CN111499709A

CN111499709A - 水稻穗粒数相关的rgn1蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111499709A
Application number: CN202010424453.2A
Authority: CN
Inventors: 李自超; 李刚岭; 张战营; 张洪亮; 李金杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-19
Also published as: CN111499709B

Abstract

本发明公开了水稻穗粒数相关的RGN1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了如下蛋白质：氨基酸序列如SEQ ID No.1或经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或具有99％、95％、90％、85％或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质或在其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的RGN1蛋白及其编码基因可以调控水稻穗粒数和控制水稻侧生颖花的产生，利用该基因可以对水稻品种的穗部性状进行改良，对于培育水稻新品种具有重要意义。

Description

水稻穗粒数相关的RGN1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及水稻穗粒数相关的RGN1蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

随着世界人口的持续增长以及可用耕地面积的逐渐减少，粮食短缺问题已成为制约人们生活水平提高的瓶颈。据预测，未来20年，我国粮食产量需以每年递增1％的速度，才能满足国内的粮食需求，我国和全球依然处于缺粮的危险境地。水稻作为世界上重要的粮食作物之一，是我国第一大口粮作物，因此，对水稻产量相关基因的发掘及应用对于保证我国以及世界的粮食安全具有重要意义。

每穗粒数、千粒重和有效穗数是水稻产量的三要素。近30年的水稻育种实践证明，穗粒数对提高水稻产量的作用最为重要。穗粒数主要由一次和二次枝梗数及其着生的颖花数目决定。当顶端分生组织进入生殖生长阶段时，顶端分生组织首先分化形成一次枝梗原基，进而发育成一次枝梗，一次枝梗原基周围分化出二次枝梗原基，并发育成为二次枝梗。侧生颖花原基着生在这些枝梗原基的四周，最终发育成籽粒。因此对控制侧生颖花基因的研究不仅可以为阐明水稻花序形态建成以及分枝发育的调控机制提供理论基，也对水稻产量的提高具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻穗粒数相关的RGN1蛋白及其编码基因与应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质来源于水稻，具体可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质的核酸分子。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

进一步地，所述核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白质的DNA，该DNA不但包括启动所述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。可用于本发明的增强子可包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等。翻译控制信号的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因细胞系或者重组菌进行鉴定及筛选，可对所用重组载体进行加工，如加入可在宿主细胞中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。

所述重组载体可为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒等。

所述重组菌可为原核细胞或低等真核细胞。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的蛋白质或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

(a1)调控植物穗粒数；

(a2)调控植物侧生颖花数；

(a3)调控植物一次枝梗数；

(a4)调控植物二次枝梗数；

(a5)调控植物籽粒长度；

(a6)调控植物籽粒宽度；

(a7)调控植物籽粒重量；

(a8)调控植物花序形态建成；

(a9)调控植物分枝发育。

在所述应用中，所述蛋白质的表达量和/或活性提高，所述植物的穗粒数增加和/或侧生颖花数增加和/或一次枝梗数增加和/或二次枝梗数增加和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或籽粒重量减少；和/或，所述蛋白质的表达量和/或活性性降低，所述植物的穗粒数减少和/或侧生颖花数减少和/或一次枝梗数减少和/或二次枝梗数减少和/或籽粒长度增加和/或籽粒宽度增加和/或籽粒重量增加。

第五方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育植物品种的方法，可为如下任一：

方法A1：一种培育具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分的植物品种的方法，包括使受体植物中前文所述蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤；

(b1)穗粒数增加；

(b2)侧生颖花数增加；

(b3)一次枝梗数增加；

(b4)二次枝梗数增加；

(b5)籽粒长度减小；

(b6)籽粒宽度减小；

(b7)籽粒重量减少。

方法A2：一种培育具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分的植物品种的方法，包括使受体植物中前文所述蛋白质的表达量和/或活性降低的步骤；

(c1)穗粒数减少；

(c2)侧生颖花数减少；

(c3)一次枝梗数减少；

(c4)二次枝梗数减少；

(c5)籽粒长度增加；

(c6)籽粒宽度增加；

(c7)籽粒重量增加。

在上述方法A1中，所述使受体植物中前文所述蛋白质的表达量和/或活性提高可通过任何技术手段实现。如向所述受体植物中导入前文第二方面中所述的核酸分子。

在上述方法A2中，所述使受体植物中前文所述蛋白质的表达量和/或活性降低可通过任何技术手段实现。如敲除或抑制所述受体植物中前文第二方面中所述的核酸分子。

第六方面，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育转基因植物的方法，可为如下任一；

方法B1：一种培育具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入前文第二方面中所述的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分；

(b1)穗粒数增加；

(b2)侧生颖花数增加；

(b3)一次枝梗数增加；

(b4)二次枝梗数增加；

(b5)籽粒长度减小；

(b6)籽粒宽度减小；

(b7)籽粒重量减少。

方法B2：一种培育具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达前文所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分；

(c1)穗粒数减少；

(c2)侧生颖花数减少；

(c3)一次枝梗数减少；

(c4)二次枝梗数减少；

(c5)籽粒长度增加；

(c6)籽粒宽度增加；

(c7)籽粒重量增加。

在上述各方面中，所述侧生颖花数具体可为二次枝梗上的侧生颖花数(二次枝梗除去顶端着粒外的着粒数)。所述籽粒重量可体现为千粒重。

在上述方法B1中，所述核酸分子可通过重组载体的形式导入所述受体植物中。

进一步地，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将SEQ ID No.3和SEQ ID No.2所示DNA片段顺次连接后克隆到pMDC162载体的多克隆位点后得到的重组载体。

在上述方法B2中，对所述受体植物中能够表达前文所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明中，具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的；以SEQ ID No.2所示DNA片段中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的一个具体实施例中，所述靶序列具体为SEQ ID No.4。

在所述方法中，将携带有所述核酸分子的所述重组载体或者用于对所述受体植物中所述核酸分子进行敲除或抑制表达时采用的基因编辑工具导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物具体可为水稻。

本发明所提供的RGN1蛋白及其编码基因可以调控水稻穗粒数和控制水稻侧生颖花的产生，利用该基因可以对水稻品种的穗部性状进行改良，对于培育水稻新品种具有重要意义。

附图说明

图1为为RGN1近等基因系的植株以及穗部表型。

图2为RGN1近等基因系的穗部枝梗性数目以及穗粒数的统计图。

图3为RGN1近等基因系的籽粒性状的表型以及统计图。

图4为RGN1的互补试验。BS208中的RGN1突变导致二次枝梗上的侧生颖花缺失，当转入正常的RGN1基因后能够恢复其表型。Comp1和Comp2表示两个独立的互补事件。

图5为RGN1的敲除试验。当正常的品种日本晴中的RGN1基因被CRISPR/Cas9编辑后发生突变，导致其二次枝梗上的侧生颖花缺失。NIP表示日本晴；RGN1-CR1和RGN1-CR2表示RGN1敲除后获得的两种纯合突变植株。

图6为RGN1的敲除试验中RGN1的突变位点。

图7为RGN1在水稻各个组织中的表达情况。内参为OsActin1基因。ROOT为根，STEM为茎，LEAF为叶片，SHEATH为叶鞘，0.5CM，1CM，2.0CM，4.0CM，8.0CM，10.0CM，15.0CM，18.0CM分别代表长度为0.5cm，1cm，2.0cm，4.0cm，8.0cm，10.0cm，15.0cm，18.0cm的穗。

图8为RGN1的亚细胞定位图。35S::GFP用为对照。

各图中的**表示P<0.01；***表示P<0.001。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻品种BS208(本实验室收集的一个稀穗材料)：公众可从中国农业大学获得。

水稻近等基因系NIL-RGN1，NIL-rgn1(以BS208与特青自交后代F₇中的剩余杂合子自交获得的纯合姊妹系作为RGN1的近等基因系，NIL-RGN1的基因型与特青一致，NIL-rgn1的基因型与BS208一致)：本实验室构建和保存，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、RGN1基因的获得

本发明利用水稻品种BS208与正常籼稻品种特青构建的分离群体定位，首先利用F₂分离群体构建高低池，并利用高低池筛选实验室保存的477个SSR标记。之后选择F₂群体中的19株稀穗单株(表型与BS208相似)与在高低池之间存在差异的标记进行连锁分析，将控制稀穗表型的基因定位在与1号染色体长臂上的SSR标记RM7431与RM3258之间，物理距离为5.8Mb，并将该基因命名为RGN1(Regulator of Grain Number 1)。随后利用F3群体中的94株稀穗单株将该区间进一步缩小到1.9Mb内。最终利用F4群体中的2742株稀穗单株将RGN1定位到10.7kb的区间内，位于SSR标记MM4411与RM11529之间。根据RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据库的注释信息发现在定位区间内仅有1个ORF，该ORF作为RGN1仅有的候选基因，因此将该ORF命名为RGN1。RGN1编码一个R2R3-MYB转录因子，并根据日本晴(Nipponbare)参考基因组序列，设计覆盖该RGN1完整基因组的引物，扩增BS208与特青基因组DNA并测序，结果表明两个亲本之间在基因区间存在4个SNPs和一个InDel的差异，4个SNPs中SNP1位于5’UTR上，SNP2位于第二个外显子上，SNP3、SNP4均位于第三个外显子上，且SNP2、SNP3、SNP4均为同义突变，为不导致编码氨基酸的变化。InDel则是BS208中3个碱基的缺失，导致BS208中在RGN1基因编码的蛋白有一个氨基酸的缺失。另外，该基因在BS208与日本晴(NIP)序列仅存在这一个InDel的差异。

以水稻品种日本晴的cDNA为模板，以5’-ATGGGGAGGGCGCCGTGCTG-3’和5’-TCATGTCAGGCTGTGGCACA-3’为引物，经PCR扩增得到RGN1基因。

经测序，RGN1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2，其编码的蛋白为RGN1，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

本发明观察并统计了水稻近等基因系NIL-RGN1(与特青基因型一致)，NIL-rgn1(与BS208基因型一致)的植株的穗部表型，包括穗部枝梗性数目，穗粒数，籽粒大小等。

图1为RGN1近等基因系的植株以及穗部表型。可见，RGN1控制水稻二次枝梗侧生颖花的产生。

图2为RGN1近等基因系的穗部枝梗性数目以及穗粒数的统计图。可见，RGN1通过影响二次枝梗数目以及二次枝梗上的着粒数，从而影响穗粒数。

图3为RGN1近等基因系的籽粒性状的表型以及统计图。可见，RGN1功能缺失后，籽粒长度以及宽度增加，从而导致千粒重增加。

实施例2、RGN1的功能验证。

一、互补载体的构建

本实验所用的互补载体命名为RGN1-Comp，是将日本晴中RGN1的CDS连接其自身启动子(ATG前2500bp的序列)并通过无缝连接的方法将之连接至植物表达载体pMDC162(公众可从中国农业大学获得)上。酶切位点为PmeI与AscI，所用引物如下所示：

RGN1-COMP-1F：AACACTGATAGTTTAAACCGACCATGGTGGGCGGGCGG

RGN1-COMP-1R：CCCTCCCCATCCCGCCGGCCTCGTACCAAT

RGN1-COMP-2F：GGCCGGCGGGATGGGGAGGGCGCCGTGCTG

RGN1-COMP-2R：TAGAGTCGAGGCGCGCCTCATGTCAGGCTGTGGCACAGCC

上述引物均为5’到3’方向书写。

RGN1-COMP-1F/RGN1-COMP-1R用于扩增启动子序列；RGN1-COMP-2F/RGN1-COMP-2R用于扩增RGN1基因。

RGN1-Comp载体的结构描述为：将pMDC162载体的酶切位点PmeI和AscI之间的小片段替换为RGN1的启动子序列以及其后连接的RGN1编码区序列后所得的重组质粒。启动子序列如SEQ ID No.3，RGN1编码区序列如SEQ ID No.2。

二、敲除载体的构建

(1)登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶位点。靶位点最好带酶切位点【Cas9切割点(离PAM/NGG 3bp)位于酶切位点中】。也可以手动设计靶位点，然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况。预测靶位点编辑效率可使用http://www.crisprscan.org/？page＝sequence网站。本研究设计的靶位点序列为：5’-GCGCATTGGCTCTGCGGGGC-3’(SEQ ID No.4)。

(2)设计两个互补DNA序列分别为：在正向靶序列前加GGCA，在反向互补靶序列前加AAAC。(如下：)

F：5’-GGCAGCGCATTGGCTCTGCGGGGC-3’；

R：5’-GCCCCGCAGAGCCAATGCGCTGCC-3’。

(3)中间载体的构建：

a.SK-gRNA载体(公众可从中国农业大学获得，记载在“王晓婉等.稻瘟病抗性基因Pita2候选基因多位点编辑载体的构建.中国农学通报,2017年”一文)进行AarI酶切(Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体；

b.F链与R链混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段；

c.将载体和片段进行连接(摩尔浓度1:3-10)，转化DH5，得到连接质粒；可用引物T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)与R链搭配进行菌落PCR阳性检测。

d.利用公共引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG)或T3进行测序检测，验证是否正确，正确载体命名为SK-gRNA-RGN1。

(4)构建至最终载体：pC1300-Cas9载体(公众可从中国农业大学获得记载在“奉宝兵等.CRISPR/Cas9技术编辑淀粉合成基因PUL.中国稻米,2019年”一文)用KpnI和BamHI进行酶切。将步骤(3)中构建的SK-gRNA-RGN1用KpnI和BglII进行酶切并回收片段。并将片段连接到pC1300-Cas9载体上，所得重组载体经测序验证正确命名为RGN1-CR。

三、转基因水稻的获得

(1)重组菌

将上述二制备的互补载体RGN1-Comp与敲除载体RGN1-CR冻融法转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌，用于侵染转基因受体品种的愈伤，互补载体RGN1-Comp的受体品种为BS208，敲除载体RGN1-CR的受体品种为日本晴。

(2)转水稻

采取经典的农杆菌介导的愈伤侵染方法，具体步骤如下：

a、胚性愈伤的获得：将成熟的种子去壳后用酒精消毒，再用消毒，无菌水漂洗一次，风干3h。接种于NB培养基，28℃暗培养2周，将胚性愈伤剥下，继代至新的NB培养基，继代培养2周(继代两次)。

b、制备侵染液：吸取保存的农杆菌液，涂布到含利福平和相应抗生素固体培养基上，28℃倒置暗培养2d，刮取少量农杆菌至AAM液体培养基中，菌液浓度OD600约为0.3。

c、共培养挑选自然分散、颜色鲜黄、直径约为3～5mm的颗粒状愈伤组织至三角瓶中，加入制备好的侵染液，侵染10min，用无菌滤纸吸取多余的侵染液，置于铺有一层滤纸的共培养培养基上，20℃共培养2～3d。

d、抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗5～6次，再用含头孢霉素和羧苄青霉素的无菌水清洗20min，最后置于无菌滤纸上沥干3h。然后移到延迟筛选培养基上。一周后移至到第一轮筛选培养基上，两周后再移至到第二轮筛选培养基上，继续培养两周。

e、分化将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，28℃暗培养2周，然后转移至分化培养基上，光照培养2～3周，得到再生转基因幼苗植株。

f、将幼苗移至壮苗培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基，炼苗1～2周，移至大田栽种，直至成熟。

上述转基因过程中所用培养基配方如表1所示。

表1转基因过程中所用各培养基配方

注：NB培养基基本成分包括N6大量元素，B5微量元素，B5有机成分，150mg/L肌醇，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，600mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。

四、各转基因水稻穗粒数相关性状鉴定

人工调查步骤三获得的各转基因水稻阳性株系以及其对应受体品种的穗部性状，包括枝梗数目，二次枝梗着粒数，每穗粒数，穗长等性状。每个株系选取15个植株进行检测。

图4为RGN1的互补试验。BS208中的RGN1突变导致二次枝梗上的侧生颖花缺失，从而导致每穗粒数减少，当转入正常的RGN1基因后能够恢复其表型。

图5为RGN1的敲除试验。当正常的品种日本晴中的RGN1基因被CRISPR/Cas9编辑后发生突变，导致其二次枝梗上的侧生颖花缺失，每穗粒数减少。

图6为RGN1的敲除试验中RGN1的突变位点。RGN1-CR1缺失2个碱基，RGN1-CR2缺失5个碱基，均为纯合突变，均导致移码。

实施例3、RGN1在水稻各个组织中的表达情况以及亚细胞定位分析

一、实时荧光定量PCR

取水稻品种日本晴各个组织，分别提取总RNA，利用反转录酶M-MLV反转录合成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，采用引物RGN1-RT-F和引物RGN1-RT-R扩增RGN1基因的特异片段，采用引物Ubiquitin-F和引物Ubiquitin-R扩增出水稻Ubiquitin基因的特异片段以作为内参进行实时定量分析。

RGN1-RT-F：5’-CGGCTACACCGACCAGGAG-3’；

RGN1-RT-R：5’-CGCGATGATGGACCACCT-3’。

Ubiquitin-F：5’-ACCAGCTGAGGCCCAAGA-3’；

Ubiquitin-R：5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3’。

实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems 7500Real TimePCR system(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time x－(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time 0

Time x表示任意时间点，Time 0表示经Ubiquitin校正后1倍量的目标基因表达。

结果如图7所示，RGN1基因能在日本晴的各个组织以及不同时期的穗中检测到。

二、RGN1的亚细胞定位

1、RGN1-GFP载体的构建

为研究RGN1的亚细胞定本研究构建了超表达RGN1-GFP融合蛋白的载体，将RGN1不含终止密码的CDS连接到植物表达载体pCAMBIA Super 1300-GFP(公众可从中国农业大学获得)上，经测序验证正确后命名为RGN1-GFP，酶切位点为HindⅢ与KpnⅠ。以日本晴cDNA为模板，所用引物如下所示：

RGN1-GFP-F：5’-AATCTCGATACACCAAATCGACTCTAGAAAGCTTATGGGGAGGGCGCCGTGCTG-3’；

RGN1-GFP-R：5’-CGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTACCTGTCAGGCTGTGGCACAGCC-3’。

2、烟草叶片瞬时表达

(1)挑选在YEP固体培养基上活化的含有RGN1-GFP质粒的农杆菌单克隆于含有相应抗生素的3-5ml YEP液体培养基中，28℃，200rpm，过夜培养。

(2)按1:100接种至扩大培养基内，扩大培养基为含有相应抗生素YEP培养基，28℃，200rpm，过夜培养至OD600为1～2，5,000rpm离心5min收集菌体。

(3)用重悬液(10mM MgCl₂，10mM MES，150μM乙酰丁香酮)重悬菌体至浓度为OD600为1.0，室温下静置3-6h(也可过夜)。

(4)选择生长较好的4周左右大小的烟草叶片，用无菌1ml医用注射器吸取菌液，从下表皮将菌液缓缓注射进烟草叶片中。烟草注射菌液后继续在22-24℃下培养，2-3d后直接在激光共聚焦显微镜下观察。

结果入图8所示，RGN1是一个定位在细胞核上的蛋白。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业大学

<120> 水稻穗粒数相关的RGN1蛋白及其编码基因与应用

<130> GNCLN201290

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Asp Lys Ala Ser Val Lys Arg Gly Pro

1 5 10 15

Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Leu Leu Arg Ser Tyr Val Arg Ser His

20 25 30

Gly Thr Gly Gly Asn Trp Ile Ala Leu Pro Gln Lys Ala Gly Leu Asn

35 40 45

Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro

50 55 60

Asp Ile Lys His Gly Gly Tyr Thr Asp Gln Glu Asp Arg Ile Ile Cys

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Asn Ser Ile Gly Ser Arg Trp Ser Ile Ile Ala Ser Lys

85 90 95

Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Lys

100 105 110

Leu Lys Lys Lys Ala Met Ala Met His His His His Gln Pro Pro Pro

115 120 125

Pro Gln Gln Gln His Tyr His His His His His His Arg Val Ala Gly

130 135 140

Gly Gly Ala Arg Val Thr Leu Val Ser Pro Pro Pro Ala Pro Gln Ser

145 150 155 160

Gln Cys Ala Ser Met Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly

165 170 175

Gly Asp Ala Cys Ser Phe Gly Ala Ala Ala Met Tyr Ser Pro Ser Pro

180 185 190

Ser Thr Gln Gln Ala Pro Gln Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala Gly Tyr

195 200 205

Thr Ser Val Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Gln Arg

210 215 220

Ser Pro Leu Asp Glu Leu Ile Cys Gln Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr

225 230 235 240

Thr Ala Ala Asp Cys Trp Ala Ser Gly Val Thr Leu Asp Asp Val Phe

245 250 255

Leu Pro Glu Leu Val Gly Ala Gly Glu Phe Pro Asn Gly Asp Leu Phe

260 265 270

Gly Gly Phe Gly Pro Leu Leu Gln Asp Arg Ser Ser Met Glu Leu Ser

275 280 285

Ala Cys Tyr Phe Pro Asn Ala Ala Ala Ala Glu Met Trp Pro Ala Ala

290 295 300

Thr Asp Ile Val Lys Pro Ala Gly Leu Cys His Ser Leu Thr

305 310 315

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggggaggg cgccgtgctg cgacaaggcg agcgtgaaga gggggccgtg gtcgccggag 60

gaggacgagc tgctgcggag ctacgtccgc agccacggca ccggtggcaa ctggatcgcg 120

ctcccgcaga aagcagggct gaaccggtgc gggaagagct gtaggctgcg gtggctcaac 180

tacctccgcc cggacatcaa gcacggcggc tacaccgacc aggaggaccg gatcatctgt 240

tccctctaca actccatcgg aagcaggtgg tccatcatcg cgtcgaagct gcccggccgg 300

acggacaacg acgtcaagaa ttactggaat accaagctca agaagaaggc catggccatg 360

catcatcatc atcagccgcc gccgccgcag cagcaacact accaccacca ccaccaccac 420

cgtgtcgccg gcggtggcgc gcgcgtcacg ctcgtgtcgc ctccgcccgc cccgcagagc 480

caatgcgcgt ccatgcagcc gtcgccggcg tccgcctcct cgtccggcgg cgacgcgtgc 540

agcttcggcg ccgccgccat gtactccccc tccccgtcaa cccagcaggc gccacaggcg 600

gcgacgctcg cggtcgcggg gtacacctcc gtggcgacgg cggcggcggc ggcggcggtg 660

gcggcgcagc gctcgccgct cgacgagctg atctgccagg tgccaccacc tcccactact 720

accgccgccg actgctgggc cagcggcgtg accctcgacg acgtgttctt gcccgagctc 780

gtcggagccg gcgagttccc caacggcgac ctcttcggcg ggttcggccc gctgctccag 840

gacaggtcgt ccatggagct ctccgcgtgc tacttcccca acgccgcggc ggcggagatg 900

tggccggcgg ccacggacat cgtcaagccg gccgggctgt gccacagcct gacatga 957

<210> 3

<211> 2509

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cgaccatggt gggcgggcgg cggggcaagg gcgcggaggc agcggcgagg cagcggtacg 60

aaagaagagt gagagagagg ggaggggaag agagagggtg ctgacatggc atcctatacg 120

tgggtcgcac gctaaatcag ctgtcacgtt ggataaaact ggtgttaaaa ccaccgaata 180

acctagagta aacggttttt tttaaagttg gggatgtcat atatctggtt ttgtggttgg 240

ggatgatttt gtagctcgat tttcggtgca cattttcctt ttgggtagta ctgaggatgg 300

ggagttgtga aacaggaatg ctagctcaat ttctgttctg accatgattt ttttttgact 360

ggtgtcctga ccatgattta gtacagcatt tcttgtatat gtatattaat tttttaaata 420

acatgtatat gtaatttaat atttttttat acctctattg ttgtaaaata taggccttgt 480

ttagttctaa actttttctt caaacttcca atttttccat cacattaaaa cttttctaca 540

cacataaact tctaactttt tcatcacatc gttcaaattt caaccaaact tacaattttg 600

acatgaacta tagactatac acactcatag gttcctaaaa aaattagact acaaaaggta 660

aaatatgttg aaatgaacgg catatttcca aatgtatgct ccattcagaa cacttgaact 720

ggaaaaggtc attttgtaaa ggtaagtgaa atcgtctcct tcttatagat ggccccagct 780

taattactaa acgaattgtg aataaaatga tcgtccttgt tccgttaaaa gtctagttcg 840

cattgcaacg cggagttact aaacgatgca ggagaaacaa attgtgaata aaatgatcgt 900

ccttgttcct ttaaaagtcc agttcgcatt gcaacgtgca gttactaaac aatgcaggag 960

aaacaatgtg ccagtcttat taatttttct aaggcagatc agatgtcata caacgagaca 1020

tgtgaatctg ttgcgctgtg gttcatttaa aaatctctcg gtggtgggtg ttcttcaaag 1080

tccaatcctt tgaaagctgt cggaacatca cactggtcaa aatgtacaga acagcaaagc 1140

acgaacagca agcagcgcgg ctatcttccc accaacatgc tctcttgttg cgcgactgat 1200

attaaacaca attaaaaacg ggacatgatt ccaggggcag agccaaggtc aagcgtgacg 1260

atccatacgg ttgtggtgtc aaacgacgga ttcggtgcaa ccgcaaagca gagactgtac 1320

cgggtgcaca caaacttgtg agttagaacg cttgaccttc tcgtgtggta aaatgcttat 1380

aattctcgcg ttctctgata aaacaattgt gtatagccat gccccttccc tagccctttt 1440

ctctagtcta gaccgtactg gaatgcctta tctgcgtggg cgcgagtttg acaagcgtta 1500

tgtgtttgtc aaccgagtag aaaccgacac gtttcgcgac tggattcgat cagggagacg 1560

gtaaagctaa catagcagag ttttagaatg gctttgtctg aatctctaga gaatggagga 1620

ggatatctga aactcgaact ctacccttcc agtttcagtg cagagctaac atggatcatt 1680

tggctctgct taagtccaaa gttgcaaaat aatttcgcag tatttacaca tgcgcggtac 1740

tcccgtcgac ctatccgcgg agaagatcga aacgcatttg gcaagaacag tagtgatttc 1800

gtgaatgcgc cacactgcct cgttttttta gtgcaaggag gtgacgctcc tctccaattc 1860

tccggccgcg tgccggtggt ggaaagcaaa atactactag tatagtatat actcgtagtc 1920

gtaccgtcgt atactacaaa agtagtagta caagaagacg gaagaattga attgtgtgtg 1980

ttgaccgtac ccgaaaagta aaacacaagc gagcgagacg acgtctcgcg tctctcctct 2040

agtcaacagc gaggctctac actaccatga aaaaaaccaa tacttttttc gtaaggacac 2100

cgcaccccgc ggctcggccg gtcgagtcga ctcggagacg agatcgcgta gctggtatca 2160

cctgcgctgc cccaccagtg ccggctaccg ccagagagaa agagagagag atggctgtct 2220

atgatgagag cgagtgcgcg cgcccgctat aaagcccgcc ccccggtgca gcatagtctg 2280

agccctcagc ctgcccagct gccacgctgc atcgcacgca cgccgctcca agcagatacg 2340

cgcctgcagg ccgcagctgc agcagcagcc acgcgacacg ctcctccact cctctcccgt 2400

gcgtcgtggc agggagagag agccggaggg agagtgagtg agagaacggt cagctcgctc 2460

taccccgcgc gcccacgtcg cgtgcttgga ttggtacgag gccggcggg 2509

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gcgcattggc tctgcggggc 20

Claims

1.蛋白质，为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

(a1)调控植物穗粒数；

(a2)调控植物侧生颖花数；

(a3)调控植物一次枝梗数；

(a4)调控植物二次枝梗数；

(a5)调控植物籽粒长度；

(a6)调控植物籽粒宽度；

(a7)调控植物籽粒重量；

(a8)调控植物花序形态建成；

(a9)调控植物分枝发育。

6.一种培育植物品种的方法，为如下任一：

方法A1：一种培育具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分的植物品种的方法，包括使受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤；

(b1)穗粒数增加；

(b2)侧生颖花数增加；

(b3)一次枝梗数增加；

(b4)二次枝梗数增加；

(b5)籽粒长度减小；

(b6)籽粒宽度减小；

(b7)籽粒重量减少；

方法A2：一种培育具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分的植物品种的方法，包括使受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性降低的步骤；

(c1)穗粒数减少；

(c2)侧生颖花数减少；

(c3)一次枝梗数减少；

(c4)二次枝梗数减少；

(c5)籽粒长度增加；

(c6)籽粒宽度增加；

(c7)籽粒重量增加。

7.一种培育转基因植物的方法，为如下任一；

方法B1：一种培育具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入权利要求2或3所述的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(b1)-(b7)所示性状中全部或部分；

(b1)穗粒数增加；

(b2)侧生颖花数增加；

(b3)一次枝梗数增加；

(b4)二次枝梗数增加；

(b5)籽粒长度减小；

(b6)籽粒宽度减小；

(b7)籽粒重量减少；

方法B2：一种培育具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达权利要求1所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(c1)-(c7)所示性状中全部或部分；

(c1)穗粒数减少；

(c2)侧生颖花数减少；

(c3)一次枝梗数减少；

(c4)二次枝梗数减少；

(c5)籽粒长度增加；

(c6)籽粒宽度增加；

(c7)籽粒重量增加。

8.根据权利要求5所述的应用或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述侧生颖花数为二次枝梗上的侧生颖花数；和/或

所述籽粒重量体现为千粒重。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述核酸分子是通过重组载体的形式导入所述受体植物中的。

10.根据权利要求5-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为水稻。