KR101775789B1 - 고추 유래의 건조 저항성 관련 단백질 ｍａｆ1 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 MAF1(CaMAF1) 단백질에 관한 것으로, 앱시스산 신호 전달 및 건조 스트레스에 관여하는 CaMAF1 단백질의 새로운 기능에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자(negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaMAF1에 관한 것으로서, 상기 CaMAF1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산(ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따라 CaMAF1 단백질을 침묵(knockdown)시킬 경우 식물체의 건조 저항성이 현저히 증진되는 효과가 있으므로, CaMAF1의 발현조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용 가능할 것으로 기대된다.

Description

고추 유래의 건조 저항성 관련 단백질 ＭＡＦ1 및 이의 용도{CaMAF1 protein imlicated in drought tolerance and the use thereof}

본 발명은 고추 MAF1(CaMAF1) 단백질에 관한 것으로, 앱시스산 신호 전달 및 건조 스트레스에 관여하는 CaMAF1 단백질의 새로운 기능에 관한 것이다.

식물은 고착성이라는 특징을 가진다. 이러한 특징 때문에 건조(drought), 고염, 병원균과 같은 환경에 지속적으로 노출되며, 건조 상태와 같은 환경 스트레스들은 직접적으로 식물의 성장 및 생산에 해로운 영향을 끼친다. 전 세계적으로 물 부족이 큰 문제가 되고 있으며 사막화가 진행되고 있는 지역도 많다. 이는 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있다. 이에 따라 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우 건조 저항성이 향상된 식물이 이상적이다. 즉, 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 건조한 조건에서의 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

한편, 식물은 가뭄, 염, 추위, 더위, 병충해 등의 다양한 환경적 스트레스에 자주 노출되기 때문에 스트레스의 해로운 효과에 대처하는 생리학적, 생화학적, 분자적 방어 기작을 발전시켜왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid: ABA) 신호 변환 조절은 식물이 상기 스트레스를 극복할 수 있도록 한다. 보고된 바에 의하면, 앱시스산을 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 앱시스산을 생성하지 못하거나, 앱시스산에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이에, 식물체의 건조 저항성 증진방법이 주요한 과제의 대상이 되고 있으며, 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질을 이용하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허 공개번호 10-2010-0040789), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 고추 MAF1(CaMAF1) 단백질이 식물체에서 건조 저항성에 영향을 미친다는 사실을 최초로 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자(negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체, 상기 식물체의 일부(특히, 종자), 및/또는 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaMAF1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자(negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자를 제공한다.

본 발명은 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 CaMAF1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자(negative regulator) 단백질을 코딩하는 신규 유전자 CaMAF1에 관한 것으로서, 상기 CaMAF1이 식물체의 환경 스트레스와 관련하여 중요한 역할을 수행하는 앱시스산(ABA) 신호 전달에서 음성 조절자 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따라 CaMAF1 단백질을 침묵(knockdown)시킬 경우 식물체의 건조 저항성이 현저히 증진되는 효과가 있으므로, CaMAF1의 발현조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 CaMAF1 단백질과 다른 식물종(Solanum lycopersicum, Solanum chacoense, Vitis vinifera, Malus domestica, 및 Arabidopsis thaliana)의 단백질 간의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 2는, 도 1의 아미노산 서열 결과를 바탕으로 계통수 분석을 실시한 결과이다.
도 3은 (A) ABA, (B) 건조 스트레스 (C) 고염(NaCl) 조건에서, CaMAF1 발현량의 변화를 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는, CaMAF1 단백질의 식물 세포내 위치를 확인하기 위하여 CaMAF1-GFP 융합단백질의 형광신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서, TRV:CaMAF1 삽입에 의해 CaMAF1이 침묵된 고추, 및 빈벡터(TRV:00)가 삽입된 대조군간에, (A) 건조 표현형, (B) 생존율, (C) 증산률, (D) 잎 온도 (E) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 6은 ABA 처리 조건에서, CaMAF1 과발현 식물(CaMAF1-OX)과 대조군(야생형, WT) 식물 간에 (A) 발아율, (B)/(C) 자엽 성장, (D) 뿌리 성장 (E) 뿌리 길이를 비교한 결과이다.
도 7은 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서, CaMAF1 과발현 식물(CaMAF1-OX)과 대조군(야생형, WT) 식물 간에, (A) 건조 표현형, (B) 생존률, (C) 증산률, (D) 잎 온도 (E) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 8은, CaMAF1-OX 식물에 나타난 건조-내성 표현형과 이와 관련된 유전자 간의 상관관계를 확인하기 위하여, NCED3, RAB18, RD29A 및 RD29B 유전자의 발현량을 qRT-PCR로 비교한 결과이다.

본 발명자들은, 앱시스산(abscisic acid, 이하 ABA), 건조, 고염 스트레스 조건에서 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자 발현 증가, CaMAF1-침묵된(silenced) 고추에서 건조 스트레스에 대한 내성(저항성) 증가, CaMAF1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대에서 ABA 민감도 감소, 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자(negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaMAF1은 Differential hybridization analysis를 통하여 ABA에 의해 많이 발현되어 고추로부터 분리하였으며, 상기 CaMAF1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaMAF1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "음성 조절인자(negative regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaMAF1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaMAF1 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.

본 발명자들은 비생물적 스트레스에 대한 반응에서 상기 CaMAF1 유전자의 새로운 기능을 밝히기 위해 연구하던 중, CaMAF1 유전자가 앱시스산(abscisic acid: ABA), 건조 및 고염(NaCl) 스트레스에 노출된 고추 잎에서 강하게 유도된다는 사실을 최초로 규명하였으며(실시예 3 참조), 앱시스산의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스 산 또는 건조 스트레스와 CaMAF1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예서는, CaMAF1 유전자를 분리하고, CaMAF1 단백질과 다른 식물종의 MAF1 간 아미노산 서열의 상동성을 확인하였다(실시예 2 참조). 또한, 35S:CaMAF1-GFP 융합단백질을 이용하여 CaMAF1 단백질이 핵 및 세포질에 위치함을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 기법으로 CaMAF1 유전자 침묵시킨 고추 식물의 경우, ABA에 대한 과민성(hypersensitivity)에 의하여 기공이 차단하여 증산률이 억제되고, 결과적으로 건조 스트레스에 대한 내성(저항성)을 매우 증가시킴을 확인하였다(실시예 5 참조). 또한, 애기장대에서 CaMAF1 유전자를 과발현시킨 결과, 발아기, 유묘기 단계에서 ABA에 대한 민감도가 감소한다는 사실을 확인함으로써, CaMAF1가 가뭄 상황을 벗어났을 때 기공을 열어서 생장을 빨리 할 수 있도록 ABA 신호전달의 음성 조절자 역할을 수행한다는 사실을 규명하였다 (실시예 6 참조).

따라서, CaMAF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성(저항성)을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaMAF1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 CaMAF1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaMAF1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaMAF1 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 현상인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사후유전자침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내생유전자가 발현될 때 내생유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.

본 발명에서는, CaMAF1의 ORF 영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaMAF1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.

본 발명에서 상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체 및/또는 이의 종자를 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 CaMAF1 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추(Capsicum annuum L., cv. Hanbyul) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 그리고 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 80 μmol photons m^-2s^{- 1} 로 빛을 비춘 27±1℃ 방에서 성장시켰다. 담배식물은 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 25±1℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 종자는 1% 수크로오스 및 Microagar (Duchefa Biochemie)가 보충된 MS (Murashige and Skoog) salt에서 발아시켜, 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 24℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에서 24℃ 온도, 60% 습도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다. 모든 종자는 챔버에 파종하기 전에 2일 동안 4℃에서 춘화처리(vernalized)를 하였다.

1-2. 서열 정렬(Sequence alignment)

CaMAF1에 대한 추정되는 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다. CaMAF1의 cDNA 클론을 다른 유기체(organism)의 것과 비교하기 위해 수동으로 아미노산 서열 정렬을 조절하였다.

1-4. CaMAF1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

전장 CaMAF1 cDNA(429-bp)를 pK2GW7 binary vector에 삽입하여 애기장대에서 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절하에 CaMAF1 유전자의 상시 발현을 유도하였다. 전기천공법(electroporation)을 통해 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101 내로 CaMAF1 binary vector를 도입하고, CaMAF1 유전자를 가진 애기장대에 floral dip 방법으로 아그로박테리움-매개의 형질전환을 수행하였다. CaMAF1-과발현(ox) 형질전환체의 선택을 위해, 형질전환된 것으로 추정되는 식물로부터 종자를 얻어 Kanamycin 50μg/mL을 함유하는 MS 한천 플레이트상에 플레이팅하였다.

1-5. Virus-induced gene silencing (VIGS)

고추에서 CaMAF1 유전자를 침묵(knockdown) 시키기 위해 담배얼룩바이러스(tobacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS 시스템을 이용하였다. 보다 구체적으로, CaMAF1 cDNA의 1-300 bp 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하여 pTRV2:CaMAF1를 제작하였다. 그리고 pTRV1, pTRV2:00, 및 pTRV2:CaMAF1을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 번질 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 26℃의 생육실에 두었다.

1-6. ABA, 건조 스트레스 및 NaCl 처리

ABA 처리 후의 고추 식물에서 CaMAF1 유전자의 발현 패턴 변화를 확인하기 위해, six-leaf stage의 고추 식물에 100 μM ABA 또는 대조구 용액을 분사하였다. NaCl 및 건조 스트레스 처리를 위해, 고추 식물을 200mM NaCl 용액으로 관개한 후, 상처 나지 않도록 조심스럽게 토양에서 분리하고, 3MM 종이(Whatman, Clifton, UK)위에서 두어 탈수시켰다. 각각의 처리 후 0, 6 및 24시간째에 잎을 회수하고, RNA 분리 및 RT-PCT 분석을 실시하였다. 발아율 및 입모율을 측정하기 위해, 야생형과 CaMAF1 과발현(CaMAF1-OX) 형질전환 애기장대 종자를 4℃에서 2일 동안 층화하고 다양한 ABA가 보충된 0.5×MS 아가 배지 상에 파종하였다. 식물체는 24℃ 온도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다.

3주 된 야생형 및 CaMAF1-OX 형질전환 애기장대를 무작위로 심은 후, 8일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고 회복되도록 2일 동안 다시 식물체에 물을 주었다.

고추 식물의 경우에는, four-leaf stage의 고추 식물에 13일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고, 회복되도록 3일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존률을 계산하였다.

건조 저항성은 증발하는 물 손실량을 측정함으로써 정량적으로 확인하였다. 이를 위해, four-leaf stage의 고추 식물 및 3주 된 애기장대로부터 회수한 잎을 페트리접시(petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리접시를 40% 상대습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-7. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도 생물학적 검정을 위해 3주된 식물체의 로제트 잎에서 잎의 껍질을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 mM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3 시간 배양 후, 상기 용액을 20μM ABA 함유 SOS 용액으로 교체하고, 2.5시간을 더 배양하였다. 이후 각 샘플에서 기공을 측정하였으며, 상기 실험을 각각 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-8. RNA 추출 및 qRT - PCR

총 RNA는 탈수되고, 박테리아 병원체로 감염된 애기장대 잎 조직으로부터 RNeasy Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNA-free DNase로 다이제스트하였다. 분광 광도계로 정량화한 후, 총 RNA 1μg을 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용한 cDNA 합성에 사용하였다. 이와 동시에 역전사효소 없이 cDNA를 합성하여 semi-quantitative RT-PCT을 수행하여 cDNA 샘플에서 genomic DNA의 오염 가능성을 배제시켰다.

qRT-PCR 분석을 위해, 합성한 cDNA는 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 나타낸 특이 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다.

명칭	서열(5'-3')
CaMAF1-F	TCTAGAATGGCGGAAATCGATTCA (서열번호 3)
CaMAF1-R	GGATCCCATCCGTTTGCTTATCT (서열번호 4)

모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분 가열 후, [95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초]를 한 사이클로 하여 45 사이클 반복. 각 유전자의 상대적 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8(Arabidopsis actin8) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

실시예 2. CaMAF1 유전자 분리 및 서열 분석

Differential hybridization 분석으로 앱시스산(abscisic acid, 이하 ABA)을 처리 또는 처리하지 않은 고추 잎으로부터 총 RNA를 추출하였다. ABA를 처리하지 않은 대조군 잎에 비해 ABA를 처리한 잎에서 CaMAF1 유전자 발현이 증가하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, CaMAF1는 429bp ORF(open reading frame)을 포함하고, 219개의 아미노산 잔기를 인코딩하고 있을 것으로 추정되었다. 또한, 실시예 1-2에 따른 아미노산 서열 정렬(Sequence alignment)을 실시한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, CaMAF1이 다른 식물종의 MAF1과 상동성을 가진다는 것을 알 수 있었다. 보다 구체적으로, CaMAF1 단백질(accession no. KT361853)은 Solanum lycopersicum (accession no. NM_001247264.1), Solanum chacoense (accession no. JF439377.1), Vitis vinifera (accession no. XM_002285022.3), Malus domestica (accession no. XM_008353760.1), 및 Arabidopsis thaliana (accession no. NM_103613.2)의 MAF 단백질과 높은 상동성을 가졌다(54.4-96.8%).

이에 더하여, phylogenetic tree analysis을 실시한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 단백질과 높은 상동성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 3. ABA, 건조(drought), 및 고염 처리에 의한 CaMAF1 유전자의 유도

ABA를 처리한 잎으로부터 CaMAF1 유전자를 분리하였는바, CaMAF1이 비생물적 스트레스 신호(abiotic stress signaling)에 관여하는지를 알아보았다.

우선, CaMAF1 유전자 발현과 관련된 abiotic stress 요인들을 결정하기 위하여, 실시예 1-6에 따라 ABA, 건조, 및 고염(NaCl)을 각각 처리한 후, 실시예 1-8에 따른 qRT-PCR 분석을 통해 고추 잎에서 시간대별 CaMAF1 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, differential hybridization screening 결과와 동일하게, ABA 처리 6-12시간 후에 CaMAF1 유전자 발현이 지속적으로 증가하였다(도 3a). 또한, 건조 처리에 의해서는 CaMAF1 유전자 발현이 약간 증가하였고(도 3b), 고염처리의 경우에는, 6시간 이후에는 발현 증가가 없었으나, 24시간 이후에 발현이 증가되었다(도 3c).

상기 결과로부터, CaMAF1이 비생물적 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. CaMAF1 단백질의 세포 내 발현 및 작용 위치 확인

CaMAF1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaMAF1 전장 cDNA의 C-말단에 형광단백질인 Green flourescent protein (GFP)을 결합시켜 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 일시 발현을 위해서, 상기 CaMAF1-GFP가 삽입된 벡터를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을 p19 균주와 혼합하여 유전자 silencing을 피하고, 1ml needless 주사기를 사용하여 5주된 Nicotiana benthamiana 잎의 배축면에 주입하였다. 현미경 분석을 위해 잎절편을 주입 2일 후에 잘랐다. 표피세포를 LSM Image Browser software로 조작되는 공초점 현미경(model Zeiss 510 UV/Vis Meta)으로 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 담배 (Nicotiana benthamiana)의 표피 세포(epidermal cell)에 있는 35S:CaMAF1-GFP 융합단백질이 핵과 세포질 내에서 GFP 신호를 만들어냈다.

상기 결과로부터, CaMAF11 단백질은 핵과 세포질을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. CaMAF1-침묵된(slienced) 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 증진된 내성(tolerance) 확인

실시예 3을 통해 건조 스트레스에 의해 CaMAF1의 발현이 유도됨을 확인하였고, 이로부터 CaMAF1 유전자가 스트레스-유도 신호 반응에 역할을 할 가능성을 높여주었다. 이에, 건조 스트레스에 대한 반응에서 CaMAF1 유전자의 역할을 알아보기 위하여, 실시예 1-5에 따른 TRV(tobacco rattle virus) vector를 이용한 VIGS(virus-induced gene silencing)-기반 유전자 기능 분석을 실시하였다.

먼저, CaMAF1-침묵된 고추 식물(TRV:CaMAF1)과 빈벡터(empty vector)를 접종한 대조군 식물(TRV:00)을 사용하여 건조 표현형을 비교하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 정상조건에서, 두 식물체 간 표현형 차이는 발견되지 않았다(도 5a 상단). 대조군 식물과 CaMAF1-침묵된 고추 식물을 13일 동안 탈수시켜 건조 스트레스를 겪도록 하면, 두 식물체 모두 시들었으나(도 5a 중단), 회복을 위해 3일 동안 물을 주게 되면, 대부분의 CaMAF1-침묵된 고추 식물은 성장을 재개하였음을 관찰할 수 있었다(도 5a 하단).

다음으로, 3일 동안 물을 준 후, 각각의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군 식물은 단지 13%만 성장을 재개한 반면, CaMAF1-침묵된 고추 식물은 63%가 성장을 재개하였다. 상기 결과로부터, CaMAF1 유전자 발현의 억제가 건조 스트레스에 대한 내성을 매우 증가시켰음을 알 수 있었다.

다음으로, 건조-내성 표현형과 수분 보유량 간의 상관관계를 확인하기 위해, 다시 말해 CaMAF1-침묵된 고추 식물의 건조-내성 표현형이 증가한 수분 보유량 때문인지 알아보기 위하여, 빈벡터(empty vector)를 접종한 대조군 식물과 CaMAF1-침묵된 고추 식물에서 떼어낸 로제트 잎(rosette leaves)의 생중량(fresh weight)을 측정하여 증산률(transpiration rate)을 비교하였다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 잎 조직의 수분 손실에 의한 생중량 손실은 대조군 식물보다 CaMAF1-침묵된 고추 식물에서 비교적 적게 나타남을 확인할 수 있었다.

다음으로, 건조-내성 표현형을 확인하기 위해, 대조군 식물과 CaMAF1-침묵된 고추 식물의 잎 온도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 후, CaMAF1-침묵된 고추 식물은 낮은 증산률로 인해 대조군 식물보다 상당히 높은 잎 온도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

한편, 증발하는 수분 손실량은 기공 운동(stomatal movement)에 의해 조절되고, 또한, ABA에 대한 높은 민감도는 기공 크기를 감소시킨다. 이에, CaMAF1-침묵된 고추 식물의 낮은 증산률이 기공개도(stomatal aperture) 감소에 의한 것인지 확인하기 위해, 다양한 농도의 ABA(0, 10 및 20μM)를 처리한 후 기공차단(stomatal closure)에서 중요한 역할을 하는 기공운동을 측정하였다. 이때, 기공개도란, 식물체에 있어서 기공이 열리는 정도를 뜻한다. 그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, CaMAF1-침묵된 고추 식물과 대조군 식물 간에 별다른 기공운동 차이는 관찰되지 않았다. 하지만, ABA를 처리하는 경우, 두 식물 모두, 기공 크기가 감소하되, CaMAF1-침묵된 고추 식물의 경우가 대조군 식물보다 더 작은 기공을 가짐을 확인하였다. 상기 결과로부터, CaMAF1-침묵된 고추 식물에서의 낮은 증산률은 ABA-유도 기공차단의 향상에 의한 것임을 알 수 있었다. 결과적으로, CaMAF1-침묵된 고추 식물의 향상된 건조-내성(저항성)은 ABA에 대한 과민성(hypersensitivity)에 의한 것임을 알 수 있었다.

실시예 6. CaMAF1 과발현(CaMAF1-OX) 식물의 발아기 및 유묘기에서의 ABA에 대한 민감도 변화 확인

CaMAF1 유전자의 생리적 역할을 조사하기 위해, 우선, 실시예 1-4에 따라 강력한 항시발현 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 CaMAF1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하고, 두 개의 독립된 T₃ 동형 라인(CaMAF1-OX)을 얻었고, 이를 표현형 분석에 이용하였다.

다음으로, 다양한 농도(0, 1.0 및 2.0μM)의 ABA를 보충한 MS 플레이트 상에 CaMAF1-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하고 발아시키면서 발아율을 비교하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 파종 후 7일째 까지 야생형 식물과 CaMAF1-OX 식물의 종자 간에는 발아율에 있어 별다른 차이가 발생하지 않았다. 하지만, 1.0μM 및 2.0μM의 ABA를 처리한 경우, 파종 후 2-7일째에 CaMAF1-OX 식물의 종자가 야생형 종자에 비하여 발아율이 감소하였는바, 상기 결과로부터 CaMAF1-OX 식물의 종자가 야생형 종자에 비하여 ABA에 대한 민감도가 낮음을 알 수 있었다.

한편, 발아기에서의 ABA에 대한 반응과 비교할 때, 유모기(seedling stage)에서 CaMAF1 과발현(CaMAF1-OX) 식물과 야생형 간의 차이가 더 두드러졌다.

보다 구체적으로, 0 또는 1μM의 ABA를 보충한 MS 플레이트 상에 CaMAF1-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하여 10일 동안 성장시킨 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 자엽(cotyledon)을 가진 다수의 묘목이 야생형 보다 CaMAF1 과발현(CaMAF1-OX) 식물에서 더 많았다. 보다 구체적으로, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 1μM의 ABA를 처리한 경우, 야생형 식물 묘목의 약 12%만이 녹색 자엽을 보인 반면, CaMAF1-OX 식물 묘목은 30-35%가 정상적인 녹색 자엽을 나타냈다.

추가적으로, ABA 처리 또는 미처리에 따른 CaMAF1-OX 식물 및 야생형 식물의 1차 뿌리 성장(primary root growth)을 비교하였다. 그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하는 경우, CaMAF1-OX 식물에 비해 야생형 식물의 1차 뿌리 성장을 매우 손상시킴을 확인할 수 있었다. ABA를 처리하지 않은 경우, 두 식물에서 형태와 뿌리 길이 간의 별다른 차이가 없었다. 반면, ABA를 처리하는 경우, CaMAF1-OX 식물의 뿌리 길이가 야생형 식물보다 더 길었다(도 6e).

상기 결과로부터, 애기장대에서 CaMAF1 유전자 과발현은 발아기 및 유모기 동안 ABA 민감도(sensitivity)를 감소시켰다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. 건조 스트레스에 대한 CaMAF1 과발현(CaMAF1-OX) 식물의 증가된 감수성(susceptibility)

실시예 5를 통해 CaMAF1-침묵된 고추 식물은 건조-내성(저항성) 표현형을 나타내고, 실시예 6을 통해 CaMAF1-OX 식물은 ABA에 대한 감소된 민감도를 나타냄을 확인하였다. 이에, CaMAF1 유전자의 과발현이 건조 스트레스에 대한 반응을 변화시키는지를 확인하였다.

먼저, 건조 스트레스에 대한 반응에서 CaMAF1 유전자의 효과를 확인하기 위해, 충분한 수분을 공급한 조건에서, 야생형 식물 및 CaMAF1-OX 형질전환 애기장대 라인을 성장시켰다. 그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 정상조건에서, 두 식물 간 표현형 차이는 나타나지 않았다(도 7a 상단). 이후, 두 식물에 8일 동안 물주기를 중단하여 건조 스트레스에 노출시키면 야생형 식물에 비해 형질전환 식물이 더 많이 시드는 것으로 나타났으나(도 7a 중단), 회복을 위해 다시 2일 동안 물을 주게 되면, 대부분의 야생형 식물은 성장을 재개하였음을 관찰할 수 있었다(도 7a 하단).

다음으로, CaMAF1 유전자의 과발현이 건조-민감도(drought sensitivity)를 증가시켰는지 여부를 확인하기 위해, 2일 동안 물을 준 후, 야생형 식물과 CaMAF1-OX 식물의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, CaMAF1-OX 라인 #1 및 #2는 각각 약 15 및 9%의 생존률을 나타낸 반면, 야생형 식물은 약 50%의 생존률을 나타냄을 확인할 수 있었다.

일반적으로, 식물에서 건조-내성(저항성)은 증발하는 수분 손실량, 잎 온도 및 기공개도와 같은 다양한 세포 및 분자적 파라미터에 의해 결정된다. 따라서, 다음으로, CaMAF1-OX 식물에 의해 나타난 건조-감수성 표현형이 높은 수분 손실률에 의한 것인지 확인하기 위해, CaMAF1-OX 식물과 야생형 식물의 로제트 잎의 생중량(fresh weight)을 확인하여 두 식물 간의 증산률을 비교하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 잎 조직의 수분 손실에 의한 로제트 잎의 생중량 감소는 야생형 식물보다 CaMAF1-OX 식물에서 상당히 높음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 감소된 건조-내성(저항성)은 잎의 증산률 변화에 의한 것임을 알 수 있었다.

다음으로, ABA 처리에 따른 야생형 식물과 CaMAF1-OX 식물의 잎 온도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, CaMAF1-침묵된 고추 식물과는 반대로, CaMAF1-OX 식물이 야생형 식물보다 상당히 낮은 잎 온도를 나타냄을 확인하였다.

다음으로, CaMAF1-OX 식물에서 나타나는 높은 수분 손실이 기공개도의 증가에 의한 것인지를 확인하기 위해, ABA 처리 및 미처리에서의 기공개도를 확인하였다. 그 결과, 도 7e에 나타낸 바와 같이, ABA 처리는 기공차단을 촉발시키지만, 야생형 식물의 잎 보다 CaMAF1-OX 식물의 잎에서 더 큰 기공크기를 나타내었다. 상기 결과로부터, CaMAF1-OX 식물에서 높은 증산률은 감소된 ABA-유도 기공차단으로부터 기인한다는 것을 알 수 있었다. 또한, CaMAF1-OX 식물의 공변세포(guard cell)에서 ABA에 대한 감소된 감수성은 건조한 조건에서 수분 보유량(water retention)을 감소시킴을 알 수 있었다.

추가적으로, 고추와 애기장대에서 CaMAF1 유전자의 발현이 ABA 민감도 및 건조-내성(저항성)에 대하여 음성적 조절을 하므로, CaMAF1-OX 식물에 나타난 건조-감수성 표현형과 건조-내성(저항성)과 관련된 유전자 간의 상관관계를 확인하였다. 보다 구체적으로, CaMAF1-OX 식물과 야생형 식물에 탈수 처리 후, 다양한 건조-내성(저항성) 관련 유전자, 즉, RAB18, RD29A 및 RD29B에 특이적인 프라이머를 이용하여 qRT-PCR 분석을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다.

명칭	서열(5'-3')
RAB18-F	GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT (서열번호 5)
RAB18-R	GCGTTACAAACCCTCATTATTTTA (서열번호 6)
RD29A-F	AGAGAATGACGAGTTACAACGAAAG (서열번호 7)
RD29A-R	TAAAACACCTAAGTGGGATGTCATT (서열번호 8)
RD29B-F	GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG (서열번호 9)
RD29B-R	ATTAACCCAATCTCTTTTTCACACA (서열번호 10)

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 탈수 처리하고 6시간 후에, 상기 유전자 발현 수준은 야생형 식물보다 CaMAF1-OX 식물에서 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, CaMAF1 유전자의 발현이 건조 스트레스에 대한 반응을 조절하고, 건조-반응성 마커 유전자(drought-responsive marker gene)의 감소된 발현 수준은 CaMAF1-OX 식물의 건조-감수성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 또한, CaMAF1-OX 식물의 감소된 건조-내성(저항성)이 ABA에 대한 저민감도(hyposensitivity) 및 건조-반응성 유전자의 낮은 발현 수준에 기인한다는 것도 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CaMAF1 protein imlicated in drought tolerance and the use thereof <130> MP15-142 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Capsicum annuum MADS affecting flowering 1 - CaMAF1 <400> 1 atggcggaaa tcgattcacc tcaatcccca gaatcccaaa tcaaaccctc taccatttcc 60 ttcagcattt ggccaccaac tcaacgtact cgtgacgctg taatcaaccg cctcatcgag 120 tctctatcaa caccttcaat tctctctaag cgttacggaa cgctcccaca agacgaggct 180 tccgatgccg ctaggagaat tgaagaggaa gctttcgttg ctgctggatc taccgccaac 240 ggtaacgatg acggaattga gatacttgag gtttattcaa aggagataag caaacggatg 300 attgaaacgg ttaagtccag atctgctcct gctgctgaga gtgaggttga gagcaaagcg 360 ctcgaggcgc cggctgttgc cgaggagtca tctactgggg aagtcgagtc cgttgagact 420 gagccttga 429 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Capsicum annuum MADS affecting flowering 1 - CaMAF1 <400> 2 Met Ala Glu Ile Asp Ser Pro Gln Ser Pro Glu Ser Gln Ile Lys Pro 1 5 10 15 Ser Thr Ile Ser Phe Ser Ile Trp Pro Pro Thr Gln Arg Thr Arg Asp 20 25 30 Ala Val Ile Asn Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Thr Pro Ser Ile Leu 35 40 45 Ser Lys Arg Tyr Gly Thr Leu Pro Gln Asp Glu Ala Ser Asp Ala Ala 50 55 60 Arg Arg Ile Glu Glu Glu Ala Phe Val Ala Ala Gly Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Gly Asn Asp Asp Gly Ile Glu Ile Leu Glu Val Tyr Ser Lys Glu Ile 85 90 95 Ser Lys Arg Met Ile Glu Thr Val Lys Ser Arg Ser Ala Pro Ala Ala 100 105 110 Glu Ser Glu Val Glu Ser Lys Ala Leu Glu Ala Pro Ala Val Ala Glu 115 120 125 Glu Ser Ser Thr Gly Glu Val Glu Ser Val Glu Thr Glu Pro 130 135 140 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMAF1-F <400> 3 tctagaatgg cggaaatcga ttca 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMAF1-R <400> 4 ggatcccatc cgtttgctta tct 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB18-F <400> 5 ggaagaaggg aataacacaa aagat 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB18-R <400> 6 gcgttacaaa ccctcattat ttta 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29A-F <400> 7 agagaatgac gagttacaac gaaag 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29A-R <400> 8 taaaacacct aagtgggatg tcatt 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29B-F <400> 9 gttgaagagt ctccacaatc acttg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29B-R <400> 10 attaacccaa tctctttttc acaca 25

Claims (5)

1. 삭제
2. CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물로,
   상기 CaMAF1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이고,
   상기 억제제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaMAF1 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제2항의 조성물을 처리하여 CaMAF1(Capsicum annuum MADS affecting flowering 1) 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 저항성을 증진시키는 방법.

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