CN111235179B

CN111235179B - OsABA8ox2启动子在根分生组织、颖花和灌浆期种子中的表达应用

Info

Publication number: CN111235179B
Application number: CN202010086903.1A
Authority: CN
Inventors: 张艳
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-11-11
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2039-11-11
Also published as: CN110577938A; CN111235179A; CN110577938B

Abstract

本发明涉及脱落酸（abscisic acid,ABA）8’‑羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用，属于植物基因工程与遗传改良。水稻ABA 8’‑羟化酶基因OsABA8ox2的蛋白产物氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明中通过基因编辑技术敲除OsABA8ox2后可以正向调控弱光或遮荫条件下的光形态建成，缓解避荫反应，提高植物耐荫性；可以优化干旱胁迫下根系结构以提高植物耐旱性。这些性状改良对作物生产和城市立体绿化具有重大应用价值。

Description

OsABA8ox2启动子在根分生组织、颖花和灌浆期种子中的表达应用

原案申请号：2019110929159

原案申请日：20191111

原案申请人：中国农业科学院生物技术研究所

原案申请名称：ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。

技术领域

本发明涉及植物基因工程与遗传改良，具体涉及ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。

背景技术

植物作为光合自养生物，对光环境是非常敏感和灵巧的。光形态建成和暗形态建成是植物采用的两套截然不同的发育程序以应对环境光线（Trends in plant science,Xu et al. 2015）。中国西南部地区的四川和贵州等地几乎全年都处于弱光环境下（中国油料作物学报，范元芳等，2016）。黄淮海等地区持续或频繁的阴雨寡照天气对水稻、玉米等作物生产带来非常不利的影响。现代农业生产上采取的密植或间作套种会加剧作物群体对光的竞争。随着我国城市化进程的加快，很多土地因处于建筑包围之中而形成荫蔽的环境。总之，弱光照或遮荫条件影响非耐荫植物光形态建成，往往出现避荫反应（过度伸长生长，茎秆纤细，易倒伏等），影响植物生长、抗逆能力和最终品质和产量。因此开发提高植物耐荫性的方法具有巨大的应用价值。植物耐荫性是指植物在弱光照条件下的生活能力，是植物为适应低光量子密度，维持自身正常生长发育而产生的一系列变化（热带农业科学，安锋和林位夫，2005；安徽农业科学，代慧等，2015），是植物的一项重要性状。植物面对弱光和遮荫会采取两种应对策略：避荫反应和耐荫反应（分子植物育种，温冰消等，2019）。伸长反应是避荫反应的主要表现之一（Current Opinion in Plant Biology，Fraser et al. 2016）。相比耐荫能力弱的植物，耐荫性强的植物伸长反应相对不明显。PIF（phytochrome-interacting factor）蛋白促进伸长反应的机制之一是其介导了YUCCA基因上调表达（Genes & Development, Li et al. 2012），提高生长素合成量。还存在避荫反应的拮抗因子，如PAR1和PAR2蛋白（The EMBO Journal, Roig-Villanova et al. 2007）。除了利用耐荫基因，抑制避荫反应的调控途径可能是产生耐荫反应的另一机制（Current Opinion inPlant Biology，Vandenbussche et al. 2005）。下调/抑制避荫基因的功能是提高植物耐荫性的技术思路之一。当前研究主要聚焦于植物对光信号的响应，如光敏色素相互作用因子PIF通过光敏色素信号途径（phyB-PIF）响应不断变化的光环境（Plant physiology, Wuet al. 2019）。耐荫植物适应弱光环境的主要机制是最大化的吸收光量子进行光合作用（湖南林业科技，黄笛和吴铁明，2011）。光与ABA信号途径的交叉在拟南芥中已有报道。BBX21，一个B-box蛋白，调控光形态建成，也参与到ABA信号途径（PLoS genetics, Xu etal. 2014）。HY5是ABI5（ABA INSENSITIVE 5）转录的直接激活子。BBX21通过干扰HY5与ABI5启动子的结合，负调控ABI5表达。ABA分解是调控植物体内ABA浓度的重要途径之一。ABA8’-羟化酶是ABA分解途径的关键酶，在水稻中由OsABA8ox1, OsABA8ox2和OsABA8ox3编码（Plant & cell physiology, Saika et al. 2007）。我国对植物耐荫性的研究始于20世纪70年代，起步较晚（湖南林业科技，黄笛和吴铁明，2011）。目前对植物耐荫分子机制仍很不清楚，尤其缺乏对ABA分解途径关键基因参与光形态建成、避荫反应和耐荫调控的相关研究。

随着世界气候变暖，极端天气条件越来越频繁出现，干旱是其中之一。干旱胁迫（水缺乏）会严重限制农业生产。水分可获取性对植物生存和充足生长起决定作用。根伸长生长到达更深土壤层以吸收足够的水分和营养对大部分植物的生存和生长至关重要。因此根系结构对植物生存至关重要。干旱耐受强的植物可以通过适当优化根系结构去适应缺水土壤环境。因此挖掘和应用重要的根系结构形成基因来增强作物干旱耐受，在极端天气越发频繁的趋势下，具有重要的价值。当光照不足时，植物变得细弱，叶片变长、变窄、变薄，向下输送的光合产物减少，影响根部生长，根系变浅（热带农业科学，安锋和林位夫，2005）。并在一定范围内，随着遮荫程度的加剧，根在全株总重中占比减少，而叶增加。因此正向调控弱光下的光形态建成，提高植物耐荫性，对植物根的生长和发育、根系结构优化是非常有益的。ABA处理24小时后显著增加了主根伸长率和根毛密度，而FLU（fluridone，氟啶草酮，ABA合成抑制剂）处理则是显著抑制（New Phytologist, Xu et al. 2013）。拟南芥ABA合成突变体aba3-1的主根伸长率和根毛密度与野生型相比是严重下降的，指出ABA对适度水胁迫下根尖响应的作用（New Phytologist, Xu et al. 2013）。与野生型水稻苗相比，OsABA8ox3 RNA干扰（RNAi）转基因系在干旱胁迫耐受方面有很大提高（PLoS One, Cai etal. 2015），但缺乏RNAi株系根发育和根系结构的研究结果。申请人的客座研究生韩璐的硕士学位论文（OsABA8ox2-RNAi转基因水稻鉴定及ABA相关基因表达分析，《中国优秀硕士学位论文全文数据库》基础科学辑，A006-307，20150115）指出对三叶期 OsABA8ox2-RNAi 转基因水稻用20% PEG 6000处理后存活率显著高于野生型，但在方法中写到：“20%的PEG6000模拟干旱胁迫：20g PEG 6000溶于1L的培养液。”。是20% PEG 6000还是2%，存在疑问，并且也未对RNAi转基因水稻根发育和根系结构进行研究。通过RNAi技术下调基因表达和功能，其精准性和灵活性远远逊于目前火热发展的基因编辑技术。美国专利“Cereals WithAltered Dormancy”（专利号：US 8269082 B2；专利日期：2012年9月18日）公开了具ABA 8’-羟化酶活性的多肽和编码这些蛋白的多核苷酸影响种子萌发率和休眠。

综上，目前还没有OsABA8ox家族基因参与植物光形态建成和根发育的相关报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。

本发明提供的技术方案是：通过失活植物体内ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2功能缓解植物避荫反应，提高耐荫性，优化干旱胁迫下根系结构。

从OsABA8ox2编码序列（SEQ ID No：4）选取了一条19 bp的特异编辑靶序列（SEQID No：6），利用T4 DNA Ligase （NEB, Ipswich, MA, USA）构建敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2。通过农杆菌介导的转化获得了靶序列插入1个碱基和缺失2个碱基的水稻株系。突变的靶序列如SEQ ID No：7 和 SEQ ID No：8所示。OsABA8ox2编码序列（codingsequence, CDS）中靠近其5’端出现移码突变，突变后氨基酸序列如SEQ ID No：2和SEQ IDNo：3所示。所有的纯合OsABA8ox2敲除株系与野生型水稻相比，均表现为株高降低，叶片变短，耐荫性增强和根系优化。所述OsABA8ox2蛋白具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。所述植物为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明的实施例中，所述植物为单子叶植物水稻，具体为粳稻品种Kitaake。

将完整的OsABA8ox2编码序列（SEQ ID No：4）通过同源重组方法整合进改造的并经BamHⅠ (NEB)和SacⅠ (NEB)双酶切后的pCAMBIA1303载体，使其受Ubi-1启动子驱动。利用农杆菌介导的转化获得Kitaake为背景的OsABA8ox2过表达转基因水稻株系。与野生型相比，过表达株系叶伸长和株高显著增加，避荫反应加强；根伸长受到严重抑制，根系总长显著变短。

将OsABA8ox家族3个启动子（SEQ ID No：5, SEQ ID No：9和SEQ ID No：10）分别与β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）融合构建pCAMBIA1303-PRO _OsABA8ox :GUS载体，利用农杆菌介导的转化获得Kitaake为背景的转基因水稻株系。通过GUS染色分析了OsABA8ox家族3个启动子活性，特别是OsABA8ox2的启动子活性。OsABA8ox2在苗期根分生组织区有强表达。在颖花和灌浆期种子中有较强表达。

本发明的有益效果是：

1. 本发明通过基因编辑技术获得的OsABA8ox2敲除水稻株系，在一定弱光条件下，避荫反应不明显，耐荫性显著提高，水稻植株光形态建成良好。

2. 本发明通过基因编辑技术获得的OsABA8ox2敲除水稻株系，在一定时间内的土壤干旱胁迫条件下，与野生型水稻相比，发展出更适合缺水环境的根系结构，因此具有更高的生存能力。

3. OsABA8ox2既是新发现的避荫基因，又是一个新的根系结构形成相关基因，因此OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的科学合理应用对水稻等禾本科作物及其他植物的遗传改良具有很大价值，应用前景广阔。

4. OsABA8ox2在苗期根分生组织区强表达，在颖花和灌浆期种子中较强表达。OsABA8ox2的启动子具有在根分生组织、颖花和灌浆期种子强启动活性。

附图说明

图1 — OsABA8ox2敲除（knockout, KO）水稻株系的鉴定。

图2 — OsABA8ox2过表达（overexpression, OE）水稻株系的鉴定。

图3 — OsABA8ox2敲除（KO）和过表达（OE）水稻株系在弱光照下光形态建成表型，叶长和株高统计结果。** 指出KO（或OE）苗和野生型之间的显著性差异（Student’s ttest，** P < 0.01）。

图4 — 自然弱光条件下OsABA8ox2敲除（KO）水稻株系呈现高耐荫性，过表达（OE）株系呈现强避荫反应。

图5 — 叶中ABA和IAA含量。星号指出KO（或OE）苗和野生型之间的显著性差异（Student’s t test，* P < 0.05，** P < 0.01）。

图6 — 根的表型观察。

图7 — OsABA8ox2敲除（KO）和过表达（OE）水稻株系耐旱性分析。** 指出KO（或OE）苗和野生型之间的显著性差异（Student’s t test，** P < 0.01）。

图8 — OsABA8ox启动子与β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）融合表达转基因水稻株系的GUS染色分析。

图9 — OsABA8ox2启动子与GUS融合表达转基因水稻株系的GUS染色分析。

序列列表说明

SEQ ID No：1 — OsABA8ox2蛋白产物氨基酸序列，

SEQ ID No：2 — OsABA8ox2突变蛋白产物氨基酸序列，

SEQ ID No：3 — OsABA8ox2突变蛋白产物氨基酸序列，

SEQ ID No：4 — OsABA8ox2编码DNA序列，

SEQ ID No：5 — OsABA8ox2启动子序列，

SEQ ID No：6 — 19bp编辑靶序列，

SEQ ID No：7 — 突变的靶序列，

SEQ ID No：8 — 突变的靶序列，

SEQ ID No：9 — OsABA8ox1启动子序列，

SEQ ID No：10 — OsABA8ox3启动子序列。

具体实施方式

下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1

OsABA8ox2敲除载体的构建和基因编辑植物（OsABA8ox2敲除水稻株系）的获得

一、OsABA8ox2敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2的构建

利用E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)选定了一条19 bp的特异靶序列用于产生sgRNA（single-guide RNA）。该序列（SEQ ID No：6）位于OsABA8ox2全长1533 bp的CDS序列（SEQ ID No：4）的92-110 bp处（5’-GGAGGAGAGATGTTGGACA-3’）。合成引物对OsABA8ox2-CRIS （表1），采用如下体系将序列5’端加上磷酸基团：

OsABA8ox2-CRISF (10 mM) 1μl

OsABA8ox2-CRISR (10 mM) 1μl,

10x T4 DNA Ligase Buffer (with 10 mM ATP) 2μl,

T4 polynucleotide kinase (3’ phosphatase plus；NEB) 1μl,

H₂O 15μl.

37℃ 40 min, 65℃ 20 min（酶热失活），94℃ 5 min, 50℃ 2 min.

质粒pHUN4c12（In Vitro Mutagenesis，Xu et al. 2017）经BsaⅠ（NEB）酶切，体系如下：

pHUN4c12 3μl (0.3μg/μl),

10x CutSmart Buffer 2μl,

BsaⅠ (NEB) 1μl,

H₂O 14μl.

共3管。37℃ 5 h，65℃ 20 min（酶热失活）。3管酶切液60μl补足至200μl，加2.5倍无水乙醇，混匀后放-80℃ 1 h。12000 rpm 12 min 离心沉淀，晾干后加20μl H₂O溶解。

然后将加磷酸基团后的OsABA8ox2-CRIS序列通过T4 DNA Ligase（NEB）连接到上述酶切过的pHUN4c12载体。

二、基因编辑植物（OsABA8ox2敲除水稻株系）的获得

将构建好的敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2按照产品说明书操作方法（热击法）转入农杆菌EHA105 (pSoup)感受态细胞（2^nd Lab，上海）。水稻转化工作委托未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司完成。简述如下：将含有pHUN4c12-OsABA8ox2的农杆菌EHA105 (pSoup)侵染粳稻品种Kitaake愈伤组织，再转到共培养基上24℃暗培养2-4天，清洗后的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选，经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4 cm时转到生根培养基上生长3周左右。生长良好的小苗（T₀代）经3天炼苗后即可移栽至土中。收到种子再种下去，得到T₁代。

三、OsABA8ox2敲除水稻株系的鉴定

首先鉴定T₀代敲除水稻株系是否整合进了含有OsABA8ox2-CRIS的T-DNA片段。以野生型和T₀代苗叶片基因组DNA为模板，用U3bF/UbiR（表1）进行PCR （polymerase chainreaction）扩增，有特异扩增带者为转基因阳性植株（图1A）。在水稻基因组靶序列两侧设计特异引物OsABA8ox2-target（表1），进行PCR扩增（图1B），再通过测序检测T₀代靶序列信息。得到8个杂合突变体和4个纯合突变体，图1C示其中2个纯合突变体KO1和KO2，突变的靶序列分别如SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示。KO1在全长1533bp的CDS序列的107和108bp之间插入1个G。KO2的CDS中105和106bp处的TG缺失。OsABA8ox2 CDS突变位点靠近其5’端，并出现移码突变，突变后氨基酸序列如SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示，使OsABA8ox2功能缺失。T₁代用同样方法再次检测。

表1 实施例所用引物

实施例2

OsABA8ox2过表达水稻株系的获得和鉴定

为构建OsABA8ox2过表达载体，完整的OsABA8ox2编码序列（SEQ ID No：4）采用引物对OsABA8ox2-OE（表1）进行RT-PCR（reverse transcription polymerase chainreaction）扩增。将经测序验证的扩增片段通过同源重组方法整合进改造的并经BamHⅠ(NEB)和SacⅠ (NEB)双酶切后的pCAMBIA1303载体，使其处于Ubi-1启动子之3’端，受该启动子驱动。同源重组选用GBclonart Seamless Cloning Kit (GBI，苏州)。与实施例1相同，利用农杆菌介导的转化获得粳稻品种Kitaake为背景的过表达转基因株系。以基因组DNA为模板，用引物对OsABA8ox2-C（表1）通过PCR扩增出外源的OsABA8ox2 CDS片段来鉴定阳性转基因系（图2A）。图2B中定量RT-PCR结果显示过表达转基因系OE1和OE2中OsABA8ox2转录水平远远高于野生型（WT），引物对为OsABA8ox2-RT（表1），内对照为Actin1（引物见表1）。

实施例3

OsABA8ox2敲除水稻株系光形态建成表型，叶长和株高测定和耐荫性分析

植株在较弱（2100 lux）光照条件下生长。与野生型（WT）相比，OsABA8ox2过表达（OE）株系第三片叶片和叶鞘细长柔弱（图3A），特别是叶鞘长度显著高于野生型（图3B），敲除株系KO1和KO2第三片叶片显著变短（图3A, B）。OE叶色较野生型浅，呈浅绿色，而KO叶呈深绿色。OsABA8ox2参与了叶的发育。25天大的WT苗处于3叶期，而OE苗第4片叶已伸出（图3A），过表达苗生长速率快于野生型。由于OsABA8ox2 OE苗叶片细长，叶鞘长且柔弱，植株不能挺直生长，弯向一侧（图3A）。推断OsABA8ox2过表达抑制了水稻苗期的光形态建成，呈现避荫反应。株高统计结果表明OsABA8ox2过表达株系OE1和OE2均显著高于野生型，而OsABA8ox2敲除水稻株系KO1和KO2均显著矮于野生型（图3B）。叶片伸长和株高是判断植物避荫反应和耐荫性的重要指标性状。据此判断OsABA8ox2敲除水稻株系具有较野生型更强的耐荫能力。此外，采用引物对COP1（表1）进行半定量RT-PCR分析，发现拟南芥COP1在水稻中的同源基因（编号LOC_Os02g53140）在OsABA8ox2敲除水稻株系中转录水平下降（图3C）。拟南芥中COP1编码光形态建成的抑制因子（Cell, von Arnim and Deng 1994; Trends inplant science, Lau and Deng 2012）。其同源基因在OsABA8ox2敲除水稻株系中转录水平下降暗示了OsABA8ox2敲除水稻株系中光形态建成分子网络的正向调控。

自然弱光条件下OsABA8ox2敲除（KO）水稻株系呈现高耐荫性，维持挺直生长（图4）。而过表达（OE）株系和野生型呈现不同程度的避荫反应，不能维持挺直生长（图4）。这里自然弱光条件为：室内，其东边和北边有玻璃引进光照。上午10:00，13000 lux，11:00，2400lux；中午12:00，1800 lux；下午15:00，700 lux，17:00，300 lux。OsABA8ox2为避荫基因。OsABA8ox2功能失活后，植株在一定程度弱光下的光形态建成较好，提高了植物耐荫性（图3A, 图4）。

实施例4

叶片中ABA和3-吲哚乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）含量测定

叶片ABA和IAA含量测定委托杭州景杰生物科技有限公司完成，采用超高效液相色谱/串联四极杆质谱分析系统（ultra-performance liquid chromatography/tandemquadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray interface; UPLC-ESI-qMS/MS)。与野生型相比，5叶期OsABA8ox2 KO1功能叶含有更高的ABA水平，而OE2叶含有较低的ABA水平和较高的IAA水平（图5）。OsABA8ox2过表达株系叶片中较高水平IAA促进伸长反应，是叶片伸长和株高表现突出的原因之一。

实施例5

根表型观察和根参量测定

利用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)测量不定根直径。根系暴露室温24h之后称重。不管是对照条件还是干旱处理，OsABA8ox2 OE2总根长、不定根直径和总根重都不及野生型（图6，表2）。停止浇水2周后KO1不定根数目显著减少（表2）。干旱胁迫下KO1大于或等于70%总根长的不定根数目显著多于野生型（表2），有利于维持足够的水分供应。垂直方向发展的根系结构被认为是典型的利于干旱耐受的根系结构（Current Opinion inBiotechnology, Rogers and Benfey, 2015）。综上，OsABA8ox2过表达抑制了水稻根系的伸长生长和发育，而敲除能优化水稻根系结构以加强干旱耐受。

表2 对照组和干旱组根参量

同一列数值后面的不同的小写字母指出通过Duncan’s multiple range test得出的显著性差异（P < 0.05）。

实施例6

OsABA8ox2敲除和过表达水稻株系土壤干旱胁迫处理和耐旱性分析

对5叶期水稻植株停止浇水来进行土壤干旱耐受分析。停止浇水4天后，OsABA8ox2过表达转基因系OE1和OE2开始展现卷叶表型，而WT和敲除株系KO1和KO2叶子仍然平展（图7B）。停止浇水5天后，OE1 和OE2出现严重萎蔫表型，WT植株也出现叶片卷曲，而KO1和KO2约一半叶子仍然平展（图7C）。经过7天土壤干旱处理后再进行复水处理（恢复浇水），所有KO植株恢复生机（图7D）。OE1和OE2的存活率远远低于野生型，而KO株系为100%，远比野生型高（图7E）。土壤干旱胁迫耐受分析指出，相比野生型，OsABA8ox2 敲除株系耐旱性有很大提高，而过表达株系对土壤干旱胁迫高度敏感。

实施例7

OsABA8ox启动子与GUS融合表达载体pCAMBIA1303-PRO _OsABA8ox :GUS的构建和转基因株系的GUS染色分析

为进行OsABA8ox2启动子分析，ATG起始密码子上游1619 bp（SEQ ID No：5）和编码序列5’端25 bp共计1644bp序列，采用引物对OsABA8ox2-Pro（表1），以Kitaake基因组DNA为模板，进行PCR扩增。为进行OsABA8ox1启动子分析，ATG起始密码子上游894 bp（SEQ ID No：9）和编码序列5’端79 bp共计973 bp序列，采用引物对OsABA8ox1-Pro（表1）进行PCR扩增。为进行OsABA8ox3启动子分析，ATG起始密码子上游1417 bp（SEQ ID No：10）和编码序列5’端199 bp共计1616 bp序列，采用引物对OsABA8ox3-Pro（表1）进行PCR扩增。将经测序验证的扩增片段通过同源重组方法整合进经HindⅢ (NEB)和Nco

(NEB)双酶切后的pCAMBIA1303载体，使GUS分别受OsABA8ox1，OsABA8ox2和OsABA8ox3的启动子驱动。同源重组选用GBclonart Seamless Cloning Kit。与实施例1相同，利用农杆菌介导的转化获得粳稻品种Kitaake为背景的PRO _OsABA8ox :GUS转基因系。

GUS染色选用GUS染色试剂盒（Coolaber，北京）。PRO _OsABA8ox :GUS转基因水稻株系GUS染色显示在营养生长期OsABA8ox2主要在根中表达（图8B）并且在胚根分生组织区有很强的表达（图9A）。OsABA8ox3主要在叶中表达（图8A）。而OsABA8ox1在苗期表达很弱，几乎无表达（图8）。表明这3个基因的表达模式具有时空特异性，暗示它们的启动子具有一些不同的顺式作用元件。OsABA8ox2在颖花和灌浆期种子都可见较强表达（图8C, 图9B）。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> OsABA8ox2启动子在根分生组织、颖花和灌浆期种子中的表达应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 510

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Ala Phe Leu Leu Phe Phe Val Phe Val Thr Ala Ala Val Leu Cys

1 5 10 15

Phe Val Val Pro Ala Phe Leu Leu Leu Cys Thr Ser Val Gln Arg Arg

20 25 30

Arg Asp Val Gly Gln Gly Gly Gly Arg Asp Trp Gln Lys Lys Lys Lys

35 40 45

Leu Arg Leu Pro Pro Gly Ser Met Gly Trp Pro Tyr Val Gly Glu Thr

50 55 60

Leu Gln Leu Tyr Ser Gln Asp Pro Asn Val Phe Phe Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Phe Lys Thr Asn Leu Leu Gly Cys Pro Cys

85 90 95

Val Met Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Arg Phe Val Leu Val Ser Gln

100 105 110

Ala Arg Leu Phe Lys Pro Thr Tyr Pro Pro Ser Lys Glu Arg Met Ile

115 120 125

Gly Pro Ser Ala Leu Phe Phe His Gln Gly Glu Tyr His Leu Arg Leu

130 135 140

Arg Arg Leu Val Gln Ala Ala Leu Ala Pro Asp Ser Leu Arg Ala Leu

145 150 155 160

Val Pro Asp Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Thr Leu Ala Ala Trp Ser

165 170 175

Gly Gly His Val Ala Ser Thr Phe His Ala Met Lys Lys Leu Ser Phe

180 185 190

Asp Val Gly Val Val Thr Ile Phe Gly Gly Arg Leu Gly Arg Arg His

195 200 205

Arg Glu Glu Leu Arg Thr Asn Tyr Ser Val Val Glu Arg Gly Tyr Asn

210 215 220

Cys Phe Pro Asn Arg Phe Pro Gly Thr Leu Tyr His Lys Ala Ile Gln

225 230 235 240

Ala Arg Lys Arg Leu Arg Ala Ile Leu Ser Glu Ile Val Ala Glu Arg

245 250 255

Arg Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp Leu Leu Gly

260 265 270

Gly Leu Met Arg Ser Arg Asp Asp Gly Thr Ala Gly Ala Val Ala Leu

275 280 285

Leu Thr Asp Asp Gln Ile Ala Asp Asn Val Val Gly Val Leu Phe Ala

290 295 300

Ala Gln Asp Thr Thr Ala Ser Val Leu Thr Trp Ile Leu Lys Tyr Leu

305 310 315 320

His Asp Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ala Val Lys Ala Glu Gln Met Ala

325 330 335

Ile Tyr Val Ala Asn Glu Gly Gly Lys Arg Pro Leu Thr Trp Thr Gln

340 345 350

Thr Arg Ser Met Thr Leu Thr His Gln Val Ile Leu Glu Ser Leu Arg

355 360 365

Met Ala Ser Ile Ile Ser Phe Thr Phe Arg Glu Ala Val Ala Asp Val

370 375 380

Glu Tyr Lys Gly Phe Leu Ile Pro Lys Gly Trp Lys Val Met Pro Leu

385 390 395 400

Phe Arg Asn Ile His His Asn Pro Asp Tyr Phe Gln Asp Pro Gln Lys

405 410 415

Phe Asp Pro Ser Arg Phe Lys Val Ala Pro Arg Pro Ser Thr Phe Leu

420 425 430

Pro Phe Gly Ser Gly Val His Ala Cys Pro Gly Asn Glu Leu Ala Lys

435 440 445

Leu Glu Met Leu Val Leu Val His Arg Leu Val Thr Ala Tyr Arg Trp

450 455 460

Glu Ile Val Gly Ala Ser Asp Glu Val Glu Tyr Ser Pro Phe Pro Val

465 470 475 480

Pro Arg Gly Gly Leu Asn Ala Lys Leu Trp Lys Gln Glu Ala Glu Glu

485 490 495

Asp Met Tyr Met Ala Met Gly Thr Ile Thr Ala Ala Gly Ala

500 505 510

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Phe Leu Leu Phe Phe Val Phe Val Thr Ala Ala Val Leu Cys

1 5 10 15

Phe Val Val Pro Ala Phe Leu Leu Leu Cys Thr Ser Val Gln Arg Arg

20 25 30

Arg Asp Val Gly Thr Gly Trp Arg Ala Arg Leu Ala Glu Glu Glu Glu

35 40 45

Ala Gln Ala Ser Ser Gly Ile His Gly Leu Ala Val Arg Arg Arg Asp

50 55 60

Ala Pro Ala Leu Leu Pro Gly Pro Gln Arg Leu Leu Arg Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Glu Val Arg Arg Asp Ile Gln Asp Glu Ser Ala Gly Val Pro Val

85 90 95

Arg Asp Ala Gly Glu Pro Gly Gly Gly Glu Val Arg Ala Gly Val Ala

100 105 110

Gly Glu Ala Val Gln Ala Asp Val Pro Ala Glu Gln Gly Ala Asp Asp

115 120 125

Arg Ala Val Gly Ala Leu Leu Pro Pro Gly Arg Val Pro Pro Pro Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Arg Pro Gly Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Pro Arg Pro

145 150 155 160

Arg Pro Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Ala Arg Arg Leu Val

165 170 175

Arg Arg Pro Arg Arg Gln His Leu Pro Arg His Glu Glu Ala Leu Val

180 185 190

Arg Arg Arg Arg Arg Asp His Leu Arg Arg Pro Ala Arg Pro Pro Ala

195 200 205

Gln Gly Gly Ala Glu Asp Glu Leu Leu Arg Arg Gly Glu Arg Leu Gln

210 215 220

Leu Leu Pro Gln Pro Leu Pro Gly Asp Ala Leu Pro Gln Gly Asp Pro

225 230 235 240

Gly Glu Glu Ala Ala Ala Arg Asp Pro Glu Arg Asp Arg Gly Gly Ala

245 250 255

Ala Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Arg

260 265 270

Arg Pro His Ala Val Ala Arg Arg Arg His Arg Arg Arg Gly Gly Ala

275 280 285

Ala His Arg Arg Pro Asp Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Ala Val Arg

290 295 300

Gly Ala Gly His His Arg Gln Arg Pro His Leu Asp Pro Gln Val Pro

305 310 315 320

Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ser Arg Gln Gly Gly Ala Asp Gly

325 330 335

Asp Leu Arg Gly Gln Arg Gly Arg Glu Ala Ala Ala Asp Val Asp Ala

340 345 350

Asp Glu Glu His Asp Thr His Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Glu Leu Glu

355 360 365

Asp Gly Glu His Asn Leu Leu His Val Gln Arg Gly Ser Arg Arg Arg

370 375 380

Gly Val Gln Arg Phe Pro Asp Ser Lys Gly Val Glu Gly Asp Ala Ser

385 390 395 400

Val Gln Glu His Pro Ser Gln Pro Gly Leu Leu Pro Gly Ser Thr Lys

405 410 415

Val

<210> 3

<211> 416

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Ala Phe Leu Leu Phe Phe Val Phe Val Thr Ala Ala Val Leu Cys

1 5 10 15

Phe Val Val Pro Ala Phe Leu Leu Leu Cys Thr Ser Val Gln Arg Arg

20 25 30

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35 40 45

Gln Ala Ser Ser Gly Ile His Gly Leu Ala Val Arg Arg Arg Asp Ala

50 55 60

Pro Ala Leu Leu Pro Gly Pro Gln Arg Leu Leu Arg Leu Gln Ala Glu

65 70 75 80

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85 90 95

Asp Ala Gly Glu Pro Gly Gly Gly Glu Val Arg Ala Gly Val Ala Gly

100 105 110

Glu Ala Val Gln Ala Asp Val Pro Ala Glu Gln Gly Ala Asp Asp Arg

115 120 125

Ala Val Gly Ala Leu Leu Pro Pro Gly Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro

130 135 140

Pro Pro Arg Pro Gly Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Pro Arg Pro Arg

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165 170 175

Arg Pro Arg Arg Gln His Leu Pro Arg His Glu Glu Ala Leu Val Arg

180 185 190

Arg Arg Arg Arg Asp His Leu Arg Arg Pro Ala Arg Pro Pro Ala Gln

195 200 205

Gly Gly Ala Glu Asp Glu Leu Leu Arg Arg Gly Glu Arg Leu Gln Leu

210 215 220

Leu Pro Gln Pro Leu Pro Gly Asp Ala Leu Pro Gln Gly Asp Pro Gly

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245 250 255

Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Ala Gly His His Arg Gln Arg Pro His Leu Asp Pro Gln Val Pro Pro

305 310 315 320

Arg Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ser Arg Gln Gly Gly Ala Asp Gly Asp

325 330 335

Leu Arg Gly Gln Arg Gly Arg Glu Ala Ala Ala Asp Val Asp Ala Asp

340 345 350

Glu Glu His Asp Thr His Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Glu Leu Glu Asp

355 360 365

Gly Glu His Asn Leu Leu His Val Gln Arg Gly Ser Arg Arg Arg Gly

370 375 380

Val Gln Arg Phe Pro Asp Ser Lys Gly Val Glu Gly Asp Ala Ser Val

385 390 395 400

Gln Glu His Pro Ser Gln Pro Gly Leu Leu Pro Gly Ser Thr Lys Val

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<210> 4

<211> 1533

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

atggctttct tgctcttctt tgtctttgtg acagctgcag tgctgtgctt cgtcgtcccg 60

gcgttcttgc tgctctgcac gagcgtgcag aggaggagag atgttggaca gggtggaggg 120

cgagattggc agaagaagaa gaagctcagg cttcctccgg gatccatggg ctggccgtac 180

gtcggcgaga cgctccagct ctactcccag gaccccaacg tcttcttcgc ctccaagcag 240

aagaggtacg gcgagatatt caagacgaat ctgctggggt gcccgtgcgt gatgctggcg 300

agcccggagg cggcgaggtt cgtgctggtg tcgcaggcga ggctgttcaa gccgacgtac 360

ccgccgagca aggagcggat gatcgggccg tcggcgctct tcttccacca gggcgagtac 420

cacctccgcc tccgccgcct cgtccaggcc gccctcgccc cggactccct ccgcgccctc 480

gtcccggacg tcgacgccgc cgtcgccgcc acgctcgccg cctggtccgg cggccacgtc 540

gccagcacct tccacgccat gaagaagctc tcgttcgacg tcggcgtcgt gaccatcttc 600

ggcggccggc tcggccgccg gcacagggag gagctgagga cgaactactc cgtcgtggag 660

agaggctaca actgcttccc caaccgcttc ccggggacgc tctaccacaa ggcgatccag 720

gcgaggaagc ggctgcgcgc gatcctgagc gagatcgtgg cggagcggcg ggcgcgcggc 780

ggcggcggcg gcggcggcgg cgacgacctc ctcggcggcc tcatgcggtc gcgcgacgac 840

ggcaccgccg gcgcggtggc gctgctcacc gacgaccaga tcgccgacaa cgtcgtcggc 900

gtgctgttcg cggcgcagga caccaccgcc agcgtcctca cctggatcct caagtacctc 960

cacgactcgc cgaagcttct cgaagccgtc aaggcggagc agatggcgat ctacgtggcc 1020

aacgagggcg ggaagcggcc gctgacgtgg acgcagacga ggagcatgac actcacgcat 1080

caggttatac tggagagctt gaggatggcg agcataatct ccttcacgtt cagagaggca 1140

gtcgccgacg tggagtacaa aggtttcctg attccaaagg ggtggaaggt gatgcctctg 1200

ttcaggaaca tccatcacaa cccggactac ttccaggatc cacaaaagtt tgatccttct 1260

agattcaagg tggcgccgcg tccaagcacg ttcctgccgt tcgggagcgg cgtgcacgcg 1320

tgcccgggca acgagctggc caagctggag atgctcgtcc tcgtccaccg cctcgtcacc 1380

gcctacaggt gggagatcgt cggggcgagc gacgaggtgg agtacagccc gttcccggtg 1440

ccgaggggcg ggctcaacgc caagctgtgg aagcaggagg cggaggagga catgtacatg 1500

gccatgggca ccatcacagc agcaggtgct tga 1533

<210> 5

<211> 1619

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

aaacaagaac aaatactcca atatttgcta gattgggtat aggcccgttg atgcattcat 60

cgaattattg ggaattccat ctcaaaactc acaaaatctt atataaaaca ttgcaaaaaa 120

aaaacacttc tattgcaaaa atcttgcaga taaattttct ttttccaatg atgcagctta 180

tatttatcac ttaaaaaagt catctcctgt gccgtggctc catttgctcc cttttattta 240

tttcccccca tcccggttat agatcaaatc catttgacca ttaaaagaag ccaaaataat 300

caagcagtac cagatcacac aaggcatcta gaaagaaaga agaaaaaaaa cgatattttt 360

tttaaaagaa tcaggaaaaa tatatccagg aaccatggta caaactactg aaactgttgt 420

gcaaacttct tgatcttttg ggatatttct aatttaggtt tttttttgtt gaattaactg 480

aacagtggac accttttttt tcaaaaaaaa tctttgacca aatgagaata gtttaaaaga 540

aatgaagaga gctgtgacaa aagagagtac cgtcttcatg cggaagaaat ggcattagag 600

gttatacaag tggcaagtaa aaatggtcta aactttatgg caggctagta aaaaatagta 660

atataaacaa caacagtcta agcaaaattt aactaaggat tacaacaatc cataatgatg 720

tagtaccaat caagctgtca gagagatctc aggctctgat gctatgttga atctcaatcc 780

ccaaatcaat gcctgtccat gggccaaatc ccagggaatt cgtgcaagcc ccgctgagct 840

gcacatgact aggaccctat ttgaaagatt agcccagaac taattttgag agctaatatt 900

tagtaatgaa ttggtaggct aaacattagt ctaggttggt atgtttggat ctatgggcta 960

attcaaggct aaaaggtaga gagagagtag aaagagagga gagagaagga gagagagagc 1020

tgctttttga tggtccccac acaaaattag ccccattagc acttcttaga gaggctaata 1080

ttttgagagg ggctaattca tattagctca aaattagaca acctgtttgg attcttgaga 1140

gctaatttaa ggctaaaagg taagagctaa acattagccc atggaaacaa acagggccag 1200

gaatcttcta atctcccttt catgtgtccc tccttttttt ctccctatcc ccaaagattt 1260

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tgcagccgtg ctcaccctct ataaataccc catacaggtg tcttccaata gcaccaccat 1380

ttggaagaat cctccccaag attgctcgat cccctcgtgt ccctctctcc caacaacact 1440

gcgccacaga cacaaatcac actcagatac gaaagataag tacagagaga gagagagggc 1500

acggattata cactgcacac aagcatatat atatatatat cgattagcca tccgtgctga 1560

tctgaagagt atcatcggta gagagtttta cagagttgtt tggacaagga gacacacac 1619

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

ggaggagaga tgttggaca 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

ggaggagaga tgttgggaca 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

ggaggagaga tgtgaca 17

<210> 9

<211> 894

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

cagtatgatg gctggttggg gatgatcaga ggaagcggcc aaaggagagc agcattatag 60

gagcaggagc aggagcagga gcagcagcag ctgctgccgg ggcagtacgt agtacgtacg 120

agagcgcgta cagtagctga tggtgtggaa acagggcgga aagggagagg tgagctggag 180

aaagggatga ttctctcgcg cgctggccag aagagaagag aggcccattt agctatcact 240

gtattggtta accggtttaa ccgatcagtt gattaatccg gctctctcgc ccgcacgcct 300

ttttcccttt atttccgtat tgattgcgca attattcggc agcgtctatc tgtctctctc 360

gcgcgcggag gcacccagct cggctattct agcgcgtagt ggtggtgcta gctactagta 420

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cacccccccc aacaacacca ccgcccattt ccctttctct tcctcttctt cttccttctc 600

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ggggtggccg tacgtcgggg agacgttcca gctgtactcg tccaagaacc ccaacgtgtt 840

cttcaacaag aagcggaaca agtacggtcc catcttcaag acgcacatcc tggg 894

<210> 10

<211> 1417

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 10

agttgctgtt ggtcattttg gtttagcccc gctatatttt tatcctggct ccgccactgt 60

attctagtag tcctagtatg tcctatctct atgtatactt ttagatgatg tggcacatac 120

ttaaagtata agtaggagta aactatactg tattaaacta cattttaata tgtacagaac 180

gacgataaaa ctggataagt tgaacttatc ttgctgcatg tacgtttcat ccccaaaaaa 240

cacatgataa gaacataata aatgcaatgc aatgctattc ttacgaccag attggccaat 300

acacgattga aactaatcag cacagggtag caaatcaaca gggtatagtg gtatactgaa 360

cttatcttgc tgcatgtacg tttcaccctc ttaagaaaat cttgataaga aataaatacc 420

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aactgaaaga aacaaacaac ttattgaagt agcttattat aatctggagc ctagcttagg 600

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taagccggtg gatttaatgt cctaagttta gtagttgagt catacatcta actcacataa 720

gccaaaaaag cttctccaac ctagcttttg gcttaatagt gttagagtgg cttatggctt 780

caaaaaaacc aaacggaaaa gctgcttgct tgtttaggct cagacttttc gacttataag 840

ttggcttata agcctaaaca aagagggctt attataatat gataagctca tttaggtgag 900

ctttttccag attattgggt aaaaaattac ccgtcatacc acaccacttt ctctttagac 960

ttgtaaaccc aataatttag gatgtaataa tctaggaaag aaacaactaa ccgtttattc 1020

tactacagat tataacaatc tagcttatgg taatctgact caataatcta gattataata 1080

atcctaagct gggaaaaaca ggccttactc cctcccctcc ctagctcgcg gacaccatat 1140

gagcttccaa actggcctct cactttctct ctcgcgctct gcctctataa ataccacgca 1200

aggccttccc acgcccacca ccattcgaaa gatccctcga agatttttct cctccctctc 1260

tccctctcct cacagctctc tccctctctc ctagcaacag catatatagc gcaaagacaa 1320

taacacacga ctagctagca agaagaagac agctggttca gaactctcaa aacagctgtg 1380

gtgtccaagt gatccttaat tctccagggt catttgg 1417

Claims

1.OsABA8ox2基因的启动子驱动目的基因在水稻颖花中特异表达的应用。

2.根据权利要求1所述OsABA8ox2基因的启动子驱动目的基因在水稻颖花中特异表达的应用，其特征是，所述OsABA8ox2基因的启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示；具有在水稻颖花强启动活性。