KR101926961B1 - 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1)에 관한 것으로서, 상기 유전자 및 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진 시키는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaDIR1에 관한 것으로서, 상기 CaDIR1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산 (ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따라 CaDIR1 단백질을 침묵 (Knockdown)시킴으로써, 식물체의 건조 저항성이 현저히 증진되는바, 상기 CaDIR1의 발현조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물을 개량하여 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to drought stress using pepper RING Finger E3 ligase CaDIR1 in plants}

본 발명은 고추 유래 신규 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 고착성을 갖기 때문에, 지속적으로 빛, 극단적인 온도 및 수분 스트레스 등의 다양한 스트레스 환경에 노출되고, 이 중 토양의 물 부족은 전 세계적으로 작물의 수확량 및 농산물 품질의 영향을 끼친다. 식물들은 증산 수분손실을 감소시키기 위한 기공개도의 조절 및 이온 수송 변경을 통해서 수분 스트레스의 불리한 효과를 덜어왔다.

한편, 식물 방어기작 중에 핵심인 앱시스산 (abscisic acid; ABA)은 건조 스트레스의 반응에서 특히 중요한 역할을 한다. 예컨대, 식물이 건조 스트레스에 노출되면, 식물은 잎에서 ABA 생합성을 증가 및 축적시킴으로써 방어 반응의 신호 전달을 시작한다. 식물 보호 메카니즘을 포함하는 대부분의 스트레스 연관 유전자들은 ABA에 의해 조절되기 때문에 ABA- 및 건조-신호전달 경로는 지속적으로 연구되어 왔으나, 이러한 특정 메카니즘은 여전히 명확하게 규명되지는 못하였다.

한편, 26S 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 진핵 세포에서 공통된 단백질 변형 메카니즘이다. 식물에서의 유비퀴틴화는 전사 인자, 호르몬 수용체 및 손상된 단백질과 같은 대상의 다양한 세포내 신호 프로세스에 필수적이다. 유비퀴틴화는 E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3 (ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다. E3 리가아제는 다수의 다중 이성체를 가지고 있으며, 표적 단백질의 특성을 결정한다. 상기 E3 리가아제는 구조적 도메인이 단일 혹은 다중 서브유닛이 포함되는지에 따라 두 종류의 슈퍼패밀리로 구분된다. 이 때, 슈퍼패밀리 중 하나는, Really Interesting New Gene (RING), Homology to E6-AP Carboxyl Terminus (HECT) 및 U-box E3 리가아제로 구성되고, 다른 하나는, CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1 (CUL4-DDB1), Anaphase Promoting Complex (APC) 및 Skp1-Cullin-Fbox (SCF) E3 리가아제로 구성된다.

한편, 애기장대의 게놈은 1,400개 이상의 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있으며, 상기 E3 유비퀴틴 리가아제는 RING 도메인의 유형에 따라 여덟 개의 서브 그룹으로 세분화된 E3 U-box 리가아제를 포함하는 약 477개의 RING finger 도메인을 포함한다. 하지만, 현재까지는 단지 몇 종류의 RING type E3 리가아제의 정확한 기능만이 밝혀져 있는 실정(한국 등록 특허 10-1335440)이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 고추에서 건조 민감성 RING finger 단백질 유전자인 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaDIR1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaDIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체, 상기 식물체의 일부 (특히, 종자) 및/또는 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaDIR1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaDIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자를 제공한다.

본 발명은 상기 CaDIR1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 CaDIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 CaDIR1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 CaDIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명은 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaDIR1에 관한 것으로서, 상기 CaDIR1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산 (ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 CaDIR1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 CaDIR1 단백질 및 다른 식물종의 단백질 간의 아미노산 서열을 비교한 결과이며, 도 1b는, C3HC4 type RING finger 도메인의 다중 서열 정렬 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, CaDIR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여 CaDIR1-GFP 융합단백질의 형광신호를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 3은, CaDIR1 단백질의 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, ABA, 건조 및 고염 스트레스 조건에서, CaDIR1 발현량의 변화를 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는, TRV:CaDIR1 삽입에 의해 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 (TRV:CaDIR1) 및 빈벡터 (TRV:00)가 삽입된 대조군 간의 전사 축적량을 비교한 결과이다.
도 6은, 건조 스트레스 조건에서, CaDIR1 유전자가 침묵된 식물 (CaDIR1-silenced) 및 대조군 (야생형, WT) 식물의 (A) 건조 표현형, (B) 생존율 (C) 잎 생중량, (D) 잎 온도, 및 (G) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 7은, CaDIR1 과발현 식물 (CaDIR1-OX) 및 대조군 (야생형, WT) 식물의 RT-PCR 분석을 수행하여, CaDIR1 발현량을 확인한 결과이며, Actin8은 내부 통제 유전자로 사용되었다.
도 8은, ABA 처리 조건에서, CaDIR1 과발현 식물 (CaDIR1-OX) 및 대조군 (야생형, WT) 식물의 (A) 발아율, (B), (C), (D), (E) 입모율, (F), (G) 뿌리 성장을 비교한 결과이다.
도 9는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서, CaDIR1 과발현 식물 (CaDIR1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물 간에, (A) 기공개도, (B) 잎 온도, (C) 잎 생중량, (D) 건조 표현형, 및 (E) 표현형을 비교한 결과이다.
도 10은, CaDIR1-OX 식물에 나타난 건조-내성 표현형과 이와 관련된 유전자 간의 상관관계를 확인하기 위하여, NCED3, DREB2A, RD29B, RD20, RD26 및 RAB18의 발현량을 qRT-PCR로 비교한 결과이다.

본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 음성 조절자로 기능하는 CaDIR1 유전자를 동정하였으며, 상기 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 내성 증가, CaDIR1 유전자가 과발현 (CaDIR1-OX)된 형질전환 애기장대에서 ABA 민감도 감소, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaDIR1 (Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 CaDIR1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaDIR1은 고추로부터 분리하였으며, 상기 CaDIR1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaDIR1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 “음성 조절인자 (negative regulator) 단백질”이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaDIR1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaDIR1 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, E3 리가아제 단백질인 CaDIR1을 동정하였고 (실시예 2 참조), 앱시스산 (ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaDIR1 유전자 간의 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, CaDIR1 유전자를 분리하고, CaDIR1 단백질과 다른 식물종간 아미노산 서열의 상동성을 확인하였다 (실시예 2 참조). 또한, 35S:CaDIR1-GFP 융합단백질을 이용하여 CaDIR1 단백질이 핵 및 세포질에 위치함을 확인하였다 (실시예 3 참조). 또한, 35S:CaDIR1-GFP 융합단백질을 이용하여 CaDIR1 단백질의 E3 ligase 활성 및 유비퀴틴 기능을 확인하였다 (실시예 4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 비생물적 스트레스 (ABA, 건조 또는 염) 처리된 CaDIR1 유전자의 발현 양상을 확인하였으며, 그 결과, CaDIR1 유전자는 ABA-신호 및 건조 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 확인하였다 (실시예 5 참조)

본 발명의 또 다른 실시예에서는, VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 기법으로 CaDIR1 유전자 침묵시킨 고추 식물의 경우, ABA에 대한 과민성 (hypersensitivity)에 의하여 기공이 차단하여 증산률이 억제되고, 결과적으로 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시킴을 확인하였다 (실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 애기장대에서 CaDIR1 유전자를 과발현시킨 결과, 발아기, 유묘기 단계에서 ABA에 대한 민감도가 감소한다는 사실을 확인함으로써, CaDIR1이 건조 상황에서 잎의 수분 손실을 억제함으로써 ABA 신호전달의 음성 조절자 역할을 수행한다는 사실을 규명하였다 (실시예 7 참조). 또한, 애기장대에서 CaDIR1 유전자를 과발현시켜, 건조 스트레스에 대한 반응을 변화시키는지 확인한 결과, CaDIR1 유전자의 발현이 ABA 합성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 건조 스트레스에 대한 반응을 조절한다는 것을 확인하였다. (실시예 8 참조)

따라서, CaDIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaDIR1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 CaDIR1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), 리보자임 (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaDIR1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드 (Peptide), 펩티드 미메틱스 (Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머 (aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, CaDIR1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 CaDIR1 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF (open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 현상인 VIGS (virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵 (virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵 (VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.

본 발명에서는, CaDIR1의 ORF 영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaDIR1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.

본 발명에서 상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체 및/또는 이의 종자를 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaDIR1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 CaDIR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., Nockwang) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 5 : 3 : 2, v/v/v)를 파종하였다. 이후, 식물은 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 80 μ㏖ photons m^-2s^{- 1} 로 하여 빛을 비추고, 16 시간 낮/8 시간 밤 사이클의 27 ± 1 ℃ 생육실에서 성장시켰다. 애기장대 (Arabidopsis thalinana: ecotype Col-0) 종자는 0.5 % 수크로오스 및 Microagar (Duchefa Biochemiem, Haarlem, The Netherlands)가 보충된 MS (Murashige 및 Skoog) salt에서 발아시켜, 24 ℃로 설정한 챔버 하에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토에서 24℃ 온도, 60% 습도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등 (130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다.

1-2. 서열 정렬 (Sequence alignment)

CaDIR1로 암호화된 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) web server는 RING finger를 식별하는데 사용하였다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다.

1-3. 세포 내 위치 분석 (Subcellular localization analysis)

정지 코돈이 없는 전장 CaDIR1 cDNA를 p326GFP binary vector에 삽입 하였다. 35S:CaDIR1-GFP 구조체를 갖는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 균주 p19와 1 : 1 의 비율로 혼합 (OD₆₀₀ = 0.5)한 후, 완전히 성장한 4 주된 담배 (N. benthamiana) 식물체에 침투시켰다. GFP 신호는 LSM Image Browser 소프트웨어가 설치된 공초점 현미경 (510 UV/Vis Meta, Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

1-4. ABA 및 건조 스트레스 처리

고추 및 애기장대 식물에서 CaDIR1 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위하여, ABA 및 건조 스트레스 처리를 진행하였다. 보다 구체적으로, 발아 분석, 발아율, 뿌리 신장 및 입모율을 측정하기 위해, 유전자형 당 각각 100개의 종자를 4 ℃에서 3일 동안 춘화시키고 다양한 ABA 농도가 보충된 MS 아가 (agar) 배지 상에 파종하였다. 발아 후 분석을 위해, ABA가 없는 5 일 된 대조군 (야생형) 및 CaDIR1-OX (과발현, overexpression) 모종을 10 μM ABA가 보충된 MS 배지로 옮긴 뒤, 7 일 후, 모종의 뿌리 길이를 측정하였다. 건조 스트레스 처리는 10 일 된 대조군 (야생형) 및 CaDIR1-OX 모종을 무작위로 심은 후, 10 일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주고, 회복되도록 1 일 동안 다시 식물체에 물을 주었다. 로제트 잎에서 생기는 수분 손실을 평가하기 위해 3 주된 식물에서 30 개의 잎을 떼어 내고, 페트리 접시에 두었다. 접시를 상대 습도 40% 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였다.

1-5. Virus-induced gene silencing (VIGS)

고추에서 CaDIR1 유전자를 침묵 (Knokdown) 시키기 위해서 담배얼룩바이러스 (tabacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS 시스템을 이용하였다. 보다 구체적으로, CaDIR1 cDNA의 N-말단 영역 (201 내지 434 bp)을 pTRV2 벡터에 삽입하였다. 음성 조절로서 pTRV1, pTRV2:00 및 pTRV:CaDIR1를 운반하는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 고추 식물의 완전히 자란 자엽에 침투시켰다 (OD₆₀₀ = 0.4).

1-6. CaDIR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

전장 CaDIR1 cDNA를 pENTR/D-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하였다. LR 반응을 거쳐, CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절 하에 복제된 유전자는 본질적으로 각 유전자를 발현하기 위해서 pK2GW7에 도입되었다. 보다 구체적으로 35S:CaDIR1 구조를 전기천공법에 의해 아그로박테리움 균주 GV3101에 도입하였다. 본 발명에서 이용된 모든 돌연변이는 Col-0을 기반으로 한 것으로, floral dip method는 CaDIR1 유전자로 애기장대를 형질전환하는 것에 이용되었다 (Clough & Bent, Plant Journal 16, 735-743, 1998). 형질전환 식물의 계통은 추정 변이 종자를 kanamycin 50 ㎍·㎖^-1 이 첨가된 MS 배지에서 발아시킴으로써 선택되었다.

1-7. 기공개도 (Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도 생물학적 검정을 위해, 4 주된 고추 식물 잎과 5 주된 애기장대 식물의 잎에서 채집된 잎의 껍질을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액 (stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 μM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3 시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 다양한 농도의 ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하고, 잎 껍질을 추가로 3 시간 동안 더 배양하였다. 이후 각각의 개별 샘플에서 기공을 측정하였으며, 100개의 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경을 이용하여 무작위로 관찰하였다. 각 기공의 그 넓이와 길이는 Image J 1.46r을 이용해 기록되었다.

1-8. 열 영상법 (Thermal imaging)

잎의 온도를 측정하기 위해 4 주된 고추 식물 및 완전히 확장된 잎을 가진 5 주된 애기장대 식물을 50 μM ABA로 처리하였다. 열 영상은 적외선 카메라 (FLIR systems; T420)를 이용하여 얻었으며 식물의 잎 온도는 FLIR Tools + ver 5.2 소프트웨어로 측정하였다.

1-9. RNA 분리 및 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)

건조 스트레스를 주거나 ABA를 처리한 애기장대 및 고추 식물의 잎으로부터 총 RNA를 분리하여 qRT-PCR을 실시하였다. 고추 및 애기장대 식물의 잎 조직으로부터 RNeasy Mini 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 모든 분리된 RNA 샘플은 유전체 DNA를 제거하기 위해 RNA-free DNase를 이용해 용해시켰고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 총 RNA (1 ㎍)를 사용하여 cDNA를 합성 하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 Ex-taq (Takara Bio, Shiga, Japan), iQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 하기 표 1에 나타낸 특이적 프라이머와 함께 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 고추 액틴 1 유전자 (CaACT1) 및 애기장대 액틴 8 유전자 (Actin8)는 각각 고추 및 애기장대 유전자 발현량의 정규화를 위해 사용되었다.

Primer name	Primer sequence (5’-3’)
For cloning CaDIR1	Forward: ATGACGAATCAAGTAGTGAAGGTGAA
	Reverse: TCAAGAAGCCGGAATGCCTG
For RT-PCR CaDIR1	Forward: TGACGAATCAAGTAGTGAAGGTGAAGA
	Reverse: TGAAGGCACAATTTCAAGTGCATT
CaACT1	Forward: GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT
	Reverse: CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT
Actin8	Forward: CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA
	Reverse: GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT
RD20	Forward: TGGTTTCCTATCTAAAGAAGCTGTG
	Reverse: ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA
RD26	Forward: AGGTCTTAATCCAATTCCAGAGCTA
	Reverse: ACCCATCAGTAACTTCACATCTCTC
RD29B	Forward: GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG
	Reverse: ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA
DREB2A	Forward: CTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC
	Reverse: AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC
NCED3	Forward: ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG
	Reverse: AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC
RAB18	Forward: GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT
	Reverse: GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA
COR47	Forward: ACAGAGGTTACGGATCGTGGA
	Reverse: ACTCGAGCGTCGTTGTCTCTT
ERD10	Forward: TCATCGGCGCCAGAGATTAA
	Reverse: GCCACAAACGACTCTGGTTCA
LTI30	Forward: TCAAACCGGAGTGCAAAAGAAG
	Reverse: CGGTACCAGTAGCACCATGATG

1-10. 통계적 분석

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student’s t-test 또는 ANOVA (Fisher’s LSD test)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. CaDIR1 유전자 분리 및 서열 분석

새로운 건조-유도 고추 전사 인자를 분리하기 위해서, 앱시스산 (ascisic acid; ABA)으로 처리된 고추 잎을 이용하여 RNA-seq 분석을 수행하였고, 건조 스트레스에 의해 유발되는 후보 인자를 분리하여, CaDIR1 유전자를 분리하였다. 상기 CaDIR1 유전자는 1293-bp의 핵산 잔기를 포함하고, 430개의 아미노산 잔기를 인코딩하며, 9.36 등전점 (pI; isoelectric point) 및 47.9 kDa의 분자량을 갖는 것으로 추정되었다. ubiquitin-26S proteasome system에서 E3 ligase에 필수적인 C3HC4 type RING finger 모티프는 CaDIR1의 N-말단 부위에 위치함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-2에 따라, 아미노산 서열 정렬 (Sequence alignment)을 실시한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, CaDIR1 단백질은 다른 RING type E3 ligase과 높은 상동성 (87.0 내지 87.9 %)을 가지는 것을 확인하였으며, 도 1b에 나타낸 바와 같이, CaDIR1 단백질은 RING finger motif를 포함하고 있으며, RING finger motif 단백질과 높은 상동성을 (90.3 내지 93.7 %) 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3. CaDIR1 단백질의 세포 내 작용 위치 및 E3 리가아제 활성 확인

상기 실시예 1-3 기재된 방법에 따라, CaDIR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaDIR1 coding region을 형광단백질인 Green Fluorescent protein (GFP)을 결합시켜 35S promoter 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 보다 구체적으로 녹색 형광단백질 (GFP) (35S:CaDIR1-GFP)의 융합단백질을 담배 (N. benthamiana) 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 담배 (N. benthamiana)의 표피 세포 (epidermal cell)에 있는 35S:CaDIR1-GFP 융합단백질이 핵과 세포질 내에서 GFP 신호를 만들었으며, 따라서 35S:CaDIR1-GFP 단백질의 발현 분석 결과, CaDIR1-GFP 융합단백질이 핵에 위치하는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, Fibrillarin-RFP 융합단백질에 대한 4`,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 적색 형광 신호에 대한 청색 형광 신호가 각각 핵과 핵에서 검출되었다. 상기 결과는 CaDIR1 단백질이 핵 내에서 위치하며 기능하는 것을 의미하여, CaDIR1 단백질은 핵과 세포질을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 확인하였다.

실시예 4. CaDIR1의 E3 ligase 활성 및 유비퀴틴 기능 확인

RING finger motif를 포함하는 E3 ligases는 생체 내에서 self-ubiquitination 활성을 나타내기 때문에, CaDIR1 단백질이 E3 ligase로 기능하는지 확인하기 위해 in vivo ubiquitination assay를 수행하였다. 35S:GFP 및 35S:CaDIR1-GFP 융합단백질을 담배 (N. benthamiana) 잎에서 발현시켜, GFP-표지된 단백질을 정제하고, 정재된 융합단백질을 anti-GFP 및 anti-ubiquitin 항체를 사용하여 검출하였다. CaDIR1-GFP 융합단백질은 면역 블롯법을 통해 유비퀴틴화 여부를 확인하였으며, CaDIR1-GFP 발현 식물 세포에서 E3 ligase 활성을 나타내어, CaDIR1이 E3 ubiquitin ligase로 작용함을 알 수 있었다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CaDIR1 단백질은 E3 리가아제 활성을 나타내었다.

실시예 5. 비생물적 스트레스에 대한 CaDIR1 유전자의 발현 양상 확인

식물 호르몬인 앱시스산 (ABA)은 이미 식물의 환경적 스트레스 및 신호 전달 경로에 연관된 방어 관련 호르몬으로 알려져있다. CaDIR1이 ABA 및 비생물적 스트레스에 유도되는지를 확인하고자, 상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따라, CaDIR1의 발현 수준을 ABA, 건조 및 고염이 처리된 6엽 고추 잎에서 수확한 잎을 사용하여 qRT-PCR 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 2 내지 24 시간 후, CaDIR1 발현이 억제되었다. 또한, 건조 처리 2 시간 후, CaDIR1 발현은 약하게 유도되었다. 그러나 고염 (NaCl) 처리된 고추 잎에서는 CaDIR1 발현을 유도하지 못하였다. 상기 결과로부터, CaDIR1이 ABA-신호 및 건조 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 확인하였다.

실시예 6. CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물에서 건조 저항성 증가 확인

비생물적 스트레스에 대한 반응에서 CaDIR1 유전자의 역할을 알아보기 위하여, 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라, TRV (tabacco rattle virus) vector를 이용한 VIGS (virus-induced gene silencing) 기반 CaDIR1 형질체 유전자 기능 손실 분석을 실시하였다. CaDIR1의 생체 내 기능을 조사하기 위해, semi-quantitative RT-PCR 분석한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CaDIR1 유전자가 대조 식물 (TRV:00)보다 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물 (TRV:CaDIR1) 에서 발현이 감소됨을 확인하였다.

상기 내용을 바탕으로 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물과 대조군의 건조 저항성을 비교하였다. 우선, 표현형 분석에서, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 CaDIR1 유전자 침묵된 식물간에 표현형 차이가 없음을 관찰하였다. 그러나 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물을 사용하여, 10 일 동안 급수를 제한하고 2 일 동안 재급수함으로써 건조 스트레스에 대한 CaDIR1의 기능을 확인한 결과, 대조 식물은 CaDIR1 유전자가 침묵된 식물보다 더 시들어진 표현형을 나타내었다(도 6A).

다음으로, 물주기를 재개한 후, 각각의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 재급수 후 CaDIR1 유전자가 침묵된 식물의 생존율은 83 % 였고, 대조군 식물의 생존율은 약 41 %를 나타내었다. 상기 결과로부터, CaDIR1 유전자 발현의 억제가 건조 내성을 강화시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 6B).

다음으로, CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물의 건조-내성 표현형이 증가한 수분 보유량에 기인한 것인지 알아보기 위하여, 대조군 및 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물에서 떼어낸 잎의 생중량 (fresh weight)를 측정하여 증산 수분손실률 (transpiration water loss)를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 잎의 수분 손실량이 대조군 (69 %) 식물보다 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물 (75 %) 에서 비교적 낮게 나타남을 확인할 수 있었다(도 6C).

한편, 기공이 열리면, 증산률이 증가하여, 잎의 온도를 떨어뜨리는바, CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물의 낮은 증산률이 기공개도 (stomatal aperture) 감소에 의한 것인지 확인하기 위해서, 대조군 및 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물에 ABA를 처리한 후, 잎의 온도 및 기공 크기를 관찰하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물의 잎 온도는 대조군의 잎 온도보다 높았으며(도 6D), 또한, 기공개도가 대조군에 비해 더 작은 것을 확인하였으며, 이는 잎의 온도와 연관됨을 확인할 수 있었다(도 6E).

실시예 7. CaDIR1 과발현 (CaDIR1-OX) 식물의 ABA 저감수성 (hyposensitivity) 확인

상시 실시예 6에 기재한 바와 같이, CaDIR1 유전자 침묵된 고추 식물은 건조 스트레스에 강한 표현형을 나타냈다. CaDIR1 유전자의 in vivo에서 기능을 더욱 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-6에 기재된 방법에 따라 항시발현 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 CaDIR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하고, 두 개의 독립된 T₃ 동형 라인 (CaDIR1-OX)을 얻었고, 이를 표현형 분석을 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

다음으로, CaDIR1 과발현 (CaDIR1-OX) 식물을 사용하여, ABA 신호 전달에 CaDIR1이 관여한다는 것을 밝히기 위해 germinative 및 post-germinative 단계에서 CaDIR1-OX 식물의 표현형 분석을 비교하였다. 보다 구체적으로, 다양한 농도 (0, 0.75 및 1.0 μM)의 ABA를 보충한 Murashige and Skoog (MS) 성장 배지에서 종자를 발아시켜 CaDIR1-OX 및 대조군(야생형) 식물의 발아율을 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 경우 대조군과 CaDIR1-OX 종자간에 발아율에 유의한 차이가 없었으며, ABA의 존재 하에서, CaDIR1-OX 종자의 발아율은 야생 종자의 발아율보다 현저히 낮았다(도 8A).

한편, 유모기 (seedling stage)에서 ABA에 대한 반응을 분석하기 위해서, ABA에서 입모율을 측정하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 발아율의 결과와 일치하는 결과로서 입모율은 대조군 식물에서보다 CaDIR1-OX 식물에서 현저히 낮았다(도 8B 내지 도 8E).

추가적으로 ABA의 농도별 처리에 따른 CaDIR1-OX 식물 및 대조군 식물의 1차 뿌리 성장 (primary root growth)을 비교하였다. 발아 5 일된 모종을 신선한 MS 배지에 처리한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 두 식물에서 형태의 유의적인 차이를 발견할 수 없었으나, 10 μM의 ABA를 처리한 경우, 대조군 식물에 비해서 CaDIR1-OX 식물의 뿌리 길이가 더 길게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 8F 및 도 8G).

또한, 상기 실시예 1-7 및 실시예 1-8에 기재된 방법에 따라, 대조군 식물 및 CaDIR1-OX 식물을 성장시킨 후, ABA를 처리하여 기공개도 및 잎 온도를 측정하였다. ABA를 처리하지 않은 경우, 대조군 및 CaDIR1-OX 식물 간에 기공개구 또는 잎 온도에 유의한 표현형 차이가 없음을 확인하였다. 그러나 도 9에 나타낸 바와 같이, 20 μM ABA에 노출시킨 결과, CaDIR1-OX 식물의 기공개구는 대조군 식물보다 유의하게 큰 것을 확인하였다(도 9A). 또한, 50 μM ABA에 노출시킨 결과, CaDIR1-OX 식물의 잎 온도는 대조군 식물의 잎 온도보다 유의하게 낮았다(도 9B). 상기 결과로부터, CaDIR1-OX 식물에 의해 표시된 변화된 ABA 민감도가 성장 단계에 의존한다는 것을 확인하였다.

실시예 8. CaDIR1 과발현 ( CaDIR1 -OX) 식물의 감소된 건조 내성 확인

상기 실시예 6의 CaDIR1 유전자가 침묵된 고추 식물은 건조-내성 표현형을 나타내었으며, 상기 실시예 7의 CaDIR1 유전자 과발현 식물은 ABA에 대한 감소된 민감도를 나타냄을 확인하였는바, 이에, CaDIR1 유전자의 과발현이 건조 스트레스에 대한 반응을 변화시키는지를 확인하였다. 우선, CaDIR1-OX 식물에 의해 나타난 ABA-감수성 표현형이 수분 손실률 감소에 의한 것인지 확인하기 위해서, CaDIR1-OX 식물 및 대조군 식물의 잎의 생중량 (fresh weight)을 확인하여 두 식물 간의 증산률을 비교하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하였을 때, 대조군 식물에 비해서, CaDIR1-OX 식물의 잎 조직에서 수분 손실이 더 높게 나타남을 확인할 수 있었다(도 9C).

또한, 건조 내성에 대한 CaDIR1 과발현의 영향을 조사하기 위해, 건조 스트레스에 대한 반응으로 대조군 및 CaDIR1-OX 식물의 표현형 분석을 수행했다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 충분한 물 조건하에서 대조군 및 CaDIR1-OX 식물의 표현형을 비교한 결과, 두 식물체 간 표현형 차이를 발견하지 못하였다(도 9D 좌측). 그러나, 10 일 동안 급수를 중단하고 1 일 동안 다시 급수하여, 식물을 건조 스트레스에 노출 시켰을 때 CaDIR1-OX 식물이 대조군 식물보다 더 많은 표현형을 나타내었다(도 9D 중간 및 우측).

또한, 식물에 다시 물을 공급한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군 식물의 100 %가 다시 생존한 반면, CaDIR1-OX 식물의 31 내지 43 % 만 다시 생존하였다. 상기 결과는 CaDIR1-OX 식물의 수분 보유 능력 감소가 ABA 저 감수성에서 유래하였으며, 이는 건조 스트레스에 민감한 표현형에 기여한다는 것을 의미한다(도 9E).

한편, 건조 유도성 유전자 발현이 CaDIR1에 의한 직접 또는 간접적으로 조절되는지 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-9에 기재된 방법에 따라, CaDIR1-OX 식물 및 대조군 식물에 탈수 처리 후 건조-내성 관련 유전자 NCED3, DREB2A, RD29B, RD20, RD26 및 RAB18에 특이적인 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. 그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 탈수 처리 6 시간 후에, ABA 합성과 관련된 NCED3, DREB2A, RD29B, RD20, RD26 및 RAB18을 비롯한 스트레스 반응 유전자의 발현 수준이 대조군 식물의 잎보다 CaDIR1-OX 식물의 잎에서 유의하게 높은 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, CaDIR1 유전자의 발현이 ABA 합성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 건조 스트레스에 대한 반응을 조절한다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using pepper RING Finger E3 ligase CaDIR1 in plants <130> MP17-034 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1293 <212> DNA <213> Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1 - CaDIR1 <400> 1 atgacgaatc aagtagtgaa ggtgaagagg agaacgattg cggcatgcat gacatgccca 60 atttgccata aactcttcag agatgccacc actatttccg agtgtcttca tacgttttgc 120 aggaaatgca tctacaagaa gctgtctggt gaagaaacag aatgctgtcc aatttgcaat 180 attgacttgg gatgtgttcc tctagagaaa ctgaggccag atcataatct gcaagatgtg 240 agagcaaagg tattccctta taagaggcga aaggtgaatg cacttgaaat tgtgccttca 300 gttgcattgc cagtaaggag aaaggagaga tcactctcat cacttgtggt ctgcactcca 360 agagtatcta cacaaactgg aatgacagga agaagatcaa aatcggtggc aagaaaatca 420 ttacagggtt cgaccttttc aattgagaaa actcccaaga aagaagacgg ttctggggaa 480 gatcagttgg atggctctag ctcacctgaa acttcgaaca agctcactca gaatataagg 540 ctgaattctt ccagtactga gccttctagc caccctacac cggataaaga aactgagaat 600 ggcagtgaac agtgggatgg taaagttgat ttgtggaagc ctttaaattg tttggtggaa 660 gcagcaaaca ggagcaaatc ttcgaggttt acatcacagg gttctactgt taagtcagaa 720 ggtctgtatt cccatgaccg tgagggtcat gtccgtaaaa ctaaagtcaa acaaaatgga 780 cagaaattga agatcaagga tgacaataat ggtgatcctg cttctccaga ttttgataaa 840 cctaaaaagt cgcgtagaat ttgcaaaaaa aaggcatcag cttttggaga gtttaatatt 900 tcaccgcaaa ctgtactgga tggaaccact gccagatgtg aaaggagaat ctatccaata 960 tggttctcat tggcagcgtc ggaagaccag gagggagatg cacctttgcc acagatttct 1020 gcaagttact tgagaataaa ggacggtaat attccagttt cttttatcca aaaatacctg 1080 atgcggaagt tggatcttaa aagcgaagat gaggttgaga ttagatgtat gggccaatca 1140 gtaatcccca gtttaccact gaacagtttg attgatatgt ggcttcaaac tactacatcg 1200 gaaagaatat cagcaattat tggttcatca gcaaaggatt ttgttatggg gttagcttat 1260 gctcgaagga taccaggcat tccggcttct tga 1293 <210> 2 <211> 430 <212> PRT <213> Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1 - CaDIR1 <400> 2 Met Thr Asn Gln Val Val Lys Val Lys Arg Arg Thr Ile Ala Ala Cys 1 5 10 15 Met Thr Cys Pro Ile Cys His Lys Leu Phe Arg Asp Ala Thr Thr Ile 20 25 30 Ser Glu Cys Leu His Thr Phe Cys Arg Lys Cys Ile Tyr Lys Lys Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Glu Thr Glu Cys Cys Pro Ile Cys Asn Ile Asp Leu Gly 50 55 60 Cys Val Pro Leu Glu Lys Leu Arg Pro Asp His Asn Leu Gln Asp Val 65 70 75 80 Arg Ala Lys Val Phe Pro Tyr Lys Arg Arg Lys Val Asn Ala Leu Glu 85 90 95 Ile Val Pro Ser Val Ala Leu Pro Val Arg Arg Lys Glu Arg Ser Leu 100 105 110 Ser Ser Leu Val Val Cys Thr Pro Arg Val Ser Thr Gln Thr Gly Met 115 120 125 Thr Gly Arg Arg Ser Lys Ser Val Ala Arg Lys Ser Leu Gln Gly Ser 130 135 140 Thr Phe Ser Ile Glu Lys Thr Pro Lys Lys Glu Asp Gly Ser Gly Glu 145 150 155 160 Asp Gln Leu Asp Gly Ser Ser Ser Pro Glu Thr Ser Asn Lys Leu Thr 165 170 175 Gln Asn Ile Arg Leu Asn Ser Ser Ser Thr Glu Pro Ser Ser His Pro 180 185 190 Thr Pro Asp Lys Glu Thr Glu Asn Gly Ser Glu Gln Trp Asp Gly Lys 195 200 205 Val Asp Leu Trp Lys Pro Leu Asn Cys Leu Val Glu Ala Ala Asn Arg 210 215 220 Ser Lys Ser Ser Arg Phe Thr Ser Gln Gly Ser Thr Val Lys Ser Glu 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ser His Asp Arg Glu Gly His Val Arg Lys Thr Lys Val 245 250 255 Lys Gln Asn Gly Gln Lys Leu Lys Ile Lys Asp Asp Asn Asn Gly Asp 260 265 270 Pro Ala Ser Pro Asp Phe Asp Lys Pro Lys Lys Ser Arg Arg Ile Cys 275 280 285 Lys Lys Lys Ala Ser Ala Phe Gly Glu Phe Asn Ile Ser Pro Gln Thr 290 295 300 Val Leu Asp Gly Thr Thr Ala Arg Cys Glu Arg Arg Ile Tyr Pro Ile 305 310 315 320 Trp Phe Ser Leu Ala Ala Ser Glu Asp Gln Glu Gly Asp Ala Pro Leu 325 330 335 Pro Gln Ile Ser Ala Ser Tyr Leu Arg Ile Lys Asp Gly Asn Ile Pro 340 345 350 Val Ser Phe Ile Gln Lys Tyr Leu Met Arg Lys Leu Asp Leu Lys Ser 355 360 365 Glu Asp Glu Val Glu Ile Arg Cys Met Gly Gln Ser Val Ile Pro Ser 370 375 380 Leu Pro Leu Asn Ser Leu Ile Asp Met Trp Leu Gln Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Glu Arg Ile Ser Ala Ile Ile Gly Ser Ser Ala Lys Asp Phe Val Met 405 410 415 Gly Leu Ala Tyr Ala Arg Arg Ile Pro Gly Ile Pro Ala Ser 420 425 430

Claims (8)

1. 삭제
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3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. CaDIR1(Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법으로서, 상기 CaDIR1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법.
   
7. 제6항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체.

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