KR102090653B1 - 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaSnRK2.6 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaSnRK2 .6 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것으로, CaSnRK2.6 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaSnRK2 .6 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaSnRK2.6 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to the drought stress using pepper protein kinase CaSnRK2.6 in plants}

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaSnRK2 .6(Capsicum annuum Snf 1 Related Protein Kinase 2.6) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.

ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.

대한민국공개특허공보 10-2011-0019978

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추에서 CaADIP1의 상호작용자인 CaSnRK2.6 동정 하였으며, 상기 단백질이 ABA 매개성 기공 폐쇄를 조절함으로써, 이를 통해 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로서 기능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은, CaSnRK2 .6 유전자, CaSnRK2.6 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, CaSnRK2.6 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSnRK2.6 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaSnRK2 .6 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaSnRK2.6 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다:

(a) CaSnRK2.6 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaSnRK2.6 단백질을 과발현시키는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 CaADIP1의 상호작용자인 CaSnRK2.6를 동정하였으며, CaSnRK2.6 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaSnRK2 .6 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 CaADIP1 및 CaSnRK2.6 사이의 상호 작용에 대한 yeast two-hybrid 분석결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 CaADIP1 및 CaSnRK2.6 사이의 상호 작용에 대한 이분자 형광상보성 (BiFC) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 CaSnRK2.6의 계통 발생(Phylogenetic tree) 수를 분석한 결과이다.
도 2b는 CaSnRK2.6 및 애기장대(Arabidopsis) SnRK2.6의 단백질 정렬 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 고추의 다양한 기관에서 CaSnRK2.6의 상대적 발현 정도를 비교한 것이다.
도 3b는 탈수 또는 ABA 처리시 CaSnRK2.6의 시간별 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 3c는 CaSnRK2.6가 기능하는 위치를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 CaSnRK2.6의 자가인산화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4c는 CaSnRK2 .6-silenced 고추 식물에서 가뭄 저항성 및 ABA 감수성 감소를 관찰한 결과로, 도 4a는 CaSnRK2.6-silenced 고추 식물(TRV:CaSnRK2.6) 및 대조군 식물(TRV:00)에서 CaSnRK2.6의 상대적 발현량을 비교한 결과이고, 도 4b는 상기 식물에 가뭄 처리시 표현형을 비교한 것이며, 도 4c는 상기 식물에 가뭄 처리 후 재 급수시 생존률을 비교한 것이다.
도 5a 내지 5d는 CaSnRK2 .6-silenced 고추 식물에서 가뭄 저항성 및 ABA 감수성 감소를 관찰한 결과로, 도 5a 및 5b는 잎의 온도 차이를, 도 5c 및 5d는 잎의 기공개도 차이를 비교한 것이다.
도 6a 내지 6c는 CaSnRK2.6 과발현 식물(CaSnRK2 .6-OX)의 가뭄저항성 증가를 관찰한 것으로, 도 6a는 CaSnRK2 .6-OX 식물 및 대조군(WT) 식물의 CaSnRK2.6 발현량을, 도 6b는 상기 식물에 가뭄처리시 표현형을, 도 6c는 상기 식물에 가뭄처리 후 재급수시 생존률을 비교한 것이다.

본 발명자들은 고추에서 CaADIP1의 상호작용자인 CaSnRK2.6 동정하였으며, 상기 단백질이 ABA 매개성 기공 폐쇄를 조절함으로써, 이를 통해 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로서 기능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, CaADIP1의 상호작용자인 CaSnRK2.6 동정하여 정렬 분석(alignment analysis)한 결과 CaSnRK2.6가 애기장대 SnRK2.6과 높은 서열 동일성을 가짐을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 탈수 또는 ABA 처리시 CaSnRK2.6 전사체가 유의하게 유도됨을 확인했으며, CaSnRK2.6 및 녹색 형광 단백질(GFP)의 융합 단백질을 이용하여 CaSnRK2.6이 핵과 세포질에서 기능한다는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaSnRK2 .6-silenced 고추 식물은 야생형 식물에 비하여 건조 스트레스 처리시 생존률이 더 낮았으며, 기공개도가 더 크게 나타나는 등 가뭄 내성 및 ABA 감수성이 감소함을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaSnRK2.6이 과발현된 형질전환 식물의 경우 야생형 식물에 비하여 건조 스트레스 처리시 생존률이 높게 나타나는 등 향상된 가뭄 내성이 나타남을 확인하였다(실시예 5 참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSnRK2 .6 유전자를 제공한다.

본 발명에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaSnRK2.6이 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CaSnRK2 .6 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaSnRK2.6 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다:

(a) CaSnRK2.6 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaSnRK2.6 단백질을 과발현시키는 단계.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 방법

1-1. 효모 이중 혼성화 분석 ( Yesst two-hybrid assay, Y2H )

효모 라이브러리 스크리닝을 위해서, PP2CA cDNA로부터 N-말단 19 아미노산 결실 구조체를 증폭시켰으며, 이를 pGBKT7 벡터에 클로닝하였다. 부분 PP2CA BD-구조체를 리튬 아세테이트-조절 전이 방법을 사용하여 효모 균주 Y2Hgold에 도입하여 형질 전환시켰다. 각 구조체는 전장 CaSnRK2 .6 및 PP2Cs를 각각 pGBKT7 및 pGADT7 벡터에 클로닝하여 제조 하였으며, 먹이 (bait) 및 사냥감 (prey)구조체는 리튬 아세테이트-조절 전이 방법을 사용하여 효모 균주 AH109에 공동 형질 전환시켰다.

형질전환체는 SC-루이신-트립토판 배지로 선택하였고, 단백질-단백질 상호 작용의 지표로서 성장률을 측정하기 위해, interation selection 배지 (SC-아데닌-히스티딘-류신-트립토판)상에 옮겼다. 시리얼(serial) 희석 분석을 위해, 기하급수적으로 성장한 효모세포를 수거하여, 멸균한 이중-증류수로 OD₆₀₀값을 0.5로 조절하고, 각 효모 세포 배양액 5 ㎕은 10 μM의 ABA가 첨가되거나 미첨가된 SC-루이신-트립토판 배지 및 SC-아데닌-히스티딘-루이신-트립토판 배지상에 스팟팅 하였다.

1-2. 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석

상기 실시예 1-1의 효모 이중 혼성화 분석에서 확인된 단백질-단백질 상호작용을 더욱 확인하기 위해 식물세포에서 BiFC 방법을 이용하였다. 우선, BIFC 구조체를 제조하기 위하여, 종결코돈을 갖지 않는 CaSnRK2 .6 및 PP2CA의 전장 cDNA를 Spel/sall을 통해 35S-CYCE 및 35S-VYNE 벡터내로 서브 클로닝한 다음, 일시 발현을 위해서, 각각의 구조체를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101를 p19 균주와 혼합하여 유전자 침묵(silencing)을 피하고, 1 ㎖ 바늘 없는 주사기를 사용하여 5 주된 담배 (Nicotiana benthamiana) 잎의 배축면에 침윤시킨 다음, 침윤 3일 후, 잎전편을 절단하고, 표피세포를 LSM Image Browser 소프트웨어가 설치된 공초점 현미경 (Zeiss 710 UV / Vis Meta, Oberkochen, Germany)으로 분석하였다.

1-3. 식물 재료 및 성장 조건

고추(Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 및 담배(Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 상기 식물은 24±1℃ 조건의 생육실에서 백색 형광등(130 μmol photons m^-2S^-1; 하루 16시간 동안) 빛 아래 성장시켰다.

1-4. 서열 정렬 (Sequence alignment)

CaSnRK2.6로 암호화된 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) web server는 RING finger를 식별하는데 사용하였다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다.

1.5. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)

CaSnRK2.6-GFP 융합 단백질은 p19 균주를 갖는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101(1:1 비율; OD₆₀₀ = 0.5)의 agroinfiltration을 사용하여 담배(N. benthamiana) 표피 세포의 잎에서 일시적으로 발현되었다. 2일간 침투시킨 후, LSM Image Browser software가 설치된 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP 신호를 관찰하였다.

1-6. ABA, 건조 스트레스 처리 및 형태 분석

고추 식물에서 CaSnRK2 .6 유전자의 발현 패턴 변화를 관찰하기 위해, ABA, 또는 건조 처리한 잎 샘플을 준비하였다. 6엽 단계(six-leaf stage)의 고추 식물에 100 μM ABA을 뿌리고, 손상을 방지하기 위해 토양에서 조심스럽게 제거했다. 다음으로, 전체 식물을 3-mm 종이(Whatman, Clifton, UK)에서 건조 시키거나 뿌리를 제거하고 식물의 공중 부분을 말렸다. 이와 같이 처리한 후, 세 번째와 네 번째 잎은 주어진 시점에서 수확했다.

건조 저항성 분석(dehydration tolerance assays)을 위해, 4 주된 유전자 침묵(gene-silenced) 고추 식물 및 대조군 고추 식물과 형질 전환 계통의 3 주된 애기장대 및 야생형 식물을 무작위로 배치했고, 각각 13일 및 11일 동안 급수를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그 후 5일 및 2일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 재수화 된 잎(rehydrated leaves)을 가진 식물의 수를 세어 생존율을 계산하였다. 건조 저항성을 정량적으로 측정하기 위해, 유전자 침묵(gene-silenced) 고추 식물 및 형질 전환된 애기장대 식물에서 분리한 잎을 건조해 수분 손실률을 측정하였다. 잎을 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

정량 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR) 분석을 위해, CaSnRK2 .6 유전자를 과발현하는 4주된 형질전환 식물과 야생형(wild-type) 식물을 토양에서 조심스럽게 제거하고 건조 스트레스를 주어 처리 후 정해진 시간에 수확하였다.

1-7. Virus-induced gene silencing ( VIGS )

CaSnRK2.6의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행 되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV1 및 pTRV2:CaSnRK2 .6 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-8. CaSnRK2 .6 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

CaSnRK2.6의 기능 분석을 위해 CaSnRK2 .6 유전자가 과별현된 애기장대를 제조하였다. CaSnRK2 .6 유전자의 전장 코딩 영역은 pENTR/D-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입 하였다. LR 반응을 통해, 클로닝 된 유전자를 pK2GW7에 도입하여 CaMV 35S 프로모터의 제어 하에 각 유전자를 구성적으로 발현시키고, 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 정확한 구조를 도입하였다. 꽃가루 딥 방법(floral dip method)은 CaSnRK2.6을 이용하여 애기장대의 형질 전환에 적용했으며 과발현된 식물은 카나마이신 (kanamycin) 50 μgㆍmL^-1의 선택 마커가 보충된 MS 플레이트에서 형질전환 종자로 추정되는 발아 종자를 선택하였다. T3 식물의 씨앗은 동일한 항생제가 보충된 MS 플레이트에서 3 : 1 분리 비율을 보이는 2세대 형질 전환 식물에서 수확했다.

1-9. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도의 생물학적 검정을 위해, 고추 및 4주된 애기장대 식물체의 1차 및 2차 잎을 수확하여 잎의 껍질을 분리하고, 빛이 있는 조건으로 2.5시간 동안 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 mM CaCl₂) 위에 띄웠다. 기공 폐쇄는 다양한 농도의 ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하며 유도되었다. 2.5시간을 더 배양한 후, Nikon eclipse 80i microscope를 이용해 각 샘플에서 임의로 100개의 기공을 관찰하였으며, Image J 1.46r(http://imagej.nih.gov/ij)를 이용해 기공의 넓이와 길이를 측정하였다. 상기 실험은 각각 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-10. 열 영상법 (Thermal imaging)

완전히 자란 1차 및 2차 잎을 가진 4주된 고추 식물에 50 μM ABA를 처리하고, 3주 된 애기장대 식물의 뿌리를 제거하여 건조 스트레스를 주었다. 열 영상은 infrared camera(FLIR systems; T420)을 이용하여 얻었으며, 식물의 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 software를 이용해 측정하였다.

1-11. RNA 추출 및 qRT - PCR

RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 각기 ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 준 고추 및 애기장대 식물의 잎을 수확하여 상기 잎으로부터 추출한 모든 RNA 샘플에 대하여 RNA가 없는 DNase(RNA-free DNase)로 분해하여 genomic DNA를 제거하고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 기재된 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 45싸이클의 프로그램으로 수행되었다. 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 고추 액틴 1(CaACT1) 유전자는 정규화를 위해 사용하였다.

Primer name		Primer sequence (5'- 3')	서열번호
Cloning	CaSnRK2 .6	Forward: ATGGATCGGACAGCAGTGACAGTAG	3
		Reverse: TTACATTGCATAGACAATCTCTCCGC	4
RT-PCR	CaSnRK2 .6	Forward: ATGGATCGGACAGCAGTGACAGTAG	5
		Reverse: AGCATTGCATATGCGCTCAAAC	6
	Actin8	Forward: CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA	7
		Reverse: GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT	8
VIGS assay	CaSnRK2 .6- XhoI	Forward: TCTAGAAAGGCTTATGAGGGATAGAC	9
	CaSnRK2 .6- XbaI	Reverse: CTCGAGTGCATAGCATGACAATAGC	10

1-12. 통계적 분석(Statistical analyses)

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test 또는 ANOVA(Fisher's LSD test)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. CaADIP1의 상호작용자인 CaSnRK2.6 동정

CaADIP1의 표적을 확인하기 위해 CaADIP1을 베이트(bait)로 사용하고 고추 cDNA 라이브러리를 프레이(prey)로 사용하여 yeast 2-hybrid(Y2H) 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 여러 개의 상호 작용 파트너 단백질이 분리되었으며 그 중 ABA 핵심 단백질 키나아제(kinase)인 AtSnRK2.6의 동종 단백질인 CaSnRK2.6이 확인되었다.

CaSnRK2.6이 CaADIP1의 상호작용자(interactor)인지 여부를 조사하기 위해, CaADIP1 및 CaSnRK2.6를 모두 효모에서 동시에 발현시켰다. 그 결과 도 1a에 나타난 바와 같이 CaSnRK2.6 및 CaADIP1이 상호 작용한다는 것을 나타내는 선택 배지에서 콜로니가 성장하였다.

또한, 식물에서 상기 상호 작용을 확인하기 위해 2분자 형광 상보성(bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 분석을 수행하였다. 그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이 CaADIP1 및 CaSnRK2.6 사이의 상호 작용을 나타내는 황색 형광 (YFP) 신호가 주로 핵과 세포질에서 검출되었다.

나아가, 계통발생분석 결과, CaSnRK2.6는 애기장대(Arabidopsis) SnRK2형 키나아제와 상동성을 가지며 ABA에 의해 강하게 활성화되는 SnRK2.2, SnRK2.3 및 SnRK2.6과 동일한 클레드(clade)에서 클러스터링되었으며(도 2a 참조), CaSnRK2.6은 ATP 결합 도메인 및 효소 활성을 위한 활성화 루프를 포함하는 362개의 아미노산으로 구성되고 특히, C말단 ABA 박스는 ABA 반응성 SnRK2에서만 발견되었으며, 정렬 분석(alignment analysis) 결과 CaSnRK2.6가 애기장대 SnRK2.6과 91.5 %의 서열 동일성을 가짐을 확인하였다(도 2b 참조).

실시예 3. 고추 잎에서 CaSnRK2 .6의 발현 및 CaSnRK2 .6의 세포 내 위치 규명

CaSnRK2 .6 유전자의 기관-특이적(organ-specific) 발현을 확인하기 위하여 qRT-PCR 분석을 이용하여 고추의 다양한 기관에서 CaSnRK2.6의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 CaSnRK2.6는 잎에서 상대적으로 높은 발현 수준을 나타냈으나 줄기에서는 상대적으로 낮은 발현 수준을 나타냈다.

종래 연구에서, CaADIP1의 전사체는 탈수 스트레스 및 ABA 처리에 의해 유도됨이 확인되었으므로 탈수 및 ABA 처리가 CaSnRK2.6의 발현 수준을 변화시키는지 조사했다. 그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 CaSnRK2.6 발현 유도는 탈수처리 후, 3시간째부터 검출되었고 이후 12시간까지 점진적으로 증가했으며, ABA 처리 또한 CaSnRK2.6 전사체를 유의하게 유도하였다.

또한, CaSnRK2.6 단백질의 위치를 확인하기 위하여 CaSnRK2.6 및 녹색 형광 단백질(GFP)의 융합 단백질을 담배 식물 표피 세포에서 발현시켰다. 그 결과 도 3c에 나타난 바와 같이, 녹색 형광 신호는 주로 핵과 세포질에서 검출되었으며, 상기 결과는 CaSnRK2.6이 핵과 세포질에서 기능한다는 것을 나타낸다.

다음으로, CaSnRK2.6이 키나아제 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 in vitro 키나아제 검정을 수행하였다. 그 결과, 도 3d에 도시된 바와 같이, 재조합 CaSnRK2.6 단백질은 양성 대조군인 AtSnRK2.6과 마찬가지로 자가인산화(autophosphorylation) 되어 키나아제 활성을 가진다는 것을 확인하였다.

실시예 4. CaSnRK2.6 -silenced 고추 식물의 가뭄 내성 및 ABA 감수성 감소

종래 연구에서 CaADIP1이 ABA 의존성 신호 전달을 통해 탈수 스트레스를 음성적으로 조절함을 확인하였으므로, 고추 식물에서 ABA 및 가뭄스트레스에 반응하는 CaSnRK2.6의 생물학적 기능을 조사하기 위하여 바이러스 유도 유전자 침묵(virus-induced gene silencing, VIGS) 분석을 사용하였다.

상기 VIGS 결과물을 이용한 qRT-PCR 분석 결과 도 4a에 나타난 바와 같이 CaSnRK2.6 전사체는 CaSnRK2 .6-silenced 고추 식물 (TRV:CaSnRK2 . 6)과 비교하여 대조군 식물 (TRV:00)에서 강하게 유도됨을 확인하였다.

또한, 가뭄 스트레스에서 CaSnRK2.6의 생물학적 역할을 입증하기 위해 TRV:00 및 TRV:CaSnRK2 .6 식물에 대해 13일간 급수를 제한한 다음 5일 동안 재급수 하여 가뭄에 노출시켰다. 그 결과 도 4b에 나타난 바와 같이 TRV:CaSnRK2 .6 식물은 탈수 및 재급수 조건 하에서 대조군과 비교하여 더 시든 표현형을 나타냈으며 TRV:00 및 TRV:CaSnRK2.6의 생존율은 각각 77 % 및 23 % 이었다 (도 4c 참조).

나아가, TRV:CaSnRK2 .6 식물의 표현형이 변화된 ABA 감수성에 의해 유발되었는지 여부를 평가하기 위해, 잎 온도 및 기공개도를 측정 하였다. 그 결과, 도 5a 내지 5d에 나타난 바와 같이 ABA가 없는 경우 잎 온도 및 기공 포어 크기는 TRV:00 및 TRV:CaSnRK2 .6 식물간에 유의한 차이가 없었으나 ABA를 처리한 경우 TRV:00 잎과 비교하여 TRV:CaSnRK2 .6의 잎 온도는 더 낮았으며 기공의 크기는 더 큰 것을 확인하였다.

실시예 5. CaSnRK2.6 과발현 형질전환식물의 향상된 가뭄 내성

상기 실시예들의 결과를 통해 CaSnRK2 .6-silenced 고추 식물은 가뭄에 민감하고 ABA에 민감한 표현형을 나타내는 것을 확인하였는바, CaSnRK2 .6의 생물학적 역할에 대한 추가적인 유전적 분석을 수행하기 위하여 애기장대 식물을 이용하여 CaSnRK2.6을 과발현시켰으며 CaSnRK2.6 과발현을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR 분석을 수행한 결과 도 6a에 나타난 바와 같이 CaSnRK2.6 전사체는 CaSnRK2.6-OX 식물에서만 검출됨을 확인하였다.

또한, 상기 식물에 표현형과 관련하여 도 6b에 나타난 바와 같이 정상적인 성장 조건에서 야생형 및 CaSnRK2 .6-OX 식물의 표현형상 차이는 발견되지 않았으나 11일 동안 급수를 제한한 다음 2일 동안 재 급수하여 가뭄 처리시, CaSnRK2 .6-OX 식물은 야생형 식물 보다 덜 시든 표현형을 보였고 도 6c에 나타난 바와 같이 재 급수 후, CaSnRK2 .6-OX 식물은 58 내지 62 %가 성장을 재개했지만 야생형 식물은 11 % 만 생존함을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using pepper protein kinase CaSnRK2.6 in plants <130> MP19-080 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> CaSnRK2.6 <400> 1 atggatcgga cagcagtgac agtaggacca gggatggacg taccgatcat gcacgatagt 60 gatagatatg agcttgtaag ggatattggt tctggaaatt ttggtgttgc aaggcttatg 120 agggatagac agactaatga acttgttgct gttaagtata tcgagagagg tgagaagatt 180 gatgaaaacg tcaagagaga aatcatcaac catagatcac tgaggcaccc taacatagtc 240 agattcaaag aggtcatatt aacaccaact catttggcta ttgtgatgga atttgcatct 300 ggaggagagc tgtttgagcg catatgcaat gctggtcgtt tcagcgagga tgaggcacgg 360 tttttcttcc aacaactcat atcaggggtc agctattgtc atgctatgca agtgtgccac 420 agagacttga aattagagaa tacattactg gatggaagcc ctgcaccaag gctaaagatt 480 tgtgattttg gatattctaa gtcctcagtg ttgcattcac aaccaaagtc gactgttggt 540 acacctgcat atattgctcc agaagtgtta ttgaagaaag aatatgacgg gaagattgca 600 gatgtctggt cttgtggagt gactttgtat gtcatgctgg tgggagcata cccttttgaa 660 gacccagagg agcctaaaaa ttttcgaaag acaatacagc gaatcttgaa cgtacagtat 720 tccattcctg attatgtaca tatctctcca gagtgtcgtc atctcatatc aaggattttt 780 gttgctgatc ctgcaaagag gataacgatc cctgagatca agaaccatga gtggttcttg 840 aggaaccttc ctgcagatct catggataat actacaaaca accagtttga ggagccggat 900 caacgtatgc agagcattga cgaaatcatg cagataataa ctgaggcaac cattcctgct 960 gccgggacca acagcctcaa tcattacctc actggaagct tggacattga cgatgacatg 1020 gaagaagact tggagagtga tcctgacctt gatatcgaca gcagcggaga gattgtctat 1080 gcaatgtaa 1089 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> CaSnRK2.6 <400> 2 Met Asp Arg Thr Ala Val Thr Val Gly Pro Gly Met Asp Val Pro Ile 1 5 10 15 Met His Asp Ser Asp Arg Tyr Glu Leu Val Arg Asp Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Asn Phe Gly Val Ala Arg Leu Met Arg Asp Arg Gln Thr Asn Glu Leu 35 40 45 Val Ala Val Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Glu Lys Ile Asp Glu Asn Val 50 55 60 Lys Arg Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Val 65 70 75 80 Arg Phe Lys Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met 85 90 95 Glu Phe Ala Ser Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly 100 105 110 Arg Phe Ser Glu Asp Glu Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser 115 120 125 Gly Val Ser Tyr Cys His Ala Met Gln Val Cys His Arg Asp Leu Lys 130 135 140 Leu Glu Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile 145 150 155 160 Cys Asp Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Val Leu His Ser Gln Pro Lys 165 170 175 Ser Thr Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys 180 185 190 Lys Glu Tyr Asp Gly Lys Ile Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr 195 200 205 Leu Tyr Val Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Glu Glu 210 215 220 Pro Lys Asn Phe Arg Lys Thr Ile Gln Arg Ile Leu Asn Val Gln Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Pro Asp Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Cys Arg His Leu Ile 245 250 255 Ser Arg Ile Phe Val Ala Asp Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ile Pro Glu 260 265 270 Ile Lys Asn His Glu Trp Phe Leu Arg Asn Leu Pro Ala Asp Leu Met 275 280 285 Asp Asn Thr Thr Asn Asn Gln Phe Glu Glu Pro Asp Gln Arg Met Gln 290 295 300 Ser Ile Asp Glu Ile Met Gln Ile Ile Thr Glu Ala Thr Ile Pro Ala 305 310 315 320 Ala Gly Thr Asn Ser Leu Asn His Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Asp Ile 325 330 335 Asp Asp Asp Met Glu Glu Asp Leu Glu Ser Asp Pro Asp Leu Asp Ile 340 345 350 Asp Ser Ser Gly Glu Ile Val Tyr Ala Met 355 360 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6 Forward primer (Cloning) <400> 3 atggatcgga cagcagtgac agtag 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6 Reverse primer (Cloning) <400> 4 ttacattgca tagacaatct ctccgc 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6 Forward primer (RT-PCR) <400> 5 atggatcgga cagcagtgac agtag 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6 Reverse primer (RT-PCR) <400> 6 agcattgcat atgcgctcaa ac 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin8 Forward primer <400> 7 caactatgtt ctcaggtatt gcaga 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin8 Reverse primer <400> 8 gtcatggaaa cgatgtctct ttagt 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6-XhoI <400> 9 tctagaaagg cttatgaggg atagac 26 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSnRK2.6-XbaI <400> 10 ctcgagtgca tagcatgaca atagc 25

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaSnRK2.6(Capsicum annuum Snf 1 Related Protein Kinase 2.6) 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaSnRK2.6 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
   
4. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
   (a) CaSnRK2.6(Capsicum annuum Snf 1 Related Protein Kinase 2.6) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaSnRK2.6 단백질을 과발현시키는 단계.
   
5. 제4항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

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