KR20180039212A - 고추 E3 ligase CaREL1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1)에 관한 것으로서, 상기 유전자 및 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진 시키는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaREL1에 관한 것으로서, 상기 CaREL1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산 (ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따란 CaREL1 단백질을 침묵 (Knockdown)시킴으로써, 식물체의 건조 저항성이 현저히 증진되는바, 상기 CaREL1의 발현조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물을 개량하여 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 E3 ligase CaREL1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to the drought stress using pepper E3 ligase CaREL1 in plants}

본 발명은 신규 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 고착성을 갖기 때문에, 지속적으로 빛, 극단적인 온도 및 수분 스트레스 등의 다양한 스트레스 환경에 노출 되고, 이 중 토양의 물 부족은 전 세계적으로 작물의 수확량 및 농산물 품질의 영향을 끼친다. 식물들은 증산 수분손실을 감소시키기 위한 기공개도의 조절 및 이온 수송 변경을 통해서 수분 스트레스의 불리한 효과를 덜어왔다.

한편, 식물 방어기작 중에 핵심인 앱시스산 (abscisic acid; ABA)은 건조 스트레스의 반응에서 특히 중요한 역할을 한다. 예컨대, 식물이 건조 스트레스에 노출되면, 식물은 잎에서 ABA 생합성이 증가 및 축적시킴으로써 방어 반응을 식물로 이어지는 신호 전달을 시작한다. 식물 보호 메카니즘을 포함하는 대부분의 스트레스 연관 유전자들은 ABA에 의해 조절되기 때문에 ABA- 및 건조-신호전달 경로는 지속적으로 연구되어 왔으나, 이러한 특정 메카니즘은 여전히 명확하게 규명되지는 못하였다.

한편, 26S 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 진핵 세포에서 공통된 단백질 변형 메카니즘이다. 식물에서의 유비퀴틴화는 전사 인자, 호르몬 수용체 및 손상된 단백질과 같은 대상의 다양한 세포내 신호 프로세스에 필수적이다. 유비퀴틴화는 E1(ubiquitin activating enzyme), E2(ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3(ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다.

E3 리가아제는 다수의 다중 이성체를 가지고 있으며, 표적 단백질의 특성을 결정한다. 상기 E3 리가아제는 구조적 도메인이 단일 혹은 다중 서브유닛이 포함되는지에 따라 두 종류의 슈퍼패밀리로 구분된다. 이 때, 슈퍼패밀리 중 하나는, Really Interesting New Gene (RING), Homology to E6-AP Carboxyl Terminus (HECT) 및 U-box E3 리가아제로 구성되고, 다른 하나는, CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1 (CUL4-DDB1), Anaphase Promoting Complex (APC) 및 Skp1-Cullin-F-box (SCF) E3 리가아제로 구성된다.

한편, 애기 장대의 게놈은 1,400개 이상의 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있으며, 상기 E3 유비퀴틴 리가아제는 RING 도메인의 유형에 따라 여덟 개의 서브 그룹으로 세분화된 E3 U-box 리가아제를 포함하는 약 477개의 RING finger 도메인을 포함한다. 하지만, 현재까지는 단지 몇 종류의 RING type E3 리가아제의 정확한 기능만이 밝혀져 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 고추에서 건조 민감성 RING finger 단백질인 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질을 코팅하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체, 상기 식물체의 일부 (특히, 종자) 및/또는 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaREL1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자를 제공한다.

본 발명은 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 CaREL1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질을 코팅하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaREL1에 관한 것으로서, 상기 CaREL1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산 (ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절 할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 CaREL1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는, CaREL1 단백질과 다른 식물종 (Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Nicotiana tomentosifiormis, Vitis vinifera, Malus domestica 및 Arabidopsis thaliana) 간의 단백질 간의 아미노산 서열을 비교한 결과이며, 도 1b는, 도 1a의 아미노산 서열 결과를 바탕으로 계통수 분석을 실시한 결과이며, 도 1c는, C3H2C3 type RING finger 도메인의 다중 서열 정렬 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는, CaREL1 단백질의 식물 세포내 위치를 확인하기 위하여 CaREL1-GFP 융합단백질의 형광신호를 공초점 현미경으로 확인한 결과이며, 도 2b는, CaREL1 단백질의 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는, CaREL1이 전체 조직에서도 반응을 하는지 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 3b는, ABA 및 건조 스트레스 조건에서, CaREL1 발현량의 변화를 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는, TRV:CaREL1 삽입에 의해 CaREL1 침묵된 고추 및 빈벡터 (TRV:00)가 삽입된 대조군간에 전사 축적량을 비교한 결과이다.
도 5는, ABA 또는 건조 스트레스 조건에서, (A), (B) 잎 온도, (C), (D) 기공개도, (E) 건조 표현형, (F) 생존율 및 (G) 증산률을 비교한 결과이다.
도 6은, CaREL1 과발현 식물 (CaREL1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물의 (a) 발현량, ABA 처리 조건에서, CaREL1 과발현 식물 (CaREL1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물간의 (b) 발아율, (c), (d) 자엽 성장, (e), (f) 뿌리 성장을 비교한 결과이다.
도 7은, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서, CaREL1 과발현 식물 (CaREL1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물 간에, (a) 건조 표현형, (b) 감소된 바이오매스, (c) 증산률, (d), (e) 잎 온도, (f), (g) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 8은, CaREL1-OX 식물에 나타난 건조-내성 표현형과 이와 관련된 유전자 간의 상관관계를 확인하기 위하여, NCED3, DREBA, RAB18, RD20, RD29B, RD29A, KIN2, ABI1 및 ERD1의 발현량을 qRT-PCR로 비교한 결과이다.
도 9는, CaREL1-OX 식물에 건조 스트레스 처리 조건에서, ABA 함량을 확인한 결과이다.

본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 음성 조절자로 기능하는 CaREL1 유전자를 동정하였으며, 상기 CaREL1-침묵된 고추에서 건조 스트레스에 대한 내성 증가, CaREL1 유전자가 과발현 (CaREL1-OX)된 형질전환 애기장대에서 ABA 민감도 감소, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자.

본 발명의 유전자인 CaREL1은 Differential hybridization 분석을 통하여 고추로부터 분리하였으며, 상기 CaREL1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaREL1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 “음성 조절인자(negative regulator) 단백질”이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaREL1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaREL1 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, E3 리가아제 단백질인 CaREL1을 동정하였고 (실시예 2 참조), 앱시스산 (ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaREL1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, CaREL1 유전자를 분리하고, CaREL1 단백질과 다른 식물종간 아미노산 서열의 상동성을 확인하였다 (실시예 2 참조). 또한, 35S:CaREL1-GFP 융합단백질을 이용하여 CaREL1 단백질이 핵 및 세포질에 위치함을 확인하였다 (실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 기법으로 CaREL1 유전자 침묵시킨 고추 식물의 경우, ABA에 대한 과민성 (hypersensitivity)에 의하여 기공이 차단하여 증산률이 억제되고, 결과적으로 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시킴을 확인하였다 (실시예 5 참조).

또한, 애기장대에서 CaREL1 유전자를 과발현시킨 결과, 발아기, 유묘기 단계에서 ABA에 대한 민감도가 감소한다는 사실을 확인함으로써, CaREL1가 건조 상황에서 잎의 수분 손실을 억제함으로써 ABA 신호전달의 음성 조절자 역할을 수행한다는 사실을 규명하였다 (실시예 6 참조).

따라서, CaREL1 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaREL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 CaREL1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaREL1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaREL1 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 현상인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사후유전자침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염식물체에 바이러스 유전체와 상동성인 있는 내생유전자가 발현될 때 내생유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.

본 발명에서는, CaREL1의 ORF 영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaREL1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.

본 발명에서 상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체 및/또는 이의 종자를 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaREL1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., cv. Hanbyul) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 5 : 3 : 2, v/v/v), 사토 (sand) 및 양토 (loam soil)를 1 : 1 : 1 (v/v/v)로 배합하여 파종하였다. 이후, 고추 식물은 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 130 μ㏖ photons m^-2s^{- 1} 로 하여 빛을 비춘 27 ± 1 ℃ 생육실에서 성장시켰다. 담배식물은 16 시간 낮/8 시간 밤 사이클 25 ± 1 ℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대 (Arabidopsis thalinana: ecotype Col-0) 종자는 1% 수크로오스 및 Microagar (Duchefa Biochemiem, Haarlem, The Netherlands)가 보충된 MS (Murashige 및 Skoog) salt에서 발아시켜, 16시간 낮/ 8 시간 밤 사이클, 24 ℃로 설정한 챔버하에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 9 : 1 : 1, v/v/v)에서 24℃ 온도, 60% 습도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다. 모든 종자는 챔버에 파종하기 전에 2일 동안 4 ℃에서 춘화처리 (vernalized)를 하였다.

1-2. 서열 정렬 (Sequence alignment)

CaREL1로 암호된 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다. CaREL1의 cDNA 클론을 다른 유기체(organism)의 것과 비교하기 위해 수동으로 아미노산 서열 정렬을 조절하였다. 다중서열정렬을 기초로 하여, MEGA sortware (version 5.2)를 통해 계통수 (phylogenetic tree)를 그렸으며, 두 단백질 사이의 서열 동일성 및 유사성을 조사하기 위해서, 매개 변수와 함께 EMBOSS Needle webtool (http://www.ebi.ac.uk.Tools/psa/emboss needle)를 이용하여 pairwise sequence alignment를 수행하였다.

1-3. Virus-induced gene silencing (VIGS) 및 CaREL1의 과발현

고추에서 CaREL1 유전자를 침묵 (Knokdown) 시키기 위해서 담배얼룩바이러스 (tabacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS 시스템을 이용하였다.

보다 구체적으로, 전장 CaREL1 cDNA를 이전에 명시된 프로토콜에 따라 전장 CaREL1 cDNA를 이용하여 CaREL1 과발현 형질 전환된 애기장대를 제조하였다.

1-4. ABA 및 건조 스트레스 처리

고추 식물에서 CaREL1 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서, ABA 및 건조 스트레스 처리를 진행하였다.

보다 구체적으로, six-leaf-stage의 고추 식물에 50 μM ABA 분사하고, 건조 스트레스 처리를 위해, 상처가 발생하지 않도록 조심스렇게 토양에서 분리시킨 뒤, 3MM 종이 (Whatman, Clifton, UK)위에서 탈수시켰다. 각각의 처리 이후, 0 내지 24시간 후 잎을 회수하고, RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 실시하였다.

발아율, 뿌리 신장 및 입모율을 측정하기 위해, 야생형과 CaREL1 과발현 (CaREL1-OX) 형질전환 애기장대 36개의 종자 각각을 4 ℃에서 3일 동안 층화하고 다양한 ABA 농도가 보충된 0.5 × MS 아가 배지 상에 파종하였다. 식물체는 24℃ 온도, 16시간 낮/8시간의 밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다.

3주 된 야생형 및 CaREL1-OX 형질전환 애기장대를 무작위로 심은 후, 9일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주고, 회복되도록 2일 동안 다시 식물체에 물을 주었다. 애기장대 생존율은 30개의 각각 식물체에서 측정하였으며, 3번 반복 수행하였다.

고추 식물의 경우, four-leaf stage의 고추 식물에 11일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었으며, 회복되도록 2일 동안 다시 식물체에 물을 주어, 식물체의 생존율을 계산하였다. 생존율은 30개의 각각 식물체에서 측정하였으며, 3번 반복 수행하였다. 고추 식물의 생존율은 20개의 각각 식물체에서 측정하였으며, 3번 반복 수행하였다.

고추저항성은 물 손실량을 측정함으로써 정량적으로 확인하였으며, four-leaf stage의 고추 식물 및 3주 된 애기장대로부터 회수한 50개의 잎을 페트리접시 (petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리접시를 40% 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손질을 측정하였으며, 상기 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-5. 열 이미지 처리법 (Thermal imaging)

4주된 고추 식물의 1차 및 2차 잎을 수확하고, 3주된 애기장대 식물체 각각에 50 μM ABA로 처리하였다. 열 영상은 적외선 카메라 (FLIR systems; T420)를 이용하여 획득하였으며, 옆온 (leaf temperature)은 FLIR Tools+ ver 5.2 software를 이용하여 측정하였다.

1-6. 기공개도 (Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도 생물학적 검정을 위해, 3 주된 식물체의 로제트 잎에서 잎의 껍질을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 μM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3 시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 10 또는 20 μM ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하고, 2시간을 더 배양하였다. 이후 각 샘플에서 기공을 측정하였으며, 상기 실험을 각각 20개의 잎에 대해서 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-7. RNA 분리, semi-qRT-PCR(semi-quantitative reverse transcription-polymerage chain reaction) 및 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerage chain reaction)

총 RNA는 탈수되거나, 박테리아 병원체로 감염된 애기장대 잎 조직으로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNA-free DNase로 다이제스트하였다. 분광 광도계로 정량화한 후, 총 RNA 1μg을 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용한 cDNA 합성에 사용하였다.

부수적으로, 역전사효소 없이 cDNA를 합성하여 semi-quantitative RT-PCR를 수행하여 cDNA 샘플에서 genomic DNA의 오염 가능성을 배제시켰다.

qRT-PCR 분석을 위해서, 합성된 cDNA는 iQTMSYBR Green Supermix 및 하기 표 1의 특이 프라이머와 함께 CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system(Bio-Rad)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였으며, PCR은 95 ℃에서 5분 가열 후, [95 ℃에서 20초, 60 ℃에서 20초 및 72 ℃에서 20초]를 사이클로 하여 45 사이클 반복하고, 각 유전자의 상대적 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8 (Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

Primer name	Primer sequence (5`-`3)
For cloning
CaREL1	Forward	ATGGGTAATTGTTGCTGCTG
	Reverse	TCCATCGATTGCAGGGTTA
For RT-PCR
CaREL1	Forward	CTCGAGCATCTCATCATGTCACAGC
	Reverse	TCTAGAAGTTTCACTGTTTGTTTCTTGA
CaCAT1	Forward	GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT
	Reverse	CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT
Actin8	Forward	CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA
	Reverse	GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT
NCED3	Forward	ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG
	Reverse	AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC
DREB2A	Forward	CTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC
	Reverse	AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC
RAB18	Forward	GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT
	Reverse	GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA
RD20	Forward	TGGTTTCCTATCTAAAGAAGCTGTG
	Reverse	ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA
RD29B	Forward	GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG
	Reverse	ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA
RD29A	Forward	CACAATCACTTGGCTCCACTGTTG
	Reverse	ACCTAGTAGCTGGTATGGAGGAACT
KIN2	Forward	TGTTAACTTCGTGAAGGACAAGAC
	Reverse	ACAACAACAAGTACGATGAGTACGA
ABI1	Forward	GTTTGGGATGTAATGACGGATG
	Reverse	TGAACTGAGGCAGAGAGGGTCC
ERD1	Forward	CCACCGACTCCTCTCTGCTT
	Reverse	AAGGGAGATTCCGAGATATGAAGA

1-8 in vitro ubiquitination assay

In vitro ubiquitination assay를 위해, 정제된 MBP-CaREL1 (500 ng)을 250 ng 재조합 인간 UBE1 (Boston BIochemicals, Cambridge, MA, USA), 250 ng 재조합 인간 H5b (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) 및 10 ㎍ 소 유비퀴닌 (Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응 (ubiquitination reaction) 완충 용액 [50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.05 mM ZnCl₂, 1 mM Mg-ATP, 0.2 mM DTT, 10 mM phosphocreatine, 및 0.1 unit of creatine kinase(Sigma- Aldrich)]과 혼합한 후, 30 ℃에서 3시간 동안 배양한 후, 반응된 단백질은 SDS-PAGE를 사용해 분리하였으며, anti-ubiquitin 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 anti-MBP 항체 (New England Biolabs, Ipswich, MA)와 함께 Immunoblotting을 통해 분석하였다.

1-9. ABA함량 측정 (Measurement of ABA content)

ABA함량 측정을 위해서, 고추 및 애기장대 식물의 잎을 탈수 처리 2시간 및 4시간 후에 수확하여, 즉시 액체 질소를 이용하여 냉동시켰고, 대략 50 ㎎ 기본 조직은 ABA 추출을 위해 사용되며, 구체적으로는, 밤새 4 ℃에서 1 ㎖ ABA 추출 완충 용액 (methanol, containing 100 ㎎ butylated hydroxly toluene, 0.5 g citiric acid monohydrate)으로 rotary shaker에서 추출하였다. 1500 g에서 원심분리 후, 상층액은 새로운 튜브로 이동하고, speed vac를 이용하여 건조하였다. 각 샘플의 ABA 함량은 Phytodetek-ABA kit (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA)를 이용하여 정량화하였으며, ABA 함량은 조직의 생중량 (pmol/mg)으로 표현하였다.

1-10. 통계적 분석

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서, ANOVA 또는 student`s T-test를 이용하여 수행되었으며, P < 0.05 일 때, 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. CaREL1 유전자 분리 및 서열 분석

Differential hydridzation 분석을 이용하여, 앱시스산 (ascisic acid; ABA)을 처리한 고추 잎으로부터 CaREL1 유전자를 분리하였으며, 상기 CaREl1 cDNA는 663-bp의 핵산 잔기를 포함하고, 220개의 아미노산 잔기를 인코딩하며, 4.52 pI 및 24.3 kDA의 분자량을 갖는 것으로 추정되었다.

또한, 상기 실시예 1-2에 따른 아미노산 서열 정렬 (Sequence alignment)을 실시한 결과, 도 1 a 및 b에 도시된 바와 같이, CaREL1이 다른 RING finger 단백질과 높은 상동성을 가진다는 것을 알 수 있었다. 보다 구체적으로, CaREL1 단백질 (accession no. KU557246)은 Solanum lycopersicum (accession no. XP_004245586.1), Solanum tuberosum (accession no. XP_006343956.1), Nicotiana tomentosiformis (accession no. XP_009591218.1), Vitis vinifera (accession no. XP_002280000.1), Malus domestica (accession no. XP_008392592.1), 및 Arabidopsis thaliana (accession no. NP_568590.1)의 RING figer 단백질과 높은 상동성을 가졌다 (43.4-89.6 %).

또한, 도 1c에 도시된 바와 같이, 상기 CaREL1 단백질의 C3H2C3형 RING finger 도메인과 다른 식물의 C3H2C3형 RING finger 단백질간에 높은 상동성을 나타냈으며, E3 ubiquitin ligase 활성에 필수적인 8개의 cysteine 및 histidine 잔기가 보존되어 있음을 확인하였다.

실시예 3. CaREL1 단백질의 세포 내 작용 위치 및 E3 리가아제 활성 확인

CaREL1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaREl1 coding region을 형광단백질인 Green Fluorescent protein (GFP)을 결합시켜 35S promoter 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다.

그 결과, 도 2a에 도시된 바와 같이, 담배 (Nicotiana benthamiana)의 표피 세포 (epidermal cell)에 있는 35S:Carel1-GFP 융합단백질이 핵과 세포질 내에서 GFP 신호를 만들어냈다.

상기 결과로부터 CaREL1 단백질은 핵과 세포질을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 알 수 있었다.

RIGN figer protein은 생체외에서 (in vitro) E3 ligase 활성을 가지고, CaREL1 단백질이 C3H2C3형 RING 도메인을 가지기 때문에, CaREL1이 E3 리가아제 활성을 가지는지 확인하기 위해서, maltose-binding protein (MBP)-tagged CaREL1 (MBP::CaREL1)를 이용하여 self-ubiquitination assay를 수행하였다. 정제된 MBP::CaREL1 융합 단백질을 ubiquitin, E1 및 E2의 존재 및 비존재하에서 배양시키고, SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다. anti-MBP 항체 및 anti-qubiquitin 항체를 이용한 면역 블롯법을 통해 유비쿼틴화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2b에 도시된 바와 같이, Ubiquitin, E1 및 E2가 모두 존재하는 조건하에서, CaREL1 단백질은 E3 리가아제 활성을 보였다.

실시예 4. ABA 및 건조 처리에 의한 CaREL1 유전자의 유도

CaREL1 유전자가 고추의 다른 조직에서 본질적으로 발현되는 것을 확인하기 위해서, RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 도시된 바와 같이, CaREL1은 뿌리, 줄기, 잎 및 꽃 조직에서 발현을 확인하였으며, 특히, CaREL1의 발현은 뿌리 및 꽃 조직에서 높은 상관성을 보였다.

이에 더하여 CaREL1이 ABA 및 건조와 같은 비생물적 스트레스에 유도되는지를 확인하였다. 상기 실시예 1-4에 따라 ABA 및 건조 처리를 진행한 후, 실시예 1-7에 따른 qRT-PCR 분석을 통해 고추 잎에서 시간대별 CaREL1 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3b에 도시된 바와 같이, ABA-처리 0-12시간 후, 잎 조직에서는 CaREL1 발현이 발현 증가가 없었으나, 24시간 이후에 발현이 증가 되었으며, 건조 처리시에는 CaREL1 전사 수준이 지속적으로 증가하였다.

상기 결과로부터, CaREL1이 ABA-신호 및 건조 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. CaREL1 - 침묵된 (silenced) 고추 식물에서 ABA hypersensitivity 및 강화된 건조 스트레스 내성 확인

비생물적 스트레스에 대한 반응에서 CaREL1 유전자의 역할을 알아보기 위하여, 실시예 1-3에 따른 TRV (tabacco rattle virus) vector를 이용한 VIGS (virus-induced gene silencing) 기반 CaREL1 형질체 유전자 기능 손실 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 4a 및 b에 도시된 바와 같이, CaREL1 전사 축적이 대조군 (TRV:00)에 비해 CaREL1-침묵된 고추 식물 (TRV:CaREL1)에서 약 50% 더 낮은 것을 확인할 수 있었다.

비생물적 스트레스 및 ABA 신호는 공통 형질전환 신호를 공유하나, 건조 스트레스 신호는 ABA-의존 및 ABA-비의존 경로를 갖는다. 이에, CaREL1 전사는 ABA 및 건조 스트레스 처리 후 축적되었는바, CaREL1 스트레스 유도된 신호에서 기능한다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 내용을 바탕으로 CaREL1-침묵된 고추 식물체와 대조군의 ABA 민감도를 비교하였다. 보다 구체적으로, 먼저, 기공개도의 간접적인 암시로서 대조군 및 CaREL1-침묵된 고추 식물의 잎에 ABA 50 μM 노출 후, 잎 온도를 측정하였다.

그 결과, 도 5A 및 B에 도시된 바와 같이, 대조군 (TRV:00)에 비해서, CaREL1-침묵된 고추 식물 (TRV:CaREL1)의 잎의 온도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

한편, 기공이 열리면, 증산률이 증가하고, 그래서 잎의 온도를 떨어뜨리는바, CaREL1-침묵된 고추 식물의 낮은 증산률이 기공개도 (stomatal aperture) 감소에 의한 것인지 확인하기 위해서, 대조군 및 CaREL1-침묵된 고추 식물에 20 μM ABA를 3시간 동안 처리한 후, 기공 크기를 측정하였다.

그 결과, 도 5C 및 D에 도시된 바와 같이, CaREL-1 침묵된 고추 식물의 기공개도가 대조군에 비해 더 작은 것을 확인하였으며, 이는 잎의 온도와 연관됨을 확인할 수 있었다.

한편, 충분한 물 조건하에서 CaREL1-침묵된 고추 식물 및 대조군에서 건조 표현형을 비교한 결과, 충분한 물 조건하에서는 두 식물체간 표현형 차이를 발견하지 못하였으나 (도 5E 좌측), 11일 동안 물주기를 중단하여 건조 스트레스를 주고, 회복을 위해 2일 동안 다시 물을 주게 되면, 대부분의 CaREL1-침묵된 고추 식물은 건조 내성 표현형을 갖는 것을 확인할 수 있었다 (도 5E 중간 및 우측).

다음으로, 물주기를 재개한 후, 각각의 생존률을 측정하였다.

그 결과, 도 5E 및 F에 도시된 바와 같이, CaREL1-침묵된 고추 식물은 87.5%가 성장을 재개하였으나, 대조군의 식물은 단지 37.5%만이 성장을 재개하였다. 상기 결과로부터, CaREL1 유전자 발현의 억제가 건조 내성을 강화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, CaREL1-침묵된 고추 식물의 건조-내성 표현형이 증가한 수분 보유량 때문인지 알아보기 위하여, 대조군 및 CaREL1-침묵된 고추 식물 떼어낸 잎의 생중량 (fresh weight)를 측정하여 증산 수분손실률 (transpiration water loss)를 확인하였다. 그 결과, 도 5G에 도시된 바와 같이, 잎의 수분 손실량이 대조군 식물보다 CaREL1-침묵된 고추 식물에서 비교적 낮게 나타남을 확인할 수 있었다.

결과적으로, CaREL1-침묵된 고추 식물의 향상된 건조 내성은 ABA에 대한 과민성 (hypersensitiviy)에 의한 것임을 알 수 있었다.

실시예 6. CaREL1 과발현 ( CaREL1 -OX) 식물의 ABA 저감수성 (hyposensitivity) 확인

CaREL1 유전자의 in vivo에서 기능을 더욱 확인하기 위해서, 실시예 1-3에 따라 항시발현 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 CaREL1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하고, 두 개의 독립된 T3동형 라인 (CaREL-OX)을 얻었고, 이를 표현형 분석을 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 6a 도시하였다.

다음으로, 다양한 농도 (0, 0.5, 0.75 및 1.0 μM)의 ABA를 보충한 성장 배지에서 종자를 발아시켜 CaREL1-OX 및 야생형 식물의 발아율을 비교하였다. 그 결과, 도 6b에 도시된 바와 같이, 0.5 μM ABA를 처리한 경우, 파종 후 5일째 까지는 야생형 식물 및 CaREL1-OX 식물의 종자의 발아율은 100%를 나타냈으나, CaREL-OX 식물의 종자에서 더욱 빠르게 발아하였으며, 이런 차이는 ABA 농도가 높아질수록 더욱 구분되어졌다.

한편, 유모기 (seedling stage)에서 ABA에 대한 반응을 분석하기 위해서, 다양한 농도 (0, 0.5, 0.75 및 1.0 μM)의 ABA에서 입모율 및 뿌리 성장률을 측정하였다. 그 결과, 5일 경과 후, 도 6c 및 d에 도시된 바와 같이, CaREL1-OX 식물에서 자엽 (cotyledon)을 가진 다수의 묘목을 확인할 수 있었다.

추가적으로, ABA의 농도별 처리에 따른 CaREL1-OX 식물 및 야생형 식물의 1차 뿌리 성장 (primary root growth)을 비교하였다. 그 결과, 도 6e 및 f에 도시된 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 두 식물에서 형태의 유의적인 차이를 발견할 수 없었으나, ABA를 다양한 농도로 처리한 경우, 야생형 식물에 비해서, CaREL1-OX 식물의 뿌리 길이가 더 길게 나타는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. CaREL1 과발현 ( CaREL1 -OX) 식물의 감소된 건조 내성 확인

실시예 5의 CaREL1-침묵된 고추 식물은 건조-내성 표현형을 나타내었으며, 실시예 6의 CaREL1-OX 식물은 ABA에 대한 감소된 민감도를 나타냄을 확인하였는바, 이에, CaREL1 유전자의 과발현이 건조 스트레스에 대한 반응을 변화시키는지를 확인하였다.

우선, 건조 스트레스에 대한 반응에서 CaREL1 유전자의 효과를 확인하기 위해서, 유리한 식물 성장 조건하에서, 야생형 식물 및 CaREl1-OX 식물을 성장 시켰다. 그 결과, 도 7a 좌측에 도시된 바와 같이, 정상조건에서는 두 식물간의 표현형 차이는 나타나지 않았으나, 이 후, 두 식물에 9일 동안 물주기를 중단하여 건조 스트레스에 노출시켰을 때는, 야생형 식물에 비해 형질전환 식물이 더 많이 시드는 것으로 나타났으나 (도 7a 중간 참조), 이 후, 회복을 위해 2일 동안 물을 주게 되면, 대부분의 야생형 식물은 성장을 재개하였음을 관찰할 수 있었다(도 7a 우측 참조).

다음으로, CaREL1-OX 및 야생형 식물의 재수화를 거친 후, 식물의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 야생형 식물은 약 85%의 생존률을 나타낸 반면, CaREL1-OX 라인 #2 및 #4는 각각 약 20% 및 35%의 생존률을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 바이오매스 감소(Reduction in biomass)는 야생형 식물에 비해 형질 전환된 식물에서 더 높게 나타났다. 따라서, CaREL1의 발현 부여는 식물의 가뭄 내성 손상에 기여한다.

다음으로, CaREL1-OX 식물에 의해 나타난 건조-감수성 표현형이 수분 손실률 감소에 의한 것인지 확인하기 위해서, CaREL1-OX 식물 및 야생형 식물의 잎의 생중량 (fresh weight)을 확인하여 두 식물 간의 증산률을 비교하였다. 그 결과, 도 7c 에 도시된 바와 같이, 이 조직의 수분 손실은 야생형 식물에 비해서, CaREL1-OX 식물의 잎 조직에서 더 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

또한, 50 μM의 ABA 처리에 따른 야생형 식물과 CaREL1-OX 식물의 잎 온도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 7d 및 e에 도시된 바와 같이, CaREL1-OX 식물의 잎의 온도가 야생형 식물보다 낮은 잎 온도를 나타냄을 확인하였다.

다음으로, CaREL1-OX 식물에서 나타나는 높은 수분 손실이 기공개도의 증가에 의한 것인지를 확인하기 위해서, ABA 처리 및 미처리에서의 기공개도를 확인하였다. 그 결과, 도 7f 및 g에 도시된 바와 같이, ABA 미처리시에는 야생형 식물 및 CaREL1-OX 식물에서의 유의적인 차이가 없었으나, ABA 처리시에는 야생형 식물의 잎 보다 CaREL1-OX 식물의 잎에서 더 큰 기공크기를 나타내었다. 상기 결과로부터, CaREL1-OX 식물의 공변세포 (guard cell)에서 ABA에 대한 감소된 감수성은 수분 보유량 (water retention)을 감소시킴을 알 수 있었다.

한편, 건조 유도성 유전자 발현이 CaREL1에 의한 직접 또는 간접적으로 조절되는지 확인하기 위해서, CaREL1-OX 식물 및 야생형 식물에 탈수 처리 후 건조-내성 관련 유전자 NCED3, DREBA, RAB18, RD20, RD29B, RD29A 및 KIN2에 특이적인 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 탈수 처리 3시간 후에, ABA 합성과 관련된 NCED3 유전자 발현 수준은 야생형 식물보다 CaREL1-OX 식물에서 현저히 높게 나타났다. 또한, DREBA, RAB18, RD20, RD29B, RD29A 및 KIN2을 포함하는 다양한 스트레스-반응성 유전자 발현은 야생형 식물에 비해서 CaREL1-OX 식물에서 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, CaREL1 유전자의 발현이 ABA 합성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 건조 스트레스에 대한 반응을 조절한다는 것을 알 수 있었다.

한편, CaREL1 유전자는 ABA-의존 신호를 통해서 건조 스트레스 반응에 대해서 음성 조절자 (negative regulator)로써 기능할 것으로 판단되는바, 야생형 식물 및 CaREL1-OX식물의 잎에서 ABI1 및 ERD1의 발현 수준을 측정하여 CaREL1의 건조 스트레스-반응성 기능이 ABA-의존 또는 ABA-비의존인지를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, ERD1 전사 수준은 유의한 변화가 없었으나, ABI1의 전사 수준은 야생형 식물보다 CaREL1-OX 식물에서 유의하게 낮은 전사 수준을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, CaREL1 유전자의 발현이 ABA-의존 경로를 통해서, 건조-유도성 마커 유전자 (drought-inducible maker gene)의 음성적으로 영향을 미친다는 것을 알 수 있었으며, 이에, CaREL1-OX 식물의 감소된 건조 내성에 기인한다는 것도 알 수 있었다.

전술한 바와 같이, ABA 생합성과 연관된 NCED3의 발현수준은 야생형 식물에 비해서 CaREL1-OX 식물의 잎에서 유의적으로 높게 났는바, CaREL1의 과발현이 ABA 생합성과 연관되어 있는지 확인하기 위해서, CaREL1-OX 및 야생형 식물을 건조 스트레스에 노출시킨 뒤, ABA 함량을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, CaREL1-OX 식물의 잎에서 ABA 함량이 야생형 식물의 잎에서 보다 더 높게 나타났음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using CaREL1 in plants <130> MP16-452 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1_CaREL1 <400> 1 atgggtaatt gttgctgctg ctgttgtgct tcaaagcgag tggaattgaa tggttcaccc 60 tcattctatc gttatcctat ggtgccagaa gagcgtgaac ccttgtcatc tcatcatgtc 120 acagctgcag cattctccac tgcgcttttg gttgatacga atctggacac ctcaagtcct 180 gacacttaca gaccacctcc aatgccaatg ccttatgaaa catatgtagg aaggcccagg 240 actccaccag gtccagatag catcaagaat gaggctgctg ttcaagaaac aaacagtgaa 300 actggtggcg cactaaactc agcagacact cctgaagctg tagacaagga taaaaaggag 360 tctgaaggta ataaagattc cgaaggcaac gtgcaaacag atatccagct tgatgcaata 420 aaggaagtgg aggatgatct tgagaagtcc gaagatctca aaaaatccaa tgtacctgta 480 gttttaccac cacaagagga gtgtcccatc tgtcttgaag aatacgatgc tgagaatcca 540 aaaatgagca caaagtgtga gcatcatttt cacctttcat gcattcttga atggatggag 600 agaagtgaaa cctgccccgt ctgtgatcag gaaacggttt ttaaccctgc aatcgatgga 660 tag 663 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1_CaREL1 <400> 2 Met Gly Asn Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ser Lys Arg Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Gly Ser Pro Ser Phe Tyr Arg Tyr Pro Met Val Pro Glu Glu Arg 20 25 30 Glu Pro Leu Ser Ser His His Val Thr Ala Ala Ala Phe Ser Thr Ala 35 40 45 Leu Leu Val Asp Thr Asn Leu Asp Thr Ser Ser Pro Asp Thr Tyr Arg 50 55 60 Pro Pro Pro Met Pro Met Pro Tyr Glu Thr Tyr Val Gly Arg Pro Arg 65 70 75 80 Thr Pro Pro Gly Pro Asp Ser Ile Lys Asn Glu Ala Ala Val Gln Glu 85 90 95 Thr Asn Ser Glu Thr Gly Gly Ala Leu Asn Ser Ala Asp Thr Pro Glu 100 105 110 Ala Val Asp Lys Asp Lys Lys Glu Ser Glu Gly Asn Lys Asp Ser Glu 115 120 125 Gly Asn Val Gln Thr Asp Ile Gln Leu Asp Ala Ile Lys Glu Val Glu 130 135 140 Asp Asp Leu Glu Lys Ser Glu Asp Leu Lys Lys Ser Asn Val Pro Val 145 150 155 160 Val Leu Pro Pro Gln Glu Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Glu Tyr Asp 165 170 175 Ala Glu Asn Pro Lys Met Ser Thr Lys Cys Glu His His Phe His Leu 180 185 190 Ser Cys Ile Leu Glu Trp Met Glu Arg Ser Glu Thr Cys Pro Val Cys 195 200 205 Asp Gln Glu Thr Val Phe Asn Pro Ala Ile Asp Gly 210 215 220

Claims (5)

1. 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자.
2. CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 CaREL1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
4. CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 단백질을 코팅하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터.
5. 제4항의 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaREL1 (Capsicum annuum RING type E3 Ligase 1) 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법.

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