CN107903311B - 水稻卷叶控制基因lrrk1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公布了一个水稻卷叶控制基因LRRK1的克隆及应用。LRRK1属于类受体胞质激酶（RLCK）家族。研究发现，在水稻中过量表达LRRK1可以使转基因水稻的叶片发生卷曲，使叶片不披垂，提高叶片直立性和群体透光率。在合理密植条件下，LRRK1过量表达转基因水稻的有效穗比野生型的显著增多。因此，LRRK1的分离和鉴定对阐明水稻卷叶调控网络具有一定的理论和现实意义，同时LRRK1对构建水稻的理想株型及改善水稻农艺性状方面具有重要的利用价值。

Description

水稻卷叶控制基因LRRK1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及水稻卷叶调控基因LRRK1及其应用。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，随着人口数量的不断增加和耕地面积的不断减少，使得人们对提高水稻产量的需求日益迫切，而进一步提高水稻总产量只能通过提高水稻的单产来实现，而改良水稻株型是提高水稻产量的重要途径。

水稻叶片是光合作用的主要器官，也是产量形成的决定性因子，因此水稻叶片形态改良一直是株型改良的重要目标。叶片的适度卷曲有利于水稻个体和群体透光性的改善，一方面可以缩小叶片与茎杆的夹角，使叶片直立，从而使叶片上下2个面的受光态势得到改善，反射率降低，提高光合强度。另一方面，适度的叶片卷曲可以保持叶片不披垂，提高叶片直立性，进而提高群体透光率，改善群体中后期基部的光照条件，有利于水稻产量的提高。在群体生长的中后期保证中下部的光照条件，提高了叶面积指数，增加光合面积，提高光能的利用率，从而提高水稻产量。

因此，卷叶是水稻宝贵的遗传资源，合理的利用卷叶进行水稻育种，以及对相关卷叶基因的克隆和功能分析，对构建水稻的理想株型和提高水稻产量具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种水稻卷叶控制基因及其编码蛋白，该基因从水稻幼苗期开始调控水稻卷叶的发生，具体表现为使水稻叶片向上卷曲，该基因通过调控水稻泡状细胞的发生从而控制水稻卷叶的发生，并且在合理密植的条件下可以提高水稻植株的有效穗。该基因对于水稻卷叶分子机制的研究，以及水稻株型的调控具有重要的理论和实际意义，并为改良作物的株型提供了一条快速、有效的途径，本发明在农业领域具有广阔的应用前景。

本发明所提供的水稻卷叶控制基因的相关蛋白，名称为LRRK1，来源于水稻（Oryza sativa L.），是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1）序列表中的SEQ ID No：3；

2）将序列表中SEQ ID No：3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控水稻卷叶功能的蛋白质。

序列表中的序列3由367个氨基酸残基组成。

同时，本发明还提供LRRK1的编码基因，LRRK1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID No：2的DNA序列；

2）编码序列表中SEQ ID No：3蛋白质序列的多核苷酸；

3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4）与序列表中SEQ ID No：2限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列2由1104个碱基组成，其开放阅读框（ORF）为自5’端第1位至1104位碱基。

LRRK1的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

2）编码序列表中SEQ ID No：3蛋白质序列的多核苷酸；

3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4）与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1为LRRK1的基因组序列，包含了3000个碱基，该基因含有4个外显子（序列1的 5’端起：183-253，987-1131，1626-1888，2011-2635）和3个内含子（序列 1的5’端起：254-986，1132-1625，1889-2010）。

所述高严谨条件可为在 0.1×SSPE(或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有LRRK1的表达载体，转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

LRRK1的基因表达为组成型表达。

扩增LRRK1基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。

本发明的还提供一种调控水稻卷叶的方法：是将所述调控水稻卷叶的基因LRRK1导入水稻组织或细胞，水稻卷叶获得调控。

所述水稻卷叶控制基因LRRK1可通过含有LRRK1的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物基因枪轰击的载体等，如pCAMBIA1301-UbiN(GenBank 号：AF234296)、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300或其他衍生植物表达载体。

使用LRRK1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素化基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入选择性标记（GUS基因、GFP、YFP、As-Red和荧光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记基因（潮霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、博莱霉素等）。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。

含有本发明的LRRK1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。

本发明具有以下有益效果：

水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，世界上近一半人口，都以大米为食。随着粮食需求持续增加以及耕地面积不断减少，育种专家乃至普通民众都在关注水稻产量的提高。在水稻的理想株型塑造中，特别关注水稻叶的直立和卷曲度，而水稻叶片特别是上面3片功能叶保持“短、厚、直立”，可以直接提高群体的受光效率和叶面积指数，进而提高群体的受光条件，从而稳定地提高水稻的产量。上世纪80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状，外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。在水稻中过量表达LRRK1基因可以使转基因水稻的叶片发生适度卷曲，使叶片直立不披垂，减少叶片之间的阴影，进而有效地改善水稻群体基部的受光条件，提高群体光合效率。在合理密植条件下LRRK1的过表达转基因植株可以显著的增加转基因水稻的有效穗，从而为提高水稻产量提供了一个很好的途径。

本发明提供了一个水稻卷叶控制基因及其编码蛋白。该基因从水稻幼苗期开始调控水稻卷叶的发生，具体表现为使水稻叶片向上卷曲。LRRK1基因通过调控水稻泡状细胞的发生从而控制水稻卷叶的发生，并且在合理密植的条件下可以提高水稻植株的有效穗。该基因对于水稻卷叶分子机制的研究，以及水稻株型的调控具有重要的理论和实际意义，并为改良作物的株型提供了一条快速、有效的途径，本发明在农业领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 pCAMBIA1301GW载体图谱（改造后的pCAMBIA1301载体）。

图2 LRRK1的基因结构分析。

图3 pCAMBIA1301GW-LRRK1载体构建图谱。

图4 LRRK1过表达植株的卷叶表型鉴定

图5 LRRK1过表达植株的分子鉴定

图6 LRRK1过表达植株叶片泡状细胞的面积和含水量分析

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。

1. LRRK1基因的克隆

从水稻数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中下载LRRK1（LOC_Os06g07）的编码序列，并用引物设计软件Primer Premier 5设计扩增LRRK1全长的特异性正向引物LRRK1-F: 5' ATGCACCCGAAGCTGTCG 3' 和反向引物5' TGCCGCTGCCAATTCTTG3'，然后在正向引物和反向引物的5’端分别添加Gateway的接头5' GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC 3'和5' GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC 3'，以日本晴（Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare）的cDNA为模板，利用RT-PCR方法克隆LRRK1基因。通过同源重组的方法将LRRK1基因克隆到GATEWAY入门载体PGWC中并测序。测序正确后将其通过LR反应重组到改造后的pCAMBIA1301GW载体中。改造后的pCAMBIA1301GW载体含有潮霉素抗性筛选基因HPT和红色荧光蛋白筛选标记基因AsRed（图1）。

2. LRRK1基因的分子特征

通过比较日本晴的LRRK1的cDNA及其基因组DNA序列，发现LRRK1共有4个外显子（SEQ ID No:1的 5’端起：183-253，987-1131，1626-1888，2011-2635），3个内含子（SEQ IDNo:1的 5’端起：254-986，1132-1625，1889-2010)；其基因组全长为3000 bp（SEQ ID No:1），cDNA全长为1104 bp（SEQ ID No:2），其开放阅读框架为SEQ ID No:2自5’端第1至1104位点共有1104个碱基；该基因编码蛋白长度为367个氨基酸（图2）。

3. LRRK1基因的功能

（1）水稻转化

将构建好的pCAMBIA1301GW-LRRK1（图3）载体通过电击转化转入农杆菌（Agrobacterium）株系EHA105中。然后用含有重组质粒pCAMBIA1301GW-PcGDH的农杆菌侵染Kitaake水稻品种的愈伤组织，将浸染后的愈伤组织共培养3天（避光，28 ℃），再经过含有50 mg/L潮霉素的筛选培养基上进行抗性愈伤的筛选以及分化培养基分化出抗性幼苗，然后将分化出的水稻植株在阴凉处水培炼苗1周，然后移栽至大田。

（2）转基因植株的鉴定及表型分析

对T₀代转基因植株进行叶片表型观察，2个独立的转基因株系Ubi::LRRK1-22和Ubi::LRRK1-27从幼苗期（图4a,b）到成熟期（图4c,d）都具有明显的卷叶表型，同时发明人对Ubi::LRRK1-22和Ubi::LRRK1-27株系进行了LRRK1的mRNA表达水平以及蛋白表达水平的分析，结果说明在Ubi::LRRK1-22和Ubi::LRRK1-27株系中LRRK1的mRNA表达量是超表达的（图5a），并且LRRK1-FLAG的融合蛋白能正常表达（图5b）。

（3）LRRK1过表达植株卷叶的细胞形态分析

为了研究LRRK1过表达植株卷叶中细胞形态的变化，我们将卷叶横切制成石蜡切片，观察细胞形态的变化。发现LRRK1过表达植株叶片的泡状细胞面积跟野生型相比明显的减少（图6a-d），同时泡状细胞的含水量与野生型相比也明显的减少（图6e），进一步我们用甲苯安蓝染色显示，在LRRK1过表达植株叶片中的泡状细胞的面积确实是比野生型要少（图6f）。因此，LRRK1过表达植株卷叶的发生是由于其泡状细胞面积减少导致的。

（4）合理密植田间分析

适当的叶片卷曲可以使叶片保持直立，在水稻群体中可以增加光的通透性，使水稻植株的下部的受光条件得到改善，增加群体的光合效率，从而提高产量。因此，本发明人通过在田间对Ubi::LRRK1-22和Ubi::LRRK1-27株系进行合理密植，发现在正常密度条件下转基因植株的结实率比对照要低，并且单株产量也比对照低，但是在合理密植条件下，虽然转基因植株的结实率比对照低，但是转基因植株的有效穗却比对照要高（表1）。因此，在合理密植条件下，LRRK1的过表达转基因植株可能通过增加了群体的光合效率增加了转基因植株的有效穗。

表1不同种植密度条件下野生型和LRRK1过表达植株农艺性状分析。

<110>湖南大学

<120>水稻卷叶控制基因LRRK1及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 3000

<212> DNA

<213>水稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

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<213>水稻属水稻(Oryza sativa L.)

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<213>水稻属水稻(Oryza sativa L.)

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Claims (6)

1.一种水稻卷叶控制蛋白编码基因在培育植物品种中的应用，其特征在于：植物叶片卷叶形态发生变化，所述植物为水稻；所述水稻卷叶控制蛋白编码基因在水稻中过表达，其所编码的蛋白质氨基酸序列SEQ ID No:3所示。

2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻卷叶控制蛋白编码基因的核苷酸如SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：是将所述水稻卷叶控制蛋白编码基因导入目标植物中，并进行过量表达，以获得对卷叶的调控。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述导入是通过含有所述水稻卷叶控制蛋白编码基因的植物表达载体导入外植体。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体为双元农杆菌载体，或可用于植物基因枪轰击的载体。

6.如权利要求5的应用，其特征在于：所述植物表达载体含有增强型，或诱导型启动子。

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