CN110317817B - Ylb9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因序列工程技术领域，为了调节植物中木质素的合成和提高植物的抗病性，本发明公开了一种YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法。其中，所述的YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的YLB9基因序列在植物中的应用实现了植物中木质素合成和抗病性的调节。

Description

YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法
技术领域
本发明涉及基因序列工程技术领域，尤其涉及一种YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
木质素是构成植物细胞壁的主要成分之一，是地球上仅次于纤维素的天然有机物。在植物细胞开始成熟和次生壁增厚的过程中，木质素在木质部导管和厚壁组织及韧皮部纤维中不断沉积，在植物体机械支持、水分运输及其病虫害防御中具有重要作用。
然而，如何提高植物中木质素的含量和提高植物的抗病性是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法，本发明实施例提供的YLB9基因序列在植物中的应用。可以有效调控植物中木质素的合成和提高植物抗病性。
本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明第一方面的实施例提供了一种YLB9基因序列，所述的YLB9基因序列如SEQID NO:1所示。
本发明第二方面的实施例提供了一种YLB9基因序列在植物中的应用，所述的应用为调控木质素合成和/或培育抗病品种；所述的YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，所述的植物为拟南芥。
本发明第三方面的实施例提供了一种调控植物木质素合成的方法，包括调控YLB9基因序列在植物中的表达，所述YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的YLB9基因序列插入到真核细胞表达载体中形成重组表达载体；
(2)将所述的重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达YLB9基因序列得到备选植物；
(3)从所述的备选植物中筛选抗性植物，得到木质素合成增加的植株。
进一步的，所述真核细胞表达载体为pCHF3-GFP。
进一步的，所述转化采用农杆菌介导法。
进一步的，所述植物为拟南芥。
借由上述方案，本发明至少具备如下有益效果：
与现有技术相比，本发明YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法至少具有如下有益效果：
本发明通过利用外源基因序列表达载体将编码序列为SEQ ID NO:1所示的YLB9基因序列导入到植物植株中，过表达YLB9基因序列，植物植株表现为木质素合成增加。本发明通过调控YLB9基因序列在植物中的表达进而用于培育木质素含量可调控的植物新品种，为培育新的作物品种提供了新思路，在分子育种上具有极大的应用价值。
本发明通过筛选拟南芥转基因序列突变体库，获得一个茎秆粗度增加且木质素含量高的植物YLB9ox，YLB9基因序列编码H2B组蛋白变体。YLB9ox植株对病原菌DC3000的抗性增强，表明YLB9基因序列在植物抗病方面具有重要的功能。本发明方法中采用过表达YLB9基因序列增加木质素含量。为培育新的作物品种提供了新思路。
附图说明
图1为真核细胞表达载体pCHF3-GFP载体图谱，图中，LB表示左边界，RB表示右边界，Sacl-Kpnl-BamH1-Sall-Pstl为多克隆位点；
图2为本发明YLB9重组表达载体的部分序列鉴定结果图；
图3为拟南芥Col-0野生型植株和YLB9转基因序列植物(YLB9ox)的表型图；
图4为拟南芥Col-0野生型植株和YLB9转基因序列植株(YLB9ox)的木质素含量情况图；
图5为拟南芥Col-0野生型植株和YLB9转基因序列植株(YLB9ox)对病原菌DC3000的抗性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将说明本发明的具体实施方式。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，下面描述的仅仅是本发明的一些实施例，不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以其他的实施方式。
以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂和材料如无特殊说明，均为市售商品。其中，使用的各种突变体均购自ABRC，各种药品试剂，如无特殊说明均购自Sigma公司。
一种YLB9基因序列，所述的YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
一种YLB9基因序列在植物中的应用，所述的应用为调控木质素合成和/或培育抗病品种；所述的YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施例中，所述的植物为拟南芥。
一种调控植物木质素合成的方法，包括调控YLB9基因序列在植物中的表达，所述YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施例中，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的YLB9基因序列插入到真核细胞表达载体中形成重组表达载体；
(2)将所述的重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达YLB9基因序列得到备选植物；
(3)从所述的备选植物中筛选抗性植物，得到木质素合成增加的植株。
在本发明的一些实施例中，所述真核细胞表达载体为pCHF3-GFP。
在本发明的一些实施例中，所述转化采用农杆菌介导法。
在本发明的一些实施例中，所述植物为拟南芥。
实施例1
(1)构建过表达YLB9的克隆
如图1和图2所示，本实施例以野生型拟南芥Col-0的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增得到YLB9基因序列的CDS。引物为：
正向引物F:5’-gc GAGCTCATGGCGCCGAGAGCAGAGAAG-3’
反向引物R:5’-cc GGATCCTCAAGAGCTTGTGAATTTGGTAAC-3’
下划线分别为SacI和BamHI限制性内切酶位点，gc和cc为保护碱基。PCR引物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，然后胶回收。把回收产物和图1所示的pCHF3载体分别用XhoI和ApaI双酶切，然后经胶回收；用T4连接酶在4℃连接过夜，连接产物经70℃、15分钟灭活后，通过热激的方法转到大肠杆菌，在壮观霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，其测序鉴定的结果如图2所示。
(2)构建转基因序列植物pCHF3-YLB9-GFP(YLB9ox)
本实施例构建了转基因序列植物pCHF3-YLB9-GFP(YLB9ox)，构建方法包括如下步骤：
PCR扩增目标片段YLB9基因序列编码区，通过核酸内切酶酶切目标片段和质粒pCHF3-GFP产生黏性末端，将片段和质粒用连接酶连接，通过测序鉴定得到质粒pCHF3-YLB9-GFP；
取2μl质粒加入100μl农杆菌GV3101中，2200V电击后迅速加入800μl LB培养基，28℃、220rpm培养1.5小时，均匀涂在50μg/ml壮观霉素LB培养基上，28℃倒置培养1天；
接种单个菌落于5ml LB培养基(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+壮观霉素50μg/ml)，28℃220rpm培养过夜；
以体积比为1：100扩大培养于500mL含适当抗生素的LB(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+壮观霉素50μg/ml)中，继续摇培5-8hr左右至生长密度为OD600值1.0-1.2；
室温，5000g，离心10min，收集菌体；
用转化介质(质量百分含量为5％的蔗糖，2.033g/L MgCl2)悬浮菌体；Silwet L-77(200μl/L)(高效有机硅表面活性剂，为拟南芥、油菜等转化必须试剂之一,能够降低水的表面张力，有效成分为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷)对菌液有伤害，应在转化植物前加入；
将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序都浸入转化介质中(莲座基部的花序可用枪浇淋)，30s～120s；
取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿24hr；
将拟南芥扶起，光下培养，约3-4周后长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子；
用50μg/ml卡那霉素的MS培养基筛选转基因序列植物，即得转基因序列植物pCHF3-YLB9-GFP(YLB9ox)。
(3)过表达YLB9基因序列降低植株高度及增加茎秆粗度
本实施例中将构建好的过表达YLB9的克隆(YLB9ox)，转化到野生型拟南芥Col-0中。将转基因序列纯合体种子播种在含有除草剂抗性的MS培养基上，放置在人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m-2s-1)下5天，能正常生长的幼苗，根据株系命名为YLB9ox#1和YLB9ox#2转移土里，在植物培养室培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。如图所示，YLB9ox植株的高度显著降低(图3A和3B)，大约是野生型的2/3。同时，YLB9ox植株的茎秆直径显著增加(图3C和3D)。
(4)过表达YLB9基因序列增加了木质素含量
本实施例中，将野生型拟南芥Col-0以及YLB9ox转基因序列种子播种MS培养基上，在4℃暗处放置4天，让所有的种子充分吸涨以便萌发一致。然后，转移到人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m-2s-1)下生长5天后转移土里。将植物转移到培养室培养，温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。植株成熟之后，收取野生型拟南芥Col-0以及YLB9ox转基因序列植株的茎秆，利用乙酰溴法定量分析YLB9ox植株茎秆木质素含量变化情况。结果发现，与野生型(15.5±1.2％)相比，YLB9ox茎秆的木质素含量(21.6±2.1％)增加了大约40％(P<0.01)(图4)。
(5)过表达YLB9基因序列提高了植株对DC3000的抗性
本实施例中，将野生型拟南芥Col-0以及YLB9ox转基因序列种子播种MS培养基上，在4℃暗处放置4天，让所有的种子充分吸涨以便萌发一致。然后，转移到人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m-2s-1)下生长5天后转移土里。将植物转移到培养室培养，温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。植物叶片发育完全之后，用OD600＝0.0002的DC3000处理叶片3天，然后拍摄照片以及生物检测病原菌繁殖能力。植物叶片细胞壁木质素是抵抗病原菌的物理屏障，发现YLB9ox的叶片具有表皮毛少、蜡质化以及叶片厚度增加的特征，同时生物检测分析发现过表达YLB9增强了对DC3000的抵抗力(图5A和5B)。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> YLB9基因序列、应用及调控植物木质素合成的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 1
atggcgccga gagcagagaa gaagcccgcg gagaagaaac cagccgccga gaaaccagta 60
gaggagaaat caaaagccga gaaagctccg gcggagaaga aaccaaaagc cggcaagaaa 120
ctcccgaagg aagccggggc cggcggcgat aagaagaaga agatgaagaa gaagagtgtg 180
gaaacttaca agatctacat cttcaaggtt ctgaaacaag ttcatccaga tattggtatt 240
tcaagcaagg ctatgggtat tatgaacagt ttcatcaacg acatcttcga gaaattggca 300
tcggaatctt caaagctcgc taggtataac aagaagccga cgattacttc tcgggagatt 360
cagactgctg ttagactcgt tcttcctggt gagctcgcta aacacgctgt ttctgaagga 420
accaaggctg ttaccaaatt cacaagctct tga 453

Claims (5)

1.一种YLB9基因序列在植物中的应用，其特征在于，所述的应用为在拟南芥中过表达YLB9基因来增加拟南芥木质素含量，从而提高植株对病原菌的抗性；所述的YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种调控植物木质素合成的方法，其特征在于，为调控YLB9基因序列在拟南芥中的表达，所述YLB9基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示的YLB9基因序列插入到真核细胞表达载体中形成重组表达载体；
（2）将所述的重组表达载体转化到拟南芥的细胞中，过表达YLB9基因序列得到备选拟南芥植株；
（3）从所述的备选拟南芥植株中筛选抗性拟南芥植株，得到木质素合成增加的拟南芥植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述真核细胞表达载体为pCHF3-GFP。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转化采用农杆菌介导法。
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