CN113773375B

CN113773375B - 大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用

Info

Publication number: CN113773375B
Application number: CN202010499249.7A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 卢龙; 陆翔; 张万科; 韦伟; 陶建军; 阴翠翠; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN113773375A

Abstract

本发明公开了大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用。本发明公开的大豆核因子蛋白GmNF307，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。实验证明，GmNF307可以提高植物的耐盐性：与野生型和空载体植物相比，转GmNF307基因植物在盐胁迫下株高、叶片叶绿素含量提高，细胞膜所受损伤降低。说明GmNF307基因及其编码的蛋白质可以调控植物耐盐性，对培育植物高耐盐性品种具有重要的理论和现实意义。

Description

大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化,如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及病虫害等生物因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，可以利用传统的育种方法和分子遗传育种方法。目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物或生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，可以启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。

植物耐非生物胁迫相关的基因已有很多报道，包括效应分子基因和调控基因。大豆作为重要的油脂和植物蛋白来源的作物，改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

核因子-Y(Nuclear-Factor-Y,NF-Y)是异三聚体转录因子，其包括NF-YA,NF-YB和NF-YC蛋白家族，植物中，每个家族又包含10个以上成员。NF-Y家族分别参与调控植物的发育和生理过程，例如:种子发育、胚形成、ABA信号传导、蓝光应答、主根生长、花期、结瘤等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐盐性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物耐盐性；

D2)制备调控植物耐盐性产品；

D3)培育耐盐性增强植物；

D4)制备培育耐盐性增强植物产品；

D5)植物育种；

所述蛋白质来源于大豆，其名称为GmNF307，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的GmNF307蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的GmNF307蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的GmNF307蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的GmNF307蛋白质。

本发明还提供了与GmNF307相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物耐盐性；

D2)制备调控植物耐盐性产品；

D3)培育耐盐性增强植物；

D4)制备培育耐盐性增强植物产品；

D5)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码GmNF307的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmNF307的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmNF307的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmNF307蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmNF307蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmNF307蛋白质且具有GmNF307蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GmNF307蛋白质的核酸分子的表达盒(GmNF307基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmNF307蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmNF307基因转录的启动子，还可包括终止GmNF307基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GmNF307基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1301载体。

B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA1301-GmNF307。所述pCAMBIA1301-GmNF307为将pCAMBIA1301的SalI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GmNF307基因得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供给了下述任一方法：

X1)培育耐盐性增强植物的方法，包括使受体植物中表达GmNF307，或提高受体植物中GmNF307的含量，或提高受体植物中GmNF307的活性，得到耐盐性增强的目的植物；

X2)增强植物耐盐性的方法，包括使受体植物中表达GmNF307，或提高受体植物中GmNF307的含量，或提高受体植物中GmNF307的活性，得到耐盐性增强的目的植物，实现植物耐盐性的增强。

上述方法中，X1)和X2)中提高受体植物中GmNF307的含量可通过向所述受体植物导入GmNF307的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述GmNF307的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmNF307的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GmNF307的编码基因可利用含有所述GmNF307的编码基因的重组载体导入受体植物。所述重组载体具体可为所述pCAMBIA1301-GmNF307。

所述重组载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，显微注射，电穿孔，农杆菌介导等常规生物方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以干旱处理筛选转化植株。

所述目的植物理解为不仅包含GmNF307蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供了增强植物耐盐性产品，所述产品含有GmNF307或所述生物材料。

所述产品可以GmNF307或所述生物材料为其活性成分，还可将GmNF307或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述产品中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

GmNF307或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述耐盐性具体可为植物对NaCl模拟的高盐环境的耐性。所述NaCl模拟的高盐环境可为NaCl浓度为200mM-300mM的环境。

植物的耐盐性可通过植物的株高、叶片叶绿素含量和/或叶片相对离子渗透率来体现。

实验证明，GmNF307基因及其编码的蛋白质可以提高植物的耐盐性：与野生型和空载体植物相比，转GmNF307基因植物在盐胁迫下株高、叶片叶绿素含量提高，细胞膜所受损伤降低。说明GmNF307基因及其编码的蛋白质可以调控植物耐盐性，对培育植物高耐盐性品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为GmNF307的表达在大豆根和叶中均受盐胁迫诱导。

图2为植物表达载体pCAMBIA1301-GmNF307示意图。

图3为转基因阳性植株的分子鉴定。JACK表示大豆受体Glycine max(L.)Merr.cvJack，Null表示转空载体株系，OE-3、OE-6、OE-7、OE-36均为转基因阳性植株。

图4为不同植株盐胁迫下表型比较。Jack表示大豆受体Glycine max(L.)Merr.cvJack，Null表示转空载体株系，OE-3、OE-6、OE-7、OE-36均为转基因阳性植株。

图5为不同植株盐胁迫后的株高比较。JACK表示大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack，Null表示转空载体株系，OE-3、OE-6、OE-7、OE-36均为转基因阳性植株。

图6为盐胁迫处理组大豆叶片叶绿素含量比较。JACK表示大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack，Null表示转空载体株系，OE-3、OE-6、OE-7、OE-36均为转基因阳性植株。

图7为大豆叶片相对离子渗透率比较。JACK表示大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack，Null表示转空载体株系，OE-3、OE-6、OE-7、OE-36均为转基因阳性植株。1表示无胁迫对照组，2表示盐胁迫处理组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的大豆Williams 82(Scott A Jackson,et al.Genome sequenceof the palaeopolyploid soybean,Nature，2010，Vol.463，178-183)由美国普渡大学Scott Jackson教授馈赠，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。在下文中大豆Williams 82简称W82。

下述实施例中的大豆Glycine max(L.)Merr.cv Jack，记载于“Thibaud-NissenF,Shealy RT,Khanna A,Vodkin LO，Clustering of microarray data revealstranscript patterns associated with somatic embryogenesis in soybean，PlantPhysiol.，2003May；132(1):118-36.Truong Q,Koch K,Yoon JM,Everard JD,Shanks JV，Influence of carbon to nitrogen ratios on soybean somatic embryo(cv.Jack)growth and composition，J Exp Bot.，2013Jul；64(10):2985-95.”一文中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大豆耐盐品种南农1138-2南京农业大学国家大豆改良中心种质库，由南京农业大学国家大豆改良中心提供,王永军，吴晓雷，喻德跃，章元明，陈受宜，盖钧镒，重组自交系群体的检测调整方法及其在大豆NJRIKY群体的应用，作物学报，2004，30(5)：413－418)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的盐敏品种科丰-1(Glycine max L.Merr.Kefeng No.1)记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTLmapping of ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)geneticmap and their association with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的表达载体pCAMBIA1301记载在“Tang W，Additional virulencegenes and sonication enhance Agrobacterium tumefaciens-mediated loblolly pinetransformation，Plant Cell Rep.，2003Feb；21(6):555-62.Epub 2002Nov 26.”一文中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌GV3101(Lee CW,et al.Agrobacterium tumefacienspromotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsisthaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、大豆核因子GmNF307编码基因的cDNA克隆和在高盐处理下的表达特征

本发明在进行大豆种子发育过程转录组分析时获得一个较高的表达的基因，经序列分析及比对，根据大豆基因组序列推定其属于核因子家族中的NF-YA类成员，记录在基因库中(Glyma02g47380)。进一步研究发现该基因的表达受高盐处理诱导，推测该基因可能参与大豆耐盐调控，命名为GmNF307基因。

1、核因子GmNF307编码基因GmNF307的获得

提取Williams 82幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

根据在PlantGDB的大豆基因组序列中GmNF307全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：

GmNF307-up：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAATCTAAATCTGAAACTG；

GmNF307-dp：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTGAATAGCAAGACGCCTCT

以Williams 82幼苗的总RNA为模板，用GmNF307-up和GmNF307-dp为引物，进行PCR扩增,得到约1Kb的PCR产物。经过测序，该PCR产物为924bp,具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列所示的基因为GmNF307基因，将该基因编码的蛋白命名为GmNF307，该蛋白包含307个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的序列2。

2、GmNF307基因受高盐胁迫的诱导

将大豆耐盐品种南农1138-2(简称NN)和盐敏品种科丰-1(简称KF)种子分别播种于装满蛭石的盆中，生长于25±2℃，连续光照，两周后取出大豆苗，操作时注意避免伤根，进行盐处理。处理过程为：盐处理，将根浸入200mM NaCl溶液中，分别在处理0、1、3、9、18小时收集新鲜叶片和根各1g，分别提取叶片和根的总RNA。

分析盐胁迫下GmNF307的表达特征。对GmNF307基因在上述处理时的表达特征进行Real Time PCR分析，引物为

GmNF307-up：5’-ATGCAATCTAAATCTGAAACTG；

GmNF307-dp：5’-TGAATAGCAAGACGCCTCT

大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-F和Primer-R。Primer-F：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT和Primer-R：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。

Q-PCR得到的值是基因相对于GmTubulin的表达量。实验生物学重复三次。

结果如图1所示，GmNF307基因在200mM NaCl处理0、1、3、9和18小时时,在耐盐品种NN叶中的相对表达量约为0.1,0.21,0.79,1.25和0.45，而在盐敏品种KF叶中的相对表达量分别约为0.15,0.19,0.48,0.45和0.25；而在NN根中的相对表达量约为0,0.2,2.2,7.3和0.4,在KF根中的相对表达量分别约为0,0.1,0.4,1.9和0。上述结果说明，GmNF307的表达在耐盐和盐敏品种的叶和根中，正常条件下难以检测到，但再高盐处理时均受诱导。200mMNaCl处理时，9小时达到峰值，18小时快速下降。无论叶还是根中，GmNF307表达受盐诱导值在耐盐品种NN中均远高于盐敏品种KF。

实施例2、大豆核因子GmNF307可以调控大豆的耐盐性

一、重组菌的获得

1.植物表达载体构建：基因克隆使用pCAMBIA1301为植物表达载体，插入位点为限制性内切酶SalI和SpeI双酶位点间。以Williams 82幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增GmNF307基因所用引物为：

Primer-F：5’-ATGTAGGTCGAC ATGCAATCTAAATCTGAAACTG

Primer-R：5’-ACGTAGACTAGT TGAATAGCAAGACGCCTCT

获得的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pCAMBIA1301得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，测序，将序列正确的重组载体记为pCAMBIA1301-GmNF307，pCAMBIA1301-GmNF307为将pCAMBIA1301的SalI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GmNF307基因得到的重组载体，pCAMBIA1301-GmNF307为能表达序列2所示的蛋白质，GmNF307基因的表达由CaMV 35S启动子驱动，pCAMBIA1301-GmNF307以抗草甘膦抗性基因EPSPS为报告基因。重组表达载体pCAMBIA1301-GmNF307结构示意图如图2所示。

2.过表达GmNF307基因大豆植株的获得

将步骤1得到重组载体pCAMBIA1301-GmNF307导入农杆菌GV3101中，得到重组菌GV3101/GmNF307。将空载体pCAMBIA1301导入农杆菌GV3101中,获得对照重组菌GV3101/pCAMBIA1301。

二、转GmNF307大豆的获得及鉴定

将重组菌GV3101/GmNF307培养至对数期，然后用子叶节转化法将其转化大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack品种。经培育后收获种子。将种子播于中蛭石生长，用含有0.1％农达(草甘膦)涂抹大豆叶片，3d后无黄化反应的为转基因阳性植株。以GV3101/pCAMBIA1301转化大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack，得到空载体株系。

对上述阳性植株进行分子检测。提取转基因阳性植株苗总RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行Real Time-PCR鉴定。引物为：GmNF307-up：5’-ATGCAATCTAAATCTGAAACTG；GmNF307-dp：5’-TGAATAGCAAGACGCCTCT。大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。Primer-TF：5’-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC，和Primer-TR：5’-TTGAGTGGATTCCCAACAACG。以大豆受体Glycine max(L.)Merr.cv Jack和转空载体株系为对照。实验重复三次，结果取平均值±标准差。结果显示，转基因阳性植株的GmNF307基因相对表达量均显著高于受体大豆和转空载体株系，图3。

从转基因阳性植株中选取GmNF307基因表达量不同的4个株系，OE-3、OE-6、OE-8和OE-36作进一步表型分析。OE-3、OE-6、OE-8和OE-36中GmNF307的相对表达量分别约为17.3、12.5、9.1和6.8，转空载体株系和受体大豆中GmNF307的相对表达量极低，约为0.1和0.2。将上述4个株系繁殖至T3代，每一代单株均经过0.1％农达(草甘膦)涂抹大豆叶片，3d后无黄化反应的为转基因阳性植株的标准进行检测，淘汰阴性植株，获得后代没有分离的转基因纯系。

三、转基因植株的耐盐性鉴定

待测植株：OE-3、OE-6、OE-8和OE-36的纯系、大豆受体Glycine max(L.)Merr.cvJack和转空载体株系。

耐盐性的检测过程为：将待测植株播于蛭石：草炭土比例为1:1的基质中，放室外生长正常浇水至第一片三出复叶完全展开，随机分为两组，即盐胁迫处理组和无胁迫对照组。搬回温室对盐胁迫处理组进行盐处理：2L 200mM NaCl水溶液浇水大豆幼苗，一周后续加1L 200mM NaCl水溶液，三天后继续加1L 300mM NaCl水溶液，将第一次加NaCl水溶液记为处理第1天。对无胁迫对照组利用等量的水进行处理。

图4显示，盐胁迫处理组实验结束后大豆受体Jack及转空载体株系Null均表现明显萎蔫，植株下部叶几乎均枯萎，而GmNF307转基因植株OE-3、OE-6、OE-8和OE-36也有不同程度萎蔫，但明显优于大豆受体Jack及转空载体株系Null。在正常条件下生长的转基因植株与对照没有显著差异。

株高：在处理第10天，对无胁迫和盐胁迫后各株系的株高做了统计，图5显示。大豆受体Jack、转空载体株系Null及OE-3、OE-6、OE-8和OE-36，在无胁迫对照组的株高约为57.2、53.1、53.0、53.1、54.2和52.1厘米，无明显差异，在盐胁迫处理组约为29.0、28.5、36.0、39.0、37.0和36.5厘米，转基因植株OE-3、OE-6、OE-8和OE-36株高均极显著高于两个对照(大豆受体Jack、转空载体株系Null)。

叶片叶绿素含量：在处理第10天，使用叶绿素测定器(Konica MinoltΛ)测定盐胁迫处理组大豆叶片叶绿素含量：将大豆叶片夹在叶绿素测定器的探头夹片之间，记录测定器的读数，每片大豆叶片测定5个点，每个样品测定20片叶片。结果如图6所示，大豆受体Jack、转空载体株系Null及OE-3、OE-6、OE-8和OE-36叶片叶绿素含量(SPAD)分别约为6.0、7.5、19.5、16.5、24.0和18.5，转基因植株OE-3、OE-6、OE-8和OE-36叶片叶绿素含量均极显著高于两个对照(大豆受体Jack、转空载体株系Null)。

相对离子渗透率：当植物组织受到逆境胁迫伤害时，细胞膜功能受损或结构破坏，透性增大，从而使细胞内各种水溶性物质包括电解质外渗。将植物组织浸入无离子水中，水的电导会因电解质的外渗而变大。伤害越重，细胞膜破坏越严重，外渗就越厉害，而水的电导率就越大。所以可以用电导仪测定外渗液电导率的变化情况，间接反映出植物组织受到的伤害程度。因此电导率的检测可计算相对离子渗透率，相对离子渗透率表示植物细胞膜受损伤的程度。

在处理第10天，测定盐胁迫处理组和无胁迫对照组的相对离子渗透率，测定方法为：将大豆的叶片剪下，放置到干净的螺口玻璃瓶中，用去离子水漂洗3遍；之后加80mL去离子水将叶片完全浸泡，抽真空45min；室温静置30min后用电导仪(DDC-308A型，上海博取仪器有限公司)测定电导率E1；然后将叶片煮沸15min，待温度降到室温后，混匀用电导仪测定电导率E2。

相对离子渗透率EL(％)＝E1/E2×100％，其中E1和E2为电导率。

结果如图7所示，可以看出，无胁迫对照组各植株的相对离子渗透率为4-6％，无明显差异；盐胁迫处理组，大豆受体Jack、转空载体株系Null及OE-3、OE-6、OE-8和OE-36的相对离子渗透率分别增至53.2、50.1、22.6、21.1、22.2和29.5％，转基因植株OE-3、OE-6、OE-8和OE-36的相对离子渗透率均极显著低于两个对照(大豆受体Jack、转空载体株系Null)，表明转基因植株细胞膜所受的损伤远小于对照。

因此，GmNF307基因及其编码的蛋白质可以提高盐胁迫下大豆的株高、叶片叶绿素含量，并降低细胞膜所受损伤，说明其可以提高大豆的耐盐性。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 1

atgcaatcta aatctgaaac tgcaaatcaa ctgaggtctg atccacattc ctttacacct 60

aacaatgctt attctgaacc ctggtggcga ggtattcagt acaatcctgt cccccaagca 120

atgttaggag tgaatgcatc taattcatct tcacttgaac gccctaatgg tgattcggaa 180

tccagtgaag aggatgatga tgccactaaa gaatcacaac ccactgctcc taatcaatca 240

ggaaattatg gacaggacca ccaagcgatg caacattctt catcatctgc acctttggta 300

cgtgatgatt gccttacaca ggctccacaa gtggaacttg ttggccactc aattggatac 360

actcctttta taggaatgcc ccatgccaga atggctttgc cccttgagat ggctcaagag 420

cctgtttatg tgaatgccaa acaataccaa ggaattctga gacgaagaca ggctcgtgct 480

aaagcagagc ttgaaaagaa attaataaaa gtcagaaagc catatcttca tgaatcccgg 540

catcagcatg ctataagaag agcacgaggt aatggagggc gttttgcaaa gaaaactgaa 600

gttgaggctt caaaccacat gaacaaggaa aaggatatgg gtactggcca ggtcccattg 660

tcacggtcaa ttagttcatc tggttttgga tcactaccct ctgactctgc tgagacctgg 720

aattctccta gtgtgcaaca agatgcaaga ggatctcaag tgcatgagag atttgaagaa 780

cgcaactatg caaatgtttt gcagtcatca tctacttttt gtttgcactc gggtgaaaga 840

gtggaggaag gggactgttc aggtcaacaa cggggaagca tcttgtcaga gcacacctca 900

cagaggcgtc ttgctattca gtaa 924

<210> 2

<211> 307

<212> PRT

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 2

Met Gln Ser Lys Ser Glu Thr Ala Asn Gln Leu Arg Ser Asp Pro His

1 5 10 15

Ser Phe Thr Pro Asn Asn Ala Tyr Ser Glu Pro Trp Trp Arg Gly Ile

20 25 30

Gln Tyr Asn Pro Val Pro Gln Ala Met Leu Gly Val Asn Ala Ser Asn

35 40 45

Ser Ser Ser Leu Glu Arg Pro Asn Gly Asp Ser Glu Ser Ser Glu Glu

50 55 60

Asp Asp Asp Ala Thr Lys Glu Ser Gln Pro Thr Ala Pro Asn Gln Ser

65 70 75 80

Gly Asn Tyr Gly Gln Asp His Gln Ala Met Gln His Ser Ser Ser Ser

85 90 95

Ala Pro Leu Val Arg Asp Asp Cys Leu Thr Gln Ala Pro Gln Val Glu

100 105 110

Leu Val Gly His Ser Ile Gly Tyr Thr Pro Phe Ile Gly Met Pro His

115 120 125

Ala Arg Met Ala Leu Pro Leu Glu Met Ala Gln Glu Pro Val Tyr Val

130 135 140

Asn Ala Lys Gln Tyr Gln Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Ala Arg Ala

145 150 155 160

Lys Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Ile Lys Val Arg Lys Pro Tyr Leu

165 170 175

His Glu Ser Arg His Gln His Ala Ile Arg Arg Ala Arg Gly Asn Gly

180 185 190

Gly Arg Phe Ala Lys Lys Thr Glu Val Glu Ala Ser Asn His Met Asn

195 200 205

Lys Glu Lys Asp Met Gly Thr Gly Gln Val Pro Leu Ser Arg Ser Ile

210 215 220

Ser Ser Ser Gly Phe Gly Ser Leu Pro Ser Asp Ser Ala Glu Thr Trp

225 230 235 240

Asn Ser Pro Ser Val Gln Gln Asp Ala Arg Gly Ser Gln Val His Glu

245 250 255

Arg Phe Glu Glu Arg Asn Tyr Ala Asn Val Leu Gln Ser Ser Ser Thr

260 265 270

Phe Cys Leu His Ser Gly Glu Arg Val Glu Glu Gly Asp Cys Ser Gly

275 280 285

Gln Gln Arg Gly Ser Ile Leu Ser Glu His Thr Ser Gln Arg Arg Leu

290 295 300

Ala Ile Gln

305

Claims

1.蛋白质的下述任一应用：

D1）培育耐盐性增强植物；

D2）制备培育耐盐性增强植物产品；

所述蛋白质为如下A1）、A2）：

A1）氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述植物为大豆。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：

D1）培育耐盐性增强植物；

D2）制备培育耐盐性增强植物产品；

所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

所述植物为大豆。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b11）或b12）：

b11）编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12）序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子。

4.下述任一方法：

X1）培育耐盐性增强植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，得到耐盐性增强的目的植物；

X2）增强植物耐盐性的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，得到耐盐性增强的目的植物，实现植物耐盐性的增强；

所述植物为大豆。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：X1）和X2）中提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量通过向所述受体植物导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1）所述核酸分子。