CN114214333A

CN114214333A - 一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用

Info

Publication number: CN114214333A
Application number: CN202210004139.8A
Authority: CN
Inventors: 肖水平; 吴翠翠; 王涛; 邓艳凤; 杨秀; 孔清泉; 杨绍群; 杨笑敏; 刘新稳
Original assignee: Cotton Research Institute Of Shanxi Agricultural University Cotton Research Institute Of Shanxi Academy Of Agricultural Sciences; Jiangxi Cotton Research Institute
Current assignee: Cotton Research Institute Of Shanxi Agricultural University Cotton Research Institute Of Shanxi Academy Of Agricultural Sciences; Jiangxi Cotton Research Institute
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114214333B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用，该基因为GhSRC2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因可降低叶表皮毛的长度，并增加茎部木质部维管细胞与束间纤维细胞的次生壁厚度，从而改良棉花纤维品质。为棉花纤维品质改良提供有效的基因资源。

Description

一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的经济作物之一，是天然纤维的重要来源，棉纤维产量占世界年总纤维需求量的35％以上。我国是主要的棉花生产和纺织品出口大国，棉花在国民经济中占有重要地位。棉纤维是一种独特类型的毛状体，来源于种子表皮，由不分枝和广泛伸长的单细胞组成。棉纤维发育包括四个不同但重叠的阶段：初始分化期(-3～3DPA，DaysPost Anthesis)、细胞伸长期(2～20DPA)、次生壁加厚期(15～45DPA)和脱水成熟期(40～50DPA)。从初始分化到次生壁加厚的三个发育阶段决定了棉纤维的产量和品质。其中，初始分化阶段决定每个胚珠上的纤维数量，初生壁和次生壁的形成阶段决定纤维长度和强度。

近年来，随着社会经济的不断发展，粮棉争地的矛盾日益激化，加之与粮食生产相比，棉花在栽培管理方面耗时费力，生产成本居高不下，棉农种植棉花的积极性大减。随着科技的发展和生产的需求，传统的常规育种已经不能满足人们对棉纤维品质和产量的要求，亟需通过新的技术和方法来挖掘具有优异品质的棉花种质资源，并对其进行深入研究，以便为后续优质棉品种培育和发展提供丰富的基因资源和选择基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因，为棉花纤维品质改良提供有效的基因资源。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因，该基因为GhSRC2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因可降低叶表皮毛的长度，并增加茎部木质部维管细胞与束间纤维细胞的次生壁厚度，从而改良棉花纤维品质。

本发明通过转基因技术在拟南芥中过表达GhSRC2基因可显著降低莲座叶表皮毛的长度，并显著增加茎部木质部维管细胞与束间纤维细胞的次生壁厚度，可见，该基因可抑制表皮毛伸长，促进次生壁加厚，为棉花纤维品质改良提供了新的基因资源。

附图说明

图1为GhSRC2基因在各组织器官及棉纤维各阶段中的转录组表达模式(A)及qRT-PCR验证结果(B)。

图2为GhSRC2基因CDS片段扩增检测(1为目标基因，585bp)(A)；过表达重组载体单克隆菌液菌P检测(1-12号为各单克隆菌液编号)(B)。

图3为GhSRC2过表达载体构建示意图。

图4为GhSRC2各过表达株系的鉴定和筛选。

图中：(A)T2代GhSRC2各过表达株系RT-PCR鉴定,其中数字代表各株系编号；(B)T3代GhSRC2各过表达株系纯合单株筛选。

图5为T2代各GhSRC2过表达株系的qRT-PCR表达量鉴定。

图6为35S:GhSRC2转基因拟南芥植株表型鉴定

图中：(A)35S:GhSRC2转基因拟南芥和WT之间的叶毛状体表型比较。叶图示Scalebar＝1cm，表皮毛图示Scale bar＝500μm。

(B)35S:GhSRC2系与WT之间成熟莲座叶表皮毛长度和密度的比较。用双尾t-test分析差异的显著性。误差条表示平均值±SE，*代表P<0.05，**代表P<0.01，下同。(C)石蜡包埋的基部茎横切面，并用来自35S:GhSRC2转基因拟南芥和WT的番红固绿染色.图中ve:木质部；if：束间纤维，Bar＝10μm。(D)35S:GhSRC2转基因拟南芥和WT茎中木质部导管和束间纤维的平均细胞壁厚度。使用ImageJ测量细胞壁厚度分析。数据为每个基因型30个细胞和三个不同茎的平均值(μm)±SE。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.GhSRC2基因表达模式分析

本发明所述的GhSRC2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长585bp，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，全长194aa。

以陆地棉标准系TM-1为材料，在开花当天标记花朵，依次收集了-3、-1、0、1、3和5DPA的胚珠，以及7、10、15、20和30DPA的纤维，所有样品立即置于液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱中。将所有样品一分为二，一份用于转录组测序分析，另一份用于实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)，所有样品均进行三次生物学重复取样和测定。用于转录组分析样本提取总RNA后在Berry Genomics公司(中国北京)的Illumina HiSeq 4000平台上进行测序分析。基因表达的测序结果通过FPKM(fragments per kilobase of transcript per millionmapped reads)值显示。用于qRT-PCR分析的样本，除了收集-3～5DPA的胚珠，7～30DPA的纤维样品外，还采集了不同发育阶段的棉花组织样本，包括苗期(两叶一心期)的根、茎和真叶，以及成熟期的花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼和苞片，所有样品提取RNA后，反转录成第一链cDNA后用于qRT-PCR分析。根据转录组结果提取目标基因GhSRC2在各纤维发育阶段的FPKM值。此外，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线数据库网载下载了其他棉花组织的RNA-seq数据(登录号：PRJNA248163)，包括根、茎、叶、苞叶、花瓣、雄蕊、雌蕊和花萼。转录组数据结果表明该基因只在纤维发育的10～15DPA时期表达(图1A)；以GhUBQ7基因内参，利用qRT-PCR方法进一步验证分析GhSRC2基因表达量变化(图1B)，结果发现该基因确实在纤维发育的15DPA时期优势表达，即该基因在纤维发育伸长及次生壁加厚过渡期优势表达，所用qRT-PCR引物序列如表1所示。

表1.基因扩增、qRT-PCR以及RT-PCR所用引物列表

2.GhSRC2基因扩增及过表达载体构建

以TM-1的15DPA时期的cDNA为模板，用基因特异引物进行扩增(表1所示)，用GXL高保真酶体系扩增，扩增体系如表2所示，扩增程序为：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，68℃，30S，35cycle；68℃，10min；4℃，∞。扩增片段电泳检测，结果如图2A所示。扩增片段经切胶回收纯化后，通过一步克隆同源重组的方法构建过表达重组融合载体pRI101-35S:GhSRC2(图3)。过表达重组载体单克隆菌液菌落PCR检测(图2B)，所用引物如表1所示，PCR扩增体系如表3所示，反应程序为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，35cycle；72℃，10min；4℃，∞。菌P正确的单克隆进一步送测序验证后，选取测序正确的单菌液提质粒后转化农杆菌GV3010，备用。

表2.目标片段扩增体系

表3.菌P、转基因阳性苗鉴定扩增体系

3.植物转化及GhSRC2转基因过表达拟南芥植株筛选

将构建好的pRI101-35S:GhSRC2重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，单菌液扩摇后通过浸花法侵染野生型拟南芥(Col-0)。用于转化的菌悬液每100mL包含MS 0.24g，蔗糖5g(5％)，100mM的AS(乙酰丁香酮)56μL，Silwet L-77 20μl(0.02％)，调pH5.8左右。T0代转基因种子点种在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基中进行阳性苗筛选，为最大限度地提高发芽率，首先在4℃条件下低温处理3天打破种子休眠，后将点有种子的培养皿转移至光照培养箱，条件设定为22℃，16h光照/20℃，8h黑暗。在抗性培养基中培养约14天后，选择正常生长的卡那阳性筛选苗移栽到装有基质营养土的小钵中，待幼苗长至一定阶段后进一步取样提DNA，基因特异引物PCR扩增目标基因片段以进一步检测卡那阳性筛选苗，待幼苗生长到成熟收获T1代阳性种子。T1代种子继续加代(即T2代)在50mg/L卡那霉素选择培养基上发芽，通过统计筛选培养基中幼苗存活与死亡的分离比(3:1)鉴定单拷贝株系。选择单拷贝插入的株系进一步种植，取叶片提RNA，反转cDNA后，用基因CDS全长引物在RNA水平鉴定目标基因的表达，结果如图4A所示；在此基础上，用基因特异性引物进行qRT-PCR分析各株系中目标基因的表达量，结果如图5所示；选择其中表达量最高的3个株系分单株收获T2代种子(OE-2，OE-3、OE-5)，T2代单株种子继续在含有50mg/L卡那霉素选择培养基上以筛选T3代纯合株系单株(如图4B所示)，纯合单株移栽后进行表型观察与鉴定。

4.T3代转基因GhSRC2株系表型鉴定

4.1莲座叶表皮毛观察与测定

观察并测量3个独立的T3代GhSRC2转基因株系的叶表皮毛密度和长度，以WT型拟南芥叶片表皮毛作为对照(图6A)。与WT型植株相比，过表达的GhSRC2转基因植株的叶片表皮毛长度显著或极显著变短。此外，与WT型相比，GhSRC2转基因株系的叶表皮毛密度略有增加，但没有显著差异(图6B)，表明GhSRC2可以显著降低拟南芥叶表皮毛的长度，但不影响表皮毛密度。

4.2茎基部横切面石蜡切片观察与分析

由于该基因在棉纤维发育过渡期的优势表达，我们进一步对GhSRC2转基因株系茎基部进行了石蜡切片包埋实验，横切面组织切片用番红固绿染色，并在显微镜下拍照，用ImageJ软件测量了茎的束间纤维(if)和木质部导管(ve)细胞壁的厚度。结果表明，在每个过表达的GhSRC2转基因系中，束间纤维细胞壁的厚度显著或极显著高于WT；且木质部导管细胞壁的厚度也显著高于WT(图6C、6D)。上述结果表明GhSRC2在调控植物毛状体发育和次生细胞壁厚度方面起重要作用，进一步说明该基因对棉纤维发育有重要影响。

综上所述，GhSRC2基因可抑制表皮毛伸长，促进次生壁加厚，为棉花纤维品质改良提供有效的基因资源。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江西省棉花研究所；山西农业大学棉花研究所（山西省农业科学院棉花研究所）

<120> 一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgtcggatc gctggacaac atttcaacga ggggaagatg agctaagaga gattgaggtt 60

ctcataatct cagctcaaga cctcaagaac gtgaagcact tgaccaaaat gagagcctac 120

gcggttgtct acgtggaaaa ggacttccac atggccaaaa cccaagtgga cgagcatgga 180

gggaccaacc ccacaaggaa ccaattggtg aaggtgaagt tccacgccaa gctggcggag 240

aaggacgtgt tggccgcggt gaacgtcgac atatacgagc atgggcacgt gagggagaag 300

ccagtgggga gtgccagggt tttactttgc gatgtattga aaggagggga tgcttcggat 360

ccggtggata acccgattca gtgcttgacg gtgcaggttt ggaggagttc gggtaggcca 420

caagggttgc ttaacttgtg ggttccgcca actgggaggt tcttgatgag gagagagtct 480

ttgtcgttta gcgtgaagga ggtggcggat ggagaaatgg tcgaaagaga ggtggcaacg 540

tcgctcggag gtggtggagc ggcggtggag aggaggagcg actag 585

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ser Asp Arg Trp Thr Thr Phe Gln Arg Gly Glu Asp Glu Leu Arg

1 5 10 15

Glu Ile Glu Val Leu Ile Ile Ser Ala Gln Asp Leu Lys Asn Val Lys

20 25 30

His Leu Thr Lys Met Arg Ala Tyr Ala Val Val Tyr Val Glu Lys Asp

35 40 45

Phe His Met Ala Lys Thr Gln Val Asp Glu His Gly Gly Thr Asn Pro

50 55 60

Thr Arg Asn Gln Leu Val Lys Val Lys Phe His Ala Lys Leu Ala Glu

65 70 75 80

Lys Asp Val Leu Ala Ala Val Asn Val Asp Ile Tyr Glu His Gly His

85 90 95

Val Arg Glu Lys Pro Val Gly Ser Ala Arg Val Leu Leu Cys Asp Val

100 105 110

Leu Lys Gly Gly Asp Ala Ser Asp Pro Val Asp Asn Pro Ile Gln Cys

115 120 125

Leu Thr Val Gln Val Trp Arg Ser Ser Gly Arg Pro Gln Gly Leu Leu

130 135 140

Asn Leu Trp Val Pro Pro Thr Gly Arg Phe Leu Met Arg Arg Glu Ser

145 150 155 160

Leu Ser Phe Ser Val Lys Glu Val Ala Asp Gly Glu Met Val Glu Arg

165 170 175

Glu Val Ala Thr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Val Glu Arg Arg

180 185 190

Ser Asp

Claims

1.一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因，该基因为GhSRC2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因的应用，其特征在于：该基因可用于改良棉花纤维品质。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：该基因可降低叶表皮毛的长度，并增加茎部木质部维管细胞与束间纤维细胞的次生壁厚度。