KR101608175B1 - 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaAIR1 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성 관련 고추유래의 유전자 CaAIR1에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CaAIR1 단백질의 발현을 조절하여 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 CaAIR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaAIR1-OX)에서, 앱시스산(ABA)에 대한 감수성 감소효과, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소효과를 확인하였으므로, 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 RING Finger 단백질 유전자 CaAIR1 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{A pepper RING Finger protein gene CaAIR1 and method for improving the resistance to the drought stress using CaAIR1 in plants}

본 발명은 신규한 고추 유래 유전자 CaAIR1(Capsicum annuum ABA-Insensitive RING protein 1) 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 고착성이라는 특징을 가진다. 이러한 특징 때문에 건조(drought), 고염, 병원균과 같은 환경에 지속적으로 노출되며, 건조 상태와 같은 환경 스트레스들은 직접적으로 식물의 성장 및 생산에 해로운 영향을 끼친다.

물은 식물의 생존, 성장, 및 발달에 가장 중요한 요소이다. 따라서, 식물들은 물이 부족한 환경에 적응하기 위한 다양한 생리학적, 분자적 방어기작을 가지고 있다. 그 예로, 기공 폐쇄와 앱시스산(ABA, abscisic acid) 축적을 들 수 있다.

식물 호르몬인 앱시스산은 식물의 성장 및 발달의 세포적 생화학적 단계에서 핵심적인 역할을 하며, 비생물적 및 생물적 스트레스들에 대한 적응에도 중요한 역할을 한다. 비생물적 스트레스에 노출되면, 잎에서 앱시스산이 증가하고 방어 반응과 관련된 신호 유도 기작을 개시한다. 이러한 반응에서, 앱시스산은 공변 세포의 이온채널을 조절함으로써 기공 폐쇄를 유도한다.

한편, 26S proteasome pathway를 통한 유비퀴틴화(Ubiquitination)는 진핵생물에서 유비퀴틴으로 선택적인 단백질을 표시하는 과정이다. 식물에서, 이는 발달, 호르몬 조절, 생물 및 비생물적 스트레스에 대한 적응 등을 포함하는 많은 세포 신호전달에 관여한다.

유비퀴틴화는 여러단계의 과정을 거치는데, 첫 번째로 유비퀴틴의 활성화가 이루어진다. 유비퀴틴의 활성화는 에너지원으로써 ATP를 필요로 하는 E1 유비퀴틴-활성화효소에 의해 두 단계의 반응으로 이루어진다.

처음 단계는 유비퀴틴-아데닐레이트 중간물의 생산을 포함하며, 두 번째 단계에는 E1 활성부위의 시스테인 잔기(residue)에 AMP를 풀어주고 유비퀴틴을 옮긴다. 이 단계가 끝나면 유비퀴틴의 C-말단 카르복실기와 E1시스테인설프하이드릴기(sulfhydryl group) 사이에 황화에스테르(thioester)결합이 생긴다. 그 다음으로 E1에 있는 유비퀴틴이 에스테르결합전이반응(transesterification)을 통해 유비퀴틴-결합단백질(Ubiquitin-conjugating enzyme)의 활성부위 시스테인에 옮겨진다. 마지막으로, 유비퀴틴화 연쇄반응(cascade)이 표적 단백질의 라이신과 유비퀴틴의 C-말단 글리신 사이에 이소펩티드결합(isopeptide bond)을 형성시킨다. 보통 이 단계는 수백개의 E3 유비퀴틴-단백질 연결효소(ligase) 중 하나가 담당한다. E3 효소는 기질인식에 기능을 하며, E3는 E2와 기질 둘 다에게 상호작용하는 것이 가능하다. 유비퀴틴 연쇄반응에서 E1은 수십개의 E2와 결합할 수 있고, E2는 수백개의 E3와 결합할 수 있다.

식물 세포는 두 개의 특징적인 E3 Ub ligase 슈퍼패밀리를 가지는데, 하나는 single subunit으로 반응하고, RING (Really Interesting New Gene), U-box, 및 HECT (Homology to E6-AP Carboxyl Terminus) E3 ligase로 이루어져있다. 다른 하나는 multisubunit으로 반응하고, APC (Anaphase Promoting Complex), CUL4-DDB1 (CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1), 및 SCF (Skp1, Cullin, F-box)로 이루어져있다. 1400개 이상의 E3 UB ligase가 애기장대 유전체에 존재하고, 그 중 약 477개의 RING finger domain-containing E3 Ub ligase이 있지만 단지 몇몇의 RING type E3 ligase만 알려져 있다.

최근, ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스 반응 조절에서 RING type E3의 중요성이 밝혀졌다. 예를 들어, RHA2a/RHA2b 및 AtAIRP1/AtAIRP2/AtAIRP3이 ABA 신호전달을 통한 수분 스트레스 반응에서 positive regulation에 참여한다. 대조적으로, AIP2, KEG, 및 RGLG2는 ABA 신호 유도 경로의 분해를 촉진함으로써 건조 스트레스의 negative regulator 역할을 한다.

CaAIR1(Capsicum annuum ABA-Insensitive RING protein 1)은 ABA 처리 및 비생물적 스트레스에 의해 발현되며, 고추(Capsicum annuum)에서 E3 ubiquitin ligase RING finger protein을 인코딩하고 있다.

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진된 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질을 이용하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허 공개번호 10-2010-0040789), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, ABA, 건조, 또는 고염 스트레스에 의한 CaAIR1 유전자 발현 증가 효과, CaAIR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaAIR1-OX)의 앱시스산 민감도 감소 효과, 및 건조 스트레스에 대한 감수성 증가 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 CaAIR1, 상기 유전자 CaAIR1에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드, 및 상기 유전자 CaAIR1를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 CaAIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 및 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질 전환 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIR1(Capsicum annuum ABA-Insensitive RING protein 1) 유전자를 제공한다.

본 발명은 상기 유전자 CaAIR1에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기에 기재된 CaAIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 재조합 발현벡터는 pTRV 벡터인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명은 CaAIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 병 저항성이 증진된, 형질 전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 후보 물질을 처리한 후, CaAIR1 단백질의 발현 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 식물체의 병 저항성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성 관련 고추 유래 신규 유전자 CaAIR1에 관한 것으로서, 상기 CaAIR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaAIR1-OX)의 앱시스산(ABA) 민감도 감소효과, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소효과를 확인하였고, 이에 더하여, CaAIR1 발현 시 식물의 건조 스트레스 반응과 관련된 단백질의 분해에 관여하여 식물이 스트레스 상황에서 normal growth condition으로 돌아오도록 하는 효과를 확인하였는바, CaAIR1 발현조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CaAIR1과 유사체 간의 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 CaAIR1 및 다른 상동 단백질들의 계통도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Nicotiana benthamiana 표피세포에서 35S:CaAIR1-GFP 융합단백질의 세포 내 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 CaAIR1 유전자 발현량을 RT-PCR을 통하여 확인한 것이다.
도 5는 in vitro에서 CaAIR1의 self-ubiquitination을 확인한 것이다.
도 6은 CaAIR1-silenced 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 증가된 내성(tolerance)을 확인한 것이다.
도 7은 CaAIR1 과발현(CaAIR1-OX) 애기장대 식물에서 앱시스산(ABA, abscisic acid)에 대한 감소된 민감도(sensitivity)를 확인한 것이다.
도 8은 CaAIR1 과발현(CaAIR1-OX) 식물에서 건조 스트레스에 대한 감소된 내성을 확인한 것이다.
도 9는 CaAIR1 과발현이 건조 내성-관련 유전자들의 발현량에 미치는 영향을 RT-PCR을 통하여 확인한 것이다.

본 발명자들은, ABA, 건조, 고염 스트레스 조건에서 CaAIR1 발현 증가, CabZIP2 silenced된 고추에서 건조 스트레스에 대한 내성 증가, CaAIR1이 과발현된 형질전환 애기장대에서 앱시스산 민감도 감소, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 신규한 유전자 CaAIR1 또는 유전자 CaAIR1에 의해 코딩되는 펩티드, 및 CaAIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현벡터는 pTRV일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자인 CaAIR1은 Differential hybridization analysis를 통하여 고추로부터 분리하였다. 또한, 본 발명의 CaAIR1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaAIR1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 상기 CaAIR1 유전자의 비생물적 스트레스에 대한 새로운 기능을 밝히기 위해 연구하던 중, CaAIR1 유전자가 앱시스산(abscisic acid: ABA), 건조(탈수) 스트레스에 노출된 고추 잎에서 강하게 유도된다는 사실을 밝혀냈으며(실시예 3 참조), 앱시스산의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스 산 또는 건조 스트레스와 CaAIR1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일실시예에서는 CaAIR1 유전자를 분리하고, CaAIR1 단백질과 다른 RING(really interesting new gene) finger protein 간 아미노산 서열의 상동성을 확인하였다(실시예 1 참조). 또한, CaAIR1-GFP 과발현을 이용하여 CaAIR1 단백질이 핵에 위치함을 확인하였고(실시예 2 참조), CaAIR1 유전자 발현과 관련된 abiotic stress 요인들을 결정하기 위하여, ABA, 건조, 및 고염(NaCl) 처리를 한 고추 잎에서 CaAIR1 발현을 관찰하였다(실시예 3 참조). 이에 더하여, CaAIR1이 E3 ligase 활성을 가지는지 확인하기 위하여, in vitro autoubiquitination assay를 실시하였고(실시예 4 참조), CaAIR1-silenced 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 내성(tolerance) 증가를 확인하였으며(실시예 5 참조), CaAIP1 과발현(CaAIR1-OX) 식물에서 앱시스산(ABA, abscisic acid)에 대한 민감도(sensitivity) 감소 및 건조 스트레스에 대한 내성 감소를 확인(실시예 6 및 실시예 7)함으로써 CaAIR1 발현 또는 활성을 억제하여 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있음을 밝혔다.

따라서, 본 발명은 CaAIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다. 상기 증진방법에서는, CaAIR1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나를 이용할 수 있으며, CaAIR1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물로서, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics), 항체, 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 CaAIR1 단백질의 발현 또는 활성이 억제되어 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. CaAIR1 분리 및 서열 분석

Differential hybridization technique으로 앱시스산(abscisic acid, 이하 ABA)을 처리한 고추 잎에서 구축된 cDNA library에서 새로운 건조 스트레스 저항성 고추 유전자 CaAIR1(Capsicum annuum ABA-Insensitive RING protein 1)을 분리하였다. ABA를 처리하지 않은 대조군 잎에 비해 ABA를 처리한 잎에서 CaAIR1 발현이 증가하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, CaAIR1는 657 bp open reading frame으로 이루어져있고, 219개의 아미노산 자기를 인코딩하고 있을 것으로 추정되었다. Multiple sequence alignment analysis를 통해서 CaAIR1이 매우 잘 보존된 RING(really interesting new gene) finger domain을 포함하는 Solanum tuberosum(accession no. XP_006349609.1), Malus domestica(accession no. XP_008338171.1), Cucumis melo(accession no. XP_008440158.1), Arabidopsis thaliana(accession no. NP_564078.1), Capsicum annuum (accession no. ACN63363.1)의 RING(really interesting new gene) finger protein과 높은 아미노산 서열의 상동성(45.2-87.7%)을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, CaAIR1의 RING 도메인은 E3 Ub(ubiquitin) ligase 활성에 필요한 8개의 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기를 포함하고, 다른 식물의 RING finger protein과 76-97%의 상동성을 가짐을 알 수 있었다. 이에 더하여, phylogenetic tree analysis를 실시한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 단백질과 높은 상동성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 2. CaAIR1의 세포 내 위치

CaAIR1 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여, 35S 프로모터 조절 하에 CaAIR1 coding region의 C-말단 영역 프레임에 녹색 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein) reporter 유전자를 융합하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 담배(N. benthamiana) 표피 세포(epidermal cell)에서 35S:CaASR1-GFP 융합 단백질의 과발현은 핵에서만 GFP 신호를 만들어냈다. 대조군은 blue signal을 나타내는 DAPI staining을 nuclear marker로 이용하였고, GFP 신호와 마찬가지로 핵에서 blue signal이 관찰되었다.

따라서, CaAIR1 단백질이 핵에서 기능한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 고추 잎에서 ABA, 건조, 및 고염 처리에 의한 CaAIR1 유전자 유도

RING E3 ubiquitin ligase 발현이 ABA 및 건조 민감도와 관계가 있음이 알려졌고, ABA를 처리한 잎에서 CaAIR1을 분리하였으므로, CaAIR1이 abiotic stress signaling에 관여하는지를 알아보았다. 우선, CaAIR1 유전자 발현과 관련된 abiotic stress 요인들을 결정하기 위하여, ABA, 건조, 및 고염(NaCl) 처리를 한 다음 고추 잎에서 CaAIR1 발현을 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 잎에서 CaAIR1 발현이 관찰되었다. differential hybridization screening 데이터와 마찬가지로, ABA 처리는 고추 잎에서 CaAIR1 전사를 강하게 유도하였고, 처리 2시간 후에 CaAIR1 발현이 처음 탐지되어 처리 후 24시간까지 유지되었다(도 4A). 또한, 건조와 고염(NaCl) 처리에 의한 CaAIR1 발현도 약간 증가하였음을 관찰하였다(도 4B 및 도 4C).

따라서, CaAIR1이 비생물적 스트레스(abiotic stress)에 대한 반응에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. In vitro에서 CaAIR1의 self-ubiquitination

In vitro에서 CaAIR1 단백질은 C3HC4-type RING motif와 E4 ligase와 같은 RING motif 기능을 가지는 여러 단백질들을 가진다. CaAIR1이 E3 ligase 활성을 가지는지 확인하기 위하여, in vitro autoubiquitination assay를 실시하였다. 정제된 MBP(maltose binding protein)-CaAIR1 단백질을 ubiquitin(Ub), E1, E2(UBC10, Ubiquitin-conjugating enzyme 10)와 함께 2시간동안 배양하여 분리하였고, immunoblot 분석을 이용하여 유비퀴틴화된(ubiquitinated) 단백질을 탐지하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CaAIR1에 의해 분자량이 증가한 여러 protein band를 관찰할 수 있었고, 이를 통해서 ubiquitin, E1, 및 E2 효소가 CaAIR1 단백질을 autoubiquitination시켰음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. CaAIR1-silenced 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 증가된 내성(tolerance) 확인

건조 스트레스에 대한 반응에서 CaAIR1의 역할을 알아보기 위하여, TRV(tobacco rattle virus) vector를 이용하여 VIGS(virus-induced gene silencing)-기반 유전자 기능 분석을 실시하였다. CaAIR1 유전자는 ABA에 의해 유도되었다. 건조 및 고염 스트레스는 CaAIR1이 stress-induced signaling에 역할을 할 가능성을 높여주었다. 이러한 가능성을 뒷받침하기 위하여, CaAIR1-silenced 고추 식물(TRV:CaAIR1)의 건조 표현형 비교실험을 실시하였고, 대조군 식물에는 공벡터(empty vector)를 이용하였다(TRV:00).

그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 정상 조건에서, 두 식물체 간 표현형 차이는 관찰되지 않았다. 하지만, 대조군 식물과 CaAIR1-silenced 고추 식물을 10일 동안 탈수시켜 건조 스트레스를 겪도록 하면, CaAIR1-silenced 고추 식물의 건조 내성(drought tolerance)이 대조군 식물에 비해 증가하였고, 다시 물을 주면 대분분의 CaAIR1-silenced 고추 식물이 성장을 재개하였음을 관찰할 수 있었다.

또한, 다시 물을 주고 2일 후에 각각의 생존률을 관찰하였다. 그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 이러한 조건에서 대조군 식물은 단지 9%만 성장을 재개한 반면, CaAIR1-silenced 고추 식물은 91%가 성장을 재개하였다. 따라서, CaAIR1 발현 감소가 건조 스트레스에 대한 내성을 매우 증가시켰음을 알 수 있었다.

이에 더하여, CaAIR1-silenced 고추 식물의 건조-내성 표현형이 증가한 수분 보유량 때문인지 알아보기 위하여, detached rosette leave의 생중량(fresh weight)으로 증산률(transpiration rate)을 측정하였다. 그 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 CaAIR1-silenced 고추 식물은 수분을 천천히 잃었음을 관찰할 수 있었다.

따라서, 상기 결과로부터 CaAIR1 유전자 발현 억제가 CaAIR1-silenced 고추 식물의 건조 내성을 증가시켰음을 알 수 있었다.

실시예 6. CaAIR1 과발현(CaAIR1-OX) 식물에서 앱시스산(ABA, abscisic acid)에 대한 감소된 민감도(sensitivity) 확인

in vivo에서 CaAIR1의 기능을 알아보기 위하여, CaMV 35S promoter를 이용하여 CaAIR1을 과발현시킨 애기장대 형질전환 식물을 만들었고, 독립적인 T₃ homozygous 형질전환 자손(CaAIR1-OX)을 표현형 분석에 이용하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 야생형 식물CaAIR1-OX 식물의 성장 및 발달 표현형을 정상 조건에서 차이가 없었다. 건조 스트레스 신호가 단지 ABA에만 의존하진 않지만, ABA 및 건조 스트레스 신호는 공통적인 신호유도기작을 가진다.

애기장대(Arabidopsis) 식물에서 건조 스트레스 관련 CaAIR1 유전자 과발현이 ABA 반응에 영향을 주는지를 알아보기 위해서, ABA에 대한 반응에서 발아 및 뿌리 성장을 관찰하였다(도 7). 우선, CaAIR1-OX 종자를 ABA를 첨가하지 않은 MS plate 또는 0.0, 0.5, 또는 1.0 μM ABA를 첨가한 MS plate에서 발아시켰다.

그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 0.5X MS 배지에서는 야생형 식물과 CaAIR1-OX 식물의 발아율(germination rate)이 큰 차이가 없었지만, 0.5 및 1.0 μM ABA를 첨가한 MS 배지에서는 야생형 종자에 비해서 CaAIR1-OX 종자가 ABA에 덜 민감한 것을 알 수 있었다.

야생형 식물과 CaAIR1-OX 식물의 차이는 seedling stage에서 더 두드러졌다(도 7B-7E). 도 7B에 나타낸 바와 같이, 파종 7일 후, 녹색 자엽(green cotyledon)을 가진 종자 수가 야생형에 비해 CaAIR1-OX 식물에서 많았다. 또한, 도 7C에 나타낸 바와 같이, 0.5μM ABA 첨가 시, 약 12%의 야생형 종자가 녹색 자엽을 나타냈고, 31-38%의 CaAIR1-OX 종자가 녹색 자엽을 나타냈다. 녹색 자엽 발달 외에도, 도 7D에 나타낸 바와 같이, ABA 처리가 CaAIR1-OX 식물에 비해 야생형 식물의 뿌리 성장을 매우 손상시켰다. ABA가 없는 경우, 두 식물에서 형태와 뿌리 길이가 유사했고, CaAIR1-OX 식물의 뿌리 길이는 ABA가 존재하는 야생형 식물의 뿌리 길이보다 길었다. 이에 더하여, 도 7E에 나타낸 바와 같이, CaAIR1-OX 식물의 뿌리 길이는 0.5 및 1.0 μM ABA를 처리한 야생형 식물보다 30 및 280% 증가하였다.

따라서, 애기장대에서 CaAIR1 유전자 과발현이 ABA에 대한 민감도(sensitivity)를 감소시켰음을 알 수 있었다.

실시예 7. CaAIR1 과발현(CaAIR1-OX) 식물에서 건조 스트레스에 대한 감소된 내성 확인

상기 실시예 6을 통하여 CaAIR1-OX 라인에서 ABA에 대한 감소된 감수성을 확인하였고, 상기 실시예 5를 통하여 CaAIR1-silenced 고추 식물에서 증가된 건조 내성을 확인하였으므로, CaAIR1-OX가 건조 스트레스 반응을 변화시키는지를 알아보았다.

그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 충분한 수분을 공급한 조건에서, CaAIR1-OX 식물은 표현형의 변화를 나타내지 않았다. 10일 동안 물주기를 중단하고, 다시 2일 동안 물을 주면, 물주기를 중단한 경우와 다시 물을 준 경우 모두 형질전환 식물이 야생형 식물에 비해 많이 시드는 것으로 나타났다.

또한, re-watering 후 야생형 식물과 CaAIR1-OX 식물의 생존률을 측정한 결과, 도 8B에 나타낸 바와 같이, 야생형 식물의 약 75%의 생존률을 나타냈고, CaAIR1-OX 라인 #1 및 #2는 각각 18 및 0%의 생존률을 나타내었다. 따라서, 야생형 식물에 비해 CaAIR1-OX 식물의 건조 감수성(drought sensitivity)이 증가했음을 알 수 있었다.

이에 더하여, 증산률(transpiration rate)을 알아보기 위하여, 떨어진 잎의 생중량(fresh weight)을 측정해 CaAIR1-OX 식물의 건조 감수성이 탈수 때문인지를 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 8C에 나타낸 바와 같이, 형질전환 라인의 잎조직에서 생중량 감소는 야생형에서보다 많았고, 이를 통해서 감소된 건조 스트레스에 대한 내성이 변화된 잎 증산률 때문임을 알 수 있었다.

일반적으로, 식물에서 ABA 감수성 및 건조 내성은 최소한 하나 또는 두가지 세포 및 분자적 parameter로 결정된다. CaAIR1-OX 라인의 건조 내성 표현형을 확인하기 위하여, ABA 처리 및 미처리 군에서 기공개도(stomatal aperture)를 측정하였다. 기공개도란, 식물체에 있어서 기공이 열리는 정도를 뜻한다.

그 결과, 도 8D에 나타낸 바와 같이, ABA 미처리 시, 야생형 및 CaAIR1-OX 잎의 평균 기공 크기에 유의한 차이가 없었다. 하지만, ABA 처리 후 형질전환 잎에서는 야생형 잎에 비해 기공개도가 덜 감소하였다. 20 μM ABA를 처리하면, 야생형 및 CaAIR1-OX 식물의 기공개도는 각각 34%, 42-46%로 감소하였다. 따라서, CaAIR1-OX 공변세포(guard cell)에서 ABA에 대한 감소된 감수성은 건조한 조건에서 수분 보유량(water retention)을 감소시킴을 알 수 있었다.

고추와 애기장대에서 CaAIR1의 발현이 ABA 감수성 및 건조 내성을 감소시키므로, CaAIR1 과발현이 건조 내성-관련 유전자들의 발현량에 영향을 주는지를 알아보았다. 4주 된 야생형 및 CaAIR1-OX 잎을 떼낸 후, 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 qRT-PCR로 RNA를 분석하였다. 이용한 프라이머 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

Gene	Direction	Sequence	서열번호
NCED3	F	5′-ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG-3’	3
	R	5’-AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC-3’	4
DREB2A	F	5′-CTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC-3’	5
	R	5’-AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC-3’	6
RAB18	F	5′-GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT-3′	7
	R	5′-GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA-3′	8
RD29B	F	5′-GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG-3′	9
	R	5′-ATTAACCCAATCTCTTTTTCACACA-3′	10
AtACT8	F	5′-CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA-3′	11
	R	5′-GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT-3′	12

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, ABA 합성에 관여하는 NCED3가 CaAIR1-OX 잎에서 상당히 낮게 발현되었다. 또한, drought-responsive marker gene을 인코딩하고 있는 RAB18 및 RD29b, drought tolerant marker gene인 DREB2A도 야생형 잎에 비해 CaAIR1-OX 잎에서 낮게 발현되었다.

따라서, CaAIR1 발현이 ABA 생합성 뿐만 아니라 건조 스트레스에 대한 반응도 조절한다는 것을 알 수 있었고, 건조-유도 marker gene의 발현 감소는 CaAIR1-OX 식물의 건조 감수성에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> A pepper RING Finger protein gene CaAIR1 and method for improving the resistance to the drought stress using CaAIR1 in plants <130> P20150069_PB15-12551 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 660 <212> DNA <213> CaAIR1 <400> 1 atggatcatg agaccggtga atcattggat tctgtgcatt cacataatat taattgcgag 60 catggtgatt ttgaatgcaa tatctgtttt gaaatagctc aagatcctat tgtgactctt 120 tgtggccacc tttattgttg gccttgtctt tgtgaatggt tgcaagttca ttcacattcc 180 caagaatgcc cagtttgtaa ggctctcata gaagaccaga agttagtacc catatatggt 240 cgaggcaagg caagctctga cccgagatcg tgcgtacgtc aaaggatgaa cattcctaac 300 cgtccagtat ttgggccaag accacaaaca gctccagcac tagatatgaa ctatttccag 360 cccaatgagt tggatctaac ggggggattt gtgcctatgt ccagtgcaag gtttgggaac 420 ttgacattat ctactctatt cggagctatt ccagcttttt tcaaccttca tgtgcaagga 480 tttcatgatg ctactgtata tggtgctacc acaggagttc catacatctt ttctagttca 540 gttcatgggg gttatgctca tggatttcat cattcaatcc atgtagatag tacaaagttc 600 ttcatcaaga tgtttctttt gatagttggt ttcctcttag ttgtttcctt aattttgtag 660 660 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> CaAIR1 <400> 2 Met Asp His Glu Thr Gly Glu Ser Leu Asp Ser Val His Ser His Asn 1 5 10 15 Ile Asn Cys Glu His Gly Asp Phe Glu Cys Asn Ile Cys Phe Glu Ile 20 25 30 Ala Gln Asp Pro Ile Val Thr Leu Cys Gly His Leu Tyr Cys Trp Pro 35 40 45 Cys Leu Cys Glu Trp Leu Gln Val His Ser His Ser Gln Glu Cys Pro 50 55 60 Val Cys Lys Ala Leu Ile Glu Asp Gln Lys Leu Val Pro Ile Tyr Gly 65 70 75 80 Arg Gly Lys Ala Ser Ser Asp Pro Arg Ser Cys Val Arg Gln Arg Met 85 90 95 Asn Ile Pro Asn Arg Pro Val Phe Gly Pro Arg Pro Gln Thr Ala Pro 100 105 110 Ala Leu Asp Met Asn Tyr Phe Gln Pro Asn Glu Leu Asp Leu Thr Gly 115 120 125 Gly Phe Val Pro Met Ser Ser Ala Arg Phe Gly Asn Leu Thr Leu Ser 130 135 140 Thr Leu Phe Gly Ala Ile Pro Ala Phe Phe Asn Leu His Val Gln Gly 145 150 155 160 Phe His Asp Ala Thr Val Tyr Gly Ala Thr Thr Gly Val Pro Tyr Ile 165 170 175 Phe Ser Ser Ser Val His Gly Gly Tyr Ala His Gly Phe His His Ser 180 185 190 Ile His Val Asp Ser Thr Lys Phe Phe Ile Lys Met Phe Leu Leu Ile 195 200 205 Val Gly Phe Leu Leu Val Val Ser Leu Ile Leu 210 215 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3 Forward <400> 3 acatggaaat cggagttaca gatag 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3 Reverse <400> 4 agaaacaaca aacaagaaac agagc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A Forward <400> 5 ctacaaagcc tcaactacgg aatac 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A Reverse <400> 6 aaactcggat agagaatcaa cagtc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB18 Forward <400> 7 ggaagaaggg aataacacaa aagat 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB18 Reverse <400> 8 gcgttacaaa ccctcattat tttta 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29B Forward <400> 9 gttgaagagt ctccacaatc acttg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29B Reverse <400> 10 attaacccaa tctctttttc acaca 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtACT8 Forward <400> 11 caactatgtt ctcaggtatt gcaga 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtACT8 Reverse <400> 12 gtcatggaaa cgatgtctct ttagt 25

Claims (6)

1. 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIR1(Capsicum annuum ABA-Insensitive RING protein 1) 유전자.
   
2. 제1항에 기재된 CaAIR1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드.
   
3. 제1항에 기재된 CaAIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터.
   
4. 삭제
5. CaAIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법으로서, 상기 CaAIR1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법.
   
6. 제5항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

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