CN111423500B

CN111423500B - SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用

Info

Publication number: CN111423500B
Application number: CN202010305155.1A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 马有志; 孙建昌; 徐伟亚; 王春霄; 唐文思; 周永斌; 徐兆师; 陈隽
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: CN111423500A

Abstract

本发明公开了SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用。本发明公开了SiMYB56蛋白在调控植物耐旱性中的应用；所述SiMYB56蛋白为SEQ ID No.1所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。转入SiMYB56蛋白的编码基因的植株与野生型植株相比，其抗旱性有较大的提高。本发明对于培育抗旱作物具有重要意义。

Description

SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用。

背景技术

干旱是人类面临的主要自然灾害之一，即使在科学技术如此发达的今天，它造成的粮食生产损失和经济损失仍然比比皆是。在全球耕地面积逐渐减少和干旱灾害发生日益频繁的今天，通过提高作物的抗旱性能来提高或者保持粮食产量具有重大意义。传统的育种技术具有周期长、盲目性高和工作量大等缺点，而且通过传统育种来提高粮食产量已经发展到一定瓶颈。近年来，随着植物分子生物学和遗传学等学科的发展以及植物抗逆分子机制的深入研究，通过基因工程的方法向植物中导入抗逆相关基因来提高作物的抗逆性已经变得日趋成熟。

转录因子是基因表达的重要调节因子，一般包含DNA结合结构域以及转录激活/抑制结构域，通过调节下游靶基因的转录起始速率来综合调节许多生理和生物化学过程。Myeloblastosis(MYB)类转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一，在植物发育及防御反应过程中发挥重要作用，还参与植物对非生物胁迫的响应。此外，MYB类转录因子还参与调节细胞的次级代谢、控制细胞形态建成。

谷子具有耐贫瘠、适应性广的特点，是研究单子叶植物非生物胁迫响应过程的理想材料之。目前，谷子功能基因组研究刚刚起步，参与谷子抗旱胁迫响应的基因功能还有待深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用。

第一方面，本发明要求保护SiMYB56蛋白或其相关生物材料在调控植物耐旱性中的应用。

所述相关生物材料为能够表达所述SiMYB56蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明要求保护SiMYB56蛋白或其相关生物材料在调控植物体内木质素合成相关基因表达量中的应用。

所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在前文所述应用中，所述SiMYB56蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物耐旱性提高。所述SiMYB56蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物体内木质素合成相关基因表达量提高。

第三方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育植物品种的方法可为如下方法A或方法B：

方法A：一种培育耐旱性提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中SiMYB56蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法B：一种培育植物体内木质素合成相关基因表达量提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中SiMYB56蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第四方面，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育转基因植物的方法，可为如下方法C或方法D：

方法C：一种培育耐旱性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SiMYB56蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐旱性提高；所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法D：一种培育植物体内木质素合成相关基因表达量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SiMYB56蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比植物体内木质素合成相关基因表达量提高；所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在上述各方面中，所述“能够表达所述SiMYB56蛋白的核酸分子”具体可为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述SiMYB56蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述SiMYB56蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在前文各方面中，所述耐旱性提高均可具体体现为：在干旱胁迫下，与受体植物相比，提高受体植物中所述SiMYB56蛋白的表达量和/或活性后，植株的株高增加、根长增加、鲜重增加(地上部分鲜重增加和/或地下部分鲜重增加)、干重增加(地上部分干重增加和/或地下部分干重增加)、电解质渗透率降低、丙二醛含量降低、木质素含量升高和/或存活率升高。

在前文各方面中，所述木质素合成相关基因均可选自如下中的全部或部分：4CL5基因、C4H基因、CAD基因、PAL基因、F5H1基因和CCR10基因。

在前文各方面中，所述植物均可为单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为水稻或谷子。

在本发明的具体实施方式中，所述植物具体为水稻品种Kitaake。

第五方面，本发明要求保护SiMYB56蛋白在作为转录因子中的应用。所述SiMYB56蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

实验证明，转入SiMYB56蛋白的编码基因的植株与野生型植株相比，其抗旱性有较大的提高。本发明对于培育抗旱作物具有重要意义。

附图说明

图1为SiMYB56蛋白及其编码基因的结构分析。(a)为基因结构图；(b)为蛋白结构域图。

图2为SiMYB56蛋白的系统发育分析。

图3为SiMYB56蛋白亚细胞定位和转录自激活验证。(a)为亚细胞定位；(b)为转录自激活验证。

图4为SiMYB56基因的表达模式分析。(a)组织特异性表达模式分析；(b)ABA诱导下根茎叶中表达模式分析；(c)PEG6000诱导下根茎叶中表达模式分析；(d)低氮诱导下根茎叶中表达模式分析。

图5为转SiMYB56基因水稻各株系在正常和干旱处理下的表型和存活率统计结果。(a)为表型；(b)为存活率统计结果。

图6为转SiMYB56基因水稻各株系在正常和10％PEG处理下的表型和生理指标测定结果。(a)为表型；(b)为生理指标测定结果。

图7为过表达SiMYB56基因和野生型对照水稻中木质素合成相关基因的表达。

各图中的Ki均表示野生型。*表示p<0.05；**表示p<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、SiMYB56基因的基础研究

一、SiMYB56基因结构分析和蛋白结构域预测

利用Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)获得SiMYB56(Seita.5G043900)的基因和蛋白序列，根据该数据库对基因序列的描述利用IBS网站在线工具(http://ibs.biocuckoo.org/)绘制SiMYB56基因结构图，并根据获得的蛋白序列利用SMART网站在线工具(https://smart.embl-heidelberg.de/)对SiMYB56可能存在的蛋白结构域进行预测。

图1中(a)所示的基因结构图显示该基因包含3个外显子，2个内含子。基因序列全长1297bp(SEQ ID No.2)，包括951bp的CDS序列(SEQ ID No.3)。图1中(b)所示的蛋白结构域图显示该基因包含两个典型的SANT保守结构域，说明该基因属于R2R3类MYB转录因子家族。SEQ ID No.2和SEQ ID No.3编码SEQ ID No.1所示的SiMYB56蛋白序列。

二、SiMYB56系统发育树构建及同源序列比对

在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中用谷子SiMYB56的蛋白序列(SEQ ID No.1)进行BLASTP比对，得到与其同源性较高的水稻和拟南芥中的MYB类转录因子的蛋白序列，然后利用这些得到的蛋白序列利用MEGA5软件以相邻法(Bootstrap设为1000)构建系统发育树。系统发育树构建完成后利用DNAMAN工具对SiMYB56所在分支上的基因的蛋白序列进行同源序列比对。

结果如图2所示，SiMYB56在系统发育树中和拟南芥中R2R3类MYB转录因子的第21个亚族的成员聚集在一个分支上，该亚族成员都具有一段保守的氨基酸基序VPPFFDDFLSVGNSAS，在SiMYB56所在分支上，水稻基因OsCSA的蛋白序列和SiMYB56的蛋白序列相似性最高。

三、SiMYB56基因编码序列的扩增及克隆载体的构建

提取两周大的谷子(谷子品种为豫谷1号，种子由中国农业科学院作物科学研究所刁先民研究员惠赠)幼苗的总RNA，反转录得到cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR反应扩增出SiMYB56的编码序列(SEQ ID No.3)，测序正确后将SiMYB56编码序列克隆到克隆载体上。植物RNA提取使用庄盟国际生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(货号：ZP405K-1)完成，操作步骤按照说明书进行。取5μl提取的总RNA采用全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒(货号：AT311-02)，按照说明书进行反转录得到谷子cDNA。取2μl反转录得到的cDNA作为模板，使用KOYOTO公司的高保真酶KOD FX(货号：KFX-101)按照说明书进行SiMYB56编码序列的扩增，扩增使用引物为：

F：5’-ATGGTTTGTTTCTCCGGCCGTG-3’；

R：5’-TCATGTCGCACCAACGCCGAG-3’。

反应结束后利用Takara胶回收试剂盒(货号：9760)并按照说明书对PCR产物进行回收，将回收后的产物送至奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序正确后使用全式金生物技术有限公司零背景克隆试剂盒(货号：CB501-01)按照说明书将SiMYB56的编码序列克隆到pBlunt载体(该载体由试剂盒自带)上，命名为pBlunt-SiMYB56。

四、SiMYB56蛋白亚细胞定位

从pBlunt-SiMYB56载体上按步骤三中所述方法扩增SiMYB56编码序列(所用引物为下面的F和R)，利用Clotech公司的无缝克隆试剂盒(货号：639649)按照说明书将扩增的目的序列克隆到载体16318hGFP的BamHⅠ酶切位点(16318hGFP载体可以从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买得到，货号：3574151)，获得p16318hGFP-SiMYB56融合载体，并测序验证正确。用PEG-钙介导法将由CaMV35S启动子启动的p16318hGFP-SiMYB56融合载体和16318hGFP空载体分别导入新鲜的拟南芥叶肉原生质体中，随后进行12-24小时的孵育以实现蛋白的瞬时表达(Yoo SD,Cho YH,Sheen J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc，2007，2(7):1565–1572)。H2B-mCherry载体作为核标记(H2B-mCherry载体可以从Addgene公司购买得到，货号：20972)，然后用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700，CarlZeiss，Oberkochen，德国)观察原生质体细胞中的荧光，并用Zen 2010软件(CarlZeiss，Oberkochen，德国)获取图像。PCR扩增使用引物序列如下：

F：5’-TATCTCTAGAGGATCCATGGTTTGTTTCTCCGGC-3’；

R：5’-TGCTCACCATGGATCCTGTCGCACCAAC-3’。

结果如图3中(a)所示，SiMYB56-GFP融合蛋白和核Marker蛋白H2B-mCherry一起在拟南芥原生质体细胞核中表达，说明SiMYB56定位在细胞核中。

五、SiMYB56基因转录活性分析

从pBlunt-SiMYB56载体上按步骤三中所述方法扩增SiMYB56编码序列(所用引物为下面的F和R)，利用Clotech公司的无缝克隆试剂盒(货号：639649)按照说明书将扩增的目的序列克隆到载体pGBKT7的NdeⅠ酶切位点(载体pGBKT7可以从庄盟生物有限科技公司购买得到，货号：ZK979)，获得pGBKT7-SiMYB56融合载体。然后将重组载体pGBKT7-SiMYB56和空载体pGBKT7用醋酸锂介导法分别转化新制的AH109酵母感受态细胞，将转化酵母菌株分别涂在不含Trp(SD/-Trp)的固体培养基上，在28℃培养温度下倒置培养2-3天。待长出单菌落后，挑取单菌落于1ml不含Trp(SD/-Trp)的液体培养基中，28℃条件下静置培养18h。然后将培养后的酵母菌液按照10倍，100倍，1000倍进行稀释，并将稀释后的酵母菌液分别点到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade的固体培养基上，之后将其放置在28℃的培养箱中倒置培养3天，3天后观察菌落生长情况，然后判断表达蛋白是否具有转录激活活性。酵母感受态制备及质粒转化使用Clotech试剂盒酵母双杂交试剂盒(货号：630489)按照说明书进行。PCR扩增使用引物序列如下：

F：5’-AGGAGGACCTGCATATGATGGTTTGTTTCTCCG-3’；

R：5’-GCCTCCATGGCCATATGTCATGTCGCAC-3’。

结果如图3中(b)所示，含有pGBKT7-SiMYB56和pGBKT7载体的克隆可以在SD/-Trp培养基上正常生长，但在SD/-Trp/-Ade/-His培养基上均不生长，说明SiMYB56蛋白在酵母中没有转录自激活活性。

实施例2、SiMYB56基因的表达模式分析

挑选大小一致的、饱满的谷子种子(谷子品种为豫谷1号，种子由中国农业科学院作物科学研究所刁先民研究员惠赠)，室温下浸泡过夜，将种子埋入蛭石中，当长出1叶1心时(约7天)，挑选大小一致的幼苗，移入水培装置中用霍格兰营养液进行水培处理，然后将两周龄的幼苗置于不同的非生物胁迫下，包括渗透胁迫(10％PEG6000)、低氮(0.2mM NH₄ ⁺)和ABA处理(100μM ABA)。在0、1、3、6、12和24小时对叶片、茎和根进行取样，所有样品在分析前立即在液氮中冷冻并储存在-70℃下。培养条件为光照14h/10h、温度24℃/21℃、湿度60％。用庄盟生物科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒(货号：ZP405K-1)按照说明书提取上述待测谷子样品的总RNA，每个样品取5μl提取的总RNA采用全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒(货号：AT311-02)，按照说明书各自反转录得到对应样品的cDNA。将cDNA浓度稀释为大约100ng/μl后，取2μl反转录得到的cDNA作为模板使用全式金生物技术有限公司的实时定量PCR试剂盒(AQ132-21)按照说明书进行扩增反应并利用实时荧光定量PCR仪(ABI7500)进行荧光信号的检测。SiActin(Si001873m.g)作为内参基因。采用2^–ΔΔCt法根据各样品在特定荧光阈值下的Ct值计算基因在不同样品中的相对表达量(Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.2001；25(4):402–408)。扩增SiMYB56基因的引物：F：5’-CTCTGTATCCGTTCCGCTTCC-3’，R：5’-GCTAATCTCCTCTGGGTCCTCTA-3’。扩增SiActin基因的引物：F：5’-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3’，R：5’-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3’。

结果如图4中(a)所示，SiMYB56在茎中的表达量最高，在根中的表达量最低。图4中(b)所示，在ABA处理下，SiMYB56表达在根中被诱导，并且随着时间的推移逐渐增强。图4中(c)所示，在PEG6000处理下，SiMYB56表达在根和叶中被诱导，在处理1h时在根中表达达到高峰、处理3h时在叶中的表达达到高峰。图4中(d)所示，在低氮处理下，SiMYB56表达在根中诱导表达，1h处理时，表达量最高，SiMYB56胁迫处理下表达模式表明SiMYB56基因可能在植物应对多种非生物胁迫中发挥作用。

实施例3、SiMYB56基因的耐旱性研究

一、过表达载体的构建

从pBlunt-SiMYB56载体上按实施例3中步骤三所述方法扩增SiMYB56编码序列(所用引物为下面的F和R，扩增产物含SEQ ID No.3)，利用Clotech公司的无缝克隆试剂盒(货号：639649)按照说明书将扩增的目的序列克隆到载体LP0471118-Bar-ubi-EDLL(公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该载体的非专利文献是：宁蕾,王曙光,琚鹏举,柏星轩,葛林豪,齐欣,姜奇彦,孙现军,陈明,孙黛珍.过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响[J].中国农业科学,2018,51(10):1830-1841)的BamHI酶切位点和SpeⅠ酶切位点之间，获得过表达载体pLB047-SiMYB56，并经测序验证正确。PCR扩增使用引物序列如下：

F：5’-AGACCGATCTGGATCATGGTTTGTTTCTC-3’；

R：5’-GATCGATCCACTAGTTCATGTCGCACCAAC-3’。

二、SiMYB56转基因水稻的获得

用农杆菌介导的遗传转化法(Toki,S.Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.Plant Mol Biol Rep.1997.15,16–21)，以水稻品种Kitaake(公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Li,G.et al.The Sequences of 1504Mutants in the Model Rice Variety KitaakeFacilitate Rapid Functional Genomic Studies.The Plant Cell.2017.29,1218)为受体材料，进行遗传转化。获得转化体植株后，将其移栽到可控温室中种植，培养条件为光照12h/12h、温度30℃/26℃、湿度70％，一月后取叶片提DNA对T0代转化植株进行PCR阳性鉴定，并单株收获其阳性植株种子(T1代)，然后经过两代的种植检测获得各株系T3代阳性种子。植物DNA的提取方法按照天根生物科技(北京)有限公司GMO作物提取检测试剂盒(货号：KG202)中的说明书进行。取2μl提取得到的DNA溶液作为模板，使用北京康润诚业有限公司的2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(货号：A112)按照说明书进行扩增反应，获得约500bp大小目的条带的为阳性植株。PCR扩增反应所用引物为：

F：5’-TCAAGAACCACTGGCACGTC-3’；

R：5’-CAACGCCGAGGAAGTCGAAG-3’。

从获得的阳性转基因株系中随机选取3个，编号分别是OE16、OE21和OE30。

三、SiMYB56转基因水稻的耐旱性鉴定

选取上述获得的转基因株系中的三个T3代阳性株系OE16、OE21和OE30和野生型对照一起进行耐旱性鉴定。

土培干旱试验：用2.5％浓度的次氯酸钠溶液将野生型对照(Ki)和转基因水稻株系(OE16、OE21、OE30)的种子浸泡大约半个小时，半小时后用自来水将水稻种子清洗3-5次，然后将其放在含有自来水的圆皿中并在28℃培养箱中催芽2-3天，在此期间皿中的自来水需要每隔12小时更换一次，待种子萌芽之后，挑选合适的水稻种子(发芽一致，状态良好)种植于装有营养土的长方形盆子中(四个株系种植在同一个盆子中，每个株系4列)，放入温室，光照12h/12h、温度30℃/26℃、湿度70％条件培养至至四叶一心期后，对其进行控水干旱处理，当所有野生型枯萎时，对其进行覆水处理。覆水7天后统计水稻成活率。统计干旱处理后水稻的成活率时，有一片水稻叶子为绿色即作为存活的标准，存活率的计算方法是各株系的水稻存活的株数和水稻株系总株数的比值。所有实验均进行3次生物学重复。

结果如图5所示在正常生长条件下，转基因水稻植株的表现与野生型对照无明显差异，但在干旱处理条件下，3个转基因株系的存活率(50％～80％)显著高于野生型水稻(10％)，说明SiMYB56确实通过一定的途径提高了转基因水稻对干旱胁迫的耐受性。

水培干旱试验：正常处理水培条件为霍格兰营养液培养，干旱处理水培条件为用含有10％PEG6000的霍格兰营养液培养以模拟干旱的渗透胁迫效果，试验所选株系及水稻种子催芽方法参照前面所述。将催芽的OE16、OE21和OE30和野生型对照水稻种子分别种于去底的96孔PCR板中，各种植6板。然后将其置于同一环境下的霍格兰营养液中生长两周，之后设置实验组(OE16、OE21和OE30和野生型对照各三板)和对照组(OE16、OE21和OE30和野生型对照各三板)，对照组继续用霍格兰营养液培养水稻幼苗，实验组含有10％PEG6000的霍格兰营养液继续培养水稻幼苗。处理两周后，进行生理指标的测定。相对电解质渗透测定：取新鲜的待测植物叶片约0.1g，剪成大约0.1mm宽度，放置于含有10ml去离子水的带盖离心管中，盖上离心管盖子后置于室温下浸泡12h，用电导仪测定浸提液电导R1，然后将离心管置于沸水浴中煮沸30min，冷却至室温后摇匀，用电导仪测定浸提液电导R2。相对电解质渗透＝R1/R2×100％，每个实验包括三个重复。丙二醛(MDA)含量测定：水稻MDA含量测定使用江苏科铭有限公司的MDA检测试剂盒(货号：MDA-2-Y)按照说明书进行操作，每个实验包括三个重复。木质素含量测定：水稻木质素含量的测定使用江莱生物科技有限公司植物木质素(Lingin)ELISA试剂盒(货号：JL22761)按照说明书进行操作，每个实验包括三个重复。

结果如图6所示，在PEG处理下，相比野生型对照，转基因植株的株高、根长、鲜重和干重都显著增加，并且电解质渗透率和丙二醛含量显著降低、能够提高作物抗旱性的木质素含量也显著增加。

四、转SiMYB56基因水稻中木质素合成相关基因的表达鉴定

将实施例3中步骤三中水培干旱实验中在正常和PEG处理条件下培养的四周大的转基因水稻苗(OE16、OE21和OE30)和野生型对照整株取样，然后按照实施例2中的步骤进行各株系以及野生型对照水稻中4CL5基因、C4H基因、CAD基因、PAL基因、F5H1基因和CCR10基因的实时荧光定量PCR实验，OsActin(LOC_Os03g50885)作为内参基因。各基因的扩增引物如下：

PAL-F：5’-TACAACAACGGGCTTCCTTC-3’；

PAL-R：5’-TGAGCTTCAGGATGTCGATG-3’；

4CL5-F：5’-GCAAGGAGCTTCAGGACATC-3’；

4CL5-R：5’-TTTCCCCTGATGCAAATCTC-3’；

C4H-F：5’-TGGTGAGGAGCTTCGAGATG-3’；

C4H-R：5’-TGAGTTCAGGCAGAGATGGG-3’；

CCR10-F：5’-TTGTCACGGTGGCACAACAG-3’；

CCR10-R：5’-ATATGCCGCCGCTGTCATGT-3’；

CAD-F：5’-TTGTCACGGTGGCACAACAG-3’；

CAD-R：5’-ATATGCCGCCGCTGTCATGT-3’；

F5H1-F：5’-GTGTGGTGTGTCATCCATGG-3’；

F5H1-R：5’-CGCATGATTAGGACGGCC-3’；

OsActin-F：5’-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’；

OsActin-R：5’-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’。

结果如图7所示，4CL5基因、C4H基因、CAD基因、PAL基因、F5H1基因和CCR10基因在转基因株系中的表达量均要高于在野生型对照中表达量，说明SiMYB56可能通过促进木质素的合成来提高转基因植物的耐旱性。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用

<130> GNCLN201151

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 316

<212> PRT

<213> Setaria italica

<400> 1

Met Val Cys Phe Ser Gly Arg Ala Pro Pro Ala Ala Ala Leu Tyr Pro

1 5 10 15

Phe Arg Phe His His His Gln Glu Gln Glu Gln Ala Val Val Ser Glu

20 25 30

Glu Val Tyr His Gly His Val Glu Asp Pro Glu Glu Ile Ser Cys Gly

35 40 45

Arg Gly Gln Gly Lys Leu Cys Ala Arg Gly His Trp Arg Pro Ala Glu

50 55 60

Asp Ala Lys Leu Lys Glu Leu Val Ala Gln His Gly Pro Gln Asn Trp

65 70 75 80

Asn Leu Ile Ala Glu Lys Leu Asp Gly Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg

85 90 95

Leu Arg Trp Phe Asn Gln Leu Asp Pro Arg Ile Asn Arg Arg Ala Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Glu Glu Glu Arg Leu Leu Ala Ala His Arg Ala Tyr Gly

115 120 125

Asn Lys Trp Ala Leu Ile Ala Arg Leu Phe Pro Gly Arg Thr Asp Asn

130 135 140

Ala Val Lys Asn His Trp His Val Leu Ala Ala Arg Arg Gln Arg Glu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Ala Leu Arg Arg Arg Lys Pro Ser Ser Cys Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Leu Ala Thr Ala Pro Thr His Ala Val Ala Val Ala Val His His

180 185 190

His Tyr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Phe His Ala Gly Gly Ala Arg Ile

195 200 205

Gln His Asp Ile His Thr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Thr Arg Ala His

210 215 220

Ser Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ser Ala Ser Thr Cys Thr Thr Asp Leu

225 230 235 240

Ser Leu Gly Ser Val Gly Ala Ala Ala Val Pro Cys Phe Tyr Gln Ser

245 250 255

Ser Tyr Asp Gly Cys Asp Met Ala Pro Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Ala Leu Ala Pro Ser Ala Arg Ser Ala Phe Ser Val Cys Ser Pro

275 280 285

Ala Arg His Arg Ala Ala Ala Ser Asp Asn Gly Cys Gly Lys Leu Ala

290 295 300

Arg Pro Phe Phe Asp Phe Leu Gly Val Gly Ala Thr

305 310 315

<210> 2

<211> 1297

<212> DNA

<213> Setaria italica

<400> 2

gccgcctcct atattagcca gcctcccttt gcagcggcag caagcagtcc ctttccctct 60

gctcctgtct tctccatttt cggttgcagc ttcctctcaa tatctctcct caaaccttgg 120

gcccagatgg ctcatgatca tgagatggtt tgtttctccg gccgtgctcc accggcggcg 180

gctctgtatc cgttccgctt ccaccaccac caggaacagg agcaggccgt cgtttcggag 240

gaggtgtacc acggccatgt agaggaccca gaggagatta gctgcggccg tgggcagggg 300

aagctctgcg cgaggggcca ctggcggccc gccgaggacg ccaagctcaa ggagctcgtg 360

gcgcagcacg gcccccagaa ctggaacctc atcgccgaga agctcgacgg cagatcaggt 420

aacacgacgc aatgcggtgg attcaaccat gcattttcgt gtcgcctgct tcttgttcct 480

gaatcctgat ccatgtgtgc tctgatggat ggaataatgg agcagggaag agctgccggc 540

tgcggtggtt caaccagctg gacccgcgca tcaaccgccg ggccttctcg gaggaggagg 600

aggagcggct gctggcggcg caccgcgcct acggcaacaa gtgggcgctc atcgcccgcc 660

tcttccccgg ccgcaccgac aacgccgtca agaaccactg gcacgtcctc gcggcgcgca 720

ggcagcgcga gcagtccggc gcgctccgcc gccgcaagcc ctcctcgtgt tccctgtcgt 780

cgttggccac cgcccccacc cacgccgtcg ctgtcgccgt tcaccaccac tatagctcgc 840

ctccaccgcc attccacgcc ggcggtgcgc gcatccagca cgacatccac acggaggcgg 900

cggcggccgc cacccgtgcg cacagcggcg gggagtccga agagtccgcg tccacctgca 960

ccaccgacct ctccctcggc tccgtcggcg ccgccgccgt cccctgcttc taccagagtt 1020

cctacgatgg taagagtcct catccctgca aactttgctc tcgtcaatct cacggcgtgt 1080

tcatccactg acatggtgtc tgtttttgtc tgtccgcgcc gcaggctgcg acatggcccc 1140

ttgcgccgcc gcgcccacgc cggccgcgct cgcgcccagc gcgcgctccg cgttctccgt 1200

ttgctcgcca gcgcgccacc gggcggcggc ctccgacaac ggctgcggca agctcgcccg 1260

gcccttcttc gacttcctcg gcgttggtgc gacatga 1297

<210> 3

<211> 951

<212> DNA

<213> Setaria italica

<400> 3

atggtttgtt tctccggccg tgctccaccg gcggcggctc tgtatccgtt ccgcttccac 60

caccaccagg aacaggagca ggccgtcgtt tcggaggagg tgtaccacgg ccatgtagag 120

gacccagagg agattagctg cggccgtggg caggggaagc tctgcgcgag gggccactgg 180

cggcccgccg aggacgccaa gctcaaggag ctcgtggcgc agcacggccc ccagaactgg 240

aacctcatcg ccgagaagct cgacggcaga tcagggaaga gctgccggct gcggtggttc 300

aaccagctgg acccgcgcat caaccgccgg gccttctcgg aggaggagga ggagcggctg 360

ctggcggcgc accgcgccta cggcaacaag tgggcgctca tcgcccgcct cttccccggc 420

cgcaccgaca acgccgtcaa gaaccactgg cacgtcctcg cggcgcgcag gcagcgcgag 480

cagtccggcg cgctccgccg ccgcaagccc tcctcgtgtt ccctgtcgtc gttggccacc 540

gcccccaccc acgccgtcgc tgtcgccgtt caccaccact atagctcgcc tccaccgcca 600

ttccacgccg gcggtgcgcg catccagcac gacatccaca cggaggcggc ggcggccgcc 660

acccgtgcgc acagcggcgg ggagtccgaa gagtccgcgt ccacctgcac caccgacctc 720

tccctcggct ccgtcggcgc cgccgccgtc ccctgcttct accagagttc ctacgatggc 780

tgcgacatgg ccccttgcgc cgccgcgccc acgccggccg cgctcgcgcc cagcgcgcgc 840

tccgcgttct ccgtttgctc gccagcgcgc caccgggcgg cggcctccga caacggctgc 900

ggcaagctcg cccggccctt cttcgacttc ctcggcgttg gtgcgacatg a 951

Claims

1.SiMYB56蛋白或其相关生物材料在调控植物耐旱性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述SiMYB56蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述调控是使所述SiMYB56蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物耐旱性提高。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述耐旱性提高体现为：在干旱胁迫下，与受体植物相比，提高受体植物中所述SiMYB56蛋白的表达量和/或活性后，植株的株高增加、根长增加、鲜重增加、干重增加、电解质渗透率降低、丙二醛含量降低、木质素含量升高和/或存活率升高。

3.SiMYB56蛋白或其相关生物材料在调控植物体内木质素合成相关基因表达量中的应用；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述木质素合成相关基因选自如下中的全部或部分：4CL5基因、C4H基因、CAD基因、PAL基因、F5H1基因和CCR10基因；

所述调控是使所述SiMYB56蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物体内所述木质素合成相关基因表达量提高。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：能够表达所述SiMYB56蛋白的核酸分子为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子。

5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为水稻或谷子。

8.一种培育耐旱性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中SiMYB56蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

9.一种培育植物体内木质素合成相关基因表达量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中SiMYB56蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述木质素合成相关基因选自如下中的全部或部分：4CL5基因、C4H基因、CAD基因、PAL基因、F5H1基因和CCR10基因。

10.一种培育耐旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SiMYB56蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐旱性提高；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

11.一种培育植物体内木质素合成相关基因表达量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SiMYB56蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比植物体内木质素合成相关基因表达量提高；

所述SiMYB56蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

12.根据权利要求8-11中任一所述的方法，其特征在于：能够表达所述SiMYB56蛋白的核酸分子为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子。

13.根据权利要求8或10所述的方法，其特征在于：所述耐旱性提高体现为：在干旱胁迫下，与受体植物相比，提高受体植物中所述SiMYB56蛋白的表达量和/或活性后，植株的株高增加、根长增加、鲜重增加、干重增加、电解质渗透率降低、丙二醛含量降低、木质素含量升高和/或存活率升高。

14.根据权利要求8-11中任一所述方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

15.根据权利要求14所述方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

16.根据权利要求15所述方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻或谷子。