KR102555522B1 - CaGIR1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents
CaGIR1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자, 및 이의 발현 조절을 통한 식물체의 건조 저항성 증진방법 등에 관한 것으로서, 상기 CaGIR1 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 건조 스트레스에 대한 저항성이 현저히 증가하는 것에 기초하여 완성된 것이다. 따라서 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자(negative regulator)인 CaGIR1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등을 적절히 개량할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 고추 녹광 품종 유래 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.
지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.
ABA는 비생물적 스트레스, 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로서 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.
오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.
이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
Catala, R., Ouyang, J., Abreu, I.A., Hu, Y., Seo, H., Zhang, X. and Chua, N.H. (2007) The Arabidopsis E3 SUMO ligase SIZ1 regulates plant growth and drought responses. The Plant cell, 19, 2952-2966.
본 발명자들은 고추에서 RING finger 단백질 코딩 유전자인 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우 식물의 건조 스트레스 저항성이 증진된다는 것에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자(negative regulator)인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CaGIR1 단백질을 암호화하는 CaGIR1 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaGIR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CaGIR1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CaGIR1 단백질을 암호화하는 CaGIR1 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaGIR1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CaGIR1 유전자는 고추로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 CaGIR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CaGIR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자, 및 이의 발현 조절을 통한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것으로서, 상기 CaGIR1 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 건조 스트레스에 대한 저항성이 현저히 증가하는 것에 기초하여 완성된 것이다. 따라서 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자(negative regulator)인 CaGIR1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등을 적절히 개량할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 탈수 처리된 고추 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGIR1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 1b는 ABA 처리된 고추 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGIR1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 2a는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 효모 이중 혼성화 분석(Y2H)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다 (BD: DNA 결합 도메인 (DNA-Binding Domain) 및 AD: 활성 도메인 (Activation Domain)).
도 2b는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 이분자 형광 상보성 분석(BiFC)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다 (흰색 막대=10 μm).
도 2c는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 풀-다운(pull-down) 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2d는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 루시퍼레이즈 보체 상호작용 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 고추 잎에 탈수, 고염(NaCl), ABA, 또는 H2O2 처리 후 qRT-PCR을 통하여 CaGIR1 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 CaGIR1의 E3 ligases 활성을 확인하기 위해 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3c는 CaGIR1 단백질의 식물 세포 내 국소화를 확인하기 위하여 CaGIR1-GFP 융합 단백질의 GFRP 형광 신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 CaGIR1 유전자의 발현을 RT-PCR 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 건조에 대한 민감성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4c는 잎 분리 후 다양한 시점에서 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00의 수분 손실을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4d 및 도 4e는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 ABA 처리에 따른 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4f 및 도 4g는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 ABA 처리에 따른 기공개도 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 야생형 식물(wild-type plant; WT)과 CaGIR1-OX 형질전환 계통에서 CaGIR1 유전자의 발현을 qRT-PCR 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 다양한 농도의 ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 종자 발아율을 나타낸 도면이다.
도 5c 및 도 5d는 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 유식물 성장을 알아보기 위해, 0.5 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 녹색 자엽 수를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e 및 도 5f는 0.5 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 1차 뿌리 신장을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5g 및 도 5h는 20 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물에 대해 발아 후 분석(Post germination assay)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조에 대한 민감성을 나타낸 도면이다.
도 6b는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조 스트레스 하의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 6c는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조 스트레스에 대한 증산 수분 손실을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6d는 ABA 처리 후 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6e 및 도 6f는 ABA 처리 후 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 기공개도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6g는 건조 스트레스 처리 조건에서 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 스트레스-반응 유전자(NCED3, RAB18, RD29B, 및 HAB1)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a는 CaGIR1이 CaGRAS1을 유비퀴틴화하는지 확인하기 위해 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 탈수(상단) 또는 ABA(하단) 처리된 CaGIR1-침묵 고추 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGRAS1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 7c는 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGRAS1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 8은 다양한 식물체의 CaGIR1 서열에 대해 다중서열분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이 때 동일한 아미노산 잔기는 검은색 하이라이트로 표시하였으며, 빨간색 박스는 E3 ligase의 RING 도메인을 나타낸다.
도 9는 CaGIR1의 계통수 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 ABA 처리된 고추 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGIR1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 2a는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 효모 이중 혼성화 분석(Y2H)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다 (BD: DNA 결합 도메인 (DNA-Binding Domain) 및 AD: 활성 도메인 (Activation Domain)).
도 2b는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 이분자 형광 상보성 분석(BiFC)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다 (흰색 막대=10 μm).
도 2c는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 풀-다운(pull-down) 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2d는 CaGIR1와 CaGRAS1의 상호작용을 검증하기 위해 루시퍼레이즈 보체 상호작용 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 고추 잎에 탈수, 고염(NaCl), ABA, 또는 H2O2 처리 후 qRT-PCR을 통하여 CaGIR1 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 CaGIR1의 E3 ligases 활성을 확인하기 위해 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3c는 CaGIR1 단백질의 식물 세포 내 국소화를 확인하기 위하여 CaGIR1-GFP 융합 단백질의 GFRP 형광 신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 CaGIR1 유전자의 발현을 RT-PCR 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 건조에 대한 민감성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4c는 잎 분리 후 다양한 시점에서 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00의 수분 손실을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4d 및 도 4e는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 ABA 처리에 따른 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4f 및 도 4g는 TRV2:CaGIR1 및 TRV2:00 고추 식물의 잎에서 ABA 처리에 따른 기공개도 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 야생형 식물(wild-type plant; WT)과 CaGIR1-OX 형질전환 계통에서 CaGIR1 유전자의 발현을 qRT-PCR 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 다양한 농도의 ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 종자 발아율을 나타낸 도면이다.
도 5c 및 도 5d는 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 유식물 성장을 알아보기 위해, 0.5 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 녹색 자엽 수를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e 및 도 5f는 0.5 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물의 1차 뿌리 신장을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5g 및 도 5h는 20 μM ABA 처리 후 야생형 및 CaGIR1-OX 형질전환 식물에 대해 발아 후 분석(Post germination assay)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조에 대한 민감성을 나타낸 도면이다.
도 6b는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조 스트레스 하의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 6c는 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 건조 스트레스에 대한 증산 수분 손실을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6d는 ABA 처리 후 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 잎 온도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6e 및 도 6f는 ABA 처리 후 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 기공개도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6g는 건조 스트레스 처리 조건에서 야생형 및 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 스트레스-반응 유전자(NCED3, RAB18, RD29B, 및 HAB1)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a는 CaGIR1이 CaGRAS1을 유비퀴틴화하는지 확인하기 위해 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 탈수(상단) 또는 ABA(하단) 처리된 CaGIR1-침묵 고추 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGRAS1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 7c는 CaGRAS1-OX 형질전환 식물의 잎에서 추출한 조추출액을 이용한 CaGRAS1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 면역블롯 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 8은 다양한 식물체의 CaGIR1 서열에 대해 다중서열분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이 때 동일한 아미노산 잔기는 검은색 하이라이트로 표시하였으며, 빨간색 박스는 E3 ligase의 RING 도메인을 나타낸다.
도 9는 CaGIR1의 계통수 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자(negative regulator)인 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자에 관한 것으로서, 상기 CaGIR1 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 건조 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 통해 상기 유전자가 식물체에서 건조 스트레스에 대한 저항성을 조절할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자인, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질 및 이를 암호화하는 CaGIR1 유전자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 CaGIR1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어져 있으며, 상기 CaGIR1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 아미노산 서열이다. 구체적으로, CaGIR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CaGIR1 유전자는 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 건조 스트레스에 대한 내성의“음성적 조절인자(negative regulator)"란 발현 또는 활성이 증가할수록 식물체의 건조 스트레스 내성을 억제하는 유전자 및/또는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaGIR1은 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자로 기능하는 단백질을 코딩하므로, CaGIR1 유전자 발현이 억제되면 ABA 민감도 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증가하고, 반대로 CaGIR1 유전자가 과발현되면, ABA 민감도 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소할 수 있다.
본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, E3 리가아제(E3 ligase)인 CaGIR1을 동정하였고, 상기 단백질이 또 다른 건조 스트레스 조절 단백질 CaGRAS1의 분해와 관련이 있을 것이라는 가정 하에 건조 스트레스와 CaGIR1 단백질 사이의 연관성을 규명하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 효모 이중 혼성화 분석을 통해 식물 스트레스 내성과 관련된 CaGRAS1 단백질과 상호작용하는 단백질들을 선별하였고, 그 중 E3 리가아제인 CaGIR1 단백질 및 이의 유전자를 동정하였으며, 구체적인 실험을 통해 CaGRAS1 단백질 및 CaGIR1 단백질의 상호작용을 검증하였다 (실험예 3).
본 발명의 다른 실시예에서는, CaGIR1 단백질의 특성을 관찰한 결과 상기 단백질이 건조 스트레스를 포함한 비생물학적 스트레스에 대한 반응에 관여함을 확인하였으며, 핵 및 세포질에 위치하고, E3 리가아제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다 (실험예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaGIR1 유전자 발현이 침묵된 고추의 건조 스트레스에 대한 반응(생존율, 잎 온도, 기공개도, 증산 수분 손실량 등)을 관찰하여, CaGIR1 유전자 침묵에 의한 식물체의 ABA 민감도 및 건조 스트레스 저항성 향상 효과를 확인하였다 (실험예 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaGIR1을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 제작하여 건조 스트레스 및 ABA를 처리한 조건에서 야생형 식물체와 CaGIR1 과발현 식물체의 발아율, 녹색 자엽화, 뿌리 성장율 측정, 스트레스 반응 유전자 발현 등을 통해 CaGIR1이 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성의 음성적 조절인자로 작용함을 확인하였으며, 실제로 애기장대 식물에서 CaGIR1 유전자 과발현시 건조 내성이 감소됨을 잎 온도, 기공개도, 증산 수분 손실 측정을 통해 확인하였다 (실험예 6 내지 7).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CaGIR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 CaGIR1 단백질을 코딩하는 유전자의 cDNA 단편(1-265 bp)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.
바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.
본 발명에서는, CaGIR1의 cDNA 단편(1-265 bp)을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaGIR1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
용어 "재조합 벡터" 또는 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaGIR1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 CaGIR1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaGIR1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics), 항체, 또는 앱타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에서, 상기 CaGIR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. 상기 CaGIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계는 전술한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 안티센스 뉴클레오티드, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 항체, 또는 앱타머 등을 이용하여 제한 없이 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 식물 재료 및 성장 조건
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 종자는 4 ℃에서 2일 동안 춘화처리(vernalization) 후, 24 ℃의 성장 챔버에서 16시간 낮/8시간 밤 주기로 성장시켰다. 고추(Capsicum annuum L. cv. NocKwang) 종자는 29 ℃의 어두운 곳에서 5일간 발아시켰다. 담배(Nicotiana benthamiana) 종자, 애기장대 및 고추 유식물은 살균된 배합토[피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v], 사토(sand), 및 양토(loam soil) 1:1:1(v/v/v)에서, 24 ℃, 상대 습도 60 % 조건의 백색 형광(130 μmol photons m-2·sec-1)하에서 성장시켰다.
실시예 2. 바이러스 유도 유전자 침묵(Virus-induced gene silencing, VIGS)
CaGIR1-침묵 고추 식물(CaGIR1-silenced pepper plant)을 분석하기 위해 담배얼룩 바이러스(tobacco rattle virus; TRV) 기반 VIGS(virus-induced gene silencing) 시스템을 이용하였다. CaGIR1 cDNA 단편(1-265bp)을 pTRV2 벡터에 삽입하였다. 음성 조절로서 pTRV1:00, pTRV2:CaGIR1(1-265bp), 및 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 동시-침투(co-infiltrated)시켰다 (각 균주별 OD600=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.
실시예 3. 형질전환 애기장대 식물의 제조
CaGIR1 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 전장 서열을 pCR™™벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. 35S-CaGIR1 구조체는 LR 반응에 의해 생성되었으며, 전기천공법에 의해 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 도입되었다. 꽃가루 딥(floral dip) 방법을 통하여 CaGIR1 유전자로 애기장대를 형질전환하였다 (Clough and Bent, 1998). T2 식물의 종자들은 25 μg·mL-1의 포스피노트리신(phosphinothricin)을 함유하는 MS 한천 배지에서 선택되었다.
실시예 4. ABA, 탈수, NaCl, 및 H
2
O
2
처리
CaGIR1 발현 수준을 측정하기 위하여, 비생물적 스트레스(Abiotic stress) 처리된 4엽(four-leaf-old) 고추 식물을 사용하였다. 구체적으로, 식물에 ABA 100 μM, 탈수(1차 잎을 떼어냄), 또는 H2O2 100 μM을 처리하였다. 식물을 200 μM NaCl 용액으로 옮겨 NaCl 처리하였다. 잎은 각각 0, 2, 6, 12 및 24시간 처리 후에 수확되었다. 스트레스 관련 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위해, 0 및 6시간 탈수 처리된 CaGRAS1-OX 형질전환, 야생형 식물을 수확하였다.
실시예 5. RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)
총 RNA는 애기장대 및 고추 잎으로부터 추출하였고, 모든 시료는 TRI-Reagent®시약(Molecular Research Center, USA)을 처리하여 DNA와 단백질을 제거한 후, 2-propanol을 처리하여 RNA를 침전시켰다. cDNA는 1 μg의 총 RNA로 iScript™ cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 이용하여 합성하였다. Quantitative real-time PCR은 iQ™ Green Supermix(Bio-Rad) 및 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 하기 표 1에 기재한 특이적 프라이머로 수행하였다. 고추 Actin1(CaACT1) 및 애기장대 Actin8(AtACT8) 유전자를 표준화를 위한 대조군으로 사용하였다. ABA 신호 전달 및 건조 반응에 관여하는 스트레스 반응-유전자의 발현을 확인하기 위하여 NCED3, RAB18, RD29B, 및 HAB1 유전자를 사용하였다.
| Primer name | Primer sequence (5'-3') | 서열번호 | |
| For cloning | |||
| CaGIR1-CDSF | Forward | ATGGCCTTAGAACAACTTTTTCAA | 3 |
| CaGIR1-CDSR | Reverse | TTATAGTTGCCTTCTTAACCTTGGA | 4 |
| CaGIR1-noSTF | Forward | AGTCCAAGGTTAAGAAGGCAACTAAAGGGCGAATTCG | 5 |
| CaGIR1-noSTR | Reverse | CGAATTCGCCCTTTAGTTGCCTTCTTAACCTTGGACT | 6 |
| CaGIR1 C59S/H61Y F | Forward | GCAAGGCCAGCAAAAGAGATATCCGCTTAACGTAACAACAGGATCA | 7 |
| CaGIR1 C59S/H61Y R | Reverse | TGATCCTGTTGTTACGTTAAGCGGATATCTCTTTTGCTGGCCTTGC | 8 |
| CaGIR1-VIGS-F | Forward | TCTAGAATGGCCTTAGAACAACTTTT | 9 |
| CaGIR1-VIGS-R | Reverse | CTCGAGATTTTGGTTTCTGGTTATAG | 10 |
| For qRT-PCR | |||
| CaGIR1-RTF | Forward | AAGCAACAAAATCATCTGAAGGCA | 11 |
| CaGIR1-RTR | Reverse | TACTGCTGGCTGCTAGATTATATGAGT | 12 |
| CaACT1 (CA12g08730) |
Forward | GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT | 13 |
| Reverse | CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT | 14 | |
| AtActin8 (At1g49240) |
Forward | CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA | 15 |
| Reverse | GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT | 16 | |
| NCED3 (At3g14440) |
Forward | ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG | 17 |
| Reverse | AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC | 18 | |
| RAB18 (At5g66400) |
Forward | GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT | 19 |
| Reverse | GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA | 20 | |
| RD29B (At5g52300) |
Forward | GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG | 21 |
| Reverse | ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA | 22 | |
| HAB1 (At1g72770) |
Forward | TAGAAAATGCTGGAGGCAAAGTT | 23 |
| Reverse | TCAGGTTCTGGTCTTGAACTTTCTTT | 24 |
실시예 6. 효모 이중 혼성화 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)
효모 라이브러리 스크리닝을 위해, CaGRAS1 cDNA 단편(316-1749bp) 및 CaGIR1의 전장(Full length) 서열을 각각 pGBKT7 및 pGADT7 벡터에 삽입하였다.
이러한 구조체는 리튬 아세테이트-조절 전이 방법을 사용하여 효모 균주 AH109에 도입하였다 (Ito et al., 1983). CaGRAS1 과 CaGIR1 간의 상호작용을 확인하기 위해, 형질전환된 AH109 세포를 SD-아데닌-히스티딘-류신-트립토판(SD-AHLW) 배지에서 성장시켰다. 다음으로, 각 효모 세포 배양액을 10배씩 연속적으로 희석하고 각 샘플 5 μl를 SC-류신-트립토판(SC-LW) 또는 SC-아데닌-히스티딘-류신-트립토판(SC-AHLW) 배지에 접종하였다.
실시예 7. 세포 내 국소화(Subcellular localization)
세포 내 국소화를 위해, 균주 p19와 함께 35S-CaGIR1-GFP를 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 담배(Nicotiana benthamiana)에 침투시켰다 (각 균주별 OD600=0.5). 침투 2일 후, 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP(green fluorescent protein) 신호를 관찰하였다.
실시예 8. 재조합 단백질의 발현에 대한 시험관 내 풀-다운 분석(
in vitro
pull-down assay)
GST-CaGRAS1, MBP-CaGRAS1, GST-GIR1, 및 MBP-GIR1 재조합 단백질의 발현을 위해, CaGRAS1의 전장(Full length) 및 CaGIR1 ORFs를 pGEX4T-3 및 pMAL-c2x 벡터에 삽입하였다. 각각의 벡터는 대장균(Escherichia coli) 균주 c+로 형질전환 된 후, 0.5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)에 의해 재조합 단백질의 발현이 유도되었다. 재조합 단백질은 제조업체의 프로토콜(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)에 따라 정제하였다.
풀-다운 분석을 위해, 5 μg의 GST 또는 GST-CaGRAS1을 4 ℃에서 2 시간 동안 회전하면서 GST 수지(resin)를 함유하는 0.5 mL 결합 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 0.5% Tween-20)에서 MBP 또는 MBP-CaGIR1과 함께 배양하였다. 용출된(eluted) 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 분석한 다음, 항-GST 및 항-MBP 항체로 면역블롯팅(immunoblotting) 및 면역침전(immunoprecipitation)을 수행하였다.
실시예 9. 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)
CaGIR1의 E3 ligase 활성을 평가하기 위해, MBP-CaGIR1으로 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석(in vitro self-ubiquitination assay)을 수행하였다. 500 ng MBP-CaGIR1 단백질을 250 ng의 인간 UBE1(E1)을 함유하는 30 μl 반응 버퍼(2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM dithiothreitol)(Boston Biochemicals, Cambridge, MA, USA), his-tagging h5b 효소(E2)(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), 및 10 lg bovine ubiquitin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 인큐베이션하였다. CaGIR1이 CaGRAS1 유비퀴틴화를 매개하는지 여부를 결정하기 위해, MBP-CaGRAS1 및 GST-CaGIR1 단백질을 포함하는 30 μl 반응 버퍼로 시험관 내 유비퀴틴화 분석(in vitro ubiquitination assay)을 수행하였다. 29 ℃에서 8시간 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 SDS-PAGE에서 분리하고 항-GST, 항-Ub, 및 항-MBP 항체를 사용하는 면역블롯팅으로 단백질을 검출하였다.
실시예 10. 무세포 분해 분석(Cell-free degradation assay)
탈수 및 100 μM ABA 처리된 4주령 고추 식물 또는 애기장대 유식물, 및 추출 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100, 10 mM ATP, 및 10 mM NaCl)를 사용하여 조추출액(crude extract)을 제조하였다. 500 ng GST-CaGRAS1을 MG132가 있거나/없이 0, 3, 6시간 또는 0, 2, 4시간 동안 조추출액(총 단백질 50㎍)과 함께 배양하였다. 단백질 분해를 평가하기 위해 항-GST 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
실시예 11. 이분자 형광 상보성(Bimolecular Fluorescence Complementation; BiFC) 분석
CaGRAS1 또는 CaGIR1의 cDNA를 각각 35s-VYNE 또는 35s-CYCE 벡터에 삽입하였다. 각각의 구조체들을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 p19 균주와 함께 담배(Nicotiana benthamiana)에 침투시켰다 (1:1:1 비율; OD600 = 0.5). 3일 후, 공초점 현미경으로 신호를 관찰하였다.
실시예 12. 표현형 분석(Phenotypic analysis)
12-1. 건조 스트레스 분석
건조 스트레스 분석을 위해, 야생형 및 CaGIR1-OX 식물 당 36개의 종자를 발아 및 유식물 성장을 위해 ABA 처리된 MS 한천 배지에 플레이팅하였다. 3주령 야생형 및 CaGIR1-OX 식물에 12일 동안 급수를 중단한 후, 2일 동안 재급수하여 생존율을 측정하였다. 고추 식물의 경우, 3주령 고추 식물에 12일 동안 급수를 중단한 후, 3일 동안 재급수하여 생존율을 측정하였다. 4엽 단계 고추 식물, 및 4주령 애기장대 식물의 로제트 잎(rosette leaf) 6개의 증산 수분 손실(transpirational water loss)은 8시간 동안 생중량을 칭량함으로써 측정하였다.
12-2. 열화상 분석
잎의 온도를 측정하기 위해, 고추와 애기장대 식물에 각각 100 μM 및 50 μM ABA를 뿌렸다. 적외선 카메라(FLIR systems; T420) 및 FLIR Tools ver 6.4를 사용하여 측정하였다.
12-3. 기공개도의 생물학적 정량
기공개도(stomata apertures)의 측정을 위해, 고추와 애기장대 잎의 표피를 분리하고, 3시간 동안 기공 개구 버퍼(stomatal opening buffer; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 mM CaCl2, 및 pH 6.5) 위에 띄웠다. 그런 다음, 기공을 측정하기 위해 24℃에서 3시간 동안 0 μM, 10 μM, 또는 20 μM ABA를 포함하는 기공 개구 버퍼로 옮겨졌다. 배양 후, 각 샘플을 무작위로 측정하였다.
실시예 13. 루시퍼레이즈 보체 상호작용 분석(luciferase complement interaction assay)
CaGRAS1 및 CaGIR1의 전장 코딩 서열(종료 코돈 없음)을 각각 pDEST-GWNLUC 및 pDEST-GWCLUC에 도입하여 CaDSIZ1-NLUC 및 CaDRHB1-CLUC를 생성하였다. 각각의 구조체들을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 p19 균주와 함께 담배(Nicotiana benthamiana)에 침투시키고 LUC assay 용액(0.5% v/v DMSO, 1 mM luciferin, 10 mM MES/KOH(pH 5.6), 10 mM MgCl2)을 침윤하고 NightSHADE LB 985 식물 이미징 시스템을 사용하여 신호를 관찰하였다.
실시예 14. 통계적 분석
통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타내며, P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다(*P<0.05, ***P<0.001).
[실험예]
실험예 1.
CaGIR1
유전자 및 단백질 서열 분석
건조 스트레스에 대한 내성의 음성 조절 유전자를 분리하기 위해, 건조 스트레스 처리된 고추 잎으로 RNA-seq 분석을 수행하고 다른 식물 GIR1과 높은 상동성을 갖는 CaGIR1 단백질의 아미노산 서열과 유사한 단백질을 알아보기 위하여 다중서열분석과 계통수 분석을 수행하였다. 다중서열분석은 Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo) 방법을 사용하였고 계통수 분석은 ClustalW2를 이용하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, CaGIR1 cDNA는 등전점이 6.30이고 분자량이 24.20 kDa인 216 개의 아미노산 잔기를 인코딩하는 651 bp 오픈리딩프레임으로 이루어져 있었다.
도 9에 나타난 바와 같이, CaGIR1 단백질과 그 상동성 단백질은 고도로 보존된 E3 ligase의 RING 도메인을 가지고 있다. CaGIR1은 다중 서열 분석 및 계통수 분석에 따라, 다른 종의 RING type E3 ligase와 높은 상동성(78.9%)을 갖는 것으로 나타났다.
실험예 2. 탈수 스트레스 하에서 CaGRAS1 안정성의 조절
단백질 안정성은 주로 다양한 스트레스 반응 및 ABA 신호 전달에 관여하는 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템(ubiquitin-26S proteasome system, UPS)에 의해 조절된다 (Horton et al., 2007; Lim et al., 2017; Stone et al., 2018; Joo et al., 2019a, Julian et al., 2019, Ali et al., 2020). CaGRAS1의 단백질 안정성이 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템에 의해 조절되는지 조사하기 위해, CaGRAS1으로 무세포 분해 분석을 수행하였다. 구체적으로, GST-태그된 CaGRAS1 단백질을 건강한, 또는 6시간 탈수 또는 6시간 ABA 처리된 고추 잎의 조추출액과 함께 배양하였으며, 항-GST 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 탈수 처리된 고추 잎의 조추출액과 함께 배양한 CaGRAS1 단백질의 수준은 건강한 잎에 비해 더 빠르게 감소한 것으로 나타났다. 반대로, 도 1b에 나타낸 바와 같이, ABA 처리된 고추 잎의 조추출액과 함께 배양한 CaGRAS1 단백질은 건강한 잎에 비해 더 느리게 분해되는 것으로 나타났다. 프로테아좀 억제제인 MG132 처리는 CaGRAS1 단백질 수준을 회복시켰으며,
이는 CaGRAS1 안정성의 저하가 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템에 의해 조절된다는 것을 의미한다.
실험예 3. CaGRAS1과 고추 RING finger E3 ligase CaGIR1의 상호작용 확인
상기 실험예 2의 무세포 분해 분석 결과에 기초하여, CaGRAS1 분해와 관련된 후보 단백질을 확인하기 위해, CaGRAS1을 미끼(bait)로 하고 고추 RING-type E3 ligases를 먹이(prey)로 하여 효모 이중 혼성화(Y2H) 스크리닝을 수행하였다. CaGRAS1 단백질은 효모 시스템에서 전사활성화(transactivation) 활성을 가지므로 절단된 CaGRAS1의 C-말단(106-582)을 스크리닝에 사용하였다. 효모 이중 혼성화 스크리닝 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 고추 RING-type E3 ligases 중 CA09g13790(CaGIR1: C apsicum a nnuum CaGRAS1 Interacting RING-type E3 ligase 1)이 CaGRAS1과 상호작용하였다.
또한, CaGIR1과 CaGRAS1의 상호작용을 확인하기 위해, 이분자 형광 상보성(BiFC), 풀-다운(pull-down), 및 루시퍼레이즈 보체 상호작용 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2b 내지 도 2d에 나타낸 바와 같이, 담배(Nicotiana benthamiana)의 표피 세포의 핵에서 노란색 형광이 발광하는 것을 통해 VYNE::CaGRAS1 및 CYCE::CaGIR1이 동시-발현된 것을 알 수 있었다.
상기 결과는 핵에서 CaGIR1과 CaGRAS1의 상호작용이 발생함을 의미한다.
실험예 4. CaGIR1의 분자적 특성 분석
CaGRAS1의 발현 수준은 비생물적 스트레스와 ABA에 의해 유도된다. 또한, CaGRAS1은 ABA 신호 전달 및 건조 스트레스 반응에 관여한다. 따라서, 다양한 스트레스(탈수, NaCl, ABA, 또는 H2O2) 처리한 고추 잎에서 CaGIR1의 발현 패턴을 분석하기 위해, qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 고추 잎에서 CaGIR1의 발현은 탈수, 높은 염분(NaCl), ABA, 및 H2O2 처리로 증가하였다.
CaGIR1은 RING 도메인을 포함하므로 CaGIR1의 E3 ligases 활성을 시험관 내 자가-유비퀴틴화 분석에 의해 확인하였다. 구체적으로, 말토스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)-태그된 CaGIR1 및 CaGIR1C59S/H61Y(Cys59 및 His61이 Ser59 및 Tyr61로 치환된 불활성 E3 ligases)를 대장균(E. coli)에서 발현시켜 시험관 내 자가-유퀴틴화 분석에 사용하였다. 유비퀴틴, UBE1(E1) 및 UbcH6b(E2)가 있는 상태에서 MBP-CaGIR1로 배양한 후, E3 ligase 활성을 관찰하였다. 그러나, CaGIR1C59S/H61Y는 E3 ligase 활성을 나타내지 않았으며, 이는 CaGIR1이 E3 유비퀴틴 ligase로 작용함을 의미한다.
세포에서 CaGIR1의 세포 내 국소화를 확인하기 위해, GFP-태그된 CaGIR1 단백질을 담배(Nicotiana benthamiana)의 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 녹색 형광 신호는 4',6-diamidino-2-phenylindole과 중첩된 세포질과 핵에서 관찰되었다.
상기 결과는 CaGIR1이 세포질과 핵에서 기능함을 나타낸다.
실험예 5. 건조 스트레스에 대한
CaGIR1
-침묵 고추 식물의 내성 증가 확인
이전 연구에서 CaGRAS1은 건조 내성 표현형을 나타냈으며, CaGIR1의 발현 수준은 건조 스트레스에 의해 유도되었다. 따라서, 바이러스 유도 유전자 침묵(virus-induced gene silencing; VIGS) 분석을 이용하여 건조 스트레스에 대한 반응에서 CaGIR1의 생물학적 기능을 확인하였다.
VIGS의 녹다운 효율을 확인하기 위해, RT-PCR(reverse polymerase chain reaction)을 사용하여 대조군(TRV2:00)과 CaGIR1-침묵 고추(TRV2:CaGIR1) 잎에서 CaGIR1의 발현 수준을 비교하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-침묵 고추에서 CaGIR1의 발현 수준은 대조군 잎에 비해 상대적으로 감소하였다.
또한, 건조 처리시 CaGIR1-침묵 고추의 내성 변화를 조사하기 위해, 대조군(TRV2:00)과 CaGIR1-침묵 고추(TRV2:CaGIR1)에 12일 동안 급수를 중단하고, 3일 동안 재급수 하여 건조 스트레스를 가하였다. 그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 정상적인 성장 조건에서는 상기 두 식물간에 표현형 차이가 관찰되지 않았으나, 건조 스트레스를 가한 경우 대조군 고추 식물이 CaGIR1-침묵 고추 식물과 비교하여 더 시든 표현형을 보였다. 또한, 상기 식물의 생존율은 CaGIR1-침묵 고추 식물이 85.31±5.15 %, 대조군 고추 식물이 48.75±8.09 %로 확인되었다. 상기 결과로부터, CaGIR1 유전자 발현 억제가 건조 내성을 강화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 감소된 증산 수분 손실(transpirational water loss)이 CaGIR1-침묵 고추의 건조 내성 표현형을 결정하는지 확인하기 위해, 대조군 및 CaGIR1-침묵 고추 잎의 생중량을 8시간 동안 측정하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-침묵 고추 잎의 남은 생중량의 백분율은 대조군 고추보다 높았으며, 이는 CaGIR1-침묵 고추 식물에서 수분 손실이 덜 발생했음을 의미한다.
잎 표면 온도는 증발 냉각(evaporative cooling)에 의해 결정되며(Park et al., 2015; Lim et al., 2017), 기공 개/폐는 잎 표면 온도를 조절하여 식물 스트레스를 완화한다(Michaltz et al., 2016; Wright et al., 2017; Wang et al., 2019). 대조군 및 CaGIR1-침묵 고추의 표현형의 차이가 ABA 민감성으로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해, ABA 처리 유/무에 따라 잎 온도와 기공개도(stomata apertures)를 분석하였다.
ABA 처리 유/무에 따라 잎 온도를 분석한 결과, 도 4d 및 도 4e에 나타낸 바와 같이, 대조군과 CaGIR1-침묵 고추 식물은 ABA가 없는 경우 유의미한 열적 차이를 나타내지 않았다. 반면, ABA를 처리한 경우 두 식물 모두에서 잎 온도가 증가하였으며, 대조군 잎과 비교하여 CaGIR1-침묵 고추 잎의 온도가 더 높았다.
ABA 처리 유/무에 따라 기공개도를 분석한 결과, 도 4f 및 도 4g에 나타낸 바와 같이, 잎 온도와 일치하게, CaGIR1-침묵 고추의 기공은 ABA가 없는 경우, 대조군 식물과 차이가 없었다. 그러나, 10 μM 또는 20 μM ABA를 처리한 경우, CaGIR1-침묵 고추 식물의 기공개도는 대조군 식물의 기공개도보다 작았다.
상기 결과는 CaGIR1-침묵 고추 식물의 건조 내성 표현형이 ABA에 대한 저민감성(hyposensitivity)에 기인한다는 것을 나타낸다.
실험예 6.
CaGIR1
-OX(overexpressing) 식물들의 감소한 ABA 민감도 확인
상기 실험예 5에서 확인한 바와 같이, CaGIR1-침묵 고추 식물은 향상된 건조 내성을 나타냈다. 따라서, CaGIR1-과발현(OX) 형질전환 애기장대를 생성하여 CaGIR1의 생체 내(in vivo) 기능을 추가로 확인하였다. 구체적으로, 항시발현 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 CaGIR1-과발현(OX) 형질전환 애기장대를 제조하고, 두 개의 독립된 T2 형질전환 애기장대 계통(CaGIR1-OX #3 및 CaGIR1-OX #5)을 얻어 형질전환 효율을 확인하기 위해, qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, CaGIR1의 전사체는 CaGIR1-OX 식물에서만 검출되었다.
다음으로, CaGIR1의 기능이 발아 및 유식물 단계에서 ABA 신호 전달에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 야생형 및 CaGIR1-OX 식물의 발아율(Germination rate)을 다양한 농도(0, 0.5, 및 0.75 μM)의 ABA를 보충한 성장 배지에서 종자를 발아시켜 측정하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 경우, 야생형 식물과 CaGIR1-OX 식물은 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 0.5 μM 또는 0.75 μM ABA 처리 조건에서 CaGIR1-OX 식물의 발아율은 야생형 식물의 발아율보다 높았다.
한편, 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이, 유식물 단계에서 녹색 자엽(green cotyledon)의 수는 0.5 μM ABA에서 야생형보다 CaGIR1-OX 식물에서 더 높았다.
나아가, 야생형 및 CaGIR1-OX 식물의 1차 뿌리 길이를 비교한 결과, 도 5e 및 도 5f에 나타낸 바와 같이, 녹색 자엽의 수와 일치하게, CaGIR1-OX 식물의 뿌리 길이가 야생형 식물에 비해 더 길게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
ABA에 대한 뿌리 성장의 저민감성(hyposensitive) 표현형이 발아 때문인지 여부를 확인하기 위해, 발아 후 분석(Post germination assay)을 수행하였다. 그 결과, 도 5g 및 도 5h에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-OX 식물의 뿌리 길이가 야생형 식물에 비해 더 길게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 CaGIR1-OX 식물이 발아 및 유식물 단계 모두에서 ABA 저민감성을 가지며 CaGIR1이 ABA 매개 반응에 기여한다는 것을 의미한다.
실험예 7.
CaGIR1
-OX 형질전환 식물의 건조 내성 감소 확인
상기 실험예 5 및 실험예 6에서 CaGIR1-침묵 고추의 건조 내성 및 CaGIR1-OX 식물의 ABA 저민감성을 확인한 것에 더하여 건조 스트레스에 대한 반응을 확인하기 위해, CaGIR1-OX 식물의 표현형 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6a(왼쪽 패널)에 나타낸 바와 같이, 물이 잘 공급되는 조건에서 야생형 및 CaGIR1-OX 식물 사이에 큰 차이는 나타나지 않았다. 12일 동안 급수를 중단한 후, 2일 동안 재급수하여 식물에 건조 스트레스를 가했을 때, 도 6a(중간 및 오른쪽 패널)에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-OX 식물은 야생형 식물보다 더 시들었다. 재급수 2일 후 생존율의 경우, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 야생형 식물의 80.0%와 CaGIR1-OX 식물의 14.2-33.8%가 생존하여 성장을 지속하였다.
또한, 야생형 및 CaGIR1-OX 식물에서 8시간 동안 잎의 생중량 손실을 측정하여 증산 수분 손실(transpirational water loss)을 확인하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-OX 식물에서 더 많은 중량 손실 비율을 나타냈으며, 이는 CaGIR1-OX 식물에서 더 많은 증산 수분 손실이 발생했음을 의미한다.
나아가, 증산은 기공 개/폐를 조절함으로써 잎의 온도에 영향을 주며, 공변세포(guard cell)에 의한 기공의 조절은 ABA 신호 전달에 의해 조절되므로, 잎 표면 온도와 기공개도를 측정하였다. 그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 경우, 잎 표면 온도와 기공개도는 야생형 식물과 CaGIR1-OX 식물 사이에 유의미한 차이가 없었다. ABA 처리 후, 잎 표면 온도는 야생형 식물보다 CaGIR1-OX 식물에서 더 낮았다. 기공개도는 도 6e 및 도 6f에 나타낸 바와 같이, 야생형 식물보다 CaGIR1-OX 식물에서 더 컸다.
상기 결과는 CaGIR1-OX 식물의 건조 내성 감소가 ABA 과민성을 통한 증산량 감소 때문임을 시사한다.
한편, ABA 신호 전달 및 건조 반응에 관여하는 스트레스-반응 유전자의 발현 수준을 3시간 및 6시간 동안 건조 스트레스에 노출된 애기장대에서 qRT-PCR을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 6g에 나타낸 바와 같이, CaGIR1-OX 식물에서 NCED3의 발현율은 유의미한 차이가 없었으며, RAB18 및 RD29B의 발현은 감소하고 HAB1은 증가하였다.
상기 결과는 CaGIR1이 ABA 또는 건조 반응과 관련된 스트레스-반응 유전자의 발현을 부정적으로 조절한다는 것을 나타낸다.
실험예 8. CaGIR1에 의한 CaGRAS1의 분해 확인
CaGIR1이 CaGRAS1을 유비퀴틴화하는지 여부를 확인하기 위해, 시험관 내(in vitro) 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 정제된 GST-CaGIR1 및 MBP-CaGRAS1을 사용하였다. 그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, CaGRAS1은 CaGIR1C59S/H61Y가 아닌 CaGIR1에 의해 폴리유비퀴틴화되었다.
또한, CaGRAS1의 무세포 분해는 6시간 탈수 또는 6시간 ABA 처리된 CaGIR1-침묵 고추로 수행하였다. 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, CaGRAS1 단백질은 CaGIR1-침묵 고추 조추출액과 함께 배양될 때 덜 분해되었다.
나아가, CaGIR1-OX 식물 조추출액으로 수행한 무세포 분해 결과, 도 7c에 나타내 바와 같이, CaGRAS1의 안정성을 더 감소시키는 것으로 나타났다.
상기 결과는 CaGIR1이 CaGRAS1을 표적으로 하고 유비퀴틴화에 의한 CaGRAS1의 분해에 기여함을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<223> CaGIR1_amino acid sequence
<400> 1
Met Ala Leu Glu Gln Leu Phe Gln Glu Gln Ile Ala Glu Thr Thr Phe
1 5 10 15
Glu Glu Arg Asn Ile Ser Leu Glu Lys Trp Lys Thr Ile Asp Asp Lys
20 25 30
Leu Glu Asp Asn Asp Leu Ser Gly Gly Leu Glu Cys Asn Ile Cys Leu
35 40 45
Asp Ile Val His Asp Pro Val Val Thr Leu Cys Gly His Leu Phe Cys
50 55 60
Trp Pro Cys Ile Tyr Lys Trp Ile His Phe Gln Ser Ile Ser Ser Glu
65 70 75 80
Asn Thr Tyr Asn Gln Lys Pro Lys Cys Pro Val Cys Lys Ala Glu Val
85 90 95
Ser Glu Lys Met Leu Ile Pro Leu Tyr Gly Arg Gly Gln Ala Thr Lys
100 105 110
Ser Ser Glu Gly Lys Ala Pro Asn Leu Gly Ile Ile Ile Pro Gln Arg
115 120 125
Pro Pro Ser Pro Arg Cys Gly Gly Lys Thr Leu Val Glu Thr Asn Asn
130 135 140
Ser Tyr Pro Ser Gln Gln Leu His His Gln Asn Tyr Pro Gln Glu Ser
145 150 155 160
Pro Thr His Gln Thr Tyr Thr Thr Glu Pro Met Leu Ser Pro Gly Gly
165 170 175
Thr Thr Thr Gly Gly Ile Val Tyr Ser Arg Met Phe Gly Asn Ser Ser
180 185 190
Thr Thr Leu Tyr Ala Gln Thr Asn Ser Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Ser
195 200 205
Ser Pro Arg Leu Arg Arg Gln Leu
210 215
<210> 2
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaGIR1_nucleotide sequence
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atggccttag aacaactttt tcaagagcaa atagcagaaa ctacctttga agaacgcaat 60
atttccttag agaagtggaa gacaattgat gataagcttg aagacaatga tctgtctgga 120
ggtttagagt gtaacatatg cctagatatt gtgcatgatc ctgttgttac gttatgcgga 180
cacctctttt gctggccttg catctacaaa tggatacatt ttcagagcat ttcttctgaa 240
aatacctata accagaaacc aaaatgtcct gtttgcaagg ctgaagtctc agagaaaatg 300
ttgattccac tctatggtcg cggtcaagca acaaaatcat ctgaaggcaa ggccccgaat 360
cttggtataa tcataccaca aaggcctcct agtccgagat gtggggggaa aacgttggta 420
gaaactaata attcatatcc atcccagcaa cttcaccatc aaaattatcc acaagagtct 480
ccaacacatc aaacgtatac aacagaacct atgttaagcc ccggtggcac gacaacaggg 540
ggaattgttt attcacggat gtttgggaat tcatcaacta ctttatatgc acaaacaaac 600
tcatataatc tagcagccag cagtagtcca aggttaagaa ggcaactata a 651
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<220>
<223> CaGIR1-CDS_cloning primer_FW
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaACT1_qRT-PCR primer_FW
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gacgtgacct aactgataac ctgat 25
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<223> CaACT1_qRT-PCR primer_RV
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ctctcagcac caatggtaat aactt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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caactatgtt ctcaggtatt gcaga 25
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<212> DNA
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<223> AtActin8_qRT-PCR primer_RV
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gtcatggaaa cgatgtctct ttagt 25
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acatggaaat cggagttaca gatag 25
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<223> RAB18_qRT-PCR primer_FW
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ggaagaaggg aataacacaa aagat 25
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<223> HAB1_qRT-PCR primer_RV
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tcaggttctg gtcttgaact ttcttt 26
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물로서,
상기 발현 억제제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1 단백질을 코딩하는 유전자의 cDNA를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터인 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaGIR1(Capsicum annuum CaGRAS Interacting RING-type E3 ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법.
- 제8항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
- 제9항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220040806A KR102555522B1 (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | CaGIR1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220040806A KR102555522B1 (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | CaGIR1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
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| KR102555522B1 true KR102555522B1 (ko) | 2023-07-13 |
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ID=87160387
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220040806A KR102555522B1 (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | CaGIR1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
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Citations (4)
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| KR20180039212A (ko) * | 2016-10-07 | 2018-04-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 E3 ligase CaREL1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| KR20180039211A (ko) * | 2016-10-07 | 2018-04-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 E3 ligase CaDSR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| KR20180093477A (ko) * | 2017-02-13 | 2018-08-22 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| KR101918590B1 (ko) * | 2016-10-26 | 2018-11-14 | 연세대학교 산학협력단 | 식물의 가뭄 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 |
-
2022
- 2022-03-31 KR KR1020220040806A patent/KR102555522B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (3)
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| NCBI GenBank Accession No. KAF3615421 (2020. 3. 30.)* * |
| NCBI GenBank Accession No. XM_016700682 (2016. 5. 5.)* * |
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