CN104945492A

CN104945492A - 植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104945492A
Application number: CN201510381481.XA
Authority: CN
Inventors: 王景一; 李倩; 景蕊莲; 毛新国; 李昂
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2035-07-02
Also published as: CN104945492B

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的TaAREB3蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义，将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐寒性植物品种中发挥重要作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用。

背景技术

非生物胁迫如干旱、极端温度和盐碱等严重影响着植物的生长发育。其中干旱和低温是影响世界农业生产的重要限制因素，也是制约小麦生产可持续发展的重要因素。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

因此，利用现代分子生物技术，发掘抗逆关键基因，通过基因工程改良小麦抗逆性，对于保障国家粮食安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用。

本发明所提供的TaAREB3蛋白来源于小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号，具体可为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由933个核苷酸组成，第1-933位为ORF，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA1300-GFP载体的多克隆位点处插入所述基因后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Xba Ⅰ和Spe I。

所述pCAMBIA1300-GFP载体的构建方法如下：以pCAMBIA1300为原始载体，在其多克隆位点插入2个CaMV 35S启动子，得到中间载体；然后在所述中间载体的Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ位点间插入GFP的开放阅读框，最终得到所述pCAMBIA1300-GFP载体。

其中，所述中间载体具体为在pCAMBIA1300载体的酶切位点Bam H I和Xba I之间插入序列3所示DNA片段后得到的重组质粒。所述GFP的开放阅读框的序列具体为序列表中序列4。所述pCAMBIA1300-GFP载体具体为在所述中间载体的Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ位点间插入序列4所示DNA片段后得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)调控植物耐逆性；

(b)选育耐逆性提高的植物品种；

(c)调控植物对ABA的耐受性；

(d)选育对ABA的耐受性降低的植物品种。

在(a)中，所述调控植物的耐逆性具体体现在：在所述植物体内，若所述基因的表达量越高，则所述植物的耐逆性越强；若所述基因的表达量越低，则所述植物的耐逆性越弱。

在(c)中，所述调控植物对ABA的耐受性具体体现在：在所述植物体内，若所述基因的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越弱；若所述基因的表达量越低，则所述植物对ABA的耐受性越强。

在(b)中，所述选育耐逆性增强的植物品种的方法，具体可包括将所述基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

在(d)中，所述选育对ABA的耐受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下(a1)和(a2)的步骤：

(a1)向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(b1)和(b2)所示性状中至少一种的转基因植物：

(b1)耐逆性提高；

(b2)对ABA的耐受性降低。

所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述受体植物；编码所述蛋白质的基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述耐逆性为如下中的至少一种：耐旱性、耐冻性。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。如：小麦、烟草或拟南芥等。

在本发明中，所述植物为拟南芥，具体为拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)。

所述蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质在作为转录因子中的应用可体现为如下中至少一种：(a1)所述蛋白质能够在体外与ABRE顺式作用元件结合；(a2)在ABA处理下，所述蛋白质能够激活RD29A、RD29B、COR15A和/或COR47基因的表达；(a3)所述蛋白质能够与RD29A、RD29B、COR15A、COR47基因的启动子区结合。

在本发明中，所述植物对ABA的耐受性具体体现为种子萌发对ABA的耐受性。

实验证明，将可表达序列表中序列2所示DNA分子的重组表达载体转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，在耐旱性实验中，野生型植株和转空载体植株的存活率分别为56.9％和58.1％，转TaAREB3的株系的存活率为89.6％-95.7％；在1/2MS培养基上生长2周的幼苗，在经过冷驯化和没有经过冷驯化的情况下，分别经过-12℃处理12h和-10℃处理12h，转基因株系的存活率都比对照高30％以上，细胞膜稳定性也提高了30％左右。本发明所提供的TaAREB3蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义，将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐寒性植物品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测TaAREB3基因在不同逆境胁迫下的相对表达量。其中，A、B分别为脱落酸处理和低温(4℃)胁迫。

图2为实时荧光定量PCR检测TaAREB3基因在小麦不同组织中的相对表达量。

图3为重组载体pCAMBIA1300-TaAREB3-GFP的T-DNA区结构示意图。

图4为半定量PCR检测转基因植株TaAREB3的表达情况。

图5为Confocal下观测烟草叶片和转基因拟南芥根系中TaAREB-GFP表达的照片。

图6为不同ABA浓度处理下转基因拟南芥种子萌发的表型结果。其中，A为各株系表型照片，B为各株系种子萌发率柱形统计图。

图7为干旱胁迫下转基因拟南芥植株抗旱性鉴定结果。其中，A为各株系植株表型照片，B为各株系存活率柱形统计图。

图8为冻害胁迫处理下转基因拟南芥植株抗冻性鉴定结果。其中，A为各株系表型照片，B为各株系存活率柱形统计图，C为各株系细胞膜稳定性柱形统计图。

图9为TaAREB3蛋白全长及其截段的转录激活活性检测结果。A为TaAREB3截段连接到BD载体上的示意图。B为转化酵母在Trp-一缺培养基上生长状况。C为转化酵母在Trp-His-二缺培养基上生长状况。D为以X-gal为底物，定性检测转录激活活性(蓝色表示有转录激活活性)。E为以ONPG为底物，定量检测β半乳糖苷酶的活性。

图10为凝胶阻滞实验检测TaAREB3结合活性的结果。A为大肠杆菌中表达和纯化TaAREB3蛋白的结果。B为TaAREB3结合ABRE(ABA binding response element)结果。

图11为在ABA处理下，检测抗逆相关下游基因的表达情况。

图12为ChIP实验检测TaAREB3蛋白体内结合下游基因启动子区的结果。A为RD29A、RD29B、COR15A、COR47的启动子区含有ABRE顺式作用元件的示意图。B为超表达TaAREB3的转基因株系中TaAREB3结合ABRE情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号：耐旱品种，来源于国家种质库(编号：ZM009279)。记载于“王正航,武仙山,昌小平等.小麦旗叶叶绿素含量及荧光动力学参数与产量的灰色关联度分析.作物学报,2010年02期”一文，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。

pCAMBIA1300-GFP载体：由CAMBIA公司的pCAMBIA1300载体按照如下方法改造而来：(1)在pCAMBIA1300载体的酶切位点Bam HI和Xba I之间插入序列3所示DNA片段(含有2个CaMV 35S启动子)后得到中间载体；(2)在所述中间载体的Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ位点间插入序列表中序列4所示DNA片段(GFP的开放阅读框)，最终得到所述pCAMBIA1300-GFP载体。

根癌农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens StrainGV3101)：Biovector ScienceLab,Inc产品。

拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)：记载于“马元媛.外源NO对拟南芥愈伤组织呼吸强度及线粒体复合体Ⅰ蛋白的影响.兰州大学,2007年硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。

实施例1、TaAREB3蛋白及其编码基因的获得

将大小均匀一致的小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号的种子，置于直径9cm培养皿中，在22℃，光强150μmol·m^-2·s^-1，光周期为12h光照、12h黑暗，相对湿度70％条件下，加去离子水培养。取长至一叶一心的旱选10号幼苗叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。用TRIZOL提取总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，以此cDNA为模板，引物F1和R1进行PCR扩增，将扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1kb左右的片段进行测序，结果该片段的序列全长933bp，如序列表序列2所示。

F1：5’-ATGGCGTCACAGCCCGGG-3’(序列2的第1-18位)；

R1：5’-TTGTACATTAACCTTTTGCTTCTTTAGCCTCTC-3’(序列2的第901-933位的反向互补序列)。

将序列表序列2所示基因命名为TaAREB3。序列表序列2所示基因编码的蛋白TaAREB3由311个氨基酸残基组成，如序列表序列1所示。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaAREB3基因的表达特性

一、TaAREB3基因对不同逆境胁迫的应答情况

用75％(体积分数)酒精对大小均匀一致的小麦品种旱选10号的种子消毒处理1min，然后用流动的自来水冲洗数分钟后，置于直径9cm培养皿中，加去离子水培养，用保鲜膜封口，以免水分蒸发。当幼苗高度伸长到保鲜膜时，在膜上挑孔，使幼苗顺孔伸出。培养条件控制为22℃，相对湿度70％，光强150μmol·m^-2·s^-1，光周期为12h光照、12h黑暗。待幼苗长至一叶一心时，分别进行如下处理：

1)低温处理：置于4℃培养箱；

2)脱落酸(ABA)处理：用50μmol·L^-1的ABA喷洒幼苗；

分别采集经上述两种处理后的第0h(对照)、0.5h、1h、1.5h、3h、6h、12h、24h、48h和72h的植株为样品，经液氮速冻，-80℃保存备用。

用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR)的方法检测基因TaAREB3对各种逆境胁迫的响应情况。用组成型表达的Tubulin基因作为内参，设计的引物序列如下：

检测基因TaAREB3表达的引物序列如下：

TaAREB3-RT-F：5’-CTCAAGGACACGAGCGATGCTG-3’(序列2的第439-460位)；

TaAREB3-RT-R：5’-CATTCAGCGGCTGAGGGACAAAC-3’(序列2的第624-646位的反向互补序列)；

检测基因Tubulin表达的引物序列如下：

Tubulin-RF：5’-GAGGCCTCGTGTGGTCGCTTTGT-3’；

Tubulin-RR：5’-GCCCAGTTGTTACCCGCACCAGA-3’。

根据Livak和Schmittgen(Livak,K.J.；Schmittgen,T.D.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method.Methods 2001,25,402–408,doi:10.1006/meth.2001.1262.)提出的目标基因相对表达量估算方法，TaAREB3基因在2种处理下的表达量为对照的N倍，N＝2^－ΔΔCT，ΔΔC_T＝(C_T,Target–C_T,Tubulin)_Time x–(C_T,Target–C_T,Tubulin)_Time 0。

其中，C_T值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达C_T值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此C_T值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的C_T值是恒定的。

Time x代表不同的处理时间点。Time 0代表处理的起始时间；(C_T,Target)_Time x为经过胁迫处理x时间时，小麦中TaAREB3基因的表达量；(C_T,Tubulin)_Time x为经过胁迫处理x时间时，小麦中Tubulin基因的表达量；(C_T,Target)_Time 0为未开始胁迫处理时，小麦中TaAREB3基因的表达量；(C_T,Tubulin)_Time 0为未开始胁迫处理时，小麦中Tubulin基因的表达量。

每次独立试验中每个样品设三次重复，每个独立实验重复三次。结果如图1中的A、B所示，可见基因TaAREB3参与小麦幼苗低温和ABA胁迫的应答反应。

二、TaAREB3基因在小麦不同发育时期的表达量

分别取如下时期的如下材料：

1)开花期材料：田间种植的小麦品种旱选10号，分别取根、茎、叶、小花、种子、花药和雌蕊。

2)种子材料：田间种植的小麦品种旱选10号收获以后放置3个月以上的种子。

将上述材料分别经液氮速冻后，-80℃保存，用于目标基因的组织特异性表达分析。按照步骤一的方法获得cDNA样品并进行实时荧光定量PCR。

用于检测TaAREB3基因的引物：

TaAREB3-RT-F：5’-CTCAAGGACACGAGCGATGCTG-3’；

TaAREB3-RT-R：5’-CATTCAGCGGCTGAGGGACAAAC-3’。

内参Tubulin的引物：

Tubulin-RT-F：5’-GAGGCCTCGTGTGGTCGCTTTGT-3’；

Tubulin-RT-R：5’-GCCCAGTTGTTACCCGCACCAGA-3’。

计算在不同发育时期各组织中的TaAREB3基因表达量为开花期小花中TaAREB3基因表达量的N倍，N＝2^－ΔΔCT，ΔΔC_T＝(C_T,Target–C_T,Tubulin)_DT–(C_T,Target–C_T,Tubulin)_F。其中公式中的DT(different tissues)代表某一发育时期的某种组织，F(floret)代表与DT相同发育时期表达量最低的组织(本发明中为小花)。

实验设3次重复，结果如图2所示(以开花期的小花中的表达为基准，其它发育时期和其它组织的表达水平为相对表达量)，可见，TaAREB3在小麦根中表达量比较高，叶次之。

实施例3、利用TaAREB3基因提高植物的耐逆性

一、重组表达载体的构建

1、TaAREB3基因的克隆

根据TaAREB3基因的序列设计引物对(F2和R2)，引物5’末端分别引入Xba Ⅰ和Spe I酶切识别位点，以实施例1获得的小麦品种旱选10号的cDNA为模板PCR扩增TaAREB3基因，将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1kb左右的条带。

F2：5’-CTAGTCTAGAATGGCGTCACAGCCCGGG-3’(下划线部分为Xba Ⅰ的酶切位点，其后的序列为序列表中序列2的第1-18位)；

R2：5’-TGACACTAGTTTGTACATTAACCTTTTGCTTCTTTAGCCTCTC-3’(下划线部分为Spe I的酶切位点，其后的序列为序列表中序列2的第901-933位的反向互补序列)。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶Xba Ⅰ和Spe I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Xba Ⅰ和Spe I酶切载体pCAMBIA1300-GFP，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组载体pCAMBIA1300-TaAREB3-GFP。重组载体pCAMBIA1300-TaAREB3-GFP的结构描述为：在pCAMBIA1300-GFP载体的XbaⅠ和Spe I酶切位点之间插入了序列表序列2所示的DNA片段后得到的重组质粒。该重组载体T-DNA区的结构示意图如图3所示。

二、转基因植物的获得

1、将2μL构建正确的重组质粒pCAMBIA1300-TaAREB3-GFP加入至20μL根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，28℃热击转化。

2、将转化的农杆菌进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的单菌落，接入5mL YEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm振荡培养过夜。

3、将步骤2的5mL菌液转至250mL YEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm振荡培养约14h(菌液OD₆₀₀达到0.8-1.0)。

4、配置农杆菌转染缓冲液，农杆菌转染缓冲液：5％(5g/100ml)蔗糖，1/2MS，ddH₂O定容到100mL，加入80μL Silwet-77。

5、离心收集菌体，用农杆菌转染缓冲液重悬菌体。

6、选取刚开花的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株，将花序浸泡在农杆菌转染缓冲液中大约30sec，套上保鲜袋保湿，在黑暗中培养24h，然后将转染后的拟南芥去掉保鲜袋，正常培养，收获种子为T₀代。T₀代自交获得T₁代。

7、将T₁代种子消毒后，平铺于MS培养基上(含50mg/L潮霉素)，4℃春化2d之后，22℃、16h光照/8h黑暗培养14d，挑选抗潮霉素的转基因拟南芥植株，将转基因株系繁种、加代，得到20多个T₃代纯合转TaAREB3的株系(所有后代均具有潮霉素抗性的亲代为纯合系)。

按照上述步骤1-7的方法，将pCAMBIA1300-GFP空载体也转入拟南芥Clo-0型中，获得纯合转空载体对照株系20个以上。

半定量PCR检测转基因植株TaAREB3基因的表达情况。具体操作如下：从待检测的转基因植株(以上获得的T₃代纯合转TaAREB3的株系和纯合转空载体对照株系)叶片中提取总RNA，反转录得到cDNA。以所得cDNA作为模板，进行PCR扩增，检测转基因植株TaAREB3基因的表达情况。同时设置拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株作为野生型对照。

用于检测TaAREB3基因的引物：

TaAREB3-RT-F：5’-CTCAAGGACACGAGCGATGCTG-3’；

TaAREB3-RT-R：5’-CATTCAGCGGCTGAGGGACAAAC-3’。

用于扩增内参actin的引物：

Actin-F：5’-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3’；

Actin-R：5’-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3’。

半定量PCR结果如图4所示，图中OE1-OE6为6株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(检测到大小约为208bp的目的条带)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系，Col和GFP均未检测到相应的目的条带。

在烟草中瞬时表达GFP和TaAREB3-GFP，利用Confocal观察到GFP在细胞的各个部位都有表达，而TaAREB3-GFP只在细胞核中表达(图5中A)。利用Confocal观察转GFP和TaAREB3-GFP基因的拟南芥T₃代株系，同样发现GFP在细胞的各个部位都有表达，而TaAREB3-GFP只在细胞核中表达(图5中B)。

三、转基因植株的耐逆性鉴定

1、实验材料的培养

取拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)(野生型对照)、T₃代纯合转空载体对照(GFP)及T₃代纯合转TaAREB3的株系(OE1、OE3)种子，先用加有0.01％(v/v)Triton X-100的10％(v/v)NaClO溶液消毒处理15min，然后在超净工作台中用灭菌水清洗6次。再将其播种到添加3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂粉的MS培养基进行萌发培养。萌发培养先经4℃处理2d，再移到22℃、12h光照的培养箱中培养14d。之后移栽到草炭土与蛭石1:1(体积比)混合配比的营养土中继续培养。移苗结束后，用保鲜膜覆盖培养，4d后揭膜。拟南芥植株的培养条件为22℃、70％的相对湿度，光强为150μmol·m^-2·s^-1，光周期为12h光照/12h黑暗。

2、ABA处理

如步骤1，将拟南芥种子(每个处理至少20粒种子)播种到含有0、0.1、0.3、0.5μmol·L^-1ABA的MS培养基中，4℃处理2d后，培养箱中培养7d，观察萌发表型。每次实验设置三个重复，重复三次实验，实验结果一致。

结果表明：拟南芥中超表达TaAREB3，其种子萌发对ABA更加敏感，在含有不同浓度ABA的培养基上，萌发变绿的比例与野生型对照相比都发生不同程度的下降，且随着ABA浓度的增大，下降幅度增大。空载体对照组与野生型对照组的种子萌发表型基本一致，无显著差异。具体结果见图6。图中，OE1和OE3为2株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(对应图4中的编号)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系。

3、干旱处理

如步骤1所述，土中培养的拟南芥植株(每个处理至少15个植株)，在培养期间不再浇水进行干旱胁迫处理，待野生型植株萎蔫时(约35d)，进行复水处理。复水后第5d统计存活率(实验重复3次，结果取平均值)。

结果如图7所示。图中，OE1和OE3为2株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(对应图4中的编号)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系。结果表明，转TaAREB3的株系植株在干旱处理后的存活率为89.6％-95.7％，明显高于野生型植株的56.9％和转空载体对照株系的58.1％，说明蛋白TaAREB3及其编码基因可明显提高植物的耐旱性。

4、冻害处理

在1/2MS培养基上生长2周的幼苗(每个处理至少50个幼苗)，在经过冷驯化(即4℃放置4天，cold accumulation,CA)和没有经过冷驯化(no cold accumulation,NA)的情况下，分别经过-12℃处理12h和-10℃处理12h，之后放入光照培养箱恢复2d，照相和统计存活率(实验重复3次，结果取平均值)。

通过电导仪检测整个植株的电导率，分析其细胞膜稳定性(实验重复3次，结果取平均值)。具体方法如下：利用煮沸法测定幼苗相对电导率，评价细胞膜稳定性(cellmembrane stability,CMS)。测定经过以上处理的幼苗电导率，50株为一次重复，共3次重复。CMS(％)＝(1–煮前电导率/煮后电导率)×100。CMS值越大，细胞膜稳定性越强，说明受盐胁迫的伤害小。

结果如图8所示，可见无论是经过冷驯化还是没有经过冷驯化，转TaAREB3基因株系的存活率都比野生型对照高30％以上。细胞膜稳定性也提高了30％左右。这说明蛋白TaAREB3及其编码基因可显著提高植物的抗冻能力。而相同处理条件下的空载体对照组与野生型对照组的植株存活率以及膜稳定性都基本一致，无显著差异。图8中，OE1和OE3为2株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(对应图4中的编号)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系。

实施例4、TaAREB3蛋白的活性

一、TaAREB3蛋白的转录激活活性

TaAREB3蛋白属于AREB类转录因子，且具有明显的三个结构域：N端(Nterminal，为序列1的第1-145位氨基酸)比较保守，含有磷酸化位点；M区域(M region，为序列1的146-257位氨基酸)变异比较大；而C端(C terminal，为序列1的258-311位氨基酸)含有一个bZIP结构域。将TaAREB3基因截段及其全长的序列都利用Nde I和EcoRI这两个酶切位点分别连接到pGBKT7载体(Clontech公司产品，其产品目录号为VT1638)上(图9中A)。利用酵母系统，通过两个报告基因HIS和LACZ确定TaAREB3的转录激活活性及其活性区域。即在Trp-His-二缺培养基(采用泛基诺公司的Minimal SD Base和二缺Trp-His-dropout配置而成)上，检测酵母在营养缺陷培养基上能否生长，同时用X-gal显色定性检测β半乳糖苷酶活性，以ONPG为底物定量检测β半乳糖苷酶的活性。

结果发现，在Trp-His-二缺培养基上，只有含有M区域的酵母生长良好，即M区域具有转录激活活性；M+C的酵母转录激活活性较弱(图9中C)。同时用X-gal定性检测转录激活活性(图9中D，蓝色表示有转录激活活性)，并且以ONPG为底物定量检测β半乳糖苷酶的活性(图9中E)，得到相同的结果。即TaAREB3具有转录激活活性，M区域是转录激活活性区，同时C端可能对M区域的转录激活活性有抑制作用。

二、TaAREB3蛋白体外结合顺式作用元件ABRE的活性

将序列表中序列3所示的TaAREB3基因连接到pGEX-4T1载体(GE公司产品，其产品目录号为27-1542-01)的酶切位点EcoRI和Sal I之间，将所得的阳性重组质粒命名为pGEX-4T1-TaAREB3-GST。参照《分子克隆实验指南(第三版)》第15章方案1，在大肠杆菌BL21中表达。将菌体破碎，通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析进行纯化，得到TaAREB3与GST的融合蛋白(图10中A)。

顺式作用元件ABRE(ABA Response Element)是ABA响应基因的启动子区共有的一段序列，其能被转录因子结合而激活响应基因的表达。ABRE探针序列：AATTCCGGACGTGGCGTAAGCT，突变的ABRE(mABRE)序列：AATTCCGGCTACAGCGTAAGCT。将TaAREB3与GST的融合蛋白和探针孵育，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用EB染色，第四条泳道显示目标条带，表示TaAREB3与ABRE结合，而不能与突变的ABRE(mABRE)结合(图10中B)。即通过凝胶阻滞实验检测到TaAREB3在体外能与ABRE顺式作用元件结合。

三、超表达TaAREB3株系中与抗逆相关下游基因的检测

将生长两周的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)(野生型对照)、T₃代纯合转空载体对照(GFP)及T₃代纯合转TaAREB3的株系(OE1、OE3)，进行脱落酸(ABA)处理：用50μmol·L^-1的ABA浸泡幼苗。分别采集处理后的第0h(对照)、1h、3h、6h样品，经过提取RNA，反转录，应用实施例2中所述方法，对下游基因(如RD22、RD29A、RD29B、COR15A、COR47、RAB18、P5CS)进行实时荧光定量PCR分析。

引物信息如下：

RD29A-F：5’-CGGTGGAAGAGGAAGTGAAAG-3’；

RD29A-R：5’-GGAGCCAAGTGATTGTGGAGAC-3’。

RD29B-F：5’-CCGCAAAGAACGTCGTTGCCTCA-3’；

RD29B-R：5’-CCACCTCCGGAGAGAGGTAGCT-3’。

COR15A-F：5’-CATCCTCGATGACCTCAACGAGG-3’；

COR15A-R：5’-CCTTAGCCTCTCCTGCTTTACCC-3’。

COR47-F：5’-GCATGACCATCCCGAGGAAGAG-3’；

COR47-R：5’-ACTTCCTCTTCAGTGGTCTTGGC-3’。

actin2-F：5’-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3’；

actin2-R：5’-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3’。

RAB18-F：5’-TCCACAAGGAAAGTGGTGGT-3’；

RAB18-R：5’-TGTCCATCATCCCCTTCTTC-3’。

P5CS-F：5’-GTTGCAGAGCTATTCCTTCGCC-3’；

P5CS-R：5’-TGTCTCCGTCGACAACTTGTCC-3’。

RD22-F：5’-GGAACCGCCGTGAACGTTGG-3’；

RD22-R：5’-GGTTTACCCGTGTGGACTGCG-3’。

结果发现，如图11所示，RD29A、RD29B、COR15A、COR47基因在正常生长情况下，超表达株系和野生型(Col)没有差别，但是经过ABA处理的超表达株系中它们的表达量比野生型对照高。即在ABA处理下，超表达TaAREB3能够激活这些基因的表达。同时RAB18和P5CS基因没有明显变化。而相同处理条件下的空载体对照组与野生型对照组的植株以上各基因的表达情况都基本一致，无显著差异。图11中，OE1和OE3为2株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(对应图4中的编号)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系。

四、ChIP实验检测TaAREB3蛋白体内是否结合下游基因的启动子区

将生长两周的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)(野生型对照)、T₃代纯合转空载体对照(GFP)及T₃代纯合转TaAREB3的株系(OE1、OE3)，用甲醛进行交联，GFP抗体将蛋白TaAREB3-GFP及其结合的DNA片段沉降下来，之后通过解交联和纯化，利用real-time PCR检测TaAREB3是否与RD29A、RD29B、COR15A、COR47基因的启动子区结合。

引物信息：

RD29A-P-F：5’-GATCAAGCCGACACAGACACG-3’；

RD29A-P-R：5’-GTGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3’。

RD29B-P1-F：5’-GAGCCAAATCGGAGACGGTCTTC-3’；

RD29B-P1-R：5’-GATACAGTCTGAGCTCCCAAGACG-3’。

RD29B-P2-F：5’-GGCCAATAAACGTGGACCGAC-3’；

RD29B-P2-R：5’-CACCTCTCTCTGGCTTCTGTCTC-3’。

COR47-P1-R：5’-CTAGCCAAAGGATCAGTACTAAATGG-3’；

COR47-P1-F：5’-GTGTCTAATGGCCCACATGACC-3’。

COR47-P2-F：5’-TGCCAAGTCCATTGAAACTCTT-3’；

COR47-P2-R：5’-CCCCTCTTATTTCTTGAAGTCGG-3’。

COR15A-P1-F：5’-CTTGTCGGTTTATTTTGTGTAGGC-3’；

COR15A-P1-R：5’-GCCATGAAATTGTGGCTACATAC-3’。

COR15A-P2-F：5’-GTATGTAGCCACAATTTCATGGC-3’；

COR15A-P2-R：5’-TTGTTTGGAAATGAAAGGAGGAG-3’。

Tubulin-F：5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’；

Tubulin-R：5’-CCATGCTCGATGGGGTACTT-3’。

首先对下游目标基因的启动子区，进行顺式作用元件分析，如图12中A所示，这些基因的启动子区有一至两个ABRE顺式作用元件。经过ChIP实验(详细步骤见下文)，发现TaAREB3能够结合到这些基因的启动子区(图12中B)。即TaAREB3蛋白体内能够结合下游基因的启动子区，从而激活这些基因的表达。图中，OE1和OE3为2株检测阳性的T₃代纯合转TaAREB3的株系(对应图4中的编号)；Col为作为野生型对照的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株；GFP为纯合转空载体对照株系。

ChIP详细步骤：

1、用镊子收集1.5g 5day拟南芥幼苗(MS培养基，3％蔗糖，pH 5.8(120μl 5MKOH/L)，8％琼脂(Japan分装))，置于36ml提取缓冲液I中，待样品都收集完后，在通风橱中加入1ml 37％福尔马林(终浓度为1％)和370μl 0.1M PMSF，用镊子搅拌混匀，在真空泵中交联5分钟两次，中间把样品翻转一下，压力为23Hg。

2、加入2.5ml 2M甘氨酸(终浓度为0.125M)，用镊子搅拌混匀，继续在真空泵下处理5分钟，以终止交联。

3、将植物材料置于纱布上先用自来水冲洗，再用纯水冲洗干净后，把材料转移到滤纸上，尽可能把材料上残留的水份吸干，之后把材料置于锡纸中包好，用液氮速冻，可直接进行下面的处理，也可将材料置于-80℃保存。

4、提核并超声破碎染色质

(1)将植物材料在预冷的研钵中磨碎，加入30ml预冷的提取缓冲液I(由于研钵比较冷，所以液体会冻上)。

(2)待样品溶解后用4层滤膜(Calbiochem)将其过滤到50ml离心管中。

(3)4℃2880g离心20分钟。

(4)小心去除上清，用1ml提取缓冲液II重悬沉淀(用枪头先慢慢地把沉淀悬起，再吹吸几次使沉淀混匀)，尽量避免产生过多泡沫。

(5)将样品转入1.5ml的EP管中，4℃12000g离心10分钟。此时会看到由核和细胞碎片组成的白色沉淀紧贴管底，其上覆盖着一层厚厚的叶绿体。

(6)去除上清，用300μl提取缓冲液III重悬沉淀(用枪头先慢慢地把沉淀悬起，再吹吸几次使沉淀混匀)。由于提取缓冲液III比较粘稠，重悬沉淀比较困难，但还是要尽量避免产生过多泡沫。另外用振荡器轻轻震荡有助于沉淀的重悬。

(7)将上述样品转移到含有300μl提取缓冲液Ⅲ的新1.5ml EP管中，4℃16000g离心1小时。

(8)去除上清，用300μl核裂解缓冲液重悬沉淀(用枪头先慢慢地把沉淀悬起，再吹吸几次使沉淀混匀)，取2μl样品用作未超声对照。

(9)把样品分成四管(85μl/管)并用ChIP稀释缓冲液稀释5倍(加360μl ChIP稀释缓冲液/管)，用公用仪器Soniprep150(MES)超声仪冰上破碎，功率10％，每次10秒，超声3次，使DNA片段打断为0.5-2.0kb大小。

5、免疫共沉淀

(1)将破碎后的产物在4℃ 16000g离心5分钟，上清移入同一个新的4ml EP管中，用ChIP稀释缓冲液稀释2倍，使SDS浓度变为0.1％，混匀后分成三等份到三个1.5ml RNA用的EP管(减少beads的挂壁损失)中(1.15ml/管)。(1.5g材料可以用于沉淀两个抗体和一个不加抗体的对照。)

(2)取60μl SSDNA/Protein A的琼脂糖beads和样品在4℃轻轻旋转结合至少1小时。

(3)4℃16000g离心2分钟，将上清转入新的RNA用1.5ml EP管中。

(4)其中两管加入一抗，第3管不加抗体，用作NoAb(不加抗体)对照，在4℃轻轻旋转结合过夜。

(5)加入80μl SSDNA/Protein Abeads，在4℃轻轻旋转结合2小时以收集IP产物。

(6)4℃1000rpm离心2分钟收集beads，保留500μl NoAb上清用作Input。

(7)然后依次用下列缓冲液洗涤beads，每次使用1ml相应buffer，在4℃轻轻旋转10min，洗涤顺序及相应的buffer如下：(a)低盐洗脱缓冲液洗一次，(b)高盐洗脱缓冲液洗一次，(c)LiCl洗脱缓冲液洗一次，(d)TE缓冲液洗2次(5min/次)，最后一次尽可能去除过多的TE缓冲液。

6、洗脱和去交联

(1)加入250μl洗脱缓冲液到beads中，室温混合15分钟，1000g 2min离心收集上清，重复一次。

(2)加入20μl 5M NaCl，在65℃放置过夜(至少6h)，以解除交联。

(3)加入10μl 0.5M的EDTA，20μl 1M的Tris-HCl(pH 6.5，pH 8.0也可以)和2μl蛋白酶K(10mg/ml)，在45℃处理1小时。

(4)用等体积的酚/仿抽提DNA(各270μl)，13000rpm离心5分钟。

(5)取上清(500～600μl)到2ml RNA用EP管中，加入两倍体积乙醇，1/10V 3M NaAc(pH 5.2，60μl)和50μg糖原(2μl 20mg/ml)，-80℃沉淀1小时以上，离心沉淀。

(6)用70％乙醇洗涤一遍，晾干，加入50μl 10mM的Tris溶液(pH 8.0)进行溶解。

(7)将DNA分装10μl/管，然后用水稀释10倍，取5μl作模板进行PCR扩增。(Input稀释50倍，取5μl作模板)。

7、试剂配置：

所用母液的配制

Claims

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；

所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为35S启动子。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：

(a)调控植物耐逆性；

(b)选育耐逆性提高的植物品种；

(c)调控植物对ABA的耐受性；

(d)选育对ABA的耐受性降低的植物品种。

7.培育具有如下(b1)和(b2)所示性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下(a1)和(a2)的步骤：

(a1)向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(b1)耐逆性提高；

(b2)对ABA的耐受性降低。

8.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为如下中的至少一种：耐旱性、耐冻性。

9.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.权利要求1所述的蛋白质在作为转录因子中的应用。