KR102633465B1 - Siprr2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents
Siprr2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SIPRR2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법에 관한 것으로, SIPRR2-1 유전자를 침묵시키는 경우 식물체 내에서의 스트레스 저항성이 증진되는 것이 확인되었다. 특히, 수분뿐만 아니라 고염에 대한 스트레스 자극에서 모두 내성이 확인되어 식물체의 생존율, 표현형 증진 효과가 현저히 우수한 것으로 나타나, SIPRR2-1 유전자 조작을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히, 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 SIPRR2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법에 관한 것이다.
고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들 예컨대 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열 충격 및 오존 등의 환경적 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되는데, 비생물적 환경 스트레스에 의한 작물의 생산량 손실이 지대하며 이는 가능한 생산량의 50% 이상에 해당하는 것으로 보고되고 있다. 더욱이 최근에는 전세계적으로 급격한 환경 변화가 기록되고 있어 이에 따른 작물의 피해 정도가 더욱 우려되고 있다.
특히나 지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 특히 수분 부족 및 고염은 식물체에 있어서 가장 큰 스트레스를 유발시키기 때문에 작물의 생산량을 감소시키는 주요한 스트레스로 지목된다.
수분 부족으로 인한 건조 스트레스는 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되고 있으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 염분 스트레스는 환경 스트레스 중에서 가장 넓은 범위의 작물 생산성에 직접적인 영향을 미치고 있는 것으로, 식물이 고염 스트레스에 노출되면 세포 내 Na+ 이온의 축척으로 인한 삼투압 불균형, 세포 내 이온농도 불균형이 일어나며, 이를 통한 발달 부진, 광합성 장애 등이 일어난다.
이에 대하여 식물체는 건조 및 고염과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예를 들어, 식물은 단기적 또는 장기적인 물 부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킬 수 있다.
그러나, 자연적인 진화만으로는 수분 및 고염 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 데에 한계가 있으며, 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태이다.
이에, 식물체의 건조 및 염 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, SIPRR2-1 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SIPRR2-1 단백질을 암호화하는 SIPRR2-1 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, SIPRR2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 상기 SIPRR2-1 단백질을 암호화하는 SIPRR2-1 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 유전자는 토마토로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물체는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 SIPRR2-1 단백질 발현 또는 활성 억제제의 식물체의 스트레스 저항성 증진 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 SIPRR2-1 단백질 발현 또는 활성 억제제의 식물체의 스트레스 저항성 증진용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
SIPRR2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법에서는 SIPRR2-1 유전자를 침묵시키는 경우 식물체 내에서의 스트레스 저항성이 증진되는 것이 확인되었다. 특히, 수분뿐만 아니라 고염에 대한 스트레스 자극에서 모두 내성이 확인되어 식물체의 생존율, 표현형 증진 효과가 현저히 우수한 것으로 나타나, SIPRR2-1 유전자 조작을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히, 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 SIPRR2-1 단백질에 대한 다중 정렬 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 SIPRR2-1의 계통수(Phylogenetic tree) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 탈수 및 NaCl(250mM)로 처리된 토마토 식물의 잎에서 SlPRR2-1의 발현 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 1d는 토마토에서 SIPRR2-1-GFP 융합 단백질의 세포 내 위치(Subcellular localization) 분석 결과를 나타낸 것이다. DAPI 염색은 핵의 마커로 사용되었다.
도 2는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 SIPRR2-1 유전자 발현 여부를 확인한 실험 결과이다.
도 3a는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 표현형 변화 및 생존율을 나타낸 사진이다.
도 3b는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 엽록소 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 전해질 누출, 지질 과산화, 및 프롤린 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3d는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 염분 스트레스 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 표현형 변화를 나타낸 사진이다.
도 4b는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 증발로 인한 수분 손실 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4d는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 잎 표면 온도 변화를 나타낸 사진이다.
도 4e는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 전해질 누출, 및 지질 과산화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4f는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 건조 스트레스 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 1b는 SIPRR2-1의 계통수(Phylogenetic tree) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 탈수 및 NaCl(250mM)로 처리된 토마토 식물의 잎에서 SlPRR2-1의 발현 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 1d는 토마토에서 SIPRR2-1-GFP 융합 단백질의 세포 내 위치(Subcellular localization) 분석 결과를 나타낸 것이다. DAPI 염색은 핵의 마커로 사용되었다.
도 2는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 SIPRR2-1 유전자 발현 여부를 확인한 실험 결과이다.
도 3a는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 표현형 변화 및 생존율을 나타낸 사진이다.
도 3b는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 엽록소 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 전해질 누출, 지질 과산화, 및 프롤린 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3d는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 염분에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 염분 스트레스 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 표현형 변화를 나타낸 사진이다.
도 4b는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 증발로 인한 수분 손실 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4d는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 잎 표면 온도 변화를 나타낸 사진이다.
도 4e는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 전해질 누출, 및 지질 과산화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4f는 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 건조에 의한 대조군(TRV2:00) 및 SIPRR2-1 침묵군(TRV2:SIPRR2-1)의 건조 스트레스 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, SIPRR2-1 단백질을 제공한다.
본 발명에서, SIPRR2-1 단백질은 고염 및 건조 스트레스에 대항 음성 조절인자(NEGATIVE REGULATOR)일 수 있다.
본 명세서에서 “음성 조절인자(negative regulator) 단백질”이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 SIPRR2-1 유전자는 건조 또는 염분 스트레스에 대한 조절을 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해 SIPRR2-1 유전자를 침묵시키는 경우 건조 및 염분 스트레스에 대한 내성이 발생하게 되므로 건조 스트레스 저항성 및 염분 스트레스 저항성이 증진될 수 있다.
본 발명에서 용어 “건조 스트레스 저항성”이란, 식물이 건조 조건하에서 견디는 성질로, 가뭄에서의 식물의 저항성을 의미한다. 장기간 가뭄이 일어날 때 스트레스 저항성이 강한 품종이 필요하며, 작물의 건조 스트레스 저항성은 건조 스트레스 조건 하에서 식물의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 “염 스트레스 저항성” 또는 “염분 스트레스 저항성”이란 식물이 고농도 염분 조건하에서 견디는 성질로, 높은 염분 농도에서의 식물의 저항성을 의미한다. 간척지에서는 염분 스트레스 저항성이 강한 품종이 필요하며, 작물의 염분 스트레스 저항성은 생산성을 잃지 않으면서 작물이 견딜 수 있는 최대 소금 농도이며 소금의 농도가 높을수록 작물의 생산성에 부정적인 영향을 준다. 상기 소금 농도는 일반적으로 토양 염분 또는 관개용수의 염분을 일컫는다.
본 발명은 상기 SIPRR2-1 단백질을 암호화하는 SIPRR2-1 유전자를 제공한다.
본 발명에서, “PRR 유전자”는 수많은 종류가 있고 수많은 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 식물체와 관련하여 PRR 유전자가 모두 저항성 기능을 나타내는 것은 아니고, 모든 유전자가 두 개 이상의 기능에 대한 저항성을 나타내지 않을 수 있을 뿐만 아니라, 식물체 종의 특징마다 전혀 다른 기능을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 PRR 단백질/유전자의 서열인 서열번호 1 및 서열번호 2는 식물체, 특히, 토마토 내 저항성 효과가 가장 높은 것으로 최적화된 서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 유전자는 토마토로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, SIPPR2-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 SIPRR2-1 단백질 발현 과정 중 하나 이상의 단계에 작용하여 발현을 억제시킬 수 있는 물질을 모두 포함하는 가장 광범위의 의미일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 억제제는 SIPRR2-1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, SIPRR2-1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서, SIPRR2-1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 방법은 식물체에서 SIPRR2-1 유전자를 침묵하는 방법을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 식물체 중 토마토는 유전자 침묵 방법이 잘 적용되지 않는 것으로 유전자 침묵 방법의 성공 여부는 유전자에 따라 상이할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SIPRR2-1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물체는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
식물 재료 및 성장 조건
토마토(Solanum lycopersicum)를 실험을 위해 사용하였다. 토마토를 발아시키기 위해, 종자를 멸균된 퇴비 혼합토(피트모스(peat moss), 펄라이트(perlite), 버미큘라이트(vermiculite), 5:3:2, v/v/v), 모래, 양토(loam soil)(1:1:1, v/v/v)에 파종하였다. 이 토마토는 16시간 명/8시간 암 주기로 백색 형광등(130 μmol photons*m-2*s-1)하에 25 ± 1℃의 성장 챔버에서 성장하였다.
바이러스-유도성 유전자 침묵 토마토 제작
SlPRR2-1-침묵 토마토 식물은 기존에 알려진 방법에 의해 담배얼룩바이러스(Tobacco rattle virus; TRV) 기반 바이러스 유도 유전자 침묵 시스템(Virus-induced gene silencing, VIGS)을 사용하여 생성하였다. SlPRR2-1 cDNA의 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하고 동결-해동 방법(freeze-thaw method)을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 도입하였다. pTRV2:SlPRR2-1을 운반하는 형질 전환된 아그로박테리아를 TRV1과 함께 토마토의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD600=1.0). SlPRR2-1은 cDNA의 290bp 단편(1100-1389)이 pTRV2 벡터 구축물에 사용되었다. 음성 대조군으로는 TRV2:00 벡터가 사용되었다. 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다. 클로닝 및 VIGS에 사용된 프라이머는 각각 하기 표 1 에 나타내었다. 표 1의 서열은 전체 18개이며, 본 발명에서는 서열번호 3 내지 20으로 표시된다. 서열번호 3 내지 6은 Cloning에, 서열번호 7 및 8은 VIGS에, 서열번호 9 내지 20은 RT-PCR에 사용되었다.
| 서열번호 | 이름 | 구분 | 서열(5’-3’) |
| 서열번호 3 | SlPRR2-1 CDS (Sl08g077230) | Forward | ATGATTTGCATTGAGAATGAATTATTG |
| 서열번호 4 | Reverse | TCATCTCCGACAACGGGAGTCGT | |
| 서열번호 5 | SlPRR2-1 CDS (w/o stop codon) |
Forward | TCCCGTTGTCGGAGAAAGGGCGAATTCGAC |
| 서열번호 6 | Reverse | GTCGAATTCGCCCTTTCTCCGACAACGGGA | |
| 서열번호 7 | SlPRR2-1 VIGS | Forward | TCTAGACAATACTAGAAAGGATGTGTCCAA |
| 서열번호 8 | Reverse | CTCGAGACGGATTTAGTGTCAGCATCAT | |
| 서열번호 9 | SlPRR2-1 RT | Forward | CATATCCTCAGAATGCTGGAGTGTA |
| 서열번호 10 | Reverse | ATCCCTTGTCTAGAAAGTTCGTCAA | |
| 서열번호 11 | SlRD29 RT (Sl03g025810) |
Forward | CAGGAGTTAGCCCGCTTGTTCA |
| 서열번호 12 | Reverse | TTGTGGATTGCTCGGATTCATACT | |
| 서열번호 13 | SlAREB RT (Sl04g078840) |
Forward | GCTTTGCCCTATGGTGCTCCTA |
| 서열번호 14 | Reverse | ACCCCACTGGCTCCTAAACCTAC | |
| 서열번호 15 | SlDREB2 RT (Sl05g052410) |
Forward | GATGGAAGGAAGCCAGTGCGTA |
| 서열번호 16 | Reverse | TCTCAGCAACCCATTTACCCCA | |
| 서열번호 17 | SlACT RT (Sl04g011500) |
Forward | AGGAATAGCATAAGATGGCAGACG |
| 서열번호 18 | Reverse | TACCCACCATCACACCAGTATGGC | |
| 서열번호 19 | SlEF-1 RT (Sl06g005060) |
Forward | CCTCCATTGGGTCGTTTTGC |
| 서열번호 20 | Reverse | AACACCAGCATCACACTGCACAGTT |
건조 및 염 스트레스 조건, 이에 따른 생존율 계산 방법
6-주령의 대조군(TRV2:00) 및 SlPRR2-1-침묵 토마토 식물(TRV2: SlPRR2-1)을 심은 후, 18일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스 처리를 하였다. 그런 다음, 5일 동안 식물에 다시 물을 주어 탈수된 식물이 회복될 수 있도록 한 후, 다시 성장한 식물의 수를 세어 생존율을 계산하였다. 건조 내성을 정량적으로 평가하기 위해, 증산(transpirational) 수분 손실을 측정하였다. 이를 위해, 6엽기의 토마토 식물로부터 분리 및 회수한 잎을 페트리접시(petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리접시를 40% 상대습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.
6-주령의 대조군(TRV2:00) 및 SlPRR2-1-침묵 토마토 식물(TRV2: SlPRR2-1)을 심은 후, 6일 동안 400mM NaCl 처리 조건으로 염 스트레스를 발생시켰으며, 이 후 다시 성장한 식물의 수를 세어 생존율을 계산하였다. 염 스트레스 내성을 정량적으로 평가하기 위해, 클로로필(chlorophyll) 양을 측정하였다.
RNA 분리 및 정량적 실시간 전사-중합 효소 연쇄 반응(quantitative real-time transcription-polymerase chain reaction)
총 RNA 분리 및 qRT-PCR(quantitative real time-reverse transcription polymerase chain reaction) 분석은 이전에 설명된(Lim and Lee, 2021; Yoon et al., 2022) 내용을 약간 수정하여 수행하였다. 간략하게, 제조사의 프로토콜에 따라 RibospinTM Plant RNA isolation kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 토마토 식물로부터 총 RNA를 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 게놈 DNA의 오염을 제거하기 위해 RNA-free DNase로 분해하였다. cDNA는 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche)를 사용하여 합성하였다. qRT-PCR 분석은 유전자-특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 CFX96 TouchTMReal-TimePCRdetectionsystem(Bio-Rad)으로 수행하였다. PCR은 다음과 같이 프로그래밍하였다: 95℃에서 5분, 이어서 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 동안 각각 45주기.
토마토 SIPRR2-1 유전자를 정규화에 사용하였다. 각 유전자의 상대적인 발현 수준은 △△Ct 방법(Livak and Schmittgen, 2001)으로 결정하였다.
세포 내 위치 분석
종결 코돈이 없는 SIPRR2-1의 코딩 영역을 GFP-융합 바이나리 벡터(binary vector) p326GFP에 삽입하였다. GFP(Green fluorescent protein)-표지된 SIPRR2-1은 agroinfiltration에 의해 N. benthamiana 잎의 표피 세포에서 일시적으로 발현되었다. Pro35S:SIPRR2-1-GFP를 운반하는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을 균주 p19(1:1 비율; OD600=0.5)와 혼합하여 유전자 침묵을 방지한 다음 5주 된 N. benthamiana 식물의 완전히 확장된 잎에 동시 침윤하였다. 침윤 3일 후, 잎 원반을 절제하고 LSM Image Browser software가 장착된 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss)으로 하부 표피 세포를 검사하였다.
실시예 1. SlPRR2-1의 분석
SlPRR2-1 특성을 단백질 분석, 계통수 분석, 및 건조 스트레스 하에서의 발현 패턴 분석, 및 SlPRR2-1 단백질 위치 분석을 통해 각각 확인하였다.
실시예 1-1. SlPRR2-1의 단백질 분석
먼저 SlPRR2-1의 단백질을 분석하였다. 구체적으로, SlPRR2-1는 수탁 번호 NP_001266246를 사용하였다. 또한, SlPRR2-1의 상동 단백질은 Arabidopsis thaliana(수탁 번호: NP_001190759), Solanum tuberosum(수탁 번호 : XP_006361171), 및 Capsicum annuum(수탁 번호 : XP_016575041)를 사용하였고, ClustalW2를 사용하여 분석하였다.
| 서열번호 | 구분 | 서열 |
| 서열번호 1 | SlPRR2-1 단백질 | MICIENELLGWKDFPKGLKVLLLDEDSNSAAEMKSRLEKMDYIVYSFCNESEALTAISSKSEGFHVAIVEVSAGNSDGVLRFLESAKDLPTIMTSNIHSLSTMMKCIALGAVEFLQKPLSDDKLKNIWQHVVHKAFNTRKDVSKSLEPVKDSVLSMLQLQLEMGEADDKSSNGTEPPTAVAESNTEQSSGCDKYPAPSTPQLKQGVRSVDDGDCHDHTIFSTDQDSGEHDADTKSVETTYNNSLAENNVQTSPTVQQGDIILKEDNVSSPDLKTETDIATTSRSNDCPDNSIMHSAEPSKASGPHSSNGTKSNRKKIKVDWTPELHKKFVQAVEQLGIDQAIPSRILDLMKVEGLTRHNVASHLQKYRMHRKQILPKEVERRWPNPQPIDSVQRSYYPHKPIMTFPQYHSNHVAPGGQFYPAWVTPASYPNGLQVWGSPYYPGWKPAETWHWTPRPELHADTWGSPIMSPSLGSYPPYPQNAGVYRPHGTHNRYSMLEKSFDLHPADEVIDKVVKEAITKPWLPLPLGLKAPSTESVLDELSRQGISTIPSQINDSRCRR- |
| 서열번호 2 | SlPRR2-1 유전자 | ATGATTTGCATTGAGAATGAATTATTGGGTTGGAAAGATTTCCCAAAGGGGCTTAAAGTCCTACTTCTTGATGAAGATAGCAACTCTGCTGCTGAGATGAAATCAAGGCTTGAGAAAATGGACTACATAGTCTACTCGTTCTGCAACGAGAGCGAAGCTTTGACTGCAATCTCAAGCAAATCCGAGGGCTTTCATGTTGCCATTGTGGAGGTAAGTGCAGGCAACAGTGATGGGGTTCTACGGTTTCTTGAAAGTGCCAAAGATCTACCAACTATAATGACATCAAATATACATTCTCTTAGTACCATGATGAAATGTATTGCGCTAGGCGCAGTTGAGTTCCTTCAGAAACCATTGTCAGATGATAAACTCAAAAATATATGGCAGCATGTAGTTCACAAGGCATTCAATACTAGAAAGGATGTGTCCAAATCACTTGAGCCGGTAAAAGATTCTGTCCTCTCGATGCTGCAGTTACAACTAGAAATGGGTGAAGCAGATGACAAAAGTTCAAATGGAACAGAACCTCCCACTGCAGTAGCGGAAAGCAATACTGAACAGTCATCGGGCTGTGATAAATACCCTGCTCCCTCAACCCCACAATTGAAACAAGGAGTGCGATCCGTCGATGATGGTGACTGCCATGATCATACTATCTTCTCAACTGACCAAGACAGTGGGGAACATGATGCTGACACTAAATCCGTCGAAACTACTTATAACAATTCACTTGCTGAGAATAATGTCCAAACAAGTCCTACTGTACAGCAAGGAGATATTATTTTGAAAGAGGATAATGTTTCATCTCCTGATCTAAAGACGGAGACTGATATCGCTACCACTTCACGAAGTAACGACTGCCCTGACAATAGCATTATGCATTCTGCTGAACCTAGTAAAGCATCTGGTCCTCATAGTTCAAATGGGACTAAATCCAATAGGAAGAAGATAAAGGTAGATTGGACACCTGAACTACACAAGAAGTTTGTTCAAGCAGTAGAGCAACTCGGTATAGATCAAGCCATTCCTTCTCGAATACTGGACCTGATGAAAGTAGAGGGCTTAACGAGACATAACGTAGCTAGCCATCTCCAGAAATACAGAATGCATCGAAAGCAAATTTTGCCAAAGGAAGTAGAAAGAAGATGGCCTAATCCGCAACCAATAGATTCAGTCCAAAGAAGTTACTATCCTCATAAACCTATCATGACATTCCCACAATATCATTCTAATCATGTTGCCCCAGGTGGTCAGTTCTATCCTGCTTGGGTAACACCAGCAAGTTATCCGAACGGTTTACAAGTGTGGGGTTCACCTTACTATCCGGGATGGAAACCTGCAGAGACTTGGCACTGGACGCCTCGTCCAGAGCTGCATGCTGATACATGGGGCTCCCCTATCATGTCACCGTCGCTTGGATCATATCCACCATATCCTCAGAATGCTGGAGTGTACCGGCCACATGGAACACATAACAGATATAGCATGCTAGAGAAGTCGTTTGATCTTCACCCGGCGGATGAGGTGATTGATAAAGTAGTAAAAGAGGCAATAACCAAACCATGGTTACCACTTCCTTTGGGCCTAAAAGCTCCTTCAACGGAGAGCGTTCTTGACGAACTTTCTAGACAAGGGATCTCAACCATTCCTTCACAAATCAACGACTCCCGTTGTCGGAGATGA |
그 결과, 시퀀스에서 동일하고 유사한 잔기는 그라데이션 파란색으로 표시되었고, cheY 상동 리시버 도메인은 빨간색 선으로 나타내었으며, Myb 유사 DNA 결합 도메인은 녹색 선으로 표시되었다(도 1a). 도 1a에 따르면 two-component signaling system에서 response regulator protein에 해당하는 SlPRR2-1 단백질은 N-말단 부위에 cheY-homologous domain과 중간 부위에 Myb-like DNA-binding domain이 위치하는 것으로 확인되었다. 또한, 아미노산 서열 정렬(Sequence alignment)을 실시한 결과, SlPRR2-1 단백질은 다른 PRR2 단백질들과 높은 상동성(70-89%)을 가지는 것이 확인되었으며, 도 1a에 나타낸 바와 같이, SlPRR2-1 단백질은 cheY-homologous domain과 Myb-like DNA-binding domain을 포함하고 있으며, 이들은 높은 상동성(82-97%)을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 1-2. SlPRR2-1의 계통수 분석
SlPRR2-1의 계통수를 분석하기 위하여 SlPRR2-1 및 상동 단백질의 추론된 아미노산 서열을 사용하여 BLAST 검색을 수행하였다. 선택된 아미노산 서열의 다중 서열 정렬은 Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 수행되었고 계통수는 MEGA 소프트웨어(버전 10.1.7)를 사용하여 구성되었다.
그 결과, 1,000개의 부트스트랩 복제에서 계산된 부트스트랩 값은 각 분기점에 표시되었으며, 눈금 막대로 유전적 거리를 나타내었다(도 1b).
실시예 1-3. 토마토 잎에서의 SIPRR2-1 발현 패턴 분석
SlPRR2-1이 비생물적 스트레스 반응에 관여하는지 알아보기 위해 다양한 스트레스에 대한 반응에서의 발현패턴을 분석하였다. 구체적으로, 스트레스 상황을 위하여 토마토 식물을 탈수 또는 NaCl(250mM)로 처리하여 준비하였으며 SIPRR2-1의 발현 분석은 PCR로 수행하였다. 이 때, SlRD29는 RT-qPCR의 양성 대조군으로 사용되었다. SlPRR2-1의 상대 발현(ΔΔCT)은 내부 제어 유전자로 사용되는 SlACT 및 SlEF-1의 상대 발현으로 정규화되었다. (표시된 값은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차이며, 별표는 대조군(0h)과 비교하여 유의미한 차이를 나타낸다(학생의 t-테스트; *P < 0.05))
그 결과, 도 1c에 따르면 SIPRR2-1는 양성 대조군과 전혀 다른 양상을 나타내는 것으로 확인되었다. 구체적으로, SIRD29는 탈수 및 NaCl 처리 시간이 길수록 토마토 잎에서 발현량이 급격히 높아졌고 이는 통계적으로 유의한 수준인 것으로 나타났다. 반면, SIPRR2-1의 경우, 시간이 지날수록 발현량이 감소하는 경향성이 나타나는 것으로 확인되었다. 건조 스트레스 하에서 SIPRR2-1 발현량이 증가하는 것으로 나타났으나 이는 SIRD29 대비 상대적인 발현량이 1.5 이하의 수준에 지나지 않았다.
실시예 1-4. SIPRR2-1의 위치 분석
식물 세포에서 SIPRR2-1 단백질의 세포 내 위치를 분석하였다. 구체적으로, SIPRR2-1 코딩 영역을 GFP(green fluorescent protein) 리포터 유전자의 N-말단에 융합하였다. 그 후 SIPRR2-1-GFP 융합 단백질인 Pro35S:SlPRR2-1-GFP는 아그로박테리움 매개 침윤을 사용하여 N. benthamiana의 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 그 다음 GFP 신호를 DAPI 염색을 사용하여 핵에서 관찰하였으며 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰되었다 (흰색 눈금 막대 = 20μm).
그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이 SIPRR2-1 단백질이 식물 세포 세포질에 국한되어 있음이 확인되었다.
실시예 2. SlPRR2-1 침묵 토마토의 제작
빈 벡터 대조군(TRV2:00) 또는 SlPRR2-1-침묵 구조(TRV2:SlPRR2-1)로 형질 감염된 토마토를 제작하고 SlPRR2-1 침묵 토마토를 제작하였다. 또한 상기 토마토에서의 SIPRR2-1의 침묵 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR을 통해 토마토 잎에서의 SlPRR2-1 발현량을 분석하였다. 이 때, SlACT 및 SlEF-1은 내부 제어 유전자로 사용되었다.
그 결과, 도 2에 따르면 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서는 각 단백질의 발현이 거의 확인되지 않는 것으로 나타나, SIPRR2-1이 침묵된 토마토가 잘 제작된 것이 증명되었다.
실시예 3. SIPRR2-1 억제에 따른 우수한 염 스트레스 저항성 확인
SIPRR2-1 억제에 따른 우수한 염 스트레스 저항성을 확인하기 위하여 실시예 2에서 제작된 SIPRR2-1 침묵 토마토에 염 스트레스를 가한 후 그에 따른 표현형 변화 및 생존율, 엽록소 함량, 전해질 누출, 지질 과산화, 프롤린 함량, 및 염 스트레스 유전자 발현을 각각 분석하였다.
실시예 3-1. 표현형 변화
각 계통의 아그로 침투(agro-infiltration) 3주 후 식물을 400mM NaCl에 6일 동안 노출시켜 염 스트레스를 가하였다. 대표 이미지를 얻었고 각 라인의 생존율을 계산하였다(n = 각 라인에 대해 복제당 20개 식물, 3개 복제).
그 결과, 대조군 대비 SIPRR2-1 침묵 토마토는 염분 처리 후 시간의 경과에 상관없이 표현형이 우수하게 유지되는 것으로 확인되었다(도 3a).
실시예 3-2. 엽록소 함량 변화
각 라인을 400mM NaCl를 처리한 후 상대적 엽록소 함량을 분석하였다. 이 때, TRV2:00 라인의 엽록소 함량은 1.0으로 설정되었다. 구체적으로, 0 또는 400mM NaCl을 처리한 각 라인에서 동일한 양의 잎을 채취하여 각각을 튜브에 넣은 다음 각 잎에 95% 에탄올을 처리하고 밀봉하여 48시간 동안 incubation한 뒤 에탄올에 녹아있는 엽록소의 함량을 측정하여 이를 상대적 수치로 변환하였다.
그 결과, 대조군은 염분 처리 후 상대적 엽록소의 양이 30%로 현저히 감소한 반면, SIPRR2-1은 50% 수준으로 유지되는 것으로 확인되었다(도 3b).
실시예 3-3. 전해질 누출, 지질 과산화, 및 프롤린 함량 변화
염 스트레스를 받게 되면 세포막의 지질 성분이 과산화 되면서 세포막의 구조가 불안정해지고 이로 인해 내부의 전해질이 세포 밖으로 누출된다. 따라서, 본 실시예에서 전해질 누출 및 MDA 함량 측정 결과는 염 스트레스에 대한 민감도의 지표로 사용되었다. 한편 세포에서는 이러한 과산화에 대응하는 방법으로 프롤린을 합성하게 되는데, 프롤린은 산화과정을 조절하여 항상성을 유지하는 역할을 수행하는 물질이다. 따라서 프롤린은 스트레스에 대응하는 저항성의 정도를 대변하는 지표로 사용되었다.
전해질 누출, 지질 과산화 및 프롤린 함량 변화를 확인하기 위하여 아그로 침투 3주 후 식물에 각 시간 설정에 대해 NaCl(0 또는 400mM)을 처리한 후 각각의 지표를 조사하였다(n = 각 라인에 대해 복제당 20개 식물, 3개 복제). 구체적으로, 전해질 누출 실험의 경우, 0 또는 400mM NaCl을 처리한 후 24시간 뒤 각 라인에서 동량의 잎을 채취하여 3차 증류수가 담겨있는 튜브에 각각 넣고 이온 측정기를 이용하여 누출되는 전해질의 양을 측정하였다. 지질 과산화 및 프롤린 함량 실험의 경우, 400mM NaCl을 처리한 후 시간대 별로(0, 12 또는 24 시간) 각 라인에서 동일한 양의 잎을 채취하여 액체 질소를 이용하여 곱게 간 다음 이를 정량하여 튜브에 담고, 1) 지질 과산화를 측정하기 위해 산성 용액에 녹인 후 고온조건에서 thiobarbituric acid (TBA)와 반응하는 malondialdehyde(MDA)의 양을 측정하였다. 2) 프롤린 함량의 경우, 정량한 튜브에 산성 용액을 첨가하고 고온조건에서 ninhydrin과 반응하는 프롤린의 양을 측정하였다.
그 결과, TRV2:00 대비 TRV2:SlPRR2-1의 전해질 누출은 염분 처리 후에도 매우 저조한 수준으로 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 지질 과산화의 수준도 염분 처리 후 시간 경과에 따라 대조군 대비 낮은 수준을 나타내었다. 마지막으로, 염분 처리 후 12시간이 지났을 때 TRV2:SlPRR2-1에서 프롤린의 함량은 대조군보다 확연한 증가세를 보였고 24시간에서는 12시간에 비해 대조군이 큰 폭으로 증가한 반면 TRV2:SlPRR2-1의 경우에는 12시간 때보다 떨어진 수치를 보임으로써, TRV2:SlPRR2-1 식물의 경우 대조군 식물보다 더 빠르게 염 스트레스에 대응하는 것이 확인되었다(도 3c).
이와 같은 결과는 SlPRR2-1의 발현이 낮을 때 염 스트레스 저항성이 증가하는 것을 시사하는 것이다.
실시예 3-4. 염 스트레스 유발 유전자 발현 변화
TRV2:00 및 TRV2:SlPRR2-1 토마토 식물의 잎에서 염 스트레스 유발 유전자의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 400mM NaCl을 처리하고 시간대에 맞추어 각 라인에서 잎을 채취하여 RNA 분리 실험을 진행하였다. 총 RNA 분리 및 qRT-PCR(quantitative real time-reverse transcription polymerase chain reaction) 분석은 이전에 설명된(Lim and Lee, 2021; Yoon et al., 2022) 내용을 일부 수정하여 수행하였다. 구체적으로, 제조사의 프로토콜에 따라 RibospinTM Plant RNA isolation kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 게놈 DNA의 오염을 제거하기 위해 RNA-free DNase로 분해하였다. cDNA는 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche)를 사용하여 합성하였다. qRT-PCR 분석은 유전자-특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 CFX96 TouchTMReal-TimePCRdetectionsystem(Bio-Rad)으로 수행하였다. PCR은 다음과 같이 프로그래밍하였다: 95℃에서 5분, 이어서 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 동안 각각 45주기.
토마토 SlPRR2-1 유전자를 정규화에 사용하였다. 각 유전자의 상대적인 발현 수준은 ΔΔCt 방법(Livak and Schmittgen, 2001)으로 결정하였다. 각 유전자의 상대 발현(ΔΔCT)은 내부 통제 유전자로 사용된 SlACT 및 SlEF-1의 것으로 정규화하였다(표시된 모든 값은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차. 서로 다른 문자는 TRV2:00, TRV2:SlPRR2-1 토마토 식물 간에 상당한 차이를 나타냄(ANOVA: P < 0.05)).
그 결과, SIRD29, SIAREB, 및 SIDREB2의 발현이 염분 처리 후 시간 경과에 따라 SIPRR2-1가 침묵된 경우 각 유전자의 발현 비율이 대조군 대비 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 이는 SIPRR2-1의 발현이 낮을 때 스트레스 반응 유전자들의 발현이 높아져 염 스트레스에 저항성이 높아지는 것을 시사하는 것이다.
실시예 4. SIPRR2-1 억제에 따른 우수한 수준 스트레스 저항성 확인
SIPRR2-1 억제에 따른 우수한 수분 스트레스 저항성을 확인하기 위하여 실시예 2에서 제작된 SIPRR2-1 침묵 토마토에 수분 스트레스를 가한 후 그에 따른 표현형 변화 및 생존율, 수분 손실, 잎 표면 온도, 전해질 누출, 지질 과산화, 프롤린 함량, 및 수분 스트레스 유전자 발현을 각각 분석하였다.
실시예 4-1. 표현형 변화
각 라인의 식물을 아그로 침투(agro-infiltration) 후 3주 동안 18일 동안 물을 주지 않고 5일 동안 다시 물을 주어 탈수 스트레스에 노출시켰다. 그 후 생존 식물의 백분율은 다시 물을 준 후 계산되었다(n=각 라인에 대해 복제당 20개 식물, 3개 복제).
그 결과, 대조군은 탈수 스트레스 후 5일부터 시들어가는 양상이 육안으로 명백히 관찰되었으나, SIPRR2-1의 경우 5일차에서 표현형에 변화가 확인되지 않았다. 탈수 스트레스 후 18일 차에서 모든 식물이 시들었으나, 각 식물의 잎을 확대한 결과 대조군의 잎이 수분 부족으로 가장자리 부분이 이파리의 중앙까지 말려들어가는 것으로 나타났다. 그러나 SIPRR2-1이 침묵된 토마토의 경우 가장자리 부분만 말려가거나 잎의 끝 부분만 조금 말린 정도에 그치는 것으로 확인되었다(도 4a). 이와 같은 SIPRR2-1의 건조 스트레스 저항성은 생존율로도 확인되었는데, 이에 따르면 SIPRR2-1의 생존율은 대조군의 약 2배에 해당하는 것으로 나타났다(도 4b).
실시예 4-2. 증발에 따른 수분 손실 변화
TRV2:SlPRR2-1 및 TRV2:00 식물의 잎에서 증발하는 수분 손실을 분석하였다(n = 각 라인에 대해 복제당 20개 잎, 3개 복제). 구체적으로, 6주령의 TRV2:00 및 TRV2: SlPRR2-1에서 잎 탈착 후, 각 식물의 계통에서 잎 생중량(fresh weight) 손실을 표시된 시점에서 측정하였다.
그 결과, TRV2:00의 수분 손실이 TRV2:SlPRR2-1 대비 높게 나타났으며, 이는 통계적으로 유의한 수준인 것으로 확인되었다(도 4c).
실시예 4-3. 잎 표면 온도 변화
앱시스산(ABA)에 반응하는 잎 표면 온도를 분석하였다. 구체적으로, 각 계통(TRV2:00 및 TRV2:SlPRR2-1)의 아그로 침투(agro-infiltration) 3주 후 식물을 조사하였다. 대표적인 열화상 이미지를 얻었고 100μM의 ABA 처리 전후에 잎 온도를 측정하였다(n = 각 라인에 대해 복제당 20개 식물, 3개 복제). 열화상 분석을 위해, 6-주령 토마토 식물의 잎에 100μM ABA 용액을 분무하였다. 열화상은 infrared camera(T420; FLIR Systems)를 사용하여 얻었고 잎 온도는 FLIR Tools+ ver. 5.2 software로 측정하였다.
그 결과, SIPRR2-1군의 잎 표현 온도가 대조군 대비 현저히 높은 것으로 확인되었다(도 4d).
실시예 4-4. 전해질 누출 및 지진 과산화 변화
TRV2:00 및 TRV2:SlPRR2-1 토마토 식물의 잎에서 전해질 누출 및 지질 과산화에 대한 탈수 스트레스의 영향을 분석하였다. 구체적으로, 전해질 누출 실험의 경우, 각 라인의 shoot를 떼어내서 탈수를 유도하고 0 또는 12시간 뒤 동량의 잎을 채취하여 3차 증류수가 담겨있는 튜브에 각각 넣고 이온 측정기를 이용하여 누출되는 전해질의 양을 측정하였다. 지질 과산화 실험의 경우, 각 라인의 shoot를 떼어내서 탈수를 유도하고 시간대 별로(0, 12 또는 24 시간) 각 라인에서 동일한 양의 잎을 채취하여 액체 질소를 이용하여 곱게 간 다음 이를 정량하여 튜브에 담고, 지질 과산화를 측정하기 위해 산성용액에 녹인 후 고온조건에서 thiobarbituric acid(TBA)와 반응하는 malondialdehyde(MDA)의 양을 측정하였다.
그 결과, SIPRR2-1이 침묵된 경우 탈수 후 12시간이 경과하였음에도 불구하고 전해질 누출이 동일한 수준으로 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 탈수 후 시간 경과에 따라 모든 식물에서의 지질 과산화가 증가되었으나, SIPRR2-1 침묵 토마토의 경우 대조군 대비 그 수준이 현저히 저조한 것으로 확인되었다(도 4e).
실시예 4-5. 탈수 스트레스 유발 유전자 발현 변화
TRV2:00 및 TRV2:SlPRR2-1 토마토 식물의 잎에서 탈수 스트레스 유발 유전자의 발현을 분석하기 위하여 각 라인의 새싹을 분리하고 각 시간 세트에 대해 배양하였다(n = 각 라인에 대해 복제당 20개 식물, 3개 복제). 구체적으로, 각 라인의 shoot를 떼어내서 탈수 처리하고 시간대에 맞추어 잎을 채취하여 RNA 분리 실험을 진행하였다. 총 RNA 분리 및 qRT-PCR(quantitative real time-reverse transcription polymerase chain reaction) 분석은 이전에 설명된(Lim and Lee, 2021; Yoon et al., 2022) 내용을 약간 수정하여 수행하였다. 간략하게, 제조사의 프로토콜에 따라 RibospinTM Plant RNA isolation kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 게놈 DNA의 오염을 제거하기 위해 RNA-free DNase로 분해하였다. cDNA는 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche)를 사용하여 합성하였다. qRT-PCR 분석은 유전자-특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 CFX96 TouchTMReal-TimePCRdetectionsystem(Bio-Rad)으로 수행하였다. PCR은 다음과 같이 프로그래밍하였다: 95℃에서 5분, 이어서 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 동안 각각 45주기.
토마토 SlPRR2-1 유전자를 정규화에 사용하였다. 각 유전자의 상대적인 발현 수준은 ΔΔCt 방법(Livak and Schmittgen, 2001)으로 결정하였다. 각 유전자의 상대 발현(ΔΔCT)은 내부 통제 유전자로 사용된 SlACT 및 SlEF-1의 것으로 정규화하였다(표시된 모든 값은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차. 서로 다른 문자는 TRV2:00, TRV2:SlPRR2-1 토마토 식물 간에 상당한 차이를 나타냄(ANOVA: P < 0.05)).
그 결과, SIRD29, SIAREB, 및 SIDREB2의 발현이 탈수 처리 후 시간 경과에 따라 SIPRR2-1이 침묵된 토마토에서 대조군 대비 낮은 것으로 나타나, SIPRR2-1의 침묵에 따른 수분 스트레스 저항성이 우수한 것으로 확인되었다(도 4f).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (12)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, SIPRR2-1 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물로서,
상기 발현 억제제는 SIPRR2-1 유전자의 서열, 상기 SIPRR2-1 유전자의 서열에 상보적인 서열 또는 상기 SIPRR2-1 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 및 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것인, 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 SIPRR2-1 단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 SIPRR2-1 유전자로 암호화되는 것인, 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 SIPRR2-1 유전자는 토마토로부터 분리된 것인, 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스인 것인, 식물체의 스트레스 저항성 증진용 조성물.
- 제1항의 조성물을 처리하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 SIPRR2-1 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 스트레스 저항성 증진 방법.
- 삭제
- 제8항에 있어서,
상기 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스인 것인, 식물체의 스트레스 저항성 증진 방법.
- 제8항의 방법에 의해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
- 제11항에 있어서,
상기 식물체는 토마토인 것인, 식물체.
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| KR1020230067253A KR102633465B1 (ko) | 2023-05-24 | 2023-05-24 | Siprr2-1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 및 염 스트레스 저항성 증진방법 |
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| KR20030076058A (ko) | 2002-03-22 | 2003-09-26 | 대한민국 (경상대학교 총장) | ａＮＤＰＫ2 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스저항성을 갖게 하는 방법 및 상기 유전자가 도입된형질전환 식물체 |
| US20110145949A1 (en) * | 2008-08-20 | 2011-06-16 | Basf Plant Science Gmbh | Plants Having Enhanced Yield-Related Traits and a Method for Making the Same |
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2023
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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