KR102516750B1 - 고추 녹광 품종 전사인자 CaSIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법 - Google Patents
고추 녹광 품종 전사인자 CaSIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고추 녹광 품종 유래 전사인자 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 이를 이용한 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로, CaSIMK1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산 (ABA) 신호 전달에서 양성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 CaSIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 고추 녹광 품종 전사인자 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 이를 이용한 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.
ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면, ABA를 생성하지 못하거나 ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.
오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.
이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
본 발명자들은 고추에서 전사인자 유전자인 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 과발현시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 접종된 식물세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaSIMK1 유전자는 고추로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.
본 발명은 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터가 접종된 식물세포를 제공한다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다,
본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 (positive regulator) 단백질을 코딩하는 유전자 CaSIMK1에 관한 것으로서, 상기 CaSIMK1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산(Abscisic acid, ABA) 신호 전달에서 양성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 CaSIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 CaSIMK1과 다른 homolog 단백질(MAPKKK proteins of Solanum tuberosum (accession no. XP_006364160.1), Nicotiana tomentosiformis (accession no. XP_009600573.1), Solanum pennellii (accession no. XP_015081664.1), Coffea arabica (accession no. XP_027060798.1) and Arabidopsis thaliana (accession no. NP_200320.1))의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 동일한 아미노산 잔기는 검은색으로 하이라이트 하였다.
도 1b는 green fluorescent protein (GFP)-tagged CaSIMK1 단백질의 세포 내 위치(Subcellular localization)를 확인한 것으로, CaSIMK1 단백질이 세포 핵 내에서의 기능함을 도시한다. 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에서 GFP의 발현은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰되었다. DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole)를 핵 마커로 사용했으며, 흰색 스케일바(scale bar)는 20μm를 나타낸다.
도 2a는 대조군 (TRV2:00) 및 CaSIMK1-silenced pepper 실험군 (TRV2: CaSIMK1) 식물에서 건조 스트레스 민감도를 확인한 결과를 나타낸다. 실험군 및 대조군의 3주령 식물에 14일 동안 물 주기를 중단하여 건조(가뭄) 스트레스를 처리한 후, 다시 2일 동안 물을 주었다. 도시된 이미지는 건조 스트레스 처리 전(위), 대조군과 실험군에서 건조 스트레스 처리 후(중간) 및 그리고 2일 동안 다시 물을 뿌린 후(아래) 촬영되었다. 그리고 건조 스트레스 처리 대조군 및 실험군에서 다시 물주기를 수행하고 2일 후에 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 고추 식물의 생존율을 정량적으로 나타내었다. 각각 36개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2b는 각각 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 식물의 잎에서 발생하는 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 정량적으로 나타낸다. 각 대조군 및 실험군 식물에서 잎을 떼어내고, 9시간 동안 매시간 간격으로 잎의 생체중(fresh weight)을 측정하였다. 데이터는 각각 12개의 잎이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2c는 ABA 처리 후 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 열화상 이미지 촬영을 통해 식물의 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸다. 대조군 및 실험군 식물의 잎에 각각 0 및 100μM의 ABA를 분사하였다. ABA 처리 3시간 후에 열화상 이미지를 촬영하여 잎 온도를 측정했다.
도 2d는 상기 도 2c의 잎 온도 측정 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 데이터는 각각 12개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2e는 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 식물에서 ABA-유도 기공 폐쇄 정도를 촬영한 이미지이다. 3주령의 대조군 및 실험군의 잎 껍질(Leaf peels)을 각각 0, 10 또는 20μM ABA가 포함된 SOS(stomata opening solution) buffer와 함께 배양하였고, 3시간 후에 도 2e에 도시된 이미지를 현미경 하에서 촬영하고 기공 개도(stomatal apertures)를 측정하였다.
도 2f는 상기 도 2e의 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 각각 12개의 잎이 평가된 세 번의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다. Asterisk(*)는 TRV2:00과 TRV2:CaSIMK1 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
도 3a는 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 식물의 건조 스트레스에 대한 내성 표현형의 증가를 도시한다. 3주령(three-week-old) 야생형(WT) 대조군 및 상기 형질전환 실험군 식물에 14일 동안 물을 주지 않는 방법으로 건조 스트레스 처리하였고, 그 후 다시 2일 동안 물을 주어 변화를 확인하였다. 도시된 이미지는 건조 스트레스 처리 전(위), 대조군과 실험군에서 건조 스트레스 처리 후(중간) 및 그리고 2일 동안 다시 물을 뿌린 후(아래) 촬영되었다. 대조군과 실험군 각각의 생존율은 상기한 바와 같이 다시 2일 동안 물을 준 후에 측정되었다. 2가지 형질전환 애기장대 계통(CaSIMK11-OX #1 및 CaSIMK1-OX #7)을 선택하여 표현형 분석에 사용하였다. 데이터는 각각 72개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3b는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에서 잎을 분리한 후 각각의 시점(time point)에서 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 나타낸다. 데이터는 각각 18개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3c는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에 50 μM ABA를 처리(분사)하고 6시간 후 잎 온도를 측정하기 위해 열화상 이미지 촬영한 결과를 나타낸다.
도 3d는 상기 도 3c의 잎 온도 측정 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 데이터는 각각 36개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3e는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에서 ABA 처리에 따른 기공 개도(stomatal apertures) 정도를 도시한다. 3주령의 대조군 및 실험군 식물로부터 잎 껍질(Leaf peels)을 수득하고, ABA를 각각 0 μM, 10μM 또는 20μM 농도로 포함하는 기공 개방 용액(SOS buffer)에서 배양하였고, 3시간 후에 현미경 하에서 도 3e에 도시된 이미지를 촬영하고 기공 개도(stomatal apertures) 정도를 측정하였다.
도 3f는 상기 도 3e의 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 각각 20개의 식물이 평가된 3번의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다. Asterisk(*)는 야생형 식물과 CaSIMK1-OX 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
도 1b는 green fluorescent protein (GFP)-tagged CaSIMK1 단백질의 세포 내 위치(Subcellular localization)를 확인한 것으로, CaSIMK1 단백질이 세포 핵 내에서의 기능함을 도시한다. 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에서 GFP의 발현은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰되었다. DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole)를 핵 마커로 사용했으며, 흰색 스케일바(scale bar)는 20μm를 나타낸다.
도 2a는 대조군 (TRV2:00) 및 CaSIMK1-silenced pepper 실험군 (TRV2: CaSIMK1) 식물에서 건조 스트레스 민감도를 확인한 결과를 나타낸다. 실험군 및 대조군의 3주령 식물에 14일 동안 물 주기를 중단하여 건조(가뭄) 스트레스를 처리한 후, 다시 2일 동안 물을 주었다. 도시된 이미지는 건조 스트레스 처리 전(위), 대조군과 실험군에서 건조 스트레스 처리 후(중간) 및 그리고 2일 동안 다시 물을 뿌린 후(아래) 촬영되었다. 그리고 건조 스트레스 처리 대조군 및 실험군에서 다시 물주기를 수행하고 2일 후에 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 고추 식물의 생존율을 정량적으로 나타내었다. 각각 36개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2b는 각각 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 식물의 잎에서 발생하는 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 정량적으로 나타낸다. 각 대조군 및 실험군 식물에서 잎을 떼어내고, 9시간 동안 매시간 간격으로 잎의 생체중(fresh weight)을 측정하였다. 데이터는 각각 12개의 잎이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2c는 ABA 처리 후 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 열화상 이미지 촬영을 통해 식물의 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸다. 대조군 및 실험군 식물의 잎에 각각 0 및 100μM의 ABA를 분사하였다. ABA 처리 3시간 후에 열화상 이미지를 촬영하여 잎 온도를 측정했다.
도 2d는 상기 도 2c의 잎 온도 측정 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 데이터는 각각 12개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 2e는 TRV2:00 및 TRV2:CaSIMK1 식물에서 ABA-유도 기공 폐쇄 정도를 촬영한 이미지이다. 3주령의 대조군 및 실험군의 잎 껍질(Leaf peels)을 각각 0, 10 또는 20μM ABA가 포함된 SOS(stomata opening solution) buffer와 함께 배양하였고, 3시간 후에 도 2e에 도시된 이미지를 현미경 하에서 촬영하고 기공 개도(stomatal apertures)를 측정하였다.
도 2f는 상기 도 2e의 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 각각 12개의 잎이 평가된 세 번의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다. Asterisk(*)는 TRV2:00과 TRV2:CaSIMK1 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
도 3a는 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 식물의 건조 스트레스에 대한 내성 표현형의 증가를 도시한다. 3주령(three-week-old) 야생형(WT) 대조군 및 상기 형질전환 실험군 식물에 14일 동안 물을 주지 않는 방법으로 건조 스트레스 처리하였고, 그 후 다시 2일 동안 물을 주어 변화를 확인하였다. 도시된 이미지는 건조 스트레스 처리 전(위), 대조군과 실험군에서 건조 스트레스 처리 후(중간) 및 그리고 2일 동안 다시 물을 뿌린 후(아래) 촬영되었다. 대조군과 실험군 각각의 생존율은 상기한 바와 같이 다시 2일 동안 물을 준 후에 측정되었다. 2가지 형질전환 애기장대 계통(CaSIMK11-OX #1 및 CaSIMK1-OX #7)을 선택하여 표현형 분석에 사용하였다. 데이터는 각각 72개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3b는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에서 잎을 분리한 후 각각의 시점(time point)에서 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 나타낸다. 데이터는 각각 18개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3c는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에 50 μM ABA를 처리(분사)하고 6시간 후 잎 온도를 측정하기 위해 열화상 이미지 촬영한 결과를 나타낸다.
도 3d는 상기 도 3c의 잎 온도 측정 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 데이터는 각각 36개의 식물이 평가된 3개의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다.
도 3e는 야생형(WT) 대조군 및 CaSIMK1-과발현(OX) 형질전환 애기장대 실험군 식물에서 ABA 처리에 따른 기공 개도(stomatal apertures) 정도를 도시한다. 3주령의 대조군 및 실험군 식물로부터 잎 껍질(Leaf peels)을 수득하고, ABA를 각각 0 μM, 10μM 또는 20μM 농도로 포함하는 기공 개방 용액(SOS buffer)에서 배양하였고, 3시간 후에 현미경 하에서 도 3e에 도시된 이미지를 촬영하고 기공 개도(stomatal apertures) 정도를 측정하였다.
도 3f는 상기 도 3e의 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 각각 20개의 식물이 평가된 3번의 독립적인 실험의 '평균 ± 표준 편차'를 나타낸다. Asterisk(*)는 야생형 식물과 CaSIMK1-OX 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
식물은 극한의 환경 조건에서도 생존을 위한 방어 메커니즘을 발전시켜 왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid; ABA)은 환경 스트레스에 대한 적응과 관련된 주요 식물 호르몬으로 알려져 있다. 본 발명자들은 고추 유래 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 유전자를 분리하였고, 상기 유전자를 과발현시킨 형질전환 고추 또는 애기장대 식물에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자인, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질 및 이를 암호화하는 CaSIMK1 유전자를 제공한다.
본 발명의 유전자인 CaSIMK1은 예를 들어 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaSIMK1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 예를 들어 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자인 CaSIMK1의 cDNA는 1,029 bp ORF(open reading frame)를 포함하고, 342 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 38.26 kD의 분자량, pH 5.94의 등전점을 가진 것으로 추정되었다.
본 발명의 유전자인 CaSIMK1은 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 건조 스트레스에 대한 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란, 발현 또는 활성이 증가할수록 식물체의 건조 스트레스 내성이 증가하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaSIMK1은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaSIMK1 유전자가 발현이 증가되는 경우, ABA 민감도 증가 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.
본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 전사인자인 CaSIMK1을 동정하였고, 앱시스산(ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄(stomatal closing)를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaSIMK1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.
우선, 본 발명의 일 실시예에서는, 고추에서 CaSIMK1 유전자를 분리 및 동정하고, CaSIMK1 단백질이 세포 핵 내에서의 기능함을 확인하였다(실시예 1, 실시예 2, 도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명자들은 CaSIMK1의 ABA, 건조 스트레스 등에 반응한 유전자 발현 정도, 묘종 및 성숙 단계의 다양한 고추 식물의 기관에서의 CaSIMK1의 발현 수준을 측정하여 CaSIMK1이 비생물 스트레스에 대한 적응 반응에 관여함을 확인하였다
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaSIMK1 침묵 고추 식물을 제조하여 건조 스트레스를 처리한 조건에서, 대조군 식물과 CaSIMK1 침묵 고추 식물의 잎에서 잎 온도, 기공개도, 생중량 등을 측정함으로써 CaSIMK1 유전자 침묵에 의한 건조 스트레스 저항성 감소 효과를 확인하였다. 또한 CaSIMK1가 ABA 민감도를 조절함으로써 건조 스트레스에서 양성 조절자 역할을 한다는 것을 보여주었다(실시예 3, 도 2a 내지 도 2f 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaSIMK1을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 제작하여 건조 스트레스를 처리한 조건에서 야생형 식물체와 CaSIMK1 과발현 식물체의 생존율, 생중량 비율, 잎의 온도, 기공개도 등을 측정함으로써 CaSIMK1이 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증가시키는 양성조절자로 작용함을 확인하였다(실시예 4, 도 3a 내지 도 3f 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 상기 CaSIMK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 침묵되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 침묵되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.
본 발명에서는, CaSIMK1의 상기 ORF(open reading frame)영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaSIMK1 유전자의 발현을 성공적으로 침묵시킨 바 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pK2GW7, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자, 번역 조절 요소(translation control element) 또는 터미네이터를 포함할 수 있다.
상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 통상의 기술자에게 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 재조합 벡터가 접종된 식물세포를 제공한다.
상기 식물세포는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료물류 등의 세포일 수 있으며, 예를 들면 애기장대 또는 고추의 식물세포이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaSIMK1 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 조성물을 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 조성물에서, 상기 CaSIMK1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료물류 등일 수 있으며, 예를 들면 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험준비 및 실험방법]
1-1. 식물 재료 및 성장 조건
본 발명에서는 고추(Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 담배(Nicotiana benthamiana)가 사용되었다. 애기장대 종자 표면을 멸균한 후 24℃에서 MS 배지 플레이트를 사용하여 발아시켰다. 고추와 담배는 각각 27℃및 25℃에서 증기 소독된 배합토[피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)]에 뿌려졌다. 상기 애기장대, 고추 및 담배의 성장을 위해 배양실을 장일 조건으로 유지하였다(16시간 광 / 8시간 암주기).
1-2. 바이러스-유도 유전자 침묵(Virus-induced gene silencing; VIGS)
CaSIMK1-침묵 고추 식물은 기존에 알려진 방법에 의해 담배얼룩바이러스(Tobacco rattle virus; TRV) 기반 바이러스 유도 유전자 침묵 시스템을 사용하여 생성하였다. CaSIMK1 cDNA의 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하고 동결-해동 방법(freeze-thaw method)을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 도입하였다. pTRV2:CaSIMK1을 운반하는 형질전환된 아그로박테리아를 TRV1과 함께 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD600=0.2). CaSIMK1의 경우는 cDNA의 170bp 단편(860 - 1029)이 pTRV2 벡터 구축물에 사용되었다. 음성 대조군으로는 TRV2:00 벡터가 사용되었다. 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.
클로닝 및 VIGS에 사용된 프라이머는 각각 하기 표 1에 나타내었다.
| Primer name | Primer sequence (5'-3') |
| CaSIMK1-CDS | Forward (서열번호 3) ATGGATTGGACAAGAGGCCATA |
| Reverse (서열번호 4) TTATTCACTTCTGCTGCTTCTAACTG |
|
| w/o stop codon Forward (서열번호 5) CGAATTCGCCCTTTTCACTTCTGCTGCTTCTAACTGT |
|
| w/o stop codon Reverse (서열번호 6) ACAGTTAGAAGCAGCAGAAGTGAAAAGGGCGAATTCG |
|
| CaSIMK1-Y2H | Reverse (서열번호 7) CTAAGAAATGGATGTCTAAGGAGTTGTT |
| CaSIMK1K32N | Forward (서열번호 8) TGAGGTTTTTGCTGTCAATTCAGTGGAGCTATCCG |
| Reverse (서열번호 9) CGGATAGCTCCACTGAATTGACAGCAAAAACCTCA |
|
| CaSIMK1-VIGS | Forward (서열번호 10) TCTAGAGAAGACATTTGGAGTTCAGATAGT |
| Reverse (서열번호 11) CTCGAGTTATTCACTTCTGCTGCTT |
1-3. CaSIMK1 유전자가 과발현(CaSIMK1-OX)된 형질전환 애기장대 제조
전장 CaSIMK1 cDNA(서열번호 1)를 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen)에 결합한 다음 콜리 플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터의 제어 하에 CaSIMK1의 구성적 발현을 위한 LR 반응을 사용하여 pK2GW7 이원 벡터에 삽입하였다. 애기장대에서. 상기 제작물은 플로랄 딥(floral dip) 방법을 사용하여 A. tumefaciens 균주 GV3101에 형질전환되었다(Clough and Bent, 1998). 트랜스제닉 계통을 선택하기 위해, 형질전환된 식물에서 수확한 종자를 50μg/ml의 카나마이신이 함유된 MS 한천 플레이트에 파종하였다.
1-4. 세포 내 위치(Subcellular localization) 및 이분자 형광 상보성 분석(bimolecular fluorescence complementation assay)
CaSIMK1의 세포내 위치를 조사하기 위해, 정지 코돈이 없는 CaSIMK1 코딩 영역을 GFP- 융합 이진 벡터 p326GFP에 삽입하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 p19 균주 (1 : 1 비율, OD600 = 0.5)와 혼합하고, 완전히 팽창 된 담배 식물 잎에 공침시켰다. 침투 3일 후, 현미경 분석을 후술 한 바와 같이 수행 하였다.
종결 코돈이 없는 CaSIMK1의 전장 cDNA는 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 구조체 (Waadt et al., 2008)의 생성을 위해 35S-VYNE 벡터에 서브 클로닝 되었다. 일과성 발현을 위해서, 상기 구조를 보유하고 있는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 유전자 침묵을 피하기 위해 p19 균주와 혼합 한 후, 1mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 담배(N. benthamiana) 식물(OD600 = 0.5)의 잎의 배축면에 침투시켰다. 침윤 3일 후, 잎 디스크를 절단하고 LSM Image Browser 소프트웨어가 장착된 공초점 현미경(모델 Zeiss 710 UV/Vis Meta, Gemany)하에서 하측 표피 세포를 검사 하였다.
1-5. RNA 분리 및 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)
스트레스 조건에서 CaSIMK1 및 ABA 반응 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, Rneasy Mini 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 ABA 또는 탈수 처리한 고추 잎 조직으로부터 분리한 총 RNA를 사용하였다. 모든 RNA 샘플은 제조사의 프로토콜에 따라 Transcript First Strand cDNA 합성 키트(Roche, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 CFX96 TouchTM Real-time PCR 검출 시스템(Bio-rad)에서 적절한 프라이머(하기 표 2 참조)와 함께 iQTM SYBR Green Supermix를 사용하여 수행하였다. 내부 대조군으로는 CaACT1(hot pepper actin1 gene)을 사용하였다. 각 반응은 세 번의 독립적인 실험으로 수행되었다.
qRT-PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
| Primer name | Primer sequence (5'-3') |
| CaSIMK1 | Forward (서열번호 12) CCAGAAATTCCAAGGTTCCTCTCTT |
| Reverse (서열번호 13) TTATTCACTTCTGCTGCTTCTAACTG |
|
| CaACT1 | Forward (서열번호 14) GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT |
| Reverse (서열번호 15) CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT |
1-6. 재조합 단백질 발현 및 정제
GST(glutathione) 또는 MBP(maltose binding protein) 융합 단백질을 발현시키기 위해 CaSIMK1의 전장 코딩 서열을 증폭하여 pGEX 4T-3(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden) 및 pMAL-c2X(New England Biolabs) 벡터에 각각 삽입하였다. 이들 작제물은 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환 되었다. 재조합 단백질은 BL21 세포에서 0.1 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 유도되었다. 재조합 단백질은 제조사의 지침에 따라 GST 또는 MBP 융합 단백질에 대해 각각 글루타티온 세파로스 4 패스트 플로우(glutathione sepharose 4 fast flow; GE-healthcare Bio-Sciences) 및 아밀로스(New England Biolabs)를 사용하여 정제되었다.
1-7. 풀다운 분석(pull-down assay)
MBP가 태그된 CaSIMK1 및 GST가 태그된 CaSIMK1 단백질은 대장균 균주 BL21(DE3)에서 발현되었다. 단백질 풀다운 분석을 위해, GST가 태그된 CaSIMK1 단백질은 프리-클리어된 MBP-태그 CaSIMK1 및 MBP와 함께 4에서 2시간 동안 배양되었다. 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.5% Triton X-100)으로 5회 세척한 후, 샘플을 GST-용리 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온) 및 4X Laemmli 단백질 버퍼와 혼합하였다. 이후 샘플을 끓인 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 적절한 항체가 존재함을 확인하였다.
1-8. 열화상 분석(Thermal imaging analysis) 및 기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량
열화상 분석을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 3주령 고추 식물을 100μM ABA로 처리하였다. 열화상 이미지는 적외선 카메라(FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며, 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 소프트웨어로 측정하였다.
기공개도(stomatal aperture)의 측정을 위해, 고추 잎에서 표피 껍질을 채취하고, 기공 개방 용액[SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH (pH 6.5), 10 μM CaCl2]에 부유시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 완충액을 각각 0, 10 또는 20 μM의 ABA(Sigma, USA)를 포함하는 새로운 SOS로 교체하였다. 추가로 3시간 배양 후, 각각 개별 샘플에서 100개의 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 무작위로 관찰하고, Image J 1.46r (http://imagej.nih.gov/ij)를 사용하여 기공의 너비와 길이를 측정하였다. 각 실험은 세 번 수행하였다. 애기장대를 이용한 실험에서도 상기한 바와 동일한 방법을 이용하여 도면 또는 도면의 설명에 기재한 조건으로 실험하였다.
1-9. 탈수 스트레스(dehydration stress) 처리
CaSIMK1와 건조 스트레스 내성과의 연관성을 조사하기 위해, 증산 수분 손실(transpirational water loss)을 측정하였다. 6엽 단계의 고추 식물에서 잎을 분리하여 배양 접시에 넣고, 상대습도 40%의 생장상에서 유지시켰다. 생중량(fresh weight) 손실은 표시된 각각의 시점에서 측정되었다. 모든 실험은 최소 3회 반복되었다. 건조 스트레스 내성 분석은 4엽 단계의 유전자 침묵 고추를 사용하여 수행되었다. 애기장대를 이용한 실험에서도 상기한 바와 동일일한 방법을 이용하여 도면에 도시한 조건으로 실험하였다.
1-10. ABA 및 건조 스트레스 처리
ABA 처리 후의 고추 식물에서 CaSIMK1 유전자의 발현 패턴 변화를 확인하기 위해, 6엽기의 고추 식물에 100 μM ABA 또는 대조군 용액을 분사하였다. 건조 스트레스 처리를 위해, 고추 식물을 상처 나지 않도록 조심스럽게 토양에서 분리하고, 3mm 여과 종이 위에서 두어 탈수시켰다. 각각의 처리 후 0, 2, 6, 12 및 24시간째에 잎을 회수하고, RNA 분리 및 qRT-PCR 분석을 실시하였다.
3주령 야생형 및 CaSIMK1-침묵 고추 식물을 무작위로 심은 후, 4엽기의 고추 식물에 14일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고 회복되도록 2일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산하였다.
건조 저항성은 증발하는 물 손실량을 측정함으로써 정량적으로 확인하였다. 이를 위해, four-leaf stage의 고추 식물로부터 회수한 잎을 페트리접시 (petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리접시를 40% 상대습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.
애기장대를 이용한 실험에서도 상기한 바와 동일일한 방법을 이용하여 도면에 도시한 조건으로 실험하였다.
1-11. 통계적 분석
통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타내며, P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다(*P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001).
실시예 1. CaSIMK1의 식별 및 분자적 특징 분석
CaSIMK1의 cDNA는 1,029 bp ORF(open reading frame)를 포함하고, 342 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 38.26 kD의 분자량, pH 5.94 의 등전점을 가진 것으로 추정되었다.
또한 SMART (Simple Modular Architecture Research Tool; http://smart.embl-heidellberg.de/) program을 이용하여 CaSIMK1 유전자의 도메인을 예측하였다. 서열분석 결과 N-terminal 부분부터 보존된 Serine/Threonine kinase domain을 가지고 있으며, domain 내부에 12개의 kinase 관련 motif와 activation loop를 포함 하고 있다(도 1a 참조).
실시예 2. CaSIMK1의 세포 내 위치 및 전사촉진
CaSIMK1의 세포 내 위치를 조사하기 위해, 상기 실험방법 1-4 기재된 방법에 따라, CaSIMK1 coding region을 형광단백질인 Green Fluorescent protein (GFP)을 결합시켜 35S promoter 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 상기 벡터를 이용해 융합단백질(35S: CaSIMK1-GFP)을 담배 (N. benthamiana) 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 담배 (N. benthamiana)의 표피 세포 (epidermal cell)에 있는 35S: CaSIMK1-GFP 융합단백질이 핵내에서 GFP 신호를 만들었으며, 따라서 35S: CaSIMK1-GFP 단백질의 발현 분석 결과, CaSIMK1-GFP 융합단백질이 핵에 위치하는 것으로 확인되었다. 이는 CaSIMK1 단백질이 핵 내에서 위치하며 기능하는 것을 의미하여, CaSIMK1 단백질은 핵을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 확인하였다.
실시예 3. CaSIMK1 침묵 고추 식물의 건조 스트레스에 대한 내성 약화
비생물적 스트레스에 대한 CaSIMK1의 생물학적 기능을 조사하기 위해, 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기술을 사용하여 일시적으로 CaSIMK1 유전자가 넉다운(knock-down)된 고추 식물을 제조하였다.
먼저, VIGS 분석의 효율성을 확인하기 위해 빈 벡터(TRV2:00) 대조군 및 CaSIMK1 침묵(TRV2:CaSIMK1) 고추 잎을 사용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 대조군 (TRV2:00)과 비교하여, CaSIMK1 침묵 고추(TRV2:CaSIMK1)에서 CaSIMK1의 발현 수준이 매우 낮음을 확인하였다.
그리고, 건조 스트레스에 대한 반응을 조사하기 위해, CaSIMK1 침묵 고추와 대조 식물을 대상으로 표현형을 확인하였다.
도 2a의 첫번째 줄에 나타난 바와 같이, 3주차에는 CaSIMK1 침묵 고추 식물과 정상 조건에서 대조 식물 사이에는 표현형 차이가 없었다.
그러나, 도 2a의 두번째, 세번째 줄에 나타난 바와 같이, 14일 동안 물을 주지 않고 2일 동안 다시 물을 주었을 때, CaSIMK1 침묵 고추 식물은 대조군 식물보다 더 시들어진 표현형을 나타내었다. 또한 도 2a에 나타낸 바와 같이, CaSIMK1-침묵 고추 식물의 생존률은 38.79%, 대조 식물의 생존율은 53.03%로, CaSIMK1-침묵 고추 식물의 생존율이 현저히 낮음을 확인하였다.
한편, CaSIMK1 침묵 고추 식물의 건조 스트레스 내성에 관한 표현형이 수분 보유 능력의 차이로 인한 것인지 조사하기 위해, 잎의 생중량(fresh weight) 비율을 측정하여 CaSIMK1 침묵 고추 식물과 대조 식물의 수분 보유 능력을 조사한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 분리 후 1 시간 이후부터 대조 식물이 CaSIMK1 침묵 고추 식물보다 잎의 생중량 비율이 증가하여 증산에 의한 수분 손실이 낮았다.
또한, CaSIMK1 침묵 고추 식물의 건조 스트레스 내성 표현형이 ABA 민감도의 변화에 기인하는지 확인하기 위해, ABA 처리 전후에 잎 온도와 기공 구멍을 측정하였다.
도 2c 및 도 2d에 나타난 바와 같이, ABA 처리 후 잎 온도는 대조 식물보다 CaSIMK1 침묵 고추에서 더 낮은 것으로 나타났다. 즉, CaSIMK1 침묵 고추의 경우에는 증산 수분 손실이 많아 증발 냉각에 의한 온도 감소 효과가 높음을 뒷받침하는 결과이다.
또한, 도 2e 및 도 2f에 나타난 바와 같이, CaSIMK1 침묵 고추 식물의 기공 구멍은 ABA 처리 후 대조 식물보다 크게 나타났다.
종합하면, 상기 결과는 CaSIMK1가 ABA 민감도를 조절함으로써 건조 스트레스에서 양성 조절자 역할을 한다는 것을 보여주었다.
실시예 4. CaSIMK1-OX 형질전환 애기장대의 건조 스트레스 저항성 확인
CaSIMK1 과발현이 건조 스트레스 반응에서 애기장대에 미치는 영향을 추가로 조사하기 위해 CaSIMK1-OX(2가지 형질전환 애기장대 계통 #1 및 #7 사용) 및 야생형(WT) 식물을 건조 스트레스에 노출시키고 그 표현형을 확인하였다.
도 3a의 첫번째 줄에 나타난 바와 같이, 3주 동안 물이 잘 뿌려진 조건에서 재배될 동안에는 CaSIMK1-OX 및 야생형 식물 사이에 다른 표현형은 관찰되지 않았다.
그러나, 도 3a의 두번째, 세번째 줄에 나타난 바와 같이, 14일 동안 물을 주지 않고 2일 동안 다시 물을 주었을 때, CaSIMK1-OX 식물은 야생형 식물에 비해 현저히 덜 시드는 것을 확인하였다.
또한 도 3a에 나타난 바와 같이, CaSIMK1-OX 식물의 생존율(평균 약 39.1%)은 야생형 식물(약 18.3%)보다 현저히 높았다. 생중량 비율에 대해서는 도 3b에 나타낸 바와 같이 분리 후 1시간 이후부터 CaSIMK1-OX 식물이 야생형 식물에 비해 잎의 생중량 비율이 증가하여 증산에 의한 수분 손실이 낮았다.
ABA 처리 전과 후에 CaSIMK1이 과발현된 애기장대의 잎의 온도를 측정하였다. 도 3c에 나타난 바와 같이, ABA 처리 전 CaSIMK1-OX 식물과 야생형 식물의 온도는 큰 차이는 없으나 야생형이 더 온도가 낮을 것을 알 수 있다. 도 3c 및 도 3d에 나타낸 바와 같이, ABS 처리 후에는 CaSIMK1-OX 식물이 야생형 식물보다 온도가 상당히 높다는 것을 알 수 있다.
CaSIMK1 과발현 애기장대 식물의 건조 스트레스 내성 표현형이 ABA 민감도의 변화에 기인하는지 확인하기 위해, ABA 처리 전 후에 기공 구멍을 측정하였다.
도 3e 및 도 3f에 나타난 바와 같이, ABA 부재시에는 CaSIMK1-OX 식물과 야생형 식물의 기공 구멍이 비슷한 크기이지만, ABA가 존재할 때는 기공 구멍의 크기가 야생형보다 CaSIMK1-OX 식물이 유의하게 작은 것을 확인하였다.
즉, CaSIMK1 과발현 애기장대의 경우에는 증산 수분 손실이 적어 증발 냉각에 의한 온도 감소 효과가 낮음을 뒷받침하는 결과이다.
종합하여, 우리는 CaSIMK1이 ABA-매개 유전자 발현의 조절을 통해 가뭄 스트레스 반응의 양성 조절자로서 기능한다는 것을 규명하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<213> Artificial Sequence
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<223> nucleic acid sequence of CaSIMK1
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aagtcaattt ggtgcgatga ggtttttgct gtcaagtcag tggagctatc cgagtcgcag 120
ttattacaaa aagaacagaa aattctgtcc caattgagct ccccttatat agttatctac 180
aagggttacg atgttactaa agagaaagac aaactcacgt ttaatcttat gatggaatac 240
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ttgatagggt gttatgcgaa gcaaattctt catggattag agtacctaca ttcaagaggc 360
atagcacact gtgacattaa ggggcagaac attctgttag gtaaaacagg tgccaaaatt 420
tctgactttg gttgtgctag gtgggttgat gctgcggaaa gggacggcgg cggcgcggct 480
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acaggtagat caccatggac tgatatgaca aacacagctt cattacttta cctaattgca 660
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<213> Artificial Sequence
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<223> amino acid sequence of CaSIMK1
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1 5 10 15
Val Ser Val Ala Lys Ser Ile Trp Cys Asp Glu Val Phe Ala Val Lys
20 25 30
Ser Val Glu Leu Ser Glu Ser Gln Leu Leu Gln Lys Glu Gln Lys Ile
35 40 45
Leu Ser Gln Leu Ser Ser Pro Tyr Ile Val Ile Tyr Lys Gly Tyr Asp
50 55 60
Val Thr Lys Glu Lys Asp Lys Leu Thr Phe Asn Leu Met Met Glu Tyr
65 70 75 80
Met Ser Gly Gly Thr Ile Ser Asn Ala Ile Arg Lys Gln Gly Gly Arg
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Ile Asn Glu Gln Leu Ile Gly Cys Tyr Ala Lys Gln Ile Leu His Gly
100 105 110
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Ser Pro Glu Ile Pro Arg Phe Leu Ser Leu Gln Ala Lys Asp Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Leu Arg Arg Asp Pro Lys Asp Arg Trp Thr Ala Lys Gln
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Thr Gln Asp Phe Val Thr Ser Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Gln Asp
275 280 285
Ile Trp Ser Ser Asp Ser Met Asp His Tyr Leu Ile Arg Thr Ala Ser
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Ser Val Asp Thr Pro Leu Gln Arg Ile Arg Glu Leu Gly Ser Asn Ser
305 310 315 320
Arg Glu Leu Asn Cys Lys Trp Asn Asp Asp Gln Arg Trp Ile Thr Val
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<220>
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Claims (10)
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- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 제5항의 조성물을 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 키트.
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CaSIMK1 (Capsicum annuum SnRK2.6 Interacting MAP3 Kinase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법.
- 제7항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
- 제8항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체. - 제5항에 있어서,
상기 CaSIMK1 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSIMK1 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
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| GRNT | Written decision to grant |