针对MYB-亚群14的研究(参见Muller等人于2006年发表的文章)。MYB-亚群14中的所有成员表现出了与所述的番茄Blind(Bl)基因的高度相似性，其中所述的番茄Blind基因是一种腋生分生组织调节剂。利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)在组织中探测到四种成员的转录产物：AtMYB37，AtMYB38，AtMYB84以及AtMYB87，其中所述的组织包括茎尖，节间，叶片，花蕾，开放的花朵，以及根，而AtMYB36以及AtMYB68的表达在根组织中进行了表达。利用AtMYB37，AtMYB38以及AtMYB84的敲除来进行的表现型的分析表明，对于调节腋芽的形成而言，MYB-亚群14中的这些成员至少是部分多余的。

MYB68是一种R2R3类型的MYB基因，并且属于MYB-亚群14中的一个成员，其已经在一项转座子基因捕获研究中被识别出来(参见Feng等人于2004年发表的文章)。已经证明了这种基因的表达对于根部的中柱鞘细胞具有特异性。在所述的无价值的突变体中，没有可以探测到的MYB68mRNA(信使核糖核酸)；然而，当植物在标准的环境下进行生长时，没有显示出突变的表现型。在对于存在于各种不同的生长环境下的MYB68进行的评价中，仅仅当植物在热的温室条件下(30-40℃)进行生长时，才辨认出唯一的一种表现型，所述的表现型是植物的叶片面积的减少。通过使用一种野生型MYB68基因对所述的myb68突变体进行后台转化，从而对这种表现型进行了援救。对于在发根培养器中生长的所述的myb68突变体的根部组织进行的检查表明，具有增加的生物量水平以及木质素水平。笔者推定在根部的形成过程中涉及到MYB68(参见Feng等人于2004年发表的文章)。

转录的激活作用首先经由转录因子进行介导，其中所述的转录因子与增强子元件以及启动子元件发生相互作用。转录因子与这样的DNA元件所进行的结合构成了转录开始的一个至关重要的步骤。每个转录因子同存在于启动子中的与所述的转录因子具有特异性的结合序列进行结合，并且通过与辅激活因子和/或蛋白间发生的相互作用激活所述的连接的编码区域的表达，其中所述的辅激活因子和/或蛋白属于所述的转录复合体中的一部分。

发明内容

本发明涉及一种增加植物的热胁迫耐受性的方法，其中所述的方法通过增加MYB亚群-14多肽的表达的方式来完成。增加的热胁迫耐受性包括在热胁迫的条件下以及经过热胁迫的条件之后具有改善的结实现象。改善的结实现象导致了增加的产量。MYB-亚群-14多肽包括例如MYB68多肽，MYB36多肽，MYB84多肽，MYB37多肽，MYB38多肽或者MYB87多肽。优选的，所述的MYB-亚群-14多肽是MYB68多肽，MYB36多肽或者MYB84多肽。所述的MYB-亚群-14多肽的表达是异位表达，或者是组成性表达。可以选择的，所述的MYB亚群-14多肽的表达发生在其典型的表达位点上，例如，根部组织。

一种热胁迫耐受性的植物是通过下述方法制备得到的：提供一种核酸构建体，其中所述的核酸构建体能够增强所述的Myb亚群-14多肽的表达，将所述的核酸构建体插入到一种载体之中，利用所述的载体对一种植物、组织培养物、或者植物细胞进行转化，从而获得一种具有增加的Myb亚群-14多肽的表达的植物、组织培养物或者植物细胞，并且使所述的植物进行生长或者从所述的组织培养物或者植物细胞中进行一种植物的再生。一种能够增强所述的Myb亚群-14多肽的表达的核酸构建体包括例如一种增强子元件。增强子是一种在真核细胞以及某些真核细胞病毒中发现的序列，当其位于与所述的相关基因距离高达几千碱基对的任意方位上时，它能够增强所述基因的转录。当位于上述谈论的基因的5’侧(上游)上时，这些序列发挥了增强子的作用。然而，当被放置于所述基因的3’侧(下游)上时，某些增强子是具有活性的。所述的增强子元件能够激活基因的转录并且改变所述的内源性基因的正常的表达类型。增强子元件对于本领域技术人员而言是已知的。例如所述的增强子元件是一种35S增强子元件。

除此之外，一种能够增强所述的Myb亚群-14多肽的表达的核酸构建体包括例如一种编码Myb亚群-14多肽的核酸。范例性的MYB多肽以及核酸包括那些序列识别号(SEQ IDNO)为1-265的多肽以及核酸。所述的编码Myb亚群-14多肽的核酸与一种启动子发生了可操作性的连接。所述的启动子是一种异源启动子或者是一种同源启动子。除此之外，所述的启动子是一种组成型启动子或者是一种诱导型启动子。

通过增加所述的MYB亚群-14多肽的表达，意味着由所述的经过所述核酸构建体进行转化的细胞所生产的量高于没有经过所述的核酸构建体进行转化的细胞所生产的量，其中所述的没有进行转化的细胞是例如一种对照细胞。对照细胞包括例如一种能够内源性的表达MYB亚群-14多肽的细胞，例如一种植物根细胞，或者对照细胞是与所述的转化细胞具有相同的细胞类型的一种非转化细胞，是一种叶片细胞、分生组织细胞或者花朵细胞或者种子细胞。增加指的是一倍的增加，两倍的增加，三倍的增加或者更高倍数的增加。表达上的增加同样意在包括在一种通常情况下不产生MYB亚群-14多肽的细胞中进行的MYB亚群-14多肽的表达。

同样被包括在本发明之内的是一种识别热胁迫耐受性植物的方法。与一种对照植物相比，通过这些方法识别出的所述植物具有减少的花朵败育以及增加的产量。热胁迫耐受性植物是通过下述方式被识别出来的：将一群开花植物暴露于热胁迫处理中并且从上述的植物群体中选择一种具有减少的花朵败育的植物。热胁迫处理包括例如将所述的植物在足够热的温度下暴露足够长的时间，这样一来导致了对植物的功能或者发育上的损伤。减少的花朵败育意味着植物不会损失与因花朵败育而损失的同样多的花朵，或者与另外一种被暴露于类似的热胁迫水平下的植物相比，所述的植物具有更高的结实产量。与一种对照植物相比，具有减少的花朵败育的植物在结实产量上具有5％，10％，20％，25％，30％或者更高的增长。

本发明进一步包括由本发明中所述的方法制备得到的所述植物，以及由所述的植物所生产的种子，其中所述的种子能够生产出对热胁迫具有增强的耐受力的植物。

除非另外定义，这里所使用的全部的技术术语以及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或者检验过程中可能使用到那些与这里所描述的方法以及材料相类似或者等价的方法以及材料，适宜的方法以及材料在下文中进行了描述。这里所提及的全部出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献均作为整体被引入作为参考。如果存在矛盾的情形，所述的说明书，包括定义，将起到主导作用。除此之外，所述的材料、方法、以及实施例仅仅是描述性的并且并不意在构成限制。

本发明的其他特征以及优点将通过下面的详细描述以及所述的权利要求而变得显而易见。

具体实施方式

本发明是以对于下述植物的令人惊奇的发现为基础的：与一种野生型的对照组相比，所述的植物对热胁迫具有增强的耐受性，这种耐受性导致了增加的产量。更具体的，本发明是以下述发现为基础的：增加所述的MYB-亚群14多肽(例如，MYB68)的表达导致了一种植物的产生，所述的植物对热胁迫具有增强的抗性。

MYB-亚群14多肽的表达可以通过例如下述方式来完成：通过增加所述的内源性MYB-亚群14多肽的表达(例如，激活标签的插入)的方式或者通过编码MYB-亚群14多肽的外源性基因构建体的表达的方式。所述的用于编码所述MYB-亚群14多肽的基因对于被转化的物种而言可以是内源性的或者是外源性的。正如实施例中所表示的，对热胁迫具有增强的抗性的植物不仅仅是通过利用其自身的MYB-亚群14多肽对植物进行转化而制备得到的，而且也包括利用来自于另外一个植物物种的MYB-亚群14多肽对植物进行转化。

因此本发明提供了用以增强(例如，增加)植物的热胁迫耐受性的方法，其中所述的方法通过增加所述的MYB亚群-14多肽的表达来实现。同样被包括在本发明之内的是一种识别热胁迫耐受性植物的方法。与一种对照植物相比，通过这些方法识别出的所述植物具有减少的花朵败育以及增加的产量。热胁迫耐受性的植物是通过下述方式被识别出来的：将一群开花植物暴露于热胁迫处理中并且从上述的植物群体中选择一种具有减少的花朵败育的植物。本发明同样包括由本发明中所述的方法制备得到的转基因植物，以及由所述的转基因植物所生产的种子，其中所述的种子能够生产出一种对热胁迫具有耐受性的植物。

除非另外定义，这里所使用的全部的技术术语以及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或者检验过程中可能使用到那些与这里所描述的方法以及材料相类似或者等价的方法以及材料，适宜的方法以及材料在下文中进行了描述。这里所提及的全部出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献均作为整体被引入作为参考。如果存在矛盾的情形，所述的说明书，包括定义，将起到主导作用。除此之外，所述的材料、方法、以及实施例仅仅是描述性的并且并不构成限制。

出于方便的目的，在对本发明进行进一步的描述之前，在这里对所述的说明书、实施例及后附的权利要求中使用到的某些术语进行定义。这些定义应当依照所述的公开内容的其余部分以及按照所属领域普通技术人员的理解来进行阅读。

所述的术语“组成性表达”指的是基因通过一种不规则的方式以恒定的水平在任意的细胞中所进行的表达。

所述的术语“cMYB”以及“MYB”指的是MYB的cDNA克隆，并且两者是可以互换使用的。在使用到或者提及到基因组序列的情况下，利用所述的术语“gMYB”或者“基因组MYB”对其进行识别以及区分，从而指的是基因组MYB序列。

所述的术语“异位表达”指的是相对于所述的内源性基因表达而言，基因在有机体的异常位置处所进行的表达。异位表达可能包括进行了组成性表达的基因，这取决于所述的给定基因的天然表达类型。

所述的术语“表达盒”指的是一种载体构建体，基因在所述的载体构建体中进行转录。除此之外，所述的经表达的mRNA(信使核糖核酸)可以被翻译成一种多肽。

所述的术语“表达”或者“过表达”可以互换使用并且指的是能够进行转基因的表达的一种基因的表达形式。可以使一个细胞中的全部表达水平相对于野生型细胞而言发生提升。

“花朵败育”指的是不能发育并且生产出果实或者种子的花朵。除了花朵的早熟性衰老之外，花朵败育可以指的是花粉产量的损失，授粉以及授精的改变以及随后的种子发育。分生组织的生长以及发育的改变，特别是花朵分生组织的生长以及发育的改变，也进一步的被包括在所述的花朵败育的含义之内。

所述的术语“热耐受性”被定义为一种表现型，在所述的表现型中，一种植物或者植物系具有增强的能力，能够抵挡住升高的温度，并且与另外一种植物或者植物系相比较，其生产的产量超过所述的另外一种植物或者植物系，其中所述的另外一种植物系是一种对照植物，例如是一种野生型对照植物系。

“启动子序列”，或者“启动子”，指的是一种核酸序列，所述的核酸序列能够在一种植物细胞中诱导一种可操作性连接的基因序列进行转录。

所述的术语“结实”是种子的形成，所述的种子的形成是花朵的授粉以及随后的卵细胞的授精以及受精卵的发育所产生的结果。结实的减少将对所生产的种子数量形成联网式的减少(net reduction)，其中所述的结实的减少的发生可能归因于上述任意一个步骤的中断。

所述的术语“本质上相类似”指的是当核酸中的一个或者多个核苷发生变化时，并不会对所述的核酸或者其编码的多肽的功能性质产生改变。由于所述的遗传密码的退化，一个碱基对的改变可能不会在所述被编码的氨基酸序列中产生变化。例如，所述的密码子ACT，ACC，ACA以及ACG全部编码一种苏氨酸氨基酸。或者，一个或者多个碱基对的改变可能使所述被编码的氨基酸产生变化，然而如果所述的替代氨基酸具有相类似的化学性质，那么所述被编码的蛋白的功能性可能不会受到影响。例如，当苏氨酸密码子ACT以及ACC分别变化为AGT或者AGC时，其编码丝氨酸，一种化学性质以及生物性质相类似的氨基酸。除此之外，在多肽中的某些氨基酸是非必需的，因而可以在这些位置处进行改变，而不会对所述多肽的功能性产生影响。本质上相类似同样指的是在一个或者多个核苷碱基上存在变化的序列，其中所述的变化不会对所述序列改变基因表达的能力产生影响，这是通过各种基因沉默方法来完成的，所述的基因沉默方法是例如反义RNAi或者共抑制。所述的术语“本质上相类似”指的是在一个或者多个氨基酸上存在变化的多肽，如上所述，其中所述的变化不会对所述多肽的功能性质产生改变。

所述的术语“产量”指的是种子的数量，种子的重量，种子的大小，全部植物的生物量，增加的植物器官的生物量，果实的产量，以及花朵的产量，其中所述的植物器官是例如茎或者叶片或者根。

所述的术语“产量保护”被定义为当经过了强加的胁迫之后，存在于所述的转基因或者突变体的产量与所述的对照产量之间的正向差异，用％值来表示，其中所述的产量被表示成最佳产量的％。通过对所述的最佳产量与经过了所述的胁迫处理之后的产量进行比较来完成所述的计算(胁迫产量/最佳产量x 100)。

根据序列的同源性以及上述定义的结构域以及基序的存在将所述的MYB基因家族进行分类，其中上述定义的结构域是例如R2R3结构域。所述的分类并不是在所有的情况下都是绝对的，可以根据进行分析所选择的标准发生改变(参见Krantz等人于1998年发表的文章，Stracke等人于2001年发表的文章)。

在这里我们所定义的所述MYB-亚群14包括至少下述的成员，MYB68，MYB36，MYB37，MYB38以及MYB87。依照这里所描述的方法以及表格1中所涵盖的实施例，利用所述的AtMYB68，MYB36，MYB84，MYB37，MYB38以及MYB87序列从其他的物种中对同系物进行识别。

所述的术语“MYB序列”指的是一种在前后文中适宜的多核苷酸序列或者多肽序列。

序列

下述是来自于所述的MYB-亚群14家族中的序列，以及相应的序列标识符，这些序列以及序列标识符是在所述的说明书、实施例以及后附的权利要求中使用到的序列以及标识符：

表1

确定两个序列或者多个序列之间的同源性

为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸的同源性百分数，对所述的序列进行比对从而达到进行最佳比较的目的(例如，为了在所述的序列间进行最佳的比较，可以向进行比较的所述序列中的任何一个中导入缺口)。之后对处于相对应的氨基酸位置或者核苷位置处的氨基酸残基或者核苷进行比较。当所述的第一个序列中的一个位置被一种氨基酸残基或者核苷占据，而所述的氨基酸残基或者核苷与所述的第二个序列中的相对应的位置处的氨基酸残基或者核苷相同时，那么在这个位置上所述的分子是同源的(即，在这里所使用的氨基酸或者核酸的“同源性”等同于氨基酸或者核酸的“同一性”)。

可以利用两个序列之间的同一性的程度来确定所述的核酸序列的同源性。可以使用本领域已知的计算机程序对所述的同源性进行确定，所述的计算机程序是例如由GCG程序包提供的GAP软件。参见，Needleman以及Wunsch于1970年在J Mol Biol《分子生物学杂志》48：443-453中发表的文章。使用GCG GAP软件并且进行下述的设定以进行核酸序列的比较：空位罚分(gap creation penalty)为5.0并且空位拓展罚分(gap extension penalty)为0.3，上述提及的所述相似的核酸序列的编码区域展现出的同一性的程度优选至少为70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或者99％，其中所述的DNA序列的所述编码序列(编码)如表格1中所示。

所述的术语“序列同一性”指的是在一段特定的比较区域内，两个多核苷酸序列或者多肽序列就每个残基而言是相同的的程度。所述的术语“序列同一性的百分数”是通过下述方式进行计算的：在进行比较的区域内对两个进行最佳比对的序列进行比较，确定同时在两个序列中出现的所述相同的核酸碱基(例如，对于核酸而言，为A，T，C，G，U，或者I)的位置的数量，从而获得所述的匹配位置的数量，将所述的匹配位置的数量除以位于所述的比较区域内的位置的总数量(即，窗口的大小)，并且将上述得到的结果乘以100，从而获得所述的序列同一性的百分数。这里所使用的所述术语“本质上的同一性”代表的是一种多核苷酸序列的性质，其中所述的多核苷酸包括一种序列，所述的序列与一种参考序列相比，在比较区域内具有至少80％的序列同一性，优选具有至少85％的序列同一性并且通常具有90％至95％的序列同一性，更加通常具有至少99％的序列同一性。所述的术语“正向残基(positive residue)的百分含量”是通过下述方式进行计算的：在进行比较的区域内对两个进行最佳比对的序列进行比较，如上文中所定义，确定同时在两个序列中出现的所述相同的以及保守的氨基酸取代的位置的数量，从而获得所述的匹配位置的数量，将所述的匹配位置的数量除以位于所述的比较区域内的位置的总数量(即，窗口的大小)，并且将上述得到的结果乘以100，从而获得所述的正向残基的百分含量。

重组表达载体以及宿主细胞

本发明的另外一个方面是关于载体的，优选是表达载体，所述的载体含有一种核酸，所述的核酸编码一种MYB-亚群14蛋白、基因、其类似物或者同系物。所述的用以编码MYB-亚群14多肽的序列可以是一种基因组序列或者是一种cDNA序列。这里所使用的所述术语表达载体包括那些被设计成用来提供所述的核酸序列的转录的载体。所述的经过转录的核酸可以被翻译成一种多肽产品或者蛋白产品。这里所使用的所述术语“载体”指的是一种核酸分子，所述的核酸分子能够将另外一种核酸运送到与其进行连接的位置处。一种类型的载体是“质粒”，它指的是一种环形的双链DNA闭合环，可以在其中进行另外的DNA片段的连结。另外一种类型的载体是一种病毒载体，其中另外的DNA片段可以在所述的病毒基因组中进行连结。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中进行自主的复制(例如，细菌载体具有一种用于复制的细菌起源)。其他的载体通过向所述的宿主细胞中的导入作用，被整合到所述的宿主细胞的基因组中，并且因而沿所述的宿主基因组进行复制。而且，某些载体能够将所述基因的表达导向与它们进行可操作性的连接的位置处。这样的载体在这里被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有效利用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。在本说明书中，由于所述的质粒是载体的最常见的使用形式，“质粒”以及“载体”可以进行互换使用。然而，本发明意在包括那些其他类型的表达载体，例如病毒载体或者植物转化载体，二元载体(binary)或者另外的能够提供同等功能的载体。

本发明中所述的重组表达载体包括本发明所述的核酸，其中所述的核酸以一种适合于所述的核酸在宿主细胞中进行表达的形式存在，这意味着所述的重组表达载体包括一个或者多个调控序列，它是以需要用来进行表达的所述宿主细胞为依据进行选择的，所述的调控序列与需要进行表达的所述核酸序列进行了可操作性的连接。在一个重组表达载体中，“可操作性的连接”意在表明所述的目标核苷酸序列与所述的调控序列进行了连接，所述的连接是以一种允许所述的核苷酸序列进行表达的方式进行的(例如，在一种体外转录/翻译体系中或者在一种宿主细胞中，当所述的载体被导入到所述的宿主细胞中时)。

所述的术语“调控序列”意在包括启动子，增强子以及其他的表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化作用信号)。这样的调控序列在例如下述文献中进行了描述：Goeddel于1990年发表的文章GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)。调控序列包括那些指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中进行组成性表达的序列，以及那些指导所述的核苷酸序列仅在某些宿主细胞中(例如，组织特异性调控序列)或者在诱导型启动子中进行表达的序列(例如，诱导对于非生物因素的应答以及对于生物的应答，其中所述的非生物因素是例如所述细胞的环境条件，热，干旱，营养状态或者生理学状态，其中所述的生物因素是例如病原体应答性的)。适合的启动子的例子包括例如组成型启动子，脱落酸(ABA)诱导型启动子，组织特异性启动子以及非生物性或者生物性诱导型启动子。本领域技术人员将能够预期到，对于所述的表达载体的设计能够取决于下列因素例如对于需要进行转化的所述宿主细胞的选择，所期望的蛋白表达水平以及时机和表达位置，等等。可以将本发明所述的表达载体导入到宿主细胞中从而制成蛋白或者肽，包括融合蛋白或者肽，其中所述的蛋白或者肽是由本发明所描述的核酸进行编码的(例如，MYB-亚群14蛋白例如MYB68蛋白，MYB68蛋白的突变体形式，融合蛋白，等等)。

可以对本发明中所述的重组表达载体进行设计，使其能够使MYB-亚群14基因或者MYB-亚群14蛋白在原核细胞或者真核细胞中进行表达。例如，MYB-亚群14基因或者MYB-亚群14蛋白可以在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞中进行表达，其中所述的细菌细胞是例如大肠杆菌。适合的宿主细胞在下述文献中进行了进一步的讨论：Goeddel于1990年发表的文章GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)。可以选择的，所述的重组表达载体可以在体外进行转录以及翻译，例如使用T7启动子调控序列以及T7聚合酶。

在一种实施方式中，使用一种植物表达载体使本发明所述的核酸在植物细胞中进行表达。植物表达载体系统的例子包括在农杆菌(Agrobacterium)中发现的肿瘤诱导(Ti)质粒或者是上述质粒的一部分，花椰菜花叶病毒(CAMV)DNA以及例如pBI121这样的载体，pCAMBA种类的载体或者本领域技术人员优先选择的一种载体。

为了在植物中进行表达，除了MYB-亚群14多核苷酸之外，所述的重组表达盒中还将含有能够在植物细胞中发挥功效的启动子区域，转录开始位点(如果需要进行转录的所述编码序列缺少位点的话)，以及转录终止/多聚腺苷酸化作用序列。所述的终止/多聚腺苷酸化作用区域可以从与所述的启动子序列相同的基因中获得，或者可以从不同的基因中获得。存在于所述的表达盒的5’端以及3’端处的独特的限制酶位点通常被包括在内，从而能够容易的插入到一种预先存在的载体当中。

适合的植物可表达性启动子的例子包括来自于植物病毒的启动子，例如所述的来自于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(参见Odell等人于1985年在Nature《自然》313：810-812中发表的文章)，来自于基因的启动子例如水稻肌动蛋白(参见McElroy等人于1990年在Plant Cell《植物细胞》163-171中发表的文章)，泛素(参见Christensen等人于1992年在Plant Mol.Biol.《植物分子生物学》12：619-632中发表的文章；以及Christensen等人于1992年在Plant Mol.Biol.《植物分子生物学》18：675-689中发表的文章)，pEMU(参见Last等人于1991年在Theor.Appl.Genet.《理论及应用遗传学》81：581-588中发表的文章)，甘露碱合成酶基因启动子(MAS)(参见Velten等人于1984年在EMBO J.《欧洲分子生物学学会杂志》3：2723-2730中发表的文章)，玉米H3组蛋白(参见Lepetit等人于1992年在Mol.Gen.Genet.《分子遗传学与普通遗传学》231：276-285中发表的文章；以及Atanassvoa等人于1992年在Plant Journal《植物学杂志》2(3)：291-300中发表的文章)，来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的5’-或者3’-启动子，Smas启动子，杜仲肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5683439)，胭脂氨酸合成酶(Nos)启动子，二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)启动子，富甘氨酸蛋白质基因(GRP)-18启动子，ALS启动子(WO 96/30530)，合成启动子，例如Rsyn7启动子，单细胞蛋白(SCP)启动子以及偶联蛋白(UCP)启动子，1，3-二磷酸核酮糖羧化酶，果实特异性启动子，热休克启动子，种子特异性启动子以及其他来自于各种不同的植物基因的转录开始区域，例如，包括各种不同的opine开始区域，例如，章鱼碱，甘露碱，以及胭脂氨酸。有用的启动子同样包括热诱导型启动子例如所述的热休克蛋白(HSP)18.2启动子或者热休克蛋白(HSP)81.1启动子(参见Takahashi等人于1992年在Plant J.《植物学杂志》2，751-761中发表的文章；Yoshida等人于1995年在Appl.Microbiol.Biotechnol.《应用微生物学与生物技术》44，466-472中发表的文章；Ueda等人于1996年在Mol Gen Genet《分子遗传学与普通遗传学》250：533-539中发表的文章)。潜在启动子同样能够有效的用于本发明中可以使用的嵌合构建体。当潜在基因调控元件存在于它们在所述的基因组中的本来位置处时，是不具备活性的，但是当将其放置于邻近转基因植物的基因位置处时，它们具有完全的功能。

除了嵌合启动子-基因构建体之外，可以预期到天然存在的MYB-亚群14启动子的用途。通过调控元件的纳入，可以对一种天然启动子的表达性质进行修饰，这样一来表达水平被提升和/或进行异位的表达和/或进行组成性的表达。例如，可以在一种构建体中纳入四个(4X)35S增强子序列(参见Wiegel等人于2000年发表的文章)，用以增强表达。或者，可以利用一种含有四个35S增强子序列的构建体进行转化，从而制备一类植物群体，其中所述的构建体是例如Wiegel等人于2000年发表的文章中所描述的pSKI15载体。可以对上述经过转化的群体进行筛选，从而筛选出具有增强的MYB-亚群14序列的表达的植物，或者筛选出具有增强的热耐受性以及减少的花朵败育的植物，或者进行这类筛选的组合，从而对目标植物进行识别。

为了在植物细胞中进行表达，能够与编码MYB-亚群14的核酸序列进行连接的其他的调控元件包括终止子，多聚腺苷酸化作用序列，以及编码信号肽的核酸序列，其允许存在于植物细胞中或者将所述的蛋白从所述的细胞中分泌出来。这样的调控元件以及将这些元件加入到MYB-亚群14基因的调控元件之中或者利用这些元件与MYB-亚群14基因中的调控元件进行交换的方法是本领域已知的，并且包括，但不局限于，3’终止和/或多聚腺苷酸化作用区域例如所述的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合成酶(nos)基因中的3’终止和/或多聚腺苷酸化作用区域(参见Bevan等人于1993年在Nucl.Acids Res.《核酸研究》12：369-385中发表的文章)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因中的3’终止和/或多聚腺苷酸化作用区域(参见Keil等人于1986年在Nucl.Acids Res.《核酸研究》14：5641-5650中发表的文章并且在此被引入作为参考；以及An等人于1989年在Plant Cell《植物细胞》1：115-122中发表的文章)；以及所述的花椰菜花叶病毒19S基因中的3’终止和/或多聚腺苷酸化作用区域(参见Mogen等人于1990年在Plant Cell《植物细胞》2：1261-1272中发表的文章)。

植物信号序列，包括，但不局限于，编码信号肽的DNA/RNA序列，所述的序列将蛋白靶向定位于(target proteins to)所述的植物细胞的细胞外基质(参见Dratewka-Kos等人于1989年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》264：4896-4900中发表的文章)以及所述的皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的延伸基因(参见DeLoose等人于1991年在Gene《基因》99：95-100中发表的文章)，或者所述的信号肽将蛋白靶向定位于所述的液泡，如所述的甘薯贮藏蛋白基因(参见Matsuka等人于1991年在Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)《美国科学院院刊》88：834中发表的文章)以及所述的大麦凝集素基因(参见Wilkins等人于1990年在Plant Cell《植物细胞》2：301-313中发表的文章)，或者所述的信号能够引起蛋白的分泌例如PRIb的信号(参见Lind等人于1992年在Plant Mol.Biol.《植物分子生物学》18：47-53中发表的文章)，或者是那些将蛋白靶向定位于所述的质体的信号例如油菜籽脂烯酰基酰基载体蛋白(enoyl-ACP)还原酶的信号，这些都可以有效的用于本发明之中。

在另外一种实施方式中，所述的重组表达载体能够指导所述的核酸优先在一种特定的细胞类型中进行表达(例如，组织特异性调控元件被用来进行所述核酸的表达)。组织特异性调控元件是本领域已知的。能够与本发明中所述的核酸进行特别有效的连接的是表达系统，所述的表达系统可以在植物中进行操作。这些系统包括受到组织特异性启动子的控制的系统，以及那些包括能够在所有的植物组织中进行操作的启动子的系统。

器官特异性启动子同样是熟知的。例如，所述的查尔酮合成酶-A基因(参见vander Meer等人于1990年在Plant Molecular Biology《植物分子生物学》15(1)：95-109中发表的文章)或者所述的二氢黄酮醇-4-还原酶(dfr)启动子(参见Elomaa等人在The PlantJournal《植物学杂志》16(1)93-99中发表的文章)能够在特异性的花朵组织中指导表达。同样可以利用的是所述的patatin I类启动子，所述的启动子仅仅能够在所述的马铃薯块茎中发生转录活化，并且可以被用来作用于在所述的块茎中发生的基因表达(参见Bevan M.于1986年在Nucleic Acids Research《核酸研究》14：4625-4636中发表的文章)。另外一种马铃薯特异性启动子是所述的颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)启动子(参见Visser R.G.R.等人于1991年在Plant Molecular Biology《植物分子生物学》17：691-699中发表的文章)。

可以使用已知的步骤对其他的器官特异性启动子进行分离，其中所述的器官特异性启动子对于一种目标靶向器官而言是适合的。这些控制序列通常是与一类基因相关联的，这类基因能够在所述的目标器官中进行唯一的表达。在一种典型的高等植物中，每个器官中含有数以千计的mRNA，这些mRNA在其他的器官系统中是不存在的(参见Goldberg P.于1986年在Trans.R.Soc.London B《皇家学会哲学汇刊，B辑》314：343中发表的文章)。

上述得到的表达系统或者表达盒被连结在或者另外通过进行构建而被纳入到一种重组载体之中，其中所述的重组载体是适于进行植物的转化的。所述的载体中还可以含有选择性标记基因，通过所述的选择性标记基因，可以在培养中对经过转化的植物细胞进行识别。所述的标记基因可以编码抗生素抗性。这些标记包括对于G418的抗性，对于潮霉素的抗性，对于博来霉素的抗性，对于卡那霉素的抗性，以及对于庆大霉素的抗性。或者所述的标记基因能够编码一种具有除草剂耐受性的基因，从而提供对于草铵膦类型或者草甘膦类型的除草剂的耐受性。在对所述的植物细胞进行转化之后，通过其能够在含有所述的特定抗生素或者除草剂的培养基中进行生长的能力，将能够识别出那些含有所述的载体的细胞。起源于细菌或者病毒的复制序列通常也是被包括在内的，从而允许所述的载体在一种细菌宿主或者噬菌体宿主中进行克隆，优选被包括在内的是一种具有广泛的宿主范围的起源于原核的复制。一种细菌的选择性标记同样也应当被包括在内，从而允许对承载了所述的目标构建体的细菌细胞进行选择。适合的原核选择性标记同样包括对于抗生素的抗性，其中所述的抗生素是例如卡那霉素或者四环素。

正如本领域中所已知的，用于编码额外功能的其他DNA序列同样可以存在于所述的载体之中。例如，在进行农杆菌(Agrobacterium)转化的情形中，为了随后向植物染色体中进行转移，T-DNA序列同样也应当被包括在内。

本发明的另外一个方面是关于宿主细胞的，在所述的宿主细胞中导入本发明中所述的重组表达载体。所述的术语“宿主细胞”以及“重组宿主细胞”在本文中可以互换使用。可以理解的是，这些术语不仅仅指的是具体的宿主细胞，其同样指代所述的这种细胞的后裔或者潜在的后裔。由于突变或者环境影响的原因，在接下来的世代中可能发生某些修饰，这使得这样的后裔实际上不同于所述的母本细胞，但其仍然被包括在这里所使用的所述术语的范围之内。

可以经由传统的转化技术或者转染技术，将载体DNA导入到原核细胞或者真核细胞之中。这里所使用的所述术语“转化”以及“转染”意在指代本领域认知的用于向一种宿主细胞中导入一种外源核酸(例如，DNA)的各种技术。

本发明中所述的宿主细胞，例如在培养之中的原核宿主细胞或者真核宿主细胞，可以被用来制备(即，表达)本发明所述的多肽，其中所述的多肽是在本发明中所述的多核苷酸的开放阅读框中进行编码的。因此，本发明进一步提供用于制备一种多肽的方法，其中所述的方法使用了本发明中所述的宿主细胞。在一种实施方式中，所述的方法包括在一种适合的培养基中培养本发明中所述的宿主细胞(向所述的宿主细胞中导入编码本发明所述的多肽的重组表达载体)，从而制备出所述的多肽。在另外一种实施方式中，所述的方法进一步包括从所述的培养基或者所述的宿主细胞中分离所述的多肽。

许多类型的细胞可以作为适合的宿主细胞被用于进行多肽的表达，其中所述的多肽是由本发明中所述的多核苷酸的开放阅读框进行编码的。植物宿主细胞包括，例如，能够发挥适合的宿主功能、用于进行本发明中所述的多核苷酸的表达的植物细胞包括来自于各种不同的植物种类的表皮细胞，叶肉以及其他的基本组织，以及叶片中的脉管组织，茎，花朵器官，以及根，其中所述的各种不同的植物种类是例如拟南芥属(Arabidopsis)，芸薹属(Brassica)，稻属(Oryza)，玉蜀黍属(Zea)，高粱(Sorghum)，棉花属(Gossypium)，小麦属(Triticum)，豆属(Glycine)，豌豆(Pisum)，菜豆属(Phaseolus)，番茄属(Lycopersicon)，三叶草(Trifolium)，大麻(Cannabis)，南瓜(Cucurbita)，蔷薇(Rosa)，葡萄(Vitis)，胡桃(Juglans)，草莓(Fragaria)，莲花(Lotus)，苜蓿(Medicago)，驴豆(Onobrychis)，葫芦巴(Trigonella)，豇豆(Vigna)，柑橘属(Citrus)，亚麻属(Linum)，天竺葵(Geranium)，木薯(Manihot)，胡萝卜属(Daucus)，萝卜属(Raphanus)，芥子属(Sinapis)，颠茄属(Atropa)，辣椒属(Capsicum)，曼陀罗(Datura)，莨菪属(Hyoscyamus)，烟草(Nicotiana)，茄属(Solanum)，矮牵牛(Petunia)，洋地黄(Digitalis)，墨角兰(Majorana)，菊苣属(Cichorium)，向日葵(Helianthus)，莴苣属(Lactuca)，雀麦属(Bromus)，芦笋(Asparagus)，金鱼草属(Antirrhinum)，萱草属(Hemerocallis)，Nemesis，天竺葵属(Pelargonium)，黍樱(Panieum)，狼尾草(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)，千里光(Senecio)，蛾蝶花(Salpiglossis)，黄瓜属(Cucumis)，蓝英花(Browallia)，黑麦草属(Lolium)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，黑麦属(Secale)，云杉属(Picea)，Caco，以及杨属(Populus)。

保守性突变

除了可能存在于所述群体之中的MYB-亚群14或者MYB68序列的天然发生的等位基因突变体之外，所述的熟练技术人员将能够进一步的预期到，可以通过突变方式向具有下述序列识别号的核苷酸序列中导入变化，所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265，从而使所述的经过编码的MYB-亚群14或者MYB68蛋白的氨基酸序列发生变化，并且不改变所述的MYB-亚群14或者MYB68蛋白的功能性能力。例如，可以在具有下述序列识别号的序列中利用核苷酸取代引发在“非必需”氨基酸残基上的氨基酸取代，所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264。“非必需”氨基酸残基指的是这样的一种残基，其可以从所述的MYB-亚群14或者MYB68野生型序列中发生改变，但不会改变所述的生物活性，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需要的。例如，存在于本发明所述的MYB-亚群14或者MYB68蛋白中的保守的氨基酸残基被预测为是不理想的改变性质的候选者。对于保守性区域的比对以及识别在本发明中进行了描述，并且这种比对以及识别为必需氨基酸以及保守性氨基酸的识别提供了进一步的指导。

本发明的另外一个方面是关于核酸分子的，其中所述的核酸分子编码一种MYB-亚群14或者MYB68蛋白，在所述的MYB-亚群14或者MYB68蛋白中存在着氨基酸残基上的变化，这些氨基酸残基对于活性而言不是必需的。这样的MYB-亚群14或者MYB68蛋白与具有下列序列识别号的序列的氨基酸序列存在不同但仍然保留了生物学活性，其中所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264。在一种实施方式中，所述的被分离的核酸分子包括一种编码蛋白的核苷酸序列，其中所述的蛋白包括一种氨基酸序列，所述的氨基酸序列与具有下述序列识别号的氨基酸序列存在至少大约75％的同源性，其中所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264。优选的，由所述的核酸编码的所述蛋白与具有下述序列识别号的序列存在至少大约80％的同源性，其中所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264，更加优选与具有下述序列识别号的序列具有至少大约90％、95％、98％、并且最优选具有至少大约99％的同源性，其中所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264。

一种经过分离的核酸分子，所述的核酸分子编码一种MYB-亚群14或者MYB68蛋白，其中所述的MYB-亚群14或者MYB68蛋白与具有下述序列识别号的蛋白是同源的，其中所述的序列为：序列2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，89，93，95，97，99，101，103，105，107，111，113，115，117，119，121，123，126，128，131，133，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，212，215，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，248，250，252，254，256，258，260，262以及264，这样的核酸分子可以通过向具有下述序列识别号的核苷酸序列中导入一个或者多个核苷酸的取代、加成或者缺失来制备，其中所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265，这样一来一个或者多个氨基酸的取代、加成或者缺失被导入到所述被编码的蛋白之中。

可以通过标准的技术向具有下述序列识别号的核苷酸序列中导入突变，所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265，其中所述的标准技术是例如定点突变以及由聚合酶链式反应(PCR)介导的突变。优选的，在一个或者多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸的取代。“保守性氨基酸取代”指的是利用一种具有相似的侧链的氨基酸残基对所述的氨基酸残基进行取代。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已经在所属领域中进行了定义。这些家族包括具有碱侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，利用与存在于MYB68中的预测的非必需氨基酸残基属于相同的侧链家族的另外一种氨基酸残基对所述的非必需氨基酸残基进行取代。可以选择的，在另外一种实施方式中，可以沿所述的MYB-亚群14或者MYB68编码序列的全部或者一部分随机的导入突变，例如通过饱和突变的方式，并且可以对上述得到的突变体进行生物活性的筛选，从而识别出保留了活性以及所期望的表现型的突变体。在具有下述序列识别号的序列发生突变之后，可以利用本领域已知的任意重组技术对所述被编码的蛋白进行表达，并且可以确定所述蛋白的活性，其中所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。

经过转化的植物细胞以及转基因植物

本发明包括原生质体，植物细胞，植物组织以及植物(例如，单子叶植物或者双子叶植物)，其中所述的原生质体，植物细胞，植物组织以及植物(例如，单子叶植物或者双子叶植物)经过了MYB-亚群14核酸、含有MYB-亚群14核酸的载体或者含有MYB-亚群14核酸的表达载体的转化。这里所使用的“植物”不仅仅意在包括整个的植物，同时也包括所述植物的某个部分(即，细胞，以及组织，包括例如，叶片，茎，嫩枝，根，花朵，果实以及种子)。

所述的植物可以是任意种类的植物，包括，例如，选自下列种属的物种：拟南芥属(Arabidopsis)，芸薹属(Brassica)，稻属(Oryza)，玉蜀黍属(Zea)，高粱(Sorghum)，棉花属(Gossypium)，小麦属(Triticum)，豆属(Glycine)，豌豆(Pisum)，菜豆属(Phaseolus)，番茄属(Lycopersicon)，三叶草(Trifolium)，大麻(Cannabis)，南瓜(Cucurbita)，蔷薇(Rosa)，葡萄(Vitis)，胡桃(Juglans)，草莓(Fragaria)，莲花(Lotus)，苜蓿(Medicago)，驴豆(Onobrychis)，葫芦巴(Trigonella)，豇豆(Vigna)，柑橘属(Citrus)，亚麻属(Linum)，天竺葵(Geranium)，木薯(Manihot)，胡萝卜属(Daucus)，萝卜属(Raphanus)，芥子属(Sinapis)，颠茄属(Atropa)，辣椒属(Capsicum)，曼陀罗(Datura)，莨菪属(Hyoscyamus)，烟草(Nicotiana)，茄属(Solanum)，矮牵牛(Petunia)，洋地黄(Digitalis)，墨角兰(Majorana)，菊苣属(Cichorium)，向日葵(Helianthus)，莴苣属(Lactuca)，雀麦属(Bromus)，芦笋(Asparagus)，金鱼草属(Antirrhinum)，萱草属(Hemerocallis)，Nemesis，天竺葵属(Pelargonium)，黍樱(Panieum)，狼尾草(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)，千里光(Senecio)，蛾蝶花(Salpiglossis)，黄瓜属(Cucumis)，蓝英花(Browallia)，黑麦草属(Lolium)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，黑麦属(Secale)，云杉属(Picea)，Caco，以及杨属(Populus)。

本发明同样包括细胞，组织，包括例如，叶片，茎，嫩枝，根，花朵，果实以及种子以及来自于所述的转化植物的后裔。

用于将外源基因向植物中导入的许多方法均是已知的并且可以利用上述方法将基因插入到一种植物宿主中，包括生物学以及物理学植物转化方案(参见，例如，Miki等人于1993年在Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology《植物分子生物学与生物技术的方法》中发表的文章“Procedure for Introducing Foreign DNA intoPlants《向植物中导入外源DNA的步骤》”，Glick以及Thompson编辑，CRC Press Inc.，BocaRaton，第67-88页；以及Andrew Bent于1998年在Clough SJ and Bent AF中发表的文章“Floral dipping：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana《花朵的浸泡：一种对拟南芥进行农杆菌介导的转化的简便方法》”)。根据所述的宿主植物的不同来选择所述的方法，并且所述的方法包括化学转染法例如磷酸钙，聚乙二醇(PEG)转化法，由微生物例如农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移(参见Horsch等人于1985年在Science《科学》227：1229-31中发表的文章)，电穿孔，原生质体转化法，显微注射，花朵浸泡(flower dipping)以及基因枪轰击法。

由农杆菌(Agrobacterium)介导的转化

用于向植物中导入表达载体的应用最广泛的方法是以所述的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以及发根农杆菌(A.rhizogenes)的天然转化系统为基础的，其中所述的根癌农杆菌以及发根农杆菌是能够对植物细胞进行遗传性转化的植物致病细菌。根癌农杆菌以及发根农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒以及根诱导(Ri)质粒携带有进行植物的遗传性转化的基因(参见，例如，Kado于1991年在Crit.Rev.Plant Sci.《植物科学的评论与回顾》10：1-32中发表的文章)。在前述的Gruber等人发表的文章中以及Moloney等人于1989年在Plant Cell Reports《植物细胞学报告》8：238-242中发表的文章中提供了对于农杆菌载体系统以及由农杆菌介导的基因转移的说明。

根据Andrew Bent于1998年在Clough SJ and Bent AF中发表的文章Floraldipping：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana《花朵的浸泡：一种对拟南芥进行农杆菌介导的转化的简便方法》中所描述的方法，通过在农杆菌(Agrobacterium)培养液中浸泡开花植物的方法，能够容易的制备出转基因拟南芥(Arabidopsis)植物。使野生型植物进行生长，直至所述的植物孕育花朵并且开花。将所述的植物倒转放入农杆菌培养液溶液中保持1分钟，其中所述的农杆菌培养液溶液中带有所述的适合的基因构建体。之后将植物水平放置于盘中并且保持覆盖两天，从而维持湿度，并且随后将其扶正(righted)并且装入袋中(bagged)以继续进行生长以及种子的发育。大批量的收获成熟的种子。

直接的基因转移

一种通常可以应用的植物转化的方法是由微弹介导的转化，其中在所述的微弹的表面上携带着DNA，所述的微弹具有大约1至4微米的测量尺寸。将所述的表达载体导入到植物组织中，利用基因枪装置对所述的微弹进行加速，使其达到300至600米/秒的速度，所述的速度足以穿透所述的植物细胞壁以及细胞膜(参见Sanford等人于1987年在Part.Sci.Technol.5：27-37中发表的文章；Sanford于1988年在Trends Biotech《生物技术趋势》6：299-302中发表的文章；Sanford于1990年在Physiol.Plant《植物生理学》79：206-209中发表的文章；Klein等人于1992年在Biotechnology《生物技术》10：286-291中发表的文章)。

还可以通过美国专利5240842、美国专利6809232中描述的气雾剂束注射(ABI)方法来完成植物的转化。使用气雾剂束技术对湿颗粒或者干颗粒进行加速，使得所述的颗粒能够穿透存活的细胞。气雾剂束技术利用到惰性气体的射流膨胀，使其经由一个小孔从具有较高的气体压力的区域流向具有较低的气体压力的区域。所述的膨胀的气体加速了气雾剂液滴，其中所述的气雾剂液滴中含有需要被导入到细胞或者组织当中的核酸分子。对所述的加速颗粒进行放置使其冲击一个优选的靶向，例如一种植物细胞。所述的颗粒作为一个具有足够小的尺寸的液滴被进行构建，从而使所述的细胞经过穿透而存活下来。利用所述的应用领域中已知的标准技术使所述的经过转化的细胞或者组织进行生长从而制备一种植物。

转化体的再生

从单一的植物原生质体或者从各种不同的外植体中进行植物的发育或者再生是本领域熟知的(参见Weissbach以及Weissbach于1988年发表的文章)。这种再生以及生长的过程通常包括下述步骤：转化细胞的筛选，对那些个体细胞进行培养，经由所述的胚胎发育的平常时期并且经由所述的根苗时期。转基因晶胚以及种子进行类似的再生。在此后将上述得到的转基因发根嫩芽种植在一种适宜的植物生长培养基例如土壤中。

所述的植物的发育或者再生可以利用已经有所描述的本领域熟知的方法(参见Horsch等人于1985年发表的文章)来完成，其中所述的植物中含有编码目标多肽的所述的外源、外生性基因，其中所述的基因是由来自于叶片外植体的农杆菌(Agrobacterium)导入的。在这个方法中，将所述的转化体在存在选择性试剂的条件下进行培养，并且利用已经有所描述的、能够诱发所述的被转化植株的嫩枝进行再生的培养基(参见Fraley等人于1983年发表的文章)中对所述的转化体进行培养。具体的，美国专利No.5349124(说明书在本文中被引入作为参考)详细描述了遗传转化的莴苣细胞的建立以及由此得到的植物，所述的植物表达杂交的晶体蛋白，其中所述的晶体蛋白为所述的植物赋予杀虫的活性，其能够抵抗鳞翅目的幼虫。

这种方法通常在两个月至四个月的时间内制备出嫩枝并且随后将那些嫩枝转移到一种适宜的根诱导培养基中，其中所述的根诱导培养基中含有所述的选择性试剂以及一种抗生素用于预防细菌的生长。在所述的选择性试剂的存在下，嫩枝发根从而形成苗，之后将苗移植到土壤或者其他介质中从而允许根部的生成。这些过程依据所使用的具体的植株而发生改变，这些改变是本领域熟知的。

优选的，所述的再生型植物是自花授粉的从而提供了纯合的转基因植物，或者将从所述的再生型植物中获得的花粉交叉传授给具有农艺学重要性的种子生长型植物，所述的种子生长型植物优选是近交系的。相反的，将来自于那些重要品系的植物的花粉用于对再生型植物进行授粉。使用本领域技术人员熟知的方法对含有目标多肽的本发明所述的转基因植物进行栽植。

一种优选的转基因植物是一种独立的分离株(segregant)并且能够将所述的MYB68基因及其活性传递给它的后裔。一种更加优选的转基因植物对于所述的基因而言是纯合的，并且能够将这种基因传递给有性交配的所有后代。转基因植物的种子可以在野外生长或者在温室中生长，并且得到的性成熟的转基因植物是自花授粉的从而生成真正的育种植物。这些植物的后裔成为真正的育种品系，这可以通过所述的MYB68转基因的表达的增强来进行评价。

制备转基因植物的方法

制备转基因植物的方法是包含在本发明之内的。所述的方法包括向一个或者多个植物细胞中导入一种化合物，用以对所述植物中的MYB-亚群14的表达或者活性进行改变，从而生成一种转基因植物细胞，以及从所述的转基因细胞中进行转基因植物的再生。所述的化合物增强了MYB-亚群14的表达或者活性。可以对所述的增强的表达和/或活性进行另外的指导，使其以异位的方式或者以组成型的方式或者以组织特异性的方式发生。所述的化合物可以是，例如，(i)MYB-亚群14多肽；(ii)MYB-亚群14核酸及其类似物以及同系物；(iii)能够增强MYB-亚群14核酸的表达的核酸。能够增强MYB-亚群14核酸的表达的核酸可以包括启动子元件或者增强子元件。所述的启动子是一种异源启动子或者是一种同源启动子。除此之外，所述的启动子是一种组成型启动子或者是一种诱导型启动子。启动子包括例如，器官特异性启动子或者组织特异性启动子。适合指导基因表达的启动子是本领域已知的并且在本发明进行了描述。增强子元件对于本领域技术人员而言是已知的。例如所述的增强子元件是一种35S增强子元件。

通过增加所述的MYB亚群-14多肽的表达，意味着由所述的经过所述核酸构建体进行转化的细胞所生产的量高于没有经过所述的核酸构建体进行转化的细胞所生产的量，其中所述的没有进行转化的细胞是例如一种对照细胞。对照细胞包括例如一种能够内源性的表达MYB亚群-14多肽的细胞，例如一种植物根细胞，或者对照细胞是与所述的转化细胞具有相同的细胞类型的一种非转化细胞，是一种叶片细胞、分生组织细胞或者花朵细胞或者种子细胞。增加指的是一倍的增加，两倍的增加，三倍的增加或者更高倍数的增加。表达上的增加同样意在包括在一种通常情况下不产生MYB亚群-14多肽的细胞中进行的MYB亚群-14多肽的表达。

所述的核酸可以是内源性的或者是外源性的。优选的，所述的化合物是一种MYB-亚群14多肽或者编码一种MYB-亚群14多肽的MYB-亚群14核酸。例如所述的化合物包括具有下述序列识别号的核酸序列，所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。优选的，所述的化合物是一个MYB-亚群14核酸序列，其中所述的核酸序列来自于被转化的物种的内源性来源。或者，所述的化合物是一种MYB-亚群14核酸序列，其中所述的核酸序列来自于被转化的物种的外源性来源。

制备转基因植物的方法是同样被包含在本发明之内的。所述的方法包括向一个或者多个植物细胞中导入一种化合物，用以对所述植物中的MYB-亚群14核酸的表达或者活性进行改变，从而生成一种转基因植物细胞，以及从所述的转基因细胞中进行转基因植物的再生。所述的化合物增强了MYB-亚群14序列的表达或者活性。所述的化合物可以是，例如，(i)MYB-亚群14多肽；(ii)MYB-亚群14核酸及其类似物以及同系物；(iii)能够增强MYB-亚群14核酸的表达的核酸。能够增强MYB-亚群14核酸的表达的核酸可以包括启动子元件或者增强子元件。所述的核酸可以是内源性的或者是外源性的。优选的，所述的化合物是一种MYB-亚群14多肽或者MYB-亚群14核酸。例如所述的化合物包括具有下述序列识别号的核酸序列，所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。优选的，所述的化合物是一个MYB-亚群14核酸序列，其中所述的核酸序列相对于被转化的物种而言是内源性的。或者，所述的化合物是一种MYB-亚群14核酸序列，其中所述的核酸序列相对于被转化的物种而言是外源性的。

在一种宿主物种中进行表达的外源性MYB-亚群14序列不需要与所述的内源性MYB-亚群14序列相同。例如，以与GAMYB基因的序列相似性为基础，可以获得三个拟南芥GAMYB样基因的序列，其中所述的GAMYB基因来自于大麦，水稻，以及毒麦(L.temulentum)。这三个拟南芥基因被确定为能够编码转录因子(AtMYB33，AtMYB65，以及AtMYB101)，并且能够取代大麦GAMYB并且控制α-淀粉酶的表达(参见Gocal等人于2001年在Plant Physiol.《植物生理学》127：1682-1693中发表的文章)。

能够对类黄酮的生物合成进行调控的玉米MYB转录因子、矮牵牛花MYB转录因子以及AtMYB转录因子具有高度的遗传相似性，并且对存在于它们的天然物种中的相同的特点产生影响，因此在这些不同的物种中，这些MYB转录因子的序列以及功能是彼此间相互关联的(参见Borevitz等人于2000年在Plant Cell《植物细胞》12：2383-2394中发表的文章)。

因此仅仅需要在所述的宿主细胞中对被表达的MYB-亚群14进行功能性的识别即可。编码核酸的MYB-亚群14在拟南芥中的表达为所述的功能等同(functionallyequivalent)检测提供了基础。例如来自于芸薹属，大豆，棉花或者玉米来源的MYB-亚群14在拟南芥中的表达以及对于所述的热耐受性的评估证明了功能的等同性并且为下述预测提供了可靠的基础：所述的外源性序列是一种MYB-亚群14基因并且因此发挥功能。

本发明中公开的是对于MYB-亚群14序列的表达进行的描述，其中所述的MYB-亚群14序列来自于拟南芥，芸薹属以及大豆，已经证明这种表达在拟南芥中是可以发挥功效的，这是因为上述得到的植物具有增强的热耐受性以及在开花过程中在热胁迫条件下具有增加的结实，其中所述的增强的热耐受性是由减少的花朵败育所表明的。

在各种不同的方面中，与野生型植物(即，未经过转化的)相比，所述的转基因植物具有一种改变的表现型。改变的表现型意味着所述的植物具有一个或者多个不同于所述的野生型植物的特征。例如，当将所述的转基因植物与一种化合物进行接触时，其中所述的化合物能够增强所述的MYB-亚群14核酸的表达或者活性，与野生型植物相比，所述的植物具有一种例如热耐受性增强的表现型，并且在表现型中显现出这种特点例如减少的花朵败育，增加的结实以及发育，增强的产量保护以及对于花粉发育的保护以及分生组织的保护，特别是对于花朵分生组织的保护，保护其免受热损伤，干旱的耐受性以及盐的耐受性。与对照植物相比，具有减少的花朵败育的植物在种子的产量上具有5％，10％，20％，25％，30％或者更高的增长。

所述的植物可以是任意种类的植物，包括，例如，选自下列种属的物种：拟南芥属(Arabidopsis)，芸薹属(Brassica)，稻属(Oryza)，玉蜀黍属(Zea)，高粱(Sorghum)，棉花属(Gossypium)，小麦属(Triticum)，豆属(Glycine)，豌豆(Pisum)，菜豆属(Phaseolus)，番茄属(Lycopersicon)，三叶草(Trifolium)，大麻(Cannabis)，南瓜(Cucurbita)，蔷薇(Rosa)，葡萄(Vitis)，胡桃(Juglans)，草莓(Fragaria)，莲花(Lotus)，苜蓿(Medicago)，驴豆(Onobrychis)，葫芦巴(Trigonella)，豇豆(Vigna)，柑橘属(Citrus)，亚麻属(Linum)，天竺葵(Geranium)，木薯(Manihot)，胡萝卜属(Daucus)，萝卜属(Raphanus)，芥子属(Sinapis)，颠茄属(Atropa)，辣椒属(Capsicum)，曼陀罗(Datura)，莨菪属(Hyoscyamus)，烟草(Nicotiana)，茄属(Solanum)，矮牵牛(Petunia)，洋地黄(Digitalis)，墨角兰(Majorana)，菊苣属(Cichorium)，向日葵(Helianthus)，莴苣属(Lactuca)，雀麦属(Bromus)，芦笋(Asparagus)，金鱼草属(Antirrhinum)，萱草属(Hemerocallis)，Nemesis，天竺葵属(Pelargonium)，黍樱(Panieum)，狼尾草(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)，千里光(Senecio)，蛾蝶花(Salpiglossis)，黄瓜属(Cucumis)，蓝英花(Browallia)，黑麦草属(Lolium)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，黑麦属(Secale)，云杉属(Picea)，Caco，以及杨属(Populus)。

识别热胁迫耐受性植物的方法

同样被包括在本发明之内的是一种识别热胁迫耐受性植物的方法。与一种对照植物相比，通过这些方法识别出的所述植物具有减少的花朵败育以及增加的产量。热胁迫耐受性植物是通过下述方式被识别出来的：将一群开花植物暴露于热胁迫处理中并且从上述的植物群体中选择一种具有减少的花朵败育的植物。热胁迫处理包括例如将所述的植物在足够热的温度下暴露足够长的时间，这样一来导致了对植物的功能或者发育上的损伤。减少的花朵败育意味着植物不会损失与因花朵败育而损失的同样多的花朵，或者与另外一种被暴露于类似的热胁迫水平下的植物相比，所述的植物具有更高的结实产量。与一种对照植物相比，具有减少的花朵败育的植物在结实产量上具有5％，10％，20％，25％，30％或者更高的增长。

实施例

本发明将在下述的非限制性实施例中进行进一步的描述。

实施例1：热耐受性突变体的识别

使用pSKI15载体对拟南芥哥伦比亚生物型(Arabidopsis thalianavar.Columbia)进行转化，其中所述的pSKI15载体中含有四个35S增强子序列(参见Wiegel等人于2000年发表的文章)。从拟南芥生物资源中心(ABRC)处获得T3世代的拟南芥种子并且用来制备T4世代，所述的T4世代被用来进行遗传筛选试验。所述的拟南芥h138突变体被识别出来，当在开花过程中被暴露于大约45℃的热胁迫下保持大约30至60分钟时，与野生型对照相比，所述的突变体具有减少的花朵败育或者不存在花朵败育。通过下述方式对初始的分离进行再测试：使开花植物经受1小时的温度梯度上升，由22℃上升至45℃，随后经受2小时的45℃下的热胁迫，对花朵的产量、结实以及种子的发育进行监控并且对热胁迫图线进行选择。

实施例2：热胁迫MYB68基因的识别

按照下述方法完成基因组的步移，从而使所述的T-DNA活化标签的插入局部化(localize)。通过苯酚：氯仿提取法对基因组DNA进行纯化，其中使用的是10天大的突变体h138的幼苗。随后利用所述的限制酶对上述分离的DNA进行消化，从而生成具有钝末端的DNA片段，其中所述的限制酶是例如EcoRV，PvuII，NruI，或者StuI。将上述来自于每个消化反应的片段与衔接子进行连结，其中所述的衔接子是由两个寡核苷酸(oligos)的退火形成的，其中所述的两个寡核苷酸(oligos)是：衔接子1以及衔接子2。所述的衔接子与所述的DNA片段发生的加成使得能够进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用对所述的衔接子具有特异性的引物以及T-DNA插入位点。

进行两轮聚合酶链式反应(PCR)，从而生成用于进行进一步的测序分析的DNA片段。在第一轮聚合酶链式反应中使用引物HeatL1(序列)以及引物CAP1(序列)，其中所述的引物HeatL1对所述的T-DNA的左边界具有特异性，而引物CAP1对所述的衔接子具有特异性。将上述得到的聚合酶链式反应的产物稀释50倍，用来作为第二轮聚合酶链式反应的模板。之后利用两个套式引物HeatL2(序列)以及CAP2(序列)对一段确认的DNA片段进行扩增。使用聚合酶链式反应程序TOUCH1(94℃，25秒，6次循环；72℃，7分钟；94℃，25秒，32次循环；67℃，7分钟，以及67℃，10分钟，1次循环)以及TOUCH2(94℃，25秒，4次循环；72℃，7分钟；94℃，25秒，20次循环；67℃，7分钟，以及67℃，10分钟，1次循环)进行上述的两轮聚合酶链式反应。使用Ex-Taq作为DNA聚合酶以及热循环机来完成全部的聚合酶链式反应。对所述的聚合酶链式反应产物进行测序，并且对所述的侧面基因组序列进行识别。所述的四个35S增强子被插入到5kb的基因间隔区内，所述的基因间隔区位于染色体5上的基因组AtMYB68(AT5G65790)的3’端的下游。Northern分析以及实时聚合酶链式反应表明：相对于野生型而言，在h138中引发的MYB68的表达超过野生型的2倍。

实施例3：h138突变体(myb68)的生理学特征

对植物在开花过程中的热耐受性进行评价，并且根据所述败育的花朵或者结荚的数量以及最终的种子产量进行打分。植物在受到控制的环境腔室中进行生长，其中最佳的生长条件为进行16小时200uE的光照以及8小时的黑暗，22℃以及70％的相对湿度。在所述的试验设计中使用到三组植物：1)在最佳条件下进行生长的对照组；2)进行3小时热处理的组以及3)进行4小时热处理的组。在第一次开花之后进行6天的热处理并且在1小时的时间内将所述的温度从22℃梯度上升至44℃。每组植物含有所述的myb68突变体以及所述突变体的野生型对照(myb68-空白)，每个品目(entry)每种处理进行10个复制锅(replicatepots)，每个锅(pot)中含有5种植物。在进行了所述的热胁迫处理的一周之后对植物的花朵败育进行评价，之后使其在最佳条件下进行生长直至成熟。对全部三组植物中的每个锅的最终的种子产量进行确定。

在经过热胁迫之后，在所述的3小时(25％)以及4小时(17％)胁迫处理组中，所述的myb68的种子产量均低于所述的myb68-空白对照，然而这种差异仅仅在所述的3小时处理组中是统计学显著的。所述的3小时处理导致所述的败育结荚相对于myb68-空白而言具有了32％的减少并且所述的最终种子产量相对于在最佳条件下进行生长的myb68植物而言增加了16％。所述的4小时处理同样导致了种子的产量相对于最佳生长的myb68植物而言具有了16％的增加。与之相反的是，所述的myb68-空白在种子的产量上相对于最佳生长的植物而言表现出15％以及23％的降低。相对于所述的野生型而言，由所述的myb68突变体提供的全部的产量保护为31％以及39％。其他的试验得出了在5％至44％的范围内的产量保护的结果，所述的结果取决于所述的试验条件。

实施例4：用于进行包括MYB68在内的MYB-亚群14序列的表达的构建体

根据下文中所描述的方法，可以使用适宜的启动子以及本发明中所述的MYB基因制备表达载体构建体。例如由具有下述序列识别号的序列所描述的任何的基因序列，所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。这样的载体构建体能够有效的用于制备MYB68基因，与一种能够在植物细胞中发挥启动子功能的序列进行可操作性的连接并且可操作性的表达所述的基因以及由所述的基因编码的蛋白。

按照下文中的描述，在组成型启动子或者条件性启动子的常规控制下，可以对过表达MYB68的载体进行构建。所述的编码一种MYB68开放阅读框的序列与下述启动子的启动子序列进行了可操作性的连接：35S花椰菜花叶病毒(CaMV)组成型启动子，P18.2或者P81.1热诱导启动子及其内源性PMYB68启动子。除此之外，在pEGAD载体骨架中，所述的MYB68基因组序列在所述的35S花椰菜花叶病毒组成型启动子之后进行了克隆。

35S-基因组AtMYB68(存在于pEGAD载体之中)(35S-gAtMYB68)

利用聚合酶链式反应(PCR)对1.4kb的MYB68基因组DNA进行扩增，其中所述的MYB68基因组DNA中包含83bps的3’非翻译区(UTR)，其中所述的扩增中使用下述引物：MYB68FW-BamH3(5’-AAAGGATCCATGGGAAGAGCACCGTGTTG-3’)(SEQ ID NO：300)以及MYB68RV-BamH4(5’-AAAGGATCCCCACTCCCTAAAGACACAGATTT-3’)(SEQ ID NO：301)，并且此后利用BamHI进行消化。将上述得到的DNA片段与pBluescript II SK(+/-)进行连结，并且随后在相同的位点处在pEGAD中进行亚克隆，从而获得存在于pEGAD中的35S-基因组AtMYB68(35S-gAtMYB68)。

35S-AtMYB68，35S-AtMYB84，35S-AtMYB36，35S-AtMYB37，35S-AtMYB38，35S-AtMYB87

与AtMYB68一同，AtMYB84(At3g49690)，AtMYB36(At5g57620)，AtMYB37(At5g23000)，拟南芥MY B38(At2g36890)以及AtMYB87(At4g37780)被划分为所述的MYB-亚群14家族中的成员(参见Stracke等人于2001年发表的文章)，因此它们的功能可能是多余的。这些MYB基因在拟南芥中发生过表达，从而检验它们作为AtMYB68的直系同源基因在热耐受性方面的功能性。利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对所述的cDNA序列进行扩增，并且在不带有葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的pBI121中进行克隆，从而生成35S-AtMYB84、35S-AtMYB36、35S-AtMYB37、35S-AtMYB38以及35S-AtMYB87的构建体。

通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)制备一种1.1kb的AtMYB68cDNA，其中使用了下述引物：HG2F(5’-AAATCTAGAATGGGAAGAGCACCGTGTT-3’)(SEQ ID NO：302)以及HG2R(5’-AAAGGATCCTTACACATGATTTGGCGCAT-3’)(SEQ ID NO：303)，并且利用XbaI以及BamHI进行消化。将上述得到的DNA片段在pBluescript II SK(+/-)中进行克隆，并且随后在不带有葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的pBI121中进行克隆，从而生成35S-MYB68。不带有葡萄糖醛酸酶基因的pBI121是通过下述方法获得的：利用SmaI以及EcolcR1进行双重消化，并且随后所述的剩余载体进行自身的连结。

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB84(933bp，AtMYB84，At3g49690)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的690M84-Xba-FW上游引物(5’-acgtTCTA GAATG GGA AGA GCA CCG TGT TG-3’)(SEQ ID NO：273)以及含有一个BamHI位点的690M84-Bam-Re下游引物(5’-atcg GGATCC TTA AAA AAA TTG CTT TGA ATC AGA ATA-3’)(SEQ ID NO：274)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，生成35S-AtMYB84的构建体。

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB36(1002bp，AtMYB36，At5g57620)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的M36-Xb-FW上游引物(5’-actgTCTAGA ATG GGA AGA GCT CCA TGC TG-3’)(SEQ ID NO：304)以及含有一个BamHI位点的M36-Bm-Re下游引物(5’-cagt GGATCC TTA AAC ACT GTG GTA GCT CAT C-3’)(SEQ ID NO：305)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，生成35S-AtMYB36的构建体。

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB37(990bp，AtMYB37，At5g23000)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的AM37-Xb-FW上游引物(5’-actgTCTAG AATG GGA AGA GCT CCG TGT TG-3’)(SEQ ID NO：306)以及含有一个BamHI位点的AM37-Bm-Re下游引物(5’-acgt GGATC CTA GGA GTA GAA ATA GGG CAA G-3’)(SEQ ID NO：307)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，生成35S-AtMYB37的构建体。

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB38(897bp，AtMYB38，At2g36890)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的AM38-Xb-FW上游引物(5’-actgTCTAGA ATG GGT AGG GCT CCA TGT TGT-3’)(SEQ ID NO：308)以及含有一个BamHI位点的AM38-Bm-Re下游引物(5’-acgt GGATCC TCA GTA GTA CAA CAT GAA CTT ATC-3’)(SEQ IDNO：309)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，生成35S-AtMYB38的构建体。

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB87(918bp，AtMYB87，At4g37780)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的M87-Xb-FW上游引物(5’-aaaaTCTAGA ATG GGA AGA GCA CCG TGC-3’)(SEQ ID NO：310)以及含有一个Bgl2位点的M87-Bg-Re下游引物(5’-aaaa AGATCT CTA CTC ATT ATC GTA TAG AGG-3’)(SEQ ID NO：311)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，生成35S-AtMYB87的构建体。

P18.2-MYB68，以及P81.1-MYB68

所述的构建包括四个步骤：1)通过聚合酶链式反应对869bp的热休克蛋白(Hsp)18.2启动子以及406bp的热休克蛋白(Hsp)81.1启动子进行扩增，其中分别使用到下述引物组：HP1F(SEQ ID NO：277)与HP1R(SEQ ID NO：278)，以及HP2F(SEQ ID NO：279)与HP2R(SEQID NO：280)，并且利用SalI以及XbaI进行消化。将上述得到的DNA片段在相同的位点处在pBI101中进行克隆，从而生成所述的新的载体：P18.2pBI101以及P81.1pBI101；2)在XbaI位点以及SmaI位点处，在所述的新的载体中进行MCS2-寡核苷酸(MCS2-oligo)(包括下述限制性位点：XbaI，HpaI，AgeI，KpnI，XhoI，ScaI，SpeI，SalI，BamHI以及SmaI)的克隆。将上述得到的载体命名为P18.2pBI101MCS以及P81.1pBI101MCS；3)通过利用SmaI以及EcolcR1的双重消化以及随后的剩余载体的自身连结，除去所述的葡萄糖醛酸酶(GUS)基因，从而获得不带有葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的P18.2pBI101MCS载体以及不带有葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的P81.1pBI101MCS载体；4)在XbaI位点以及BamHI位点处，将所述的1.1kb的MYB68cDNA片段连结在所述的两个最新的载体之中，从而为P18.2-MYB68完成了不带有葡萄糖醛酸酶基因的P18.2pBI101MCS的构建，并且为P81.1-MYB68完成了不带有葡萄糖醛酸酶基因的P81.1MCSpBI12的构建。

pHSP81.1-AtMYB68

利用XbaI以及BamHI进行限制性消化来分离所述的AtMYB68的编码序列，并且将其在pHSP81.1的XbaI-BamHI位点处进行克隆，其中所述的XbaI以及BamHI来自于质粒pHSP18.2-AtMYB68。

pHPR-AtMYB68

利用聚合酶链式反应从拟南芥基因组DNA中对所述的拟南芥羟基丙酮酸还原酶基因(HPR，At1g68010)的启动子序列(-1至-506bp，相对于ATG起始密码子而言)进行扩增，其中所述的扩增使用到下述引物：含有一个Sal I位点的上游引物(HPR-Sal-FW，acgt gtcgacGAAGCAGCAGAAGCCTTGAT)(SEQ ID NO：312)以及含有一个Xba I位点的下游引物(HPR-Xb-R2，acgt tctaga GGT AGA GAA AAG AGA aag cct c)(SEQ ID NO：313)。将上述经过消化的片段在所述的载体pHSP81.1-AtMYB68中进行克隆，其中所述的pHSP81.1-AtMYB68载体利用SalI以及XbaI进行了预先消化，从而除去了所述的热休克蛋白(HSP)81.1启动子。这样生成了一个重组质粒，其中所述的羟基丙酮酸还原酶基因(HPR)启动子位于AtMYB68的位置之前。

PMYB68-AtMYB68

通过聚合酶链式反应对所述的AtMYB68启动子(从-1至-1034，相对于所述的MYB68ATG起始密码子而言)进行扩增，所述的扩增中使用下述引物：Pm-68-H3-FW(SEQ IDNO：275)以及Pm68-Av-Xh-Re(SEQ ID NO：276)，并且利用下述限制酶进行消化：HindIII以及XhoI。将上述得到的启动子片段在相同的位点处在不带有葡萄糖醛酸酶基因的P81.1MCSpBI121中进行克隆，从而替代所述的热休克蛋白(Hsp)81.1启动子。之后将这种载体命名为PMYB68pBI121，并且将其用于在AvrII位点以及BamHI位点处进行AtMYB68cDNA(1.1kb)的进一步克隆，从而获得PMYB68-AtMYB68。从所述的质粒18.2-MYB68中回收所述的MYB cDNA的AvrII-BamHI片段。

pM68-AtMYB84

通过逆转录-聚合酶链式反应对AtMYB84(933bp，AtMYB84，At3g49690)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的690M84-Xba-FW上游引物(5’-acgtTCTAGA ATG GGA AGA GCA CCG TGT TG-3’)(SEQ ID NO：273)以及含有一个BamHI位点的690M84-Bam-Re下游引物(5’-atcg GGATCC TTA AAA AAA TTG CTT TGA ATC AGA ATA-3’)(SEQ ID NO：274)。将所述的聚合酶链式反应产物在pB-Pm68的AvRII-BamHI位点处进行克隆，在所述的AtMYB68启动子的控制下生成AtMYB84的构建体。

pM68-AtMYB36

通过逆转录-聚合酶链式反应从年幼的拟南芥幼苗(叶片以及根部)中分离出的RNA中对AtMYB36(1002bp，At5g57620)的编码序列进行扩增，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的M36-Xb-FW上游引物(5’-actg TCTAGA ATG GGA AGA GCT CCA TGC TG-3’)(SEQ ID NO：305)以及含有一个BamHI位点的M36-Bm-Re下游引物(5’-cagt GGATCC TTAAAC ACT GTG GTA GCT CAT C-3’)(SEQ ID NO：306)。将所述的聚合酶链式反应产物在如上所述的pBI-Pm68的AvRII位点以及BamHI位点处进行克隆。这样一来，在所述的AtMYB68启动子的控制下生成了AtMYB36的构建体。

35S-水稻MYB36(35S-OsMYB36)

水稻MYB36cDNA同系物：利用逆转录-聚合酶链式反应从水稻根部RNA中对水稻MYB36基因的编码序列(966bp)进行扩增，其中所述的水稻MYB36基因的编码序列编码一种被识别为序列识别号10的蛋白，在所述的扩增中使用了下述引物：含有一个XbaI位点的rM-Xb-FW2上游引物(5’-acgt TCTAGA ATG GGG AGA GCG CCG TGC TG-3’)(SEQ ID NO：314)以及含有一个BamH I位点的rM-Bm-Re2下游引物(5’-tgca GGATCC CTA CTG CAT CCC GAGGTC AG CT-3’)(SEQ ID NO：315)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，从而生成35S-水稻MYB36的构建体。

35S-基因组水稻MYB36(35S-gOsMYB36)

水稻MYB基因组同系物克隆：利用与如上所述的相同的引物：rM-Xb-FW2上游引物(SEQ ID NO：314)以及rM-Bm-Re2下游引物(SEQ ID NO：315)，对所述的水稻MYB36基因的基因组序列(SEQ ID NO：265)进行扩增(1259bp)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，从而生成35S-基因组水稻MYB36的构建体。

35S-大豆MYB84(35S-GmMYB84)

所述的大豆MYB161是AtMYB84的同系物。这里所述的术语“大豆MYB84”可以与大豆MYB161进行互换使用。利用逆转录-聚合酶链式反应从大豆根部RNA中进行所述的1068bp的大豆MYB161编码序列的克隆，其中使用到下述引物：含有一个XbaI位点的soybM-Xba-FW2上游引物(5’-acgt TCTAGA ATG GGG AGG GCA CCT TGC T-3’)(SEQ ID NO：316)以及含有一个BamHI位点的soybM-Bm-Re下游引物(5’-acgt GGATC CTA TTG CGC CCC CGG GTA G-3’)(SEQ ID NO：317)。将所述的聚合酶链式反应产物在pBI121的XbaI-BamHI位点处进行克隆，从而生成35S-大豆MYB84的构建体。

35S-玉米MYB36(35S-ZmMYB36)

利用聚合酶链式反应对所述的玉米MYB36cDNA(SEQ ID NO：261)进行扩增，其中使用了下述引物：ZmYYBFW-XbaI(5’-aaatctagaATGGGGAGAGCTCCGTGCTGCGACA-3’)(SEQ IDNO：318)以及ZmMYBRV-BamHI2(5’-aaaggatccCTACTTCATCCCAAGGTTTCCTGGC-3’)(SEQ IDNO：319)。利用XbaI以及BamHI对所述的DNA片段进行消化并且随后在同样的位点处与pBluescript II SK(+/-)进行连结，并且之后在所述的pBI121的相同位点处进行亚克隆，从而替代葡萄糖醛酸酶基因(GUS)。

35S-棉花MYB68(35S-GhMYB68或者35S-CotMYB68)

利用聚合酶链式反应对所述的棉花MYB68cDNA进行扩增，其中使用了下述引物：CotM-Xb-Fw(5’-acgt TCTAGA ATG GGG AGA GCT CCT TGT TG-3’)(SEQ ID NO：320)以及CotM-BmRe(5’-acgt GGATCC CTA TTG CGC TCC TCC TGG G-3’)(SEQ ID NO：321)。利用XbaI以及BamHI对所述的DNA片段进行消化。将其在同样的位点处与pBluescript II SK(+)进行连结，并且之后在所述的pBI121的相同位点处进行亚克隆，从而替代葡萄糖醛酸酶基因(GUS)。

35S-油菜MYB68r(35S-BnMYB68r)

利用聚合酶链式反应对所述的油菜根部MYB68cDNA进行扩增，其中使用了下述引物：Bn68root-Fw-XbaI(5’-aaatctagaATGGGAAGAGCACCGTGTTGTGATAAGGCC-3’)(SEQ ID NO：322)以及Bn68root-RV-BamHI(5’-aaaggatcc TTACACATTATTTGGCCCATTGAAGTATCTTGC-3’)(SEQ ID NO：323)。利用XbaI以及BamHI对所述的DNA片段进行消化。将其在同样的位点处与pBluescript II SK(+)进行连结。之后将上述片段在所述的pBI121的相同位点处进行亚克隆，从而替代葡萄糖醛酸酶基因(GUS)。

35S-油菜MYB68b(35S-BnMYB68b)

利用聚合酶链式反应对所述的油菜蓓蕾的MYB68cDNA进行扩增，其中使用了下述引物：Bn68Bud-Fw-XbaI(5’-aaatctagaATGGGAAGAGCACCGTGTTGTGACAAGGCT-3’)(SEQ IDNO：324)以及Bn68Bud-RV-BamHI(5’-aaaggatcc TTACAAATGATTTGCCCCATTGAAGTAACTTGC-3’)(SEQ ID NO：325)。利用XbaI以及BamHI对所述的DNA片段进行消化。将其在同样的位点处与pBluescript II SK(+)进行连结。之后将上述片段在所述的pBI121的相同位点处进行亚克隆，从而替代葡萄糖醛酸酶基因(GUS)。

下面的表格2描述的是在制备如上所述的载体构建体中所使用到的寡核苷酸引物，以及能够有效的用于克隆AtMYB同系物的其他的引物。

表格2：用于进行AtMYB68同系物的克隆而合成的寡核苷酸引物

注释：

1.FW：带有基因特异性序列的上游引物，其中所述的基因特异性序列是从所述的ATG起始密码子开始的。

2.Re：带有基因特异性序列的下游引物，其中所述的基因特异性序列是从所述的终止密码子开始的。

3.用下划线表示在所述的5’端的限制性位点。

可以将本发明所述的表达载体构建体导入到拟南芥、所述的起源植物或者所选择的任何物种之中。例如一个AtMYB基因可以在芸薹属物种中进行过表达，或者可以选择的在大豆、玉米、水稻或者棉花物种中进行过表达。

实施例5：MY B68的氨基酸序列分析

下面的表格提供了对于来自于不同的植物物种的MYB基因家族的氨基酸序列的比较，其中为进行多重序列的比对以及氨基酸序列的分析而进行了不同的设置。注释：在针对不同的植物物种的所述文献以及数据库中使用不同的MYB命名以及编号体系。

在下面的表格中，(*)表示根据肽序列的比对对所述预测的开放阅读框(ORF)基因组DNA序列进行编辑，从而生成一个推定的编码序列序列。所述的(P)标识表示的是一个部分的序列。利用ClustalW在http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/.上对序列的同源性以及多重序列的比对进行比较。

表格3：

表格4：来自于各种不同作物/物种的AtMYB68同系物

在上述的表格4当中，利用ClustalW在http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/上对序列的同源性以及多重序列的比对进行比较，其中使用到下述的参数设定：

矩阵(Matrix)：Gonnet 250

开放的缺口(GAP OPEN)：10.0

末端缺口(END GAPS)：-1

缺口的延伸(GAP EXTENSION)：0.2

缺口的距离(GAP DISTANCES)：4

表格5：来自于各种不同作物/物种的AtMYB68同系物

在上述的表格5当中，利用ClustalW在http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/上对序列的同源性以及多重序列的比对进行比较，其中使用到下述的参数设定：

矩阵(Matrix)：蛋白：Gonnet 250

开放的缺口(GAP OPEN)：DNA：15.0蛋白：10.0

末端缺口(END GAPS)：-1

缺口的延伸(GAP EXTENSION)：DNA：6.66蛋白：0.2

缺口的距离(GAP DISTANCES)：4

实施例6：35S-MYB68表达品系的生理学特征

在一个转基因品系群体中，将存在一种表达水平以及生理学应答的分级。在某种程度上，所述的变化的分级是所述的基因构建体的整合位点以及在这一位点上进行的基因表达的局部环境的结果。因此，为了筛选出具有最佳表现的品系，必须对品系进行筛选以及评价。这种方法对于本领域技术人员而言是一种常规的方法。

在一项热与花朵败育试验中，对表达一种35S-MYB68表达构建体的纯合品系进行了评价。所述的试验方案包括每个品系的8个复制植物，每个3尺的锅(3’pot)中含有1个植物，并且使其在一个受到控制的环境腔室(18小时200uE的光照，6小时的黑暗，22℃，70％的相对湿度)中在最佳条件下进行生长。在最初的开花出现之后的三天，将植物在42℃的热休克条件下暴露1小时，并且将其送回至最佳条件下进一步生长7天。对植物的主茎上的花朵败育情况进行评价。对品系进行识别，其中被识别出的品系与野生型对照相比，其表现出的花朵败育率减少了34％至60％。

对九种独立的35S-MYB68转基因品系的种子产量以及产量保护进行确定，其中使用相对于野生型的百分数进行表达。所述的试验方案在每个3尺的锅(pot)中包括3个植物，所述的植物在如上所述的条件下进行生长，每个品系含有22个复制体。在最初的开花出现之后的三天，将每个品系中的12个复制体在45℃下的热胁迫条件下暴露3小时，其中所述的温度是在1小时的时间里由22℃梯度上升为45℃的。三天之后，将上述的热胁迫再施加一次。使每个品系中的剩余10个复制体植物在它们的全部生命周期中被维持在最佳条件下进行生长。对于上述全部植物的最终种子产量进行确定。由于上述施加的热胁迫，野生型植物在产量上表现出40％的下降，而转基因品系由于热胁迫的原因尽管也具有下降的产量，但所述的下降程度较轻，形成了10％至12％的产量保护。

对筛选出的品系进行再次评价并且按照下述方式进行胁迫。将植物暴露于1小时的温度梯度上升阶段，从22℃上升至45℃，并且使45℃的热胁迫保持1.5至1.8小时。在连续的五天时间里每天施加热胁迫，在此之后进行五天的恢复阶段并且之后进行第六次的热处理。上述的热处理导致野生型(WT)植物在产量上发生了11％的下降，而在四种转基因品系中观察到在2％至17％范围内的产量的增加。正如表格6中所示，在接受了所述的热胁迫之后，相对于野生型而言，六种转基因品系(68，80，93，73，83，30)表现出了产量保护。这种保护在3％至31％的范围内。这些转基因品系中的两种(30以及73)已经在先前的试验中表现出了产量的保护，而两种品系(93以及83)表现出了花朵败育的减少。

表格6：

表达所述的PMYB68-AtMYB68构建体的拟南芥(Arabidopsis)品系的特征

在一项花朵败育试验中，对T3世代的十四种纯合的转基因品系进行了评价。使植物(每个品目针对十四个复制体)在2.25尺的锅(pots)中在最佳条件下(18小时的光照，200uE，22℃，60％的相对湿度)进行生长，直至距离第一次开花有三天的时间。在这一时间点处将植物暴露于43℃下进行1小时的处理。在所述的热处理过后，将植物送回至最佳条件下继续进行7天的生长。在这一时间点处，通过对存在于被暴露于上述的热胁迫中的所述区域内的败育结荚(pod)以及被损伤的(变短的)结荚(pod)进行计算，从而对上述的热处理对于结荚的形成所产生的影响进行评价。与对照组(野生型-哥伦比亚以及所述的空白-n11-8)相比，六种转基因品系在被损伤的结荚的总数量上表现出了减少(参见下面的表格7)。所述最佳的品系仅仅表现出了对照组的热损伤的70％。在这里进行检查的两种转基因品系在所述的T2阶段的筛选中同样表现出了减少的花朵败育。所述的被作为一种阳性对照而包括在内的myb68突变体同样在被损伤的结荚总数量上表现出了减少，这种减少是与所述的myb68突变体的分离的空白对照(myb68-空白)相比较而言的。

表格7：

实施例7：对表达MYB68的转基因植物进行的生理学评价

AtMYB68突变体表现出干旱耐受性

使每个3尺的锅(pot)中的五个植物在生长腔室中在16小时的光照(180uE)、22℃、70％的相对湿度(RH)的最佳条件下进行生长，直至第一次开花，其中每个品目中针对6个复制体。开始进行干旱处理，对所有锅中的水的量进行平衡并且停止浇水。通过对所述的锅进行称重从而每天测量水分的损失。对土壤的水分含量(SWC)进行计算，用初始的％来表示。在所述的干旱处理的第0天、第2天以及第4天对植物进行收集。对相对于所述植物的嫩枝干重而言的水分损失进行计算。在经历了所述的干旱处理之后，所述的myb68植物比对照组表现出了具有更高的土壤水分含量的趋势。嫩枝的重量没有差别或者比对照组的重量稍重一些。与对照组相比，所述的myb68突变体具有的两天里的水分损失与第二天的嫩枝干重的比例较低，这表明其具有干旱耐受性的趋势。

表格8：在干旱处理的时间里的土壤水分含量(初始的％)以及相对于第二天的嫩枝干重而言在两天时间里的水分损失

myb68突变体以及35S-基因组MYB68以及35S-MYB68拟南芥转基因品系在出苗阶段表现出对于盐的耐受性

将种子进行灭菌并且将其放置于琼脂平板之上，在所述的琼脂平板上带有1/2的MS生长培养基，所述的MS生长培养基中含有盐(200毫摩氯化钠)或者不含盐(最佳平板)，每个品目(entry)中具有6个平板并且每个平板上具有30个种子。在4℃下放置3天之后，将平板放置于所述的生长室中，在22℃、以及18小时的光照(100uE)下生长16天。经过7天之后，对平板中的萌芽状况进行打分，并且再经过9天之后对漂白的出苗状况进行打分(表示胁迫的白色幼苗％)。在最佳平板以及盐平板上，没有发现对照组以及转基因品系或者所述的突变体在萌芽状况中存在差别。但是在被暴露于盐中16天之后，幼苗通过被漂白而表现出胁迫的迹象。结果表明所述的myb68突变体以及所述的转基因35S-MYB68表达品系具有更少的漂白苗，这代表着对于盐胁迫具有较低的敏感性。

表格9：在含有琼脂的200毫摩氯化钠以及1/2MS平板中进行16天的培养之后对被漂白的幼苗的打分(白色幼苗％)

MYB68在拟南芥中的组成型表达引发了热胁迫之后的产量保护

使所述的35S-Myb68拟南芥植物在3尺的锅(pot)中进行生长，每个锅中装有3个植物，并且每次最佳处理是针对10个复制体进行的，而每次热处理是针对12个复制体进行的。让所有的植物在最佳条件下进行生长直至开花进行两天。在这一时间点上使最佳植物仍然保留在最佳条件下(22℃，18小时200uE的光照，70％的相对湿度)并且每天向所述的测试组施加一次热处理，其中所述的热处理是：在1小时的梯度时间里将温度由22℃升高至45℃并且将这一温度保持1.5至2.5小时，所述的热处理连续进行五天。使植物恢复两天的时间，在此期间不对其施加胁迫，在此之后再次施加三天的胁迫(共计八天的热处理)。在所述的热处理之后，将植物与所述的最佳组一同维持在最佳条件下直至成熟，并且对两个组的最终种子产量进行确定。所述的结果表明，四种35S-Myb68转基因品系(22-7，20-11，35-1以及8-6)在经过了所述的热胁迫处理之后表现出产量的保护，相对于对照组而言，所述的产量保护在8％至21％的范围之内。

表格10：每个锅(pot)中的种子产量，所述的种子产量来自于如上所述的在最佳条件下生长的植物以及在热胁迫条件下生长的植物。通过在经过所述的热胁迫之后所述的种子产量间的差异计算出产量保护，并且将其表示为转基因品系以及对照组中的最佳情形的百分数(％)。

实施例8：对AtMYB-亚群14序列及其来自于其他物种的同系物所具有的制备所述 的目标表现型例如热耐受性表现型的功能的确认

油菜MYB68在拟南芥中的组成型表达引发了热胁迫之后的减少的花朵败育

从芸薹属(Brassica)中识别出两个高度相关的Myb68序列。它们的表达类型的不同之处在于：其中一个主要在所述的根部中进行表达(SEQ ID NO：54)，另外一个主要在花蕾中进行表达(SEQ ID NO：56)。对含有能够表达任意的所述油菜Myb68的构建体的植物进行生产以及评价。使植物在2.25尺的锅(每锅一个植物)中、在最佳条件下(22℃，50％的相对湿度，17小时200uE的光照)进行生长，直至距离第一次开花三天的时间。将植物从22℃下转移至43℃下并保持2小时-2.5小时(参见下面的表格)。在经过这种热胁迫之后，将植物送回至22℃的最佳条件下保持一周。在经过所述的热胁迫一周之后，对败育花朵的数量进行计算。与对照组(空白)相比，35S-油菜Myb68(根)构建体的转基因品系表现出较少的败育蓓蕾。在经过热胁迫之后，与对照组(空白品系)相比，两个35S-油菜Myb68(蓓蕾)构建体的转基因品系表现出减少的花朵败育。

表格11：在经历过43℃下的2小时热胁迫之后，败育花朵的数量——35S-油菜MYB68(根)

表格12：在经历过43℃下的2.5小时热胁迫之后，败育花朵的数量——35S-油菜MYB68(蓓蕾)

大豆MYB84或者AtMYB84或者AtMYB36在拟南芥中的组成型表达引发了热胁迫之后的减少的花朵败育

制备大豆-Myb84(GmMyb84)或者AtMYB84(AtMyb84)或者AtMYB36(AtMyb36)的过表达构建体，并且将所述的过表达构建体转化至拟南芥植物中，已经对所述的Myb-亚群14同系物产生热耐受性的功能进行了证实，所述的功能是通过在热胁迫下发生的减少的花朵败育来证明的。制备转基因植物并且所述的T2世代被用来进行热耐受性的初始筛选。随后，T3纯合转基因植物被用来进行详细的生理学评价以及对初始结果的证实。

将所述的T2种子放置于0.5倍的MS琼脂平板上，所述的平板上含有维生素(每个平板上一层)。每个测试组中包括一个阳性对照，所述的初始的热耐受性突变体myb68，以及一个相应的野生型。在萌芽之后的第十天将幼苗移植到土壤中。在早期的开花阶段，将植物放置于一个45℃下的加热腔室中(湿度65％)，保持24-30分钟。之后将所述的植物放回到所述的具有正常的生长条件(17小时的光照/7小时的黑暗，200uE，22℃，湿度70％)的生长室中。在第三十二天对植物进行检查并且对败育的长角(silique)、部分败育的长角、坏死的分生组织或者正常的长角进行打分。如果绝大部分的野生型植物出现了显著的花朵败育，则表明热胁迫确实发挥了作用。利用逆转录-聚合酶链式反应对转基因品系的基因表达进行评价并且证明其具有提升的表达水平。

使用Myb-亚群14序列的同系物制备构建体以及转基因植物，并且所述的构建体以及转基因植物提升了热耐受性，其中所述的Myb-亚群14序列的同系物来自于目标作物物种，例如，水稻，玉米，小麦，大豆以及棉花。

表格13：

构建体	作为％对照的花朵败育
		35S-油菜MYB68-蓓蕾	84
35S-油菜MYB68-根	82
		35S-玉米MYB84	58
35S-AtMYB84	77
		35S-AtMYB36	81

这个实施例证明，拟南芥可以被用来作为一种模型系统，用来评价以及提供构象，Myb-亚群14序列能够提供热耐受性并且从其他的植物物种中识别出来的这一序列能够在拟南芥中发挥功效。

表达35S-AtMYB36构建体的拟南芥品系的特征

在一项花朵败育试验中，对T3世代的十五种纯合的转基因品系进行了评价。使植物(每个品目针对十四个复制体)在2.25尺的锅(pots)中在最佳条件下(18小时的光照，200uE，22℃，60％的相对湿度)进行生长，直至距离第一次开花有四天的时间。在这一时间点处将植物暴露于43℃下进行1小时的处理。在所述的热处理过后，将植物送回至最佳条件下继续进行7天的生长。在这一时间点处，通过对存在于被暴露于上述的热胁迫中的所述区域内的败育结荚(pod)以及被损伤的(变短的)结荚(pod)进行计算，从而对上述的热处理对于结荚的形成所产生的影响进行评价。与对照组(野生型-哥伦比亚以及所述的空白-n77-4)相比，九种转基因品系在被损伤的结荚的总数量上表现出了减少(参见下面的表格7)。在这里进行检查的三种品系在所述的T2阶段的筛选中同样表现出了减少的花朵败育。所述的被作为一种阳性对照而包括在内的myb68突变体同样在被损伤的结荚总数量上表现出了减少，这种减少是与所述的myb68突变体的分离的空白对照(myb68-空白)相比较而言的。

表格14：

AtMYB68在油菜(Brassica napus)中的组成型表达或者诱导型表达表现出了热胁迫之后的减少的花朵败育

在生长腔室的环境下，对于含有AtMYB68基因序列的五种转基因品系的热胁迫耐受性进行评价，其中所述的转基因品系受到了组成型启动子或者热诱导型启动子的控制。这些品系处于所述的T2阶段并且是杂合的，除了所述的01-105G-1-E品系之外。相比较于在纯合品系中完成的分析而言，对于杂合品系进行的同样的分析通常会产生更大的变化。然而，早期的分析允许对所述的衍生的纯合品系进行筛选以及随后的分析。分离的空白以及所述的母本DH12075作为对照被包括在内。所述的试验被编排为一种裂区设计，其中利用温度作为主要因素并且利用转基因品系作为次要因素。使所述的植物在15厘米的塑料锅中进行生长，在所述的塑料锅中装有“Sunshine Mix#3”，所述的植物接受到大约500微摩/平方米秒的光合有效辐射，所述的辐射作用于所述的作物冠层的顶端。进行分子分析从而确认转基因的存在。在所述的测试中包括两组植物：一组在其全部的生长时期内均在最佳条件(22℃/18℃的日/夜温度，16小时的光周期)下进行生长，而所述的第二组每天经受5小时的31℃下的热胁迫(从18℃梯度上升至31℃，之后下降回18℃)。在所述的第一次开花之后的第三天开始进行热胁迫条件的处理并且在此之后持续七天的时间。之后将所述的热胁迫植物送回至最佳条件下直至其成熟。在所述的热胁迫周期开始的时候以及结束的时候对所述的胁迫植物的所有的总状花序进行标记，用以指明哪些花朵经受了热胁迫。对于存在于所述被标记的总状花序之上的存活的结荚以及败育的结荚进行计算，并且通过热胁迫条件下败育的结荚与败育的结荚加上存活的结荚的总数的比值来计算所述的结荚败育率，以百分数来表示。在收获之后确定种子的产量。

在这些不同的品系之间，在花朵败育上存在着显著的差异，与所述的母本品系相比，两种35S-Myb68品系在经过热胁迫之后表现出显著降低的败育率。与其分离的空白(48％)以及DH12075(61％)相比，品系02-104G-4-A具有显著降低的败育率(33％)。品系02-104G-3-K的败育率(47％)同样显著的低于所述的分离的空白(66％)以及DH12075的败育率。与其分离的空白(58％)以及所述的母本对照相比，所述的纯合品系(01-105G-1-E)具有些微降低的败育率(53％)。在一个转基因品系群体中，将存在一种表达水平以及生理学应答的分级。在某种程度上，所述的变化的分级是所述的基因构建体的整合位点以及在这一位点上进行的基因表达的局部环境的结果。这种分级是可以预期的并且因此，为了筛选出具有最佳表现的品系，必须对品系进行筛选以及评价。这种方法对于本领域技术人员而言是一种常规的方法。

在上述的受试品系间存在着种子产量的差异。所述的三种转基因品系02-104G-3-K、02-104G-4-A以及01-105G-1-E的产量与所述的母本品系的产量相似，然而与其自身的空白(null)相比，所述的三种品系在种子产量上表现出了10％至22％的增长。与所述的DH12075母本相比，两种转基因品系(02-33H-1-V以及01-105G-3-G)呈现出的表现不佳，然而与适宜的空白(null)相比，一种品系则显著的较低。由于这些品系的接合性，这样的差异度是未预料到的。

在存在于热胁迫条件下的每个总状花序的种子的数量方面发现了类似的趋势。与所述的母本品系相比，品系02-104G-3-K、02-104G-4-A以及01-105G-1-E在每个总状花序上具有些许增加的种子数量，但是其他的转基因品系(02-33H-1-V以及01-105G-3-G)在每个总状花序上具有显著减少的种子数量。在上述的受试品系间，在100粒种子的重量上不存在显著的差异。

概括的说，在开花期间施加的热胁迫过程中，表达所述的AtMYB68基因的两种转基因品系证明了其对于花朵败育产生了显著的保护。除此之外，三种转基因品系表现出了一种种子产量增加的趋势。

表格15：

实施例9：MYB-亚群14序列及其同系物的识别

识别AtMYB序列的方法、将MYB序列划分成指定的亚群的方法以及识别MYB-亚群14序列的方法在Stracke等人于2001年发表的文章中以及在Kranz等人于1998年发表的文章中进行了进一步的描述。MYB-亚群14序列已经被定义为一种核苷酸序列或者一种蛋白序列，其中包括拟南芥，这样的特征在本发明中也有所描述。所述的MYB-亚群14是一种R2R3MYB序列，所述的序列额外包括一种保守的基序，所述的基序是通过下述的形式来进行描述的。

所述的一般模式(SEQ ID NO：266)提供了一种序列，所述的序列可以被用来识别一种备选的MYB-亚群14序列。在某些位置处，对于所述给定的位置而言，允许存在多个氨基酸残基。在允许存在多个氨基酸的情况下，将所述任选的残基在方括号内进行表示。当一种R2R3MYB蛋白序列能够与所述的一般模式相互匹配(fit)时，所述的蛋白序列可能是一个MYB-亚群14序列。一个MYB-亚群14序列可能不完全等同于所述的一般模式，例如它可以是90％、95％或者99％等同的。

如果一个备选的MYB-亚群14序列与所述的一般模式相互匹配，并且其进一步的包括一种与所述的排他模式(SEQ ID NO：267)之间的匹配，那么所述的序列是一种被包括在内的有力的备选者，成为一个MYB-亚群14序列。所述的排他序列(SEQ ID NO：267)定义了氨基酸的类型，这些氨基酸存在于MYB-亚群14序列中但是可能与其他的R2R3MYB蛋白产生不同。所述的排他模式在一种MYB蛋白中的出现是一种有力的指示，表明所述的MYB是所述的MYB-亚群14家族中的一个成员。

如果一个备选的MYB-亚群14序列与所述的一般模式相互匹配，并且其进一步的包括一种与所述的绝对模式(SEQ ID NO：268)之间的匹配，那么所述的序列是一种被包括在内的有力的备选者，成为一个MYB-亚群14序列。所述的绝对模式(SEQ ID NO：268)代表的是到目前为止分析出的存在于所有的MYB-亚群14序列中的序列残基。

对于下面列出的所述的一般模式、排他模式、以及绝对模式(SEQ ID NO：266-268)而言，“X”表示的是任意的氨基酸，“X(N)”，其中N表示任意数字，表示的是由所指示的数量个“X”构成的一串(即，X(23)表示的是由23个“X”构成的一串)，其中X是任意的氨基酸。在某些位置处，对于所述给定的位置而言，允许存在多个氨基酸残基。在允许存在多个氨基酸的情况下，将所述任选的残基在方括号内进行表示。

一般模式(SEQ ID NO：266)

M-G-R-X-P-C-C-D-[KR]-X-X-[MV]-K-[RK]-G-X-W-[SA]-X-[DQE]-E-D-X-X-[IL]-[RK]-X-[FY]-X-X-X-X-G-X-X-X-[SN]-W-I-X-X-P-X-[RK]-X-G-[IL]-X-R-C-G-[KR]-S-C-R-L-R-W-[IL]-N-Y-L-R-P-X-[IL]-[RK]-H-G-X-[FY]-[ST]-X-X-E-[DE]-X-X-[IV]-X-X-X-[FY]-X-X-X-G-S-[KR]-W-S-X-[MI]-A-X-X-[ML]-X-X-R-T-D-N-D-[ILV]-K-N-[HY]-W-[DN]-[ST]-[RK]-L-[RK]-[RK]-[RK]

排他模式(SEQ ID NO：267)

[RK]-X(9)G-X-X-I-X(28)-H-X(14)-[YF]-X(4)-S-X(23)-[RK]

绝对模式(SEQ ID NO：268)

G-X-W-X-X-X-E-D-X-X-[IL]-[RK]-X-X-X-X-X-X-G-X(23)-R-W-[IL]-N-Y-L-R-P-X-[IL]-[RK]-H-G-X-[FY]-X-X-X-E-[DE]-X(13)-W-X-X-X-A-X-X-X-X-X-R-T

可以通过序列识别号266的一致序列对MYB-亚群14序列进行定义。在所述的MYB-亚群14序列中，通过发现排他性的氨基酸残基或者支配性的氨基酸残基，从而对所述的氨基酸残基所在的位置进行识别。在下面的描述中，所有的位置的数字是参照AtMYB68蛋白(SEQ ID NO：2)而言的，所述的蛋白与上述的一般的一致序列，序列识别号266相关联。

在所述的R2结构域中的位置26上，在MYB-亚群14中存在一个保守的带阳性电荷的(K或者R)残基。尽管这个氨基酸在这一位置上对于这个亚群而言不是排他性的，但所述的其余AtMYB蛋白的趋势是一种疏水性的残基，在所有的MYB蛋白中有超过50％的蛋白具有一个疏水性的异亮氨酸残基或者缬氨酸残基(参见Stracke等人于2001年发表的文章)。

亚群14中的全部成员在位置36上含有一个插入，形成了一个额外的氨基酸残基。这对于MYB-亚群14而言似乎是排他性的。在所有的情况下，甘氨酸(G)，一个小的疏水性残基，是所述的额外的残基，除了在MYB87(SEQ ID NO：32)中以及在一种水稻同系物(SEQ IDNO：194)中，在所述的MYB87中，这一位置上含有一个天冬酰胺残基，而在所述的水稻同系物中，这一位置上含有一个银色金属(argentine)。

所述的MYB-亚群14成员在位置39上支配性的含有一个疏水性的异亮氨酸残基。其中一个例外是一种被鉴定为序列识别号191的水稻同系物，所述的水稻同系物在这一位置上具有一个谷氨酰胺。尽管在MYB蛋白的这一位置上通常会发现其他的疏水性残基，但异亮氨酸对于MYB-亚群14而言似乎是排他性的。除此之外，在这一位置上，带阳性电荷的残基(39％R)以及极性残基(23％N)是最普遍的。

在所述的R3结构域中的位置68上，所有的MYB-亚群14成员含有所述的带阳性电荷的组氨酸残基。一种带阳性电荷的残基出现在所有的MYB蛋白中的这一位置上；然而与所述的MYB-亚群14相反的是，在其他的MYB蛋白中73％含有一个精氨酸(R)残基并且17％含有一个赖氨酸残基。

在位置83上，MYB-亚群14的大部分成员含有一个芳香族的疏水性残基(酪氨酸Y，或者苯丙氨酸F)。芳香族疏水性残基在这一位置上的出现对于MYB-亚群14而言似乎是排他性的。大部分的MYB蛋白具有一个组氨酸残基(87％)。已经提出这个组氨酸是存在于所述的螺旋的疏水性核中的一个至关重要的残基(参见Ogata等人于1992年发表的文章)。经过核磁共振(NMR)分析，所述的组氨酸似乎与两个临界的(critical)色氨酸残基进行了接触。在位置83上不存在组氨酸并不必须将其排除在MYB-亚群14的成员之外，因为已经识别出有些成员不具有组氨酸残基，例如序列识别号为169以及序列识别号为225的成员。

在位置88上，MYB-亚群14的成员含有所述的极性丝氨酸残基，而几乎所有的其他MYB蛋白(91％)含有所述的极性天冬酰胺残基。丝氨酸残基对于这个亚群而言似乎是排他性的。在位置88上不存在丝氨酸并不必须将其排除在MYB-亚群14的成员之外，因为已经识别出至少一个MYB-亚群14的成员在位置88上具有一个苯丙氨酸残基，例如序列识别号为256的成员。

在位置112上，MYB-亚群14的成员含有一个带阳性电荷的精氨酸残基或者赖氨酸残基。大部分的MYB蛋白在这一位置上同样含有带阳性电荷的残基，然而，组氨酸(48％)是已经发现的最普遍的残基。在位置112上不存在精氨酸并不必须将其排除在MYB-亚群14的成员之外，因为已经识别出至少一个MYB-亚群14的成员在位置112上具有一个谷氨酸残基，例如含有一个谷氨酸残基的序列识别号为68的成员以及含有一个苏氨酸的序列识别号为191的成员。

在R2R3结构域中存在变异是可以允许的，正如在所述的被识别出的一致序列中所表示出的。相对于所呈现的一致序列而言，一个MYB-亚群14序列的R2R3结构域可以是90％同源的，优选是95％同源的或者更加优选是99％同源的。

S1基序以及S2基序的加入

在MYB-亚群14中，所述的MYB68序列以及MYB84序列中含有两个更加保守的基序，所述的基序被鉴定为S1(SFSQLLLDPN)(SEQ ID NO：269)以及S2(TSTSADQSTISWEDI)(SEQ IDNO：270)。在AtMYB68序列、AtMYB36序列和AtMYB84序列以及芸薹属MYB68序列、芸薹属MYB36序列和芸薹属MYB84序列中都发现了这些基序，并且这些氨基酸序列表现出了至少70％的同源性。除此之外，已经发现，在油菜(Brassica napus)(Canola)、芜菁(Brassica rapa)(卷心菜)、甘蓝(Brassica oleracea)、野芥菜(Raphanus raphanistrum)(小萝卜)中的直系同源基因中存在与所述的S1基序或者S2基序的同源性，并且在枳壳(Poncirustrifoliate)(橘)的S2区域中存在同源性，而在截形苜蓿(Medicago truncatula)的同系物以及葡萄(Vitis Vinifera)(葡萄)的同系物的S2区域中存在微弱的同源性。当被作为S1基序或者S2基序而被包括在内时，目标序列应当表现出具有至少70％的同源性，更加优选为80％并且最优选为90％。

来自于不属于拟南芥以及芸薹属的物种中的MYB68序列以及MYB84序列可能不含有S1基序以及S2基序，但仍然可能被划分为一种MYB亚群-14序列，这是根据序列分析以及考虑到其他标准来进行划分的。

MYB-亚群14成员的识别，包括MYB68，同系物

可以使用本领域技术人员已知的各种公共软件或者商业软件来寻找AtMYB-亚群14序列的同系物(表格1)或者一种目标MYB68(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)。可以利用基础性局部相似性比对搜索工具(Blast)进行比对并且对推定的序列进行识别。可以按照这里所概括的方法进行搜索。使用例如tblastn、tblastp这样的程序确定具有最高同源性的同系物，针对从美国国立生物信息中心(NCBI)处获得的数据库以及其他的基因组数据库进行搜索，其中所述的从美国国立生物信息中心(NCBI)处获得的数据库是例如表达序列标签数据库(EST)，基因组综述序列数据库(GSS)，高通量基因组数据库(HTG)以及染色体数据库，所述的其他基因组数据库是例如所述的美国基因组研究所(TIGR)人类基因序列集成(unigene)数据库，葫芦(Cucurbit)基因组学数据库(http：//www.icugi.org/)，向日葵以及莴苣(http：//compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php)，截形苜蓿(国际苜蓿基因组注释机构)，SGN(http：//www.sgn.cornell.edu/)，以及橘(http：// harvest.ucr.edu/)。当物种具有更高程度的歧化时，在此情形下可以对所述的比对参数进行适当的变化，其中所述的比对参数是例如需要的缺口数量(Gap costs)，矩阵值(matrixvalues)。

为了证实在每个物种中最接近AtMYB68的hit基因事实上是一种MYB68同系物，可以进行双向基础性局部相似性比对搜索，在所述的搜索中针对所有的拟南芥蛋白进行上述同系物的基础性局部相似性比对搜索。在许多情况中，所述的同系物中的最接近拟南芥的hit基因是一种MYB68基因家族成员(MYB亚群-14)，而不是MYB68本身。如果所述的同系物与一种拟南芥蛋白最接近，而所述的拟南芥蛋白不在所述的MYB68基因家族的范围之内，在这种情况下，所述的同系物被评定为不属于MYB-亚群14中的成员。

可以使用例如“getorf”这样的程序对开放阅读框进行确定，其中所述的“getorf”程序来自于所述的欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)程序，或者表达序列标签数据库扫描(ESTScan)。

识别MYB序列的方法、将MYB序列划分成指定的亚群的方法以及识别MYB-亚群14序列的方法在Stracke等人于2001年发表的文章中以及在Kranz等人于1998年发表的文章中进行了进一步的描述。

利用传统的基础性局部相似性比对搜索工具(blast)的方法通常不能找到在高度歧化的物种之间存在的具有微弱的保守性的同系物。在这样的情况下，在同系物之间将存在保守的基序、结构域以及指纹(fingerprint)，并且这些物质是很好的功能同源性的预报者。存在许多精通于在物种间寻找保守性结构域的程序，所述的程序使用到隐式马尔可夫模型，位置特异性得分矩阵，以及模式。

PSI-Blast，PRATT，PHI-Blast，以及HMMBuild/HMMSearch

PRATT是一种由所述的蛋白质功能位点(PROSITE)数据库提供的工具。它建立了来自于一组保守性蛋白质的保守性模式http：//www.expasy.ch/prosite/。利用PRATT来确定MYB68与同其最接近的同系物之间的保守性模式。之后利用ScanProsite以及PHI-Blast分别在所述的Swiss-Prot以及美国国立生物信息中心(NCBI)蛋白数据库中寻找所述的保守性模式。所述的搜索结果限于发生在同样含有所述的模式之间的比对。

利用HMMBuild来建立一种隐式马尔可夫模型，其中使用到所述的MYB68及其同系物。利用所述的隐式马尔可夫模型，通过HMMSearch在所述的美国国立生物信息中心的蛋白数据库中进行扫描。能够找到与所述的基础blastp搜索相类似的蛋白。

利用上述的方法，在超过50种不同的植物物种中发现了MYB68的同系物。在大多数的情形中，同源性被限制于所述的N-末端MYB DNA结合结构域中。在油菜(Brassica napus)(Canola)、芜菁(Brassica rapa)(卷心菜)、甘蓝(Brassica oleracea)、野芥菜(Raphanusraphanistrum)(小萝卜)、枳壳(Poncirus trifoliate)(橘)中发现的基因中，在所述的保守性较弱的C-末端区域中存在同源性，而在截形苜蓿(Medicago truncatula)的同系物以及葡萄(Vitis Vinifera)(葡萄)中发现的基因中，在所述的S2区域内存在微弱的同源性。

通过下载强有力的表达序列标签(EST)hits基因，并且使用CAP3对它们进行装配，从而对所述的枳壳(Poncirus trifoliate)以及芜菁(Brassica rapa)基因进行识别。上述得到的重叠群不能编码一个完整的蛋白。来自于橘的所述重叠群序列编码了一个仅仅跨越所述的S2区域的部分蛋白，而在芜菁(Brassica rapa)中，发现了一个具有202个氨基酸的部分蛋白，所述的部分蛋白跨越了AtMYB68中的1-202位置。

各种不同的程序已经利用数据图、模式、以及隐式马尔可夫模型对所述的MYB结构域进行了定义。为了证实所述的MYB结构域在一个未知的序列中的存在，可以针对这些数据图对这个序列进行搜索。InterProScan是格外有效的，因为它提供了一种能够同时在13个程序中进行查询的界面。被整合在InterPro中的所述数据库包括

a)ProDom：一个蛋白质结构域家族的数据库。是通过对来自于Swiss-Prot/Trembl(欧洲分子生物学实验室)数据库中的同源性片段进行聚集而建立的，并且随后进行递归性的PSI-BLAST(位置特异性叠代基础性局部相似性比对搜索工具)搜索。

b)HMMTIGR：由隐式马尔可夫模型所表示的蛋白质家族。

c)TMHMM：对蛋白质中的跨膜螺旋的预测。

d)FPrintScan：对指纹(fingerprints)PRINTS数据库进行的检索。指纹是由多个基序所表示的蛋白质家族。

e)ProfileScan：来自于家族相关性序列的数据图。

f)HMMPanther：一个隐式马尔可夫模型的数据库。

g)HMMPIR：基于完整蛋白的进化关系的隐式马尔可夫模型。

h)ScanRegExp：对所述的模式以及数据图的蛋白位点数据库进行扫描。

i)Gene3D：一个含有功能信息的蛋白质数据库。

j)HMMPfam：由隐式马尔可夫模型所表示的蛋白质结构域家族。

k)Superfamily：一个对所有的经过完整测序的有机体进行结构蛋白以及功能蛋白的标注的数据库。

l)HMMSmart：允许以隐式马尔可夫模型为基础对移动的结构域进行识别。

m)SignalIP：预测在氨基酸序列中是否存在信号肽的断裂位点并且定位所述的信号肽断裂位点在氨基酸序列中的位置。

对应于所述的蛋白中具有最高保守性的区域，将块(blocks)乘以进行比对的不带有缺口的片段。利用三个块对所述的MYB结构域进行表示。正如所预期的，AtMYB68含有这三个块中的每一个，以及一个5Wos2块。

本发明在一定程度上是以发现了具有热胁迫耐受性的植物作为基础的。形成所述的热耐受性表现型的基因已经被确定并且被证明是一个MYB68基因。这里公开了制备一种热耐受性转基因植物的方法。具体的，本发明识别了一个转录因子基因家族，具体的说是所述的MYB基因家族，并且特别的说是一个MYB-亚群14，当所述的MYB-亚群14在植物中进行表达时，使植物具有热胁迫耐受性并且所述的植物在经过热胁迫之后具有增加的产量或者显示出对干旱胁迫或者盐胁迫所具有的耐受性。

实施例10：MYB68同系物的识别

利用数据库序列搜索工具对来自于相同的植物物种、不同的植物物种或者其他有机体的同系物进行识别，其中所述的数据库序列搜索工具是例如所述的基础性局部相似性比对搜索工具(BLAST)(参见Altschul等人于1990年在J.Mol.Biol.《分子生物学杂志》215：403-410中发表的文章；以及Altschul等人于1997年在Nucl.Acid Res.《核酸研究》25：3389-3402中发表的文章)。利用所述的BLOSUM-62得分矩阵，对所述的tblastn或者blastn序列分析程序进行使用(参见Henikoff S.以及Henikoff J.G.于1992年在Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国科学院院刊》89：10915-10919中发表的文章)。所述的基础性局部相似性比对搜索工具(BLAST)报告的给出提供了一个得分，所述的得分考虑了相似残基或者相同残基的比对以及为了对所述的序列进行比对而需要的任何缺口。所述的得分矩阵为任何可能的序列对间进行的比对指定了一个得分。所述的P值反映了期望看到一个偶然发生的得分的次数。较高的得分是优选的并且一个低的阈值P值的阈值是优选的。这些是所述的序列识别标准。所述的tblastn序列分析程序被用来在一个核苷酸数据库中的六种翻译方式的序列中对一种多肽序列进行查询。当遇到P值小于-25，优选小于-70，并且更加优选小于-100时，将其鉴定为一种同源序列(范例性的选择性的序列标准)。所述的blastn序列分析程序被用来在一个核苷酸序列数据库中对一种核苷酸序列进行查询。同样，在这种情形中，较高的得分是优选的并且一个优选的阈值P值小于-13，优选小于-50，并且更加优选小于-100。

可以选择的，通过随机引物法对来自于具有下述序列识别号的序列的片段进行³²磷的放射性标记(参见Sambrook等人于1989年编写的Molecular Cloning.A LaboratoryManual《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press冷泉港实验室出版社，New York纽约)，并且利用其进行一种植物基因组文库的筛选(范例性的受试多核苷酸)，其中所述的序列是：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。作为一个例子，依照Stockinger等人所描述的方法(参见Stockinger E.J.等人于1996年在J.Heredity《遗传学杂志》87：214-218中发表的文章)，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)、甜樱桃(Prunus avium)、酸樱桃(Prunus sativus)、或者水稻(Oryzasativa)中分离出植物总DNA。使大约2至10微克的每种DNA的样本进行限制性消化，将其转移至尼龙膜上(Micron Separations，Westboro，Mass.)并且进行杂交。杂交条件为：42℃，在由下述物质组成的溶液中：50％的甲酰胺，5倍的柠檬酸钠盐缓冲液(SSC)，20毫摩磷酸盐缓冲液1倍的Denhardt’s，10％的硫酸葡聚糖，以及100微克/毫升的鲱鱼精DNA。在室温(RT)下利用下述物质进行四次低度严格的洗涤：2倍的柠檬酸钠盐缓冲液(SSC)，0.05％的十二烷基肌氨酸钠以及0.02％的焦磷酸钠，在此之后在55℃下利用下述物质进行高度严格的洗涤：：0.2倍的柠檬酸钠盐缓冲液(SSC)，0.05％的十二烷基肌氨酸钠以及0.02％的焦磷酸钠。进行高度严格的洗涤直至依照Walling等人所描述的方法(参见Walling L.L等人于1988年在Nucl.Acids Res.《核酸研究》16：10477-10492中发表的文章)在所述的洗脱液中探测不到可以计算的物质。

实施例11：MYB68的技术特征的鉴定

可以利用识别基因对MYB68基因进行识别，其中所述的识别基因与AtMYB68(SEQID NO：1)具有高度的同源性。除了与所述的核苷酸序列或者氨基酸序列具有同源性之外，我们可以对备选基因进行识别，其中所述的备选基因共享构象蛋白结构。这样的结构基序能够帮助进行相关蛋白的识别，并且对所述的相关蛋白的结构与功能间的关系进行鉴定。

实施例12：同系物的功能确认

将备选的同系物导入到拟南芥中并且对热耐受性进行评价。使由具有下述序列识别号的序列所公开的基因在拟南芥植物中进行表达并且按照这里所描述的方法对热耐受性进行评价，其中所述的序列为：序列1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，88，90，91，92，94，96，98，100，102，104，106，108，109，110，112，114，116，118，120，122，124，125，127，129，130，132，134，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，211，213，214，216，217，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，247，249，251，253，255，257，259，261，263以及265。任选的，如果一个备选的MYB-亚群14序列与所述的一般模式相互匹配，并且其进一步的包括一种与所述的排他模式之间的匹配，那么所述的序列是一种被包括在内的有力的备选者，成为一个MYB-亚群14序列或者MYB68基因，可以在任何可转化的物种中对上述序列的表达进行评价，其中所述的物种是例如芸薹属，玉米，棉花，大豆或者水稻。在本发明公开中已经提供了这样的功能性测试的例子。

值得注意的是，在这里所公开的某些序列不是完整长度的。可以通过本领域技术人员已知的标准分子方法获得完整长度的序列。之后可以按照这里所描述的方法对所述的完整长度的序列进行表达。

Claims (6)

1.一种制备热胁迫耐受性植物的方法，所述的方法包括：

a)提供一种核酸构建体，所述的核酸构建体能够增强一种MYB亚群-14多肽的表达；

b)将所述的核酸构建体插入到一个载体之中；

c)利用所述的载体对一种植物、组织培养物、或者一种植物细胞进行转化，从而获得一种具有增加的所述Myb亚群-14多肽的表达的植物、组织培养物或者植物细胞；

d)使所述的植物进行生长或者从所述的组织培养物或者植物细胞中进行一种植物的再生，其中生成了一种具有热胁迫耐受性的植物。

2.一种通过权利要求1所述的方法制备的热胁迫耐受性转基因植物。

3.一种由权利要求2所述的转基因植物制备的转基因种子，其中所述的种子制备一种具有热胁迫耐受性的植物。

4.一种识别具有热胁迫耐受性的植物的方法，其中与对照植物相比，所述的植物具有减少的花朵败育以及增加的产量，所述的方法包括

a.将一群开花植物暴露于热胁迫处理中；并且

b.从上述的植物群体中选择一种具有减少的花朵败育的植物，从而识别出具有热胁迫耐受性的植物。

5.一种由权利要求4所述的方法识别出的植物。

6.一种由权利要求4所述的方法识别出的植物制备的转基因种子，其中所述的种子制备一种具有热胁迫耐受性的植物。