CN107573411B

CN107573411B - 小麦TaZIM1-7A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

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Publication number: CN107573411B
Application number: CN201711037149.7A
Authority: CN
Inventors: 柳洪; 李甜; 王雅美; 郑军; 李慧芳; 郝晨阳; 张学勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2037-10-30
Also published as: CN107573411A

Abstract

本发明公开了一种小麦TaZIM1‑7A蛋白在调控作物抽穗期中的应用。本发明提供了TaZIM1‑7A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用；所述TaZIM1‑7A蛋白的序列为SEQ ID No.1，或将其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能，或者与其具有80％以上同源性且具有相同功能，或者在其N端和/或C端连接标签序列且具有相同功能。本发明通过转基因过表达TaZIM1‑7A可显著延迟小麦抽穗期。本发明为培育具有适应不同生态环境的作物新品种提供候选基因，同时对于认识作物抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

Description

小麦TaZIM1-7A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小麦TaZIM1-7A蛋白在调控作物抽穗期中的应用。

背景技术

抽穗是禾谷类作物(水稻、小麦、玉米等)发育完全的穗，随着茎秆的伸长而伸出顶部叶的现象。抽穗期是植物发育过程中由营养生长向生殖生长转变的一个关键的阶段(Kardailsky,I.,Shukla,V.K.,Ahn,J.H.,Dagenais,N.,Christensen,S.K.,Nguyen,J.T.,Chory,J.,Harrison,M.J.,and Weigel,D.(1999).Activation tagging of the floralinducer FT.Science 286:1962-1965.)。对作物而言，适宜的抽穗期决定作物对不同气候及生态区的适应性，同时对作物的产量产生重要的影响(Cockram,J.,Jones,H.,Leigh,F.J.,O'Sullivan,D.,Powell,W.,Laurie,D.A.,and Greenland,A.J.(2007).Control offlowering time in temperate cereals:genes,domestication,and sustainableproductivity.J.Exp.Bot.58:1231-1244.)。例如，对于我国夏季干热风剧烈发生的地区，可以适当选择一些抽穗期提前的小麦品种，这样可以在干热风发生时提前灌浆、成熟，避免遭受产量的重大损失。因此，对品种抽穗期的选择是育种过程中重要的目标之一。重要的研究表明，植物的抽穗期受光照、温度、激素以及内在的小分子的调节，因此，决定植物抽穗期的复杂性和多样性(Weng,X.Y.,Wang,L.,Wang,J.,Hu,Y.,Du,H.,Xu,C.G.,Xing,Y.Z.,Li,X.H.,Xiao,J.H.,and Zhang,Q.F.Grain number,plant height,and heading date7is acentral regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiology,2014,164:735-747.)。因此克隆一些调控抽穗期基因并解析其作用机理，可以为培育具有适应不同生态环境的小麦新品种提供候选基因，同时也可以增加对小麦抽穗调控机理的理解和认识。

小麦是全球主要粮食作物，主要产区分布全球各地。因此，适宜的抽穗期是决定小麦品种地区适应性和季节适应性的重要指标。小麦的抽穗期同样受一系列内在和外在因素的影响。目前，已知的调控小麦抽穗期的信号通路主要分为以下几个方面，光周期路径、春化路径，和自主开花路径(Chen A,Li C,Hu W,Lau MY,Lin H,Rockwell NC,Martin SS,Jernstedt JA,Lagarias JC,Dubcovsky J.(2014)PHYTOCHROME C plays a major rolein the acceleration of wheat flowering under long-day photoperiod.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:10037-10044.)。其中，在光周期路径中，PPD1、CO1、CO2作为主要的调控基因在小麦中已被克隆；在小麦花期和春化相关研究中，VRN1、VRN2与VRN3认为是春化途径中的3个关键基因(Yan,L.L,Fu,D.,Li,C.,Blechl,A.,Tranquilli,G.,Bonafede,M.,Sanchez,A.,Valarik,M.,Yasuda,S.,and Dubcovsky,J.(2006).The wheat and barleyvernalization gene VRN3is an orthologue of FT.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:19581-19586.6)；自主开花路径中，近来发掘micoRNA156、microRNA172可以直接调控抽穗期相关基因(Liu J,Cheng X,Liu P,Sun J(2017)miR156-Targeted SBP-BoxTranscription Factors Interact with DWARF53to Regulate TEOSINTE BRANCHED1andBARREN STALK1Expression in Bread Wheat.PLANT PHYSIOLOGY 174:1931-1948)。小麦具有广泛的适应性，能成功适应不同的地理和生态环境，抽穗期不可能由少数几个基因控制，必然有许多相关调控基因尚未被发现，它们的功能及机制还有待揭示。因此，对小麦开花过程相关基因进一步克隆和深入研究，对于认识小麦抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦TaZIM1-7A蛋白的新用途。

本发明所提供的小麦TaZIM1-7A的新用途，具体为：TaZIM1-7A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用。

所述TaZIM1-7A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且来源于小麦具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述相关生物材料可为能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述表达盒可由能够启动所述核酸分子转录的启动子，所述核酸分子，以及转录终止序列组成。

在所述应用中，所述调控具体可体现为：所述TaZIM1-7A蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抽穗期越延迟。

本发明还提供了一种培育抽穗期延迟的植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)。

本发明所提供的培育抽穗期延迟的植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)，包括使受体植物中TaZIM1-7A蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。其中，所述TaZIM1-7A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

其中，所述“使受体植物中TaZIM1-7A蛋白的表达量和/或活性提高”可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。在本发明中，具体是通过向受体植物中导入能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子来实现的。

相应的，本发明提供了一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抽穗期延迟。其中，所述TaZIM1-7A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在上述各应用或方法中，所述“能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子”为TaZIM1-7A蛋白的编码基因，具体可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaZIM1-7A蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaZIM1-7A蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在前文所述的培育抽穗期延迟的转基因植物的方法中，所述“向受体植物中导入能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子”可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。在本发明中，所述“向受体植物中导入能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子”具体是通过向所述受体植物中导入含有所述TaZIM1-7A的编码基因的重组表达载体实现的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pAHC-PSK、pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组载体中启动所述TaZIM1-7A蛋白的编码基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子。

更加具体的，所述重组表达载体为将所述TaZIM1-7A蛋白的编码基因插入到pAHC-PSK载体载体的多克隆位点处(SpeI和NotI)所得的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述TaZIM1-7A蛋白的编码基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在本发明中，所述抽穗期延迟具体体现为长日照(16h光照/8h黑暗)条件下或短日照(8h光照/16h黑暗)条件下或自然田间条件抽穗期的延迟。

在本发明中，每个单株的所述抽穗期的统计方法是以第一个穗抽出时记为抽穗的日期。

前文所述方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

进一步，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更加具体的，所述禾本科植物为小麦。在本发明的一个实施例中，所述小麦具体为小麦品种科农199。

本发明通过转基因过表达TaZIM1-7A，可以显著延迟小麦的抽穗期。本发明为培育具有适应不同生态环境的小麦新品种提供候选基因，同时对于认识小麦抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为TaZIM1-7A基因的PCR扩增结果。

图2为TaZIM1表达模式分析。A：qRT-PCR显示TaZIM1在不同的光照条件下呈现生物钟的表达模式。将两周的幼苗分别放置于长日照(LD,16h光照/8h黑暗)，短日照(SD，8h光照/16h黑暗)，全光照(LL)或全黑暗(DD)。白框和黑框分别代表光照和黑暗条件。以上统计数据均是2个生物学重复和三个技术性重复。TaTOC1作为正向对照，TaActin作为内参基因。B：TaZIM1组织表达。苗期根(SR)、苗期茎(SS)、苗期叶(SL)、拔节期根(RES)、拔节期茎(SES)、拔节期叶(LES)、抽穗期根(HR)、抽穗期茎(HS)、抽穗期叶(HL)、抽穗期倒2叶(HSL)、抽穗期节(HN)、抽穗期穂(HSP)、雄蕊(S)、雌蕊(P)、幼穂(YS)、花后5天(5DPA)、花后10天籽粒(10DPA)、花后15天籽粒(15DPA)、花后20天籽粒(20DPA)、花后25天籽粒(25DPA)。

图3为构建的小麦过表达转基因载体和酶切验证结果。A：小麦转基因载体结构图；B：转基因载体酶切验证(用SpeI和NotI双酶切)。

图4为PCR检测转基因阳性株系。

图5为TaZIM1-7A在转基因株系OE-L1、OE-L2和野生型WT中转录水平检测结果。

图6为TaZIM1-7A过表达株系的表型鉴定。A、C和E为自然田间条件(A)、长日照(C)或短日照(E)条件下，比较TaZIM1-OE转基因株系和野生型抽穗期相关表型。B、D和F为自然田间条件(B)、长日照(D)或短日照(F)条件TaZIM1-7A转基因株系和野生型抽穗时间。统计的数据是使用20个单株的平均值和标准差。^**P<0.01(t检验)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、TaZIM1-7A的基因克隆

供试材料：所用的小麦品种中国春为本实验室保存。中国春种子萌发后2周左右取样，采用TRIZON法提取叶片部位的RNA样品，使用5X All-In-One MasterMix反转录试剂盒(北京艾可莘生物技术有限公司)对RNA样品进行反转录得到cDNA。

一、TRIZON法提取RNA

1、取下样品后直接置于液氮中速冻，研钵(事先用清水洗干净并用DEPC水处理过夜，120℃20min灭菌2次，使用前置于-20℃预冷)用液氮预冷，将样品迅速用力研磨(中间添加液氮时应小心防止液氮溅出)后，转移到RNase-free的2ml离心管中，加入1.0ml TRIZOL，Vortex 15秒，室温静置5min，12000rpm，4℃，10分钟离心，将上清转移到一新的RNase-free的2ml离心管中。

2、加入200μl氯仿，用手晃动均匀后，室温静置3min，10000g，4℃，15分钟离心，将上清(约500μl)转移到一新的RNase-free的15ml离心管中。

3、向上清中加入1/10体积的3M NaAc，1倍体积的异丙醇，用手晃动均匀后，置于-20℃中30min，使RNA逐渐析出。10000g，4℃，10分钟，离心沉淀，将上清弃去。

4、向有RNA沉淀的1.5ml离心管中加入70％乙醇1.2ml。Vortex沉淀悬浮，反复用手晃动混匀室温静置10-15min，10000rpm，4℃，5min，离心沉淀。小心将上清倒出，注意不要将RNA倒出。重复上步一遍。将剩余乙醇吸干，置于超净台中吹干(10min)。

5、加入50μl DEPC-ddH₂O，轻弹离心管使RNA沉淀溶解，室温溶解30min。

反转录反应体系及反应条件如表1所示。

表1反转录反应体系及反应条件

二、TaZIM1基因的获得

TaZIM1引物的设计主要依据植物转录因子数据库(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)中的参考序列，上游引物包括翻译起始密码子ATG，下游引物包括终止密码子TGA。然后以反转录的中国春叶片cDNA为模板，使用引物TaZIM1-CDS-F和TaZIM1-CDS-R进行PCR扩增，引物序列如下：进行PCR扩增。

引物序列如下：

TaZIM1-CDS-F：5’-ATGGCACAGCACGACGGCAAGCCAT-3’；

TaZIM1-CDS-R：5’-TCATGTCGAAGAACCATGGTCG-3’。

PCR反应体系如表2。

表2 PCR反应体系

成分	体积(μl)
		2×pfu PCR Mastermix	5
dNTP	0.24
		TaZIM1-CDS-F(10μM)	0.5
TaZIM1-CDS-R(10μM)	0.5
		DNA模板	2
PCR enhancer	5
		ddH<sub>2</sub>0	11.76
总体积(μl)	25

反应程序：94℃3min，(94℃30sec；60℃30sec；72℃1min30sec)×36，72℃10min。

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖140V电压下电泳20min后，在1.2kb位置存在扩增条带(图1)，切下条带后使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(北京百灵克生物科技有限责任公司)回收PCR产物。再将回收的DNA片段与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物)连接20min，转化大肠杆菌感受态细胞TransT1(北京全式金生物)。过夜培养后挑单克隆，通过PCR鉴定(体系见表2)后将单克隆测序得到TaZIM1-7A的基因序列。

TaZIM1-7A的基因序列如SEQ ID No.2所示，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。

实施例2、TaZIM1-7A的表达模式分析

节律表达材料：小麦科农199种子萌发后分别放于长日照条件(16h光照/8h黑暗)，短日照条件(8h光照/16h黑暗)，普通日照条件(12h光照/12h黑暗)12天后分别置于全光照和全黑暗条件下。每隔4h取样(旗叶前5cm样品，去除1cm叶尖)。在72小时一共取样18次。使用5X ALL-IN-ONE MASTERMIX反转录试剂盒(北京艾可莘生物技术有限公司)对RNA样品进行反转录得到cDNA。

组织表达材料：选取小麦科农199苗期根(SR)、苗期茎(SS)、苗期叶(SL)、拔节期根(RES)、拔节期茎(SES)、拔节期叶(LES)、抽穗期根(HR)、抽穗期茎(HS)、抽穗期叶(HL)、抽穗期倒2叶(HSL)、抽穗期节(HN)、抽穗期穂(HS)、雄蕊(S)、雌蕊(P)、幼穂(YS)、花后5天(5DPA)、花后10天(10DPA)、花后15天(15DPA)、花后20天(20DPA)、花后25天(25DPA)的种子取样提取组织RNA，反转录后得到cDNA。

根据所得到的TaZIM1-7A的基因序列，设计一对TaZIM1-7A qRT-PCR引物。

引物序列如下：

TaZIM1-qPCR-F：5’-CCACCACGGGTAACCAGCTAA-3’；

TaZIM1-qPCR-R：5’-TCTCCCTAAACCTCATCAACGA-3’。

qRT-PCR反应体系如表3所示。

表3 qRT-PCR反应体系

成分	体积(μl)
		SYBR<sup>@</sup>Taq Ex	10
TaZIM1-qPCR-F(10μM)	0.4
		TaZIM1-qPCR-R(10μM)	0.4
模板	2
		ddH<sub>2</sub>0	7.2
总体积(μl)	20

反应程序：94℃5min，(94℃30sec；60℃30sec；72℃30sec)×40，72℃7min。

为了验证TaZIM1-7A的节律性表达模式，我们在长日照、短日照、全光照和全黑暗四种不同光照条件下通过qRT-PCR方法对TaZIM1-7A在不同时间点的表达量进行检测。同时，TaTOC1作为一个已知的小麦生物钟基因，作为阳性对照。表达模式结果见图2中A。在不同的光照条件下，TaZIM1-7A呈现生物钟的表达模式，与TaTOC1的表达模式相似，在12h达到表达的峰值。

我们还对TaZIM1-7A在小麦不同发育时期以及不同组织部位的表达水平进行了研究。如图2中B所示，TaZIM1-7A在幼穂中表达量较高，其次是叶片，在根系、雄蕊、雌蕊以及发育的籽粒中表达量较低。

实施例3、TaZIM1-7A转基因小麦的获得及表型鉴定

一、TaZIM1-7A转基因过表达载体构建

转基因载体pAHC-PSK由中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴老师提供(记载于“毕惠惠,王根平,王成社,夏兰琴.单子叶植物RNA干扰和过表达Gateway载体的构建.植物遗传资源学报[J].,2013,14(1):115-123”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。该载体的多克隆位点及两端序列详见SEQ ID No.3)。使用SpeI和NotI双酶切pAHC-PSK载体，切胶回收。以实施例1克隆的TaZIM1-7A CDS(如SEQ ID No.2所示)为模板，通过TaZIM1-OE-SpeI-F和TaZIM1-OE-NotI-R引入酶切位点SpeI和NotI，进行PCR扩增(PCR条件参照表2)，将扩增产物进行双酶切后与酶切回收的pAHC-PSK载体使用T4 DNA连接酶(北京经科宏达生物技术有限公司)连接(体系见表4)，转化到大肠杆菌感受态细胞(Trans)，获得阳性克隆。提取质粒后分别进行双酶切(图3)和测序验证，酶切后分别出现提取正确的阳性克隆，使用高浓度质粒小提中量试剂盒(北京天根)提取质粒，确保最终的质粒浓度在1μg/μl左右，将提取好的质粒载体用于后续的基因枪转化。

表4连接反应体系

成分	体积(μl)
		T4 DNA ligase Buffer	1μl
T4 DNA ligase	1μl
		载体	2μl
PCR产物	6μl
		总体积	10μl

引物序列如下：

TaZIM1-OE-SpeI-F：5’-CTAGACTAGTATGGCACAGCACGACGGCA-3’；

TaZIM1-OE-NotI-R：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATGTCGAAGAACCATGGTCG-3’。

最终，将测序表明将pAHC-PSK载体的酶切位点Spel和Notl之间的小片段替换为SEQ ID No.2所示DNA片段后的重组质粒命名为pAHC-PSK-TaZIM1-7A。重组载体pAHC-PSK-TaZIM1-7A中启动TaZIM1-7A基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子。

二、基因枪转化

1、金粉准备：将称量好的金粉用70％酒精清洗，震荡3min,然后离心10000rmp/min，10s，弃去上清液，重复3次，加入无菌水，浓度为40mg/ml。

2、样品混合(10枪的量)：

金粉(40mg/ml)：20μl

DNA(1ug/μl)：10μl

CaCl₂(2.5M)：10μl

亚精胺：10μl

3、样品混匀后，冰浴15min，然后离心10000rmp/min，10s，弃掉上清液，加入100％无水乙醇(100μl/枪)，混匀。

4、离心10000rmp/min，10s，弃上清，加入100％无水乙醇，20μl/枪。

5、每枪上样15μl。

三、组织培养

1、选取开花12天的科农199幼胚，用70％酒精洗1min，清水冲洗1遍，再用2％次氯酸钠灭菌20min，无菌水清洗5-6遍。

2、用显微镜剥去幼胚，高渗处理4h(高渗培养基：MS盐4.4g/L，2,4-D 5mg/L，0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇，蔗糖30g/L，pH 5.8；植物凝胶3g/L)。然后进行基因枪轰击。轰击后，22℃，暗培养16h，

3、恢复培养，24℃，暗培养2周。该步骤使用W1培养基，为在MS盐4.4g/L中添加以下物质：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)至终浓度为1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT)至终浓度为0.5mg/L，水解酪蛋白至终浓度为500mg/L，L-天门冬酰胺至终浓度为250mg/L，L-谷氨酰胺至终浓度为200mg/L，盐酸硫胺素(VB1)至终浓度为8.0mg/L，蔗糖至终浓度为15000mg/L，麦芽糖至终浓度为15000mg/L，琼脂至终浓度为5000mg/L。

4、再生培养，24℃，16h光照，8h黑暗，培养4周，每两周继代一次。该步骤使用W2培养基，为以MS培养基为基准，添加以下物质：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)至终浓度为1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT)至终浓度为0.5mg/L，α-萘乙酸(NAA)至终浓度为0.01mg/L，水解酪蛋白至终浓度为500mg/L，L-天门冬酰胺至终浓度为250mg/L，L-谷氨酰胺至终浓度为200mg/L，盐酸硫胺素(VB1)至终浓度为8.0mg/L，PPT至终浓度为5mg/L，蔗糖至终浓度为15000mg/L，麦芽糖至终浓度为15000mg/L，琼脂至终浓度为5000mg/L。

5、生根培养，24℃，16h光照，8h黑暗，培养4周，每两周继代一次。该步骤使用W3培养基，配方如下：MS盐2.2g/L，MES 0.5g/L，蔗糖30g/L pH 5.8；植物凝胶3.0g/L，PPT 5mg/L。

6、当转基因植株长至10cm左右，可移栽到温室，直径12cm的花盆，每盆一株。苗期生长温度为，光照20℃，黑暗15℃。孕穗期生长温度为，光照28℃，黑暗20℃，得到T1代种子。

将T1代种子种于大田后得到T1代株系，将每个单株分别取样进行PCR阳性鉴定(引物如下)，得到转基因阳性株系。T1代株系自交后获得T2代种子，T2代株系同样阳性鉴定后自交得到T3代种子。

转基因株系阳性鉴定PCR引物：

PSK-TJC-F1：5’-TATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCT-3’；

2C-TJC-OVER-R：5’-TTCCGCTCTTTCCGCTTCTCCCTAA-3’。

经PCR鉴定，能够得到大小约为805bp目的条带的株系为阳性株系(见图4)。从阳性株系中随机选取两株，分别编号为OE-L1和OE-L2。

实验同时设置向小麦品种科农199中转入pAHC-PSK空载体的对照。

四、TaZIM1-7A的转基因小麦表型鉴定

将T3代种子种于自然田间、长日照(16h光照/8h黑暗)和短日照(8h光照/16h黑暗)温室三种条件下观察转基因过表达株系的表型。

首先，我们通过qRT-PCR方法检测了OE-L1和OE-L2两个代表性的转基因株系中TaZIM1-7A的表达量。qRT-PCR具体参见实施例2中相关步骤。

结果如图5所示，OE-L1和OE-L2株系中TaZIM1-7A的表达量分别是野生型的5.3和7.8倍。另外，空载对照株系中TaZIM1-7A的表达量与野生型相比基本一致，无统计学差异。

同时，每个单株抽穗期统计方法是以第一个穗抽出时记为抽穗的日期。在田间条件下，OE-L1和OE-L2两个株系平均抽穗期分别比野生型晚3.6天和4.3天(图6中A和6中B)；OE-L1和OE-L2两个株系抽穗期在长日照和短日照条件下均出现一定的延迟，其中，长日照分别延迟4.8天和5.7天(图6中C和图6中D)，短日照延迟1.6天和2天(图6中E和图6中F)。另外，空载对照株系各条件下的抽穗期与野生型相比基本一致，无统计学差异。因此，过表达TaZIM1-7A可以显著延迟小麦的抽穗期，其中，在长日照条件下的效应显著高于短日照。根据以上结果可知，TaZIM1-7A作为一个生物钟表达节律基因可以显著调节小麦的生育期。

在田间育种过程中，合适的抽穗期和成熟期是保证高产和稳产的前提，未来我们可以利用TaZIM1-7A在不同育种材料表达量、等位基因功能差异以及基因编辑技术来调节品种的生育期，根据抽穗期多样性显著提高优异品种的适应性。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦TaZIM1-7A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

<130> GNCLN171933

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 397

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivuml L.）

<400> 1

Met Ala Gln His Asp Gly Lys Pro Tyr Gln Pro Arg Arg Gly Pro Glu

1 5 10 15

Arg Pro Pro Gln Pro Ala Glu Asp Pro Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro

20 25 30

Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp Ala Val Ile Asp His Leu Ala Ala

35 40 45

Val Ala Ala Glu Ala Glu Ala Leu Asn Ala Ser Ile Ala Ala Val Ala

50 55 60

Ala Glu Ala Glu Ala Met Asn Ala Tyr Glu His Ala Gln Glu Gln Glu

65 70 75 80

Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met

85 90 95

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Gly Glu Gly Asp Gly Gln His Gly Gly Asn

100 105 110

Gly Glu Ser Val Pro Ile Asp Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Leu Asp Pro His Gly Ala Met Val Ser

130 135 140

Ala Ile Val Pro Pro Thr Thr Gly Asn Gln Leu Thr Leu Ser Phe Gln

145 150 155 160

Gly Glu Val Tyr Val Phe Asp Ser Val Ser Pro Asp Lys Val Gln Ala

165 170 175

Val Leu Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Leu Asn Pro Gly Met Gly Ala

180 185 190

Gly Ala Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Ser Lys Arg Leu Asn Phe Pro His

195 200 205

Arg Val Ala Ser Leu Met Arg Phe Arg Glu Lys Arg Lys Glu Arg Asn

210 215 220

Phe Asp Lys Lys Ile Arg Tyr Thr Val Arg Lys Glu Val Ala Leu Arg

225 230 235 240

Met Gln Arg Asn Arg Gly Gln Phe Thr Ser Ser Lys Pro Lys Pro Asp

245 250 255

Asp Gly Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ala Asp Gly Ser Pro Asn Trp Gly

260 265 270

Ser Val Glu Gly Arg Pro Pro Ser Ala Ala Ser Cys His His Cys Gly

275 280 285

Thr Asn Ala His Asn Thr Pro Met Met Arg Arg Gly Pro Glu Gly Pro

290 295 300

Arg Thr Leu Cys Asn Ala Cys Gly Leu Met Trp Ala Asn Lys Gly Met

305 310 315 320

Leu Arg Asp Leu Ser Lys Ser Thr Pro Pro Ser Leu Gln Met Val Ser

325 330 335

Thr Gly Pro Asn Asp Ser Gln Asn Gly Asn Thr Leu Ser Gln Gln Asn

340 345 350

Gly Asn Thr Leu Ser Gln Gln Asn Gly Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asn

355 360 365

Gly Asn Ala Ala Ile Val Pro Phe Ala Glu Gln Gln Asn Pro Ala Pro

370 375 380

Ala Thr Asp Ala Asn Gly His Asp His Gly Ser Ser Thr

385 390 395

<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivuml L.）

<400> 2

atggcacagc acgacggcaa gccataccag ccacgccggg gccccgagcg ccccccgcag 60

ccggcggagg acccgcccgc gcccgccgct gcgcccgccg ctgcgcccgc agcagcggac 120

gccgtgattg accacctcgc ggccgtggct gccgaggcgg aggccttgaa cgcgtccatc 180

gcggccgtcg cggccgaggc ggaggcgatg aacgcgtacg agcacgcgca ggagcaggag 240

atggaggagg aagaggagga ggaggaagag gaggaagagg aggagatgga ggaggacgac 300

gacgatggcg agggggacgg gcagcacggc ggcaacgggg agtccgtccc aatagacgcc 360

gaggccgcgg cacaggcggc tgctgcagct gcggccggcg caccgttgga cccgcacggg 420

gcgatggtct ctgcgattgt gccgcccacc acgggtaacc agctcactct ttcatttcag 480

ggcgaggtct acgtgttcga ctctgtttcc cctgataagg tgcaagctgt gcttttgctg 540

ctagggggaa gggagctgaa tccaggcatg ggtgccggag catcatcatc tactccatac 600

agtaagaggt tgaattttcc acaccgggtg gcatcgttga tgaggtttag ggagaagcgg 660

aaagagcgga actttgataa gaagatccgg tatacagttc gcaaggaagt tgcactaagg 720

atgcagcgta atagaggcca atttacatct tcaaaaccaa aacctgatga cggaacatct 780

gaactggcaa ctgcagatgg ctccccaaat tggggatcag tggaaggtcg acctccgtct 840

gctgcttcat gccatcactg tggtactaat gcacataata cacctatgat gcgtcgtgga 900

cctgaagggc caagaacatt atgcaatgct tgcggcctca tgtgggcaaa taagggcatg 960

ttgagggacc tatcaaagtc tactccccca tctcttcaaa tggtgtcaac aggtccaaat 1020

gatagtcaga atggaaacac cctctctcag cagaatggaa acaccctctc tcagcagaat 1080

ggaagcaccc tctctcagca gaatggaaat gctgccatag tgccctttgc cgagcaacaa 1140

aacccagcac cagcgaccga tgccaacggt cacgaccatg gttcttcgac atga 1194

<210> 3

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga 60

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata 120

tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat 180

aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc 240

agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact 300

gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag 360

gatccccggg ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tcgaatttcc 420

ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 480

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 540

gcatgacgtt att 553

Claims

1.TaZIM1-7A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用；

所述TaZIM1-7A蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述相关生物材料为能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述植物为小麦。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TaZIM1-7A蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抽穗期越延迟。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述核酸分子是SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.一种培育抽穗期延迟的植物的方法，包括使受体植物中TaZIM1-7A蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述TaZIM1-7A蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为小麦。

5.一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达所述TaZIM1-7A蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抽穗期延迟；

所述TaZIM1-7A蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为小麦。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸分子是SEQ ID No.2所示的DNA分子。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：向所述受体植物中导入所述核酸分子是通过向所述受体植物中导入含有所述TaZIM1-7A蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

8.权利要求4-7中任一所述的方法在小麦育种中的应用。