CN110684089B - 植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用 - Google Patents

植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用。本发明提供的植物耐逆性相关蛋白GmMYB118为A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的GmMYB118可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用。
背景技术
干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。
低温、干旱、土壤盐渍化是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家也克隆了许多不同来源的与抗逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但所取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高盐及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。进一步对处于信号传导途径下游的转录因子在植物多种信号途径相互作用中的调控机制进行研究，对深入理解植物的生物胁迫和非生物胁迫应答过程具有重要意义。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一个来源于大豆的蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；所述蛋白质名称为GmMYB118，为如下A1)或A2)或A3)：
A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；
A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的GmMYB118蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的GmMYB118蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的GmMYB118蛋白质的编码基因可通过将序列2的第128-991位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2的第128-991位所示的DNA分子编码序列1所示的GmMYB118蛋白质。
本发明还提供了与GmMYB118蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码GmMYB118蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B15)降低GmMYB118蛋白质表达的核酸分子；
B16)含有B15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)编码序列是序列表中序列2的第128-991位的cDNA分子或DNA分子；
b2)序列表中序列2的第128-991位的cDNA分子或DNA分子；
b3)序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmMYB118蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmMYB118蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmMYB118蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmMYB118蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmMYB118蛋白质且具有GmMYB118蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码GmMYB118蛋白质的核酸分子的表达盒(GmMYB118基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmMYB118蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmMYB118基因转录的启动子，还可包括终止GmMYB118基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GmMYB118基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBI121载体或pCAMBIA3301载体。
B3)所述重组载体具体可为pBI121-GmMYB118或35S：GmMYB118。所述pBI121-GmMYB118为在pBI121的SmaⅠ和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第128-991位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。所述35S：GmMYB118为将序列表中序列2的第128-991位所示的DNA分子插入pCAMBIA3301载体的35S下游得到的重组载体，该重组载体中GmMYB118基因的表达由35S驱动。
B16)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低GmMYB118含量的重组载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌K599或农杆菌C58C1。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还提供了GmMYB118蛋白质或所述生物材料的下述任一应用：
C1)在提高植物耐逆性中的应用；
C2)在制备提高植物耐逆性产品中的应用；
C3)在培育耐逆性增强植物中的应用；
C4)在制备培育耐逆性增强植物产品中的应用；
C5)在植物育种中的应用。
本发明还提供了提高植物耐逆性产品，所述产品含有GmMYB118蛋白质或所述生物材料。
所述产品可以GmMYB118蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可以将GmMYB118蛋白质或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。
本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：
X1)一种培育耐逆植物的方法，包括：提高目的植物中GmMYB118蛋白质的活性和/或含量，或，促进GmMYB118蛋白质的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比耐逆增强的耐逆植物；
X2)一种培育不耐逆植物的方法，包括：降低目的植物中GmMYB118蛋白质的活性和/或含量，或，降低GmMYB118蛋白质的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比耐逆降低的不耐逆植物。
上述方法中，所述耐逆植物可为通过向所述目的植物中导入GmMYB118蛋白质的编码基因得到的与所述目的植物相比GmMYB118蛋白质表达升高的转基因植物。
所述不耐逆植物可为通过向所述目的植物中导入B16)所述重组载体得到的与所述目的植物相比GmMYB118蛋白质表达降低的转基因植物。
上述方法中，所述GmMYB118蛋白质的编码基因可为B1)所述核酸分子。
上述方法中，其中所述GmMYB118的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据目的植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmMYB118的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述GmMYB118的编码基因可利用含有所述GmMYB118的编码基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为所述pBI121-GmMYB118或所述35S：
GmMYB118。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。
所述耐逆植物和所述不所述耐逆植物理解为不仅包含第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗冷植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：
m1)双子叶植物或单子叶植物；
m2)豆科植物或十字花科植物；
m3)大豆或拟南芥；
所述目的植物可为m1)或m2)或m3)：
m1)双子叶植物或单子叶植物；
m2)豆科植物或十字花科植物；
m3)大豆或拟南芥。
本发明中，所述耐逆可为耐盐或抗旱。所述耐盐具体可体现在对250mM NaCl水溶液的耐性上。所述抗旱具体可提现直接对干旱的抗性上，也可提现在对PEG模拟的干旱环境的抗性上。
实验证明，本发明的GmMYB118可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
附图说明
图1为野生型和转基因拟南芥耐盐性检测结果。A：盐处理前野生型与转基因植株；B:250mM NaCl处理14天后的野生型与转基因植株；C:盐处理后存活率。MYB118-1、MYB118-2和MYB118-3分别为GmMYB118-1、GmMYB118-2和GmMYB118-3，为三个转GmMYB118基因株系。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。
图2为野生型和转基因拟南芥抗旱性检测结果。A：干旱处理前野生型与转基因植株；B:干旱处理14天后的野生型与转基因植株；C：复水后三天；D：旱处理后存活率。MYB118-1、MYB118-2和MYB118-3分别为GmMYB118-1、GmMYB118-2和GmMYB118-3，为三个转GmMYB118基因株系。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。
图3为侵染不同菌株大豆的耐盐性检测结果。A：盐处理前大豆植株；B：盐处理3天后的大豆植株；C：盐处理7天后的毛状根大豆植株；D：叶绿素含量的测定；E：脯氨酸含量的测定；F：丙二醛含量的测定。OE、CK和CRISPR分别表示侵染了K599-35S：GmMYB118、K599-pCAMBIA3301和K599-pCas9-GmU6-sgRNA的大豆。Control表示正常生长条件下生长。**表示与CK相比差异达到极显著水平(p<0.01)。
图4为侵染不同菌株大豆的检测结果。A：干旱处理前大豆植株；B:干旱处理16天后的大豆植株；C:复水3天后的大豆植株；D：叶绿素含量的测定；E：脯氨酸含量的测定；F：丙二醛含量的测定。OE、CK和CRISPR分别表示侵染了K599-35S：GmMYB118、K599-pCAMBIA3301和K599-pCas9-GmU6-sgRNA的大豆。Control表示正常生长条件下生长。**表示与CK相比差异达到极显著水平(p<0.01)。
图5为GmMYB118受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。
图6为GmMYB118在拟南芥原生质体中的定位结果；A：GmMYB118定位于细胞核中；B：16318hGFP空载体对照。图中标尺均为20μm。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pCAMBIA3301载体、GmU6-sgRNA载体、pCAMBIA3301-Cas9载体、发根农杆菌K599和大豆Williams 82均由中国农业科学院作物科学研究所张辉研究员提供，记载在文章DOi:10.1038/srep10342“Sun et al.，Targeted mutagenesis in soybeanusing the CRISPR-Cas9system，Scientific Reports，2015.5.29”))，经张辉研究员同意后公众可从申请人处获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、GmMYB118基因可以提高拟南芥的耐盐性和抗旱性
本实施例提供了一种来源于大豆品种铁丰8号(中国农业科学院作物科学研究所)的基因，其名称为GmMYB118基因，其cDNA的序列为序列表中序列2，开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第128-991位，编码序列表中序列1所示的GmMYB118蛋白质。GmMYB118基因及其编码的蛋白质可以提高植物的耐盐性和抗旱性，具体检测步骤如下：
一、重组表达载体的构建
1、GmMYB118基因的克隆
根据GmMYB118基因的序列设计引物对(GmMYB118-121F和GmMYB118-121R)，引物末端分别引入SmaⅠ和SacI酶切识别位点，以铁丰8号大豆cDNA为模板PCR扩增GmMYB118基因。
GmMYB118-121F：5'-TCCCCCGGGATGTCTCGCGCCTCCT-3'
GmMYB118-121R：5'-GCCGAGCTCAGCAACACTAATGATGCTTTCT-3'
PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0(TaKaRa公司,Code No.:DV807A)回收纯化1Kb左右的条带。
2、重组表达载体的构建
①用限制性内切酶SmaⅠ和SacI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
②用限制性内切酶SmaⅠ和SacI酶切pBI121载体(Clontech公司)，回收载体骨架；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒，将序列正确的重组质粒命名为pBI121-GmMYB118，pBI121-GmMYB118为在pBI121的SmaⅠ和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第128-991位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒，pBI121-GmMYB118能表达GmMYB118。
二、转基因植物的获得
1、将步骤一得到的重组质粒pBI121-GmMYB118导入农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌C58C1-pBI121-GmMYB118。将pBI121载体导入农杆菌C58C1中，得到作为对照的重组菌C58C1-pBI121。
2、将重组农杆菌C58C1-pBI121-GmMYB118接种于LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；
3、将步骤2的菌液转至LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)中进行扩大培养，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；
4、步骤3完成后收集菌体，4℃、4000g离心10min，用转化液(该转化液为向MS液体培养基中添加蔗糖和silwet得到的蔗糖和silwet质量百分比浓度分别为10％和0.02％的液体)重悬菌体得到菌体悬液，菌体悬液的OD600约为0.8-1.0；
5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌体悬液的容器中，使花序在菌体悬液中浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，将T1代种子播种于含有卡那霉素的培养基(卡那霉素浓度为50μg/L)中利用卡那霉素筛选得到T1代阳性植株。
T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T1代阳性植株得到的T3代植株进行在DNA和cDNA水平鉴定(DNA水平鉴定的引物对：F:5'-ATGTCTCGCGCCTCCTC-3'；R:5'-AGCAACACTAATGATGCTTTCTCC-3'；预期条带为864bp；cDNA水平鉴定的引物对：F:5'-ATCATACTGTTCGGAGTCAG；R:5'-CAGACACTGTAGAGACCTTGTT-3'；预期条带为300bp)。从阳性植株中筛选得到在DNA和cDNA水平上的鉴定结果中均含有目的条带转基因植株，记为转GmMYB118基因植株。
按照步骤2-5的方法，将C58C1-pBI121-GmMYB118替换为C58C1-pBI121，其他步骤均不变，得到转空载体植株。
四、转基因植物的耐盐性鉴定
分别将T3代转GmMYB118基因植株(Transgenic line)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。
将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，用250mM NaCl水溶液进行盐处理两周，具体处理方法为：待长至3周后，将栽培盆放入含有约2L的250mM NaCl水溶液底盆中进行浇水(和浇水的方式一样，浇水时把水倒入底盆中，然后把栽培小盆放入其中，让其自然渗吸)，让其自然渗吸，两周后统计存活率。
结果见图1，结果显示，在经盐处理后，转GmMYB118基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，表明，转GmMYB118基因植株具有耐盐性，GmMYB118基因及其所编码的蛋白质GmMYB118可以用来提高拟南芥的耐盐性。
按照上述方法，鉴定转空载体对照植株的耐盐性，结果显示，空载体对照植株在经250mM NaCl水溶液处理两周后其表型与野生型拟南芥拟南芥Col-0无明显区别，且其存活率也与拟南芥拟南芥Col-0无显著差异。
五、转基因植物的抗旱性鉴定
分别将T3代转GmMYB118基因植株(Transgenic line)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行抗旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。
将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，干旱处理两周，复水3天，统计植株存活率。
结果见图2，结果显示，在经干旱与复水处理后，转GmMYB118基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，表明，转GmMYB118基因植株具有抗旱性，GmMYB118基因及其所编码的蛋白质GmMYB118可以用来提高拟南芥的抗旱性。
实施例2、GmMYB118基因及其编码的蛋白质可以提高毛状根大豆的耐盐性和抗旱性
一、GmMYB118植物过表达载体构建
1、根据大豆GmMYB118cDNA序列和pCAMBIA3301载体中NcoI，BglII酶切位点两侧序列与同源重组要求[正向引物与载体左臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段正向序列(20-25nt左右)，反向引物与载体右臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段反向序列(20-25nt左右)]设计引物序列如下：
GmMYB118-3301-T-F：5'-GGACTCTTGACCATGATGTCTCGCGCCTCCT-3'
GmMYB118-3301-T-R：5'-ATTCGAGCTGGTCACCAGCAACACTAATGATGCTTTCT-3'
2、以铁丰8号大豆cDNA模板，使用北京全式金生物技术有限公司的2×
Figure BDA0001718830790000111
FastPfu PCR SurperMix进行PCR扩增，得到PCR产物；
3、将步骤2得到的PCR产物经琼脂糖电泳检测后，纯化回收酶切产物；
4、先用NcoI与BglII内切酶酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架；
5、用北京全式金生物技术有限公司的Quick-Fusion Clong Kit将步骤3回收的酶切产物克隆到pCAMBIA3301载体中，将得到的序列正确的重组载体命名为35S：GmMYB118。35S：GmMYB118为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体，该重组载体能表达GmMYB118，GmMYB118基因的表达由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。反应体系与条件如下：
Figure BDA0001718830790000121
37℃孵育30min。其中，Fusion Buffer与Fusion Enzyme均为Quick-Fusion ClongKit中试剂。
二、CRISPR/Cas9载体构建
1、根据GmMYB118PAM位点与sgRNA前导序列设计原则(NGG/NAG上游的20bp序列、PAM位点上游1-8个碱基包含常见内切位点、尽量减少脱靶效应的产生)在http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR选择评分最高的sgRNA引导序列，然后在F引物前端加attg，R引物前端加aaac
GmMYB118-CR-F：5'-attgGAGACAGCGTGTCTTGATTC-3'
GmMYB118-CR-R：5'-aaacGAATCAAGACACGCTGTCTC-3'
2、用BsaI对GmU6-sgRNA载体进行酶切，回收载体骨架；
3、将GmMYB118-CR-F和GmMYB118-CR-R均稀释成100μM，各取5μl均匀混合(成对互补的sgRNA引物)，将PCR仪设置为94℃，2min；55℃，30s，之后缓慢降温(可以立即放入37℃杂交炉内半小时以上)，得到sgRNA片段；然后用T4连接酶连接载体骨架与sgRNA片段，得到连接产物；
4、将步骤3得到的连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆摇菌，用通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAG)+GmMYB118-CR-R检测菌液，之后用M13F测序验证。将连接有正确特异sgRNA片段的重组质粒命名为GmU6-sgRNA；
5、利用HindIII与EcoRI对GmU6-sgRNA进行双酶切，回收小片段(500bp左右)，记为DNA片段1；利用HindIII与EcoRI对pCAMBIA3301-Cas9进行双酶切，回收大片段，得到载体骨架；连接DNA片段1和载体骨架，将得到的序列正确的重组载体命名为pCas9-GmU6–sgRNA。
三、大豆毛状根的转化过程
将35S：GmMYB118、pCAMBIA3301载体和pCas9-GmU6–sgRNA分别导入发根农杆菌K599中，将得到的重组菌分别命名为K599-35S：GmMYB118、K599-pCAMBIA3301和K599-pCas9-GmU6-sgRNA。
1、将大豆Williams 82种子播于混合土中(营养土：蛭石＝1：1)1-2cm深。置于温室，白天28℃/晚上20℃，每天浇水；
2、用注射器分别挑取K599-35S：GmMYB118、K599-pCAMBIA3301和K599-pCas9-GmU6-sgRNA侵染6天大子叶尚未展开的幼苗大豆的子叶节；
3、侵染完用塑料盒盖上；
4、待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30天，每两天交一次水，保持浸染部分的潮湿环境；
5、30天后，当毛状根长到5-10cm时，将主根减去(此时毛状根用于GmMYB118基因表达量检测)，得到的植株称为复合体植株，将复合体植株埋入混合土中(营养土：蛭石＝1：1)，每三天浇一次水；
6、45天后，待毛状根恢复到足够健康时，按照实施例1中的方法进行盐处理和干旱处理。
7、盐处理结果和生理指标测定结果见图3；旱处理结果和生理指标测定结果见图4。其中，所测生理指标为叶绿素、脯氨酸和丙二醛，所测叶绿素、脯氨酸和丙二醛分别为叶片的叶绿素、脯氨酸和丙二醛的含量。
各植株GmMYB118基因表达量检测结果显示，侵染了K599-35S：GmMYB118的大豆毛状根中GmMYB118基因的表达量显著高于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根，侵染了K599-pCas9-GmU6-sgRNA的大豆毛状根中GmMYB118基因的表达量显著低于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根。
盐处理和干旱处理的结果显示，与侵染K599-pCAMBIA3301的大豆相比，侵染K599-35S：GmMYB118的大豆表现出了更强的耐盐性和抗旱性，而侵染K599-pCas9-GmU6-sgRNA的大豆则表现出了更弱的耐盐性和抗旱性。表明，GmMYB118基因及其所编码的蛋白质GmMYB118可以用来提高大豆的耐盐性和抗旱性。
实施例3、实时荧光定量PCR分析GmMYB118的表达特性
一、胁迫处理
取室温生长20d左右的大豆铁丰8号幼苗进行以下处理：
(1)干旱处理(图1中A)：将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时和48小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(2)高盐处理(图1中B)：将大豆幼苗置于200mM的NaCl水溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后和48小时分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(3)PEG处理(图1中C)：将大豆幼苗置于10％(质量百分比)PEG的水溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时和48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。图1中C中横坐标单位为小时。
(4)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。
二、mRNA的分离
采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。
三、反转录为cDNA
将纯化的mRNA反转录为cDNA。
四、实时荧光定量PCR
将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因的特异引物对(引物序列为RT118-F1：ATCATACTGTTCGGAGTCAG，RT118-R1：CAGACACTGTAGAGACCTTGTT)对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin(RT-Gmactin F：ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT，RT-Gmactin R：CTGTTGGAAGGTGCTGAG)做内参。Q-RT-PCR在ABI
Figure BDA0001718830790000141
7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Time x－(CT.Target－CT.Actin)Time 0
Time x表示任意时间点，Time 0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。
结果见图5。结果显示，干旱和高盐处理均可以使GmMYB118基因的表达升高，在PEG模拟的干旱环境中，在处理的第4小时GmMYB118基因的表达量达到最高。
实施例4、GmMYB118亚细胞定位分析
一、拟南芥原生质体的制备
1、配制15mL酶解液(配方见表1)置于小烧杯中。
2、取长势良好的野生型的拟南芥(生长3周左右)10株，将茎以上部分切成细条，置于酶解液中。
3、将小烧杯用锡箔纸包好，抽真空15min，然后在25℃，50rpm的摇床上避光放置约5h，至叶片细胞完全裂解。
4、用筛子(100目)过滤裂解液，去除杂质，将滤好的滤液(枪尖要被剪掉约3厘米)分装于2.0mL离心管中，4℃离心，100g，2min，加速度设置为2。
5、弃上清，用预冷的W5溶液轻轻混匀原生质体，4℃离心，100g，1min，加速度设置为2。
6、弃上清，用预冷的W5溶液轻轻混匀原生质体，在冰上静置30min。
7室温离心，100g离心1min，加速度设置为2，弃上清。每管沉淀用0.5mL MMg溶液轻轻悬浮(本步骤及以下操作在23℃进行)。
8、取20μg质粒加入100μL原生质体。轻轻混匀后加入110μL PEG/Ca溶液轻柔混匀。置于25℃加热块中，避光转化25min。其中所用质粒为重组质粒MYB118-GFP,该重组质粒表达GmMYB118与GFP的融合蛋白，并由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。选取多克隆位点中的BamHΙ酶切位点，经过酶切、连接等步骤将GmMYB118的cDNA全长连入16318hGFP载体中，构建成重组质粒MYB118-GFP。
9、加入440μL W5溶液，以终止反应。23℃离心，100g离心1min，加速度设为2。
10、弃上清，加1mL W5溶液轻柔混匀，置于23℃培养箱中避光培养10-16h。
11、在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。
表1、酶解液
Figure BDA0001718830790000151
注：上述各物质混合于水中后，冷却至室温，加入CaCl2，使CaCl2在酶解液中的浓度为1M。
表2、W5溶液
Figure BDA0001718830790000152
注：用KOH调pH至5.8。
表3、PEG溶液
Figure BDA0001718830790000153
Figure BDA0001718830790000161
表4、MMg溶液
Figure BDA0001718830790000162
注：用KOH调pH至5.6。
图6为GmMYB118在拟南芥原生质体中的定位结果，结果显示GmMYB118定位于细胞核中(图6中A)，图6中B为16318hGFP空载体对照。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 植物耐逆性相关蛋白GmMYB118在调控植物耐逆性中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 287
<212> PRT
<213> 大豆属大豆（Glycine max L.）
<400> 1
Met Ser Arg Ala Ser Ser Ala Ala Asp Ser Ala Ala Ser Gly Glu Ile
1 5 10 15
Ile Leu Phe Gly Val Arg Val Val Val Asp Ser Met Arg Lys Ser Val
20 25 30
Ser Met Ser Asn Leu Ser Gln Tyr Glu His Pro Gln Asp Gly Ser Asn
35 40 45
Asn Lys Asp Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Ala Ser Ala Asp Asp Ala Ala
50 55 60
Pro Gln Asn Ser Gly Arg Leu Arg Glu Arg Glu Arg Lys Arg Gly Val
65 70 75 80
Pro Trp Thr Glu Glu Glu His Lys Leu Phe Leu Val Gly Leu Gln Lys
85 90 95
Val Gly Lys Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ser Lys Asn Tyr Val Lys Thr
100 105 110
Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Leu Arg
115 120 125
Arg Ser Asn Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Leu Phe Asp Ile
130 135 140
Thr Thr Asp Thr Val Ser Ala Ile Pro Met Glu Gly Glu Gln Val Gln
145 150 155 160
Asn Gln Asp Thr Leu Ser His Ser Gln Gln Gln Ser Pro Leu Phe Pro
165 170 175
Ala Glu Thr Ser Lys Ile Asn Gly Phe Pro Met Met Pro Val Tyr Gln
180 185 190
Phe Gly Phe Gly Ser Ser Gly Val Ile Ser Val Gln Gly Gly Asn Gly
195 200 205
Asn Pro Met Glu Glu Leu Thr Leu Gly Gln Gly Asn Val Glu Lys His
210 215 220
Asn Val Pro Asn Lys Val Ser Thr Val Ser Asp Ile Ile Thr Pro Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ser Ser Ala Val Asp Pro Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Ser
245 250 255
Phe Ser Ser Asp Gln Arg Gln Thr Ser Ser Arg His Ser Ala Leu His
260 265 270
Ala Ile Gln Cys Phe Ser Asn Gly Glu Ser Ile Ile Ser Val Ala
275 280 285
<210> 2
<211> 1544
<212> DNA
<213> 大豆属大豆（Glycine max L.）
<400> 2
gtctctctgt ctcaactttc cttcattttc tctcttcctc tcaccgagtc acgcactcgg 60
cttgactcgt acgaactccg atcccccccc gagtcacact caaccagcac caccgcccga 120
tccgacgatg tctcgcgcct cctccgccgc agattccgcc gcctccggtg agatcatact 180
gttcggagtc agagtcgtcg tcgattccat gaggaagagc gtcagcatga gcaacctctc 240
acagtacgag catcctcaag acggcagcaa caacaaagac gctctcgccg ccggttacgc 300
ctccgccgac gacgccgctc ctcagaactc cggccgcctc cgggagcgcg agcgaaagcg 360
aggagttccg tggacggagg aagagcacaa gctgtttttg gttggattgc agaaggtagg 420
gaaaggtgat tggagaggaa tctccaaaaa ctacgtcaaa acgcgaacgc caacgcaggt 480
tgcgagccat gctcagaagt actttctccg acgaagcaac ctcaatcgcc gtcgccgtag 540
atccagcctc tttgacatca ccaccgacac ggtctctgca attccaatgg agggagaaca 600
ggtccagaat caagacacgc tgtctcattc acaacaacaa tcacccttgt ttcctgctga 660
aactagcaaa atcaatgggt ttccaatgat gccagtgtat cagtttgggt ttggttcttc 720
tggagtgatt tcagtccaag gtggcaatgg aaacccaatg gaagaactca ctctgggaca 780
aggaaacgtg gaaaaacata atgtgccaaa caaggtctct acagtgtctg atatcatcac 840
cccgagttct tctagttctg ccgttgaccc accgacactg tccctggggc tatccttttc 900
atctgaccaa agacagacat catcaagaca ttcagcttta catgccatac aatgtttcag 960
caatggagaa agcatcatta gtgttgcttg agattatggt ccttggattc acatattaat 1020
tacatatact aatctttctc tagtttcctg tctttttggt gggagaaaga gaaagaggtt 1080
gaaggaaagg gtgatggatt agagaaggca agaagaagtt ttaagtgact gaatttgatc 1140
cttctgttcc ttgtacagac cccggaaaag gtcctgtcct gtttcttctt gtttgcttat 1200
gttaattaat gtcatgactt tagattcttg tttatttggc cgtttatgtt tgtagtagtt 1260
gatgtaactg aaaataacaa agtactctct gtttttatct gctgataatg tattgacgtt 1320
cgatatggac ttcacagatg agtggtcttt gtggctcctt tggggggata ttatcaagtt 1380
ggtagtctgt ttcattcatg ttaggtgtta gtagttggcc acgtttttct tttctcataa 1440
atactggtag ctgcagtagt atcataattg ttttcgagca aatgtaaatg ttggtcgatt 1500
tacatgtgaa gttataaatt tgtttaaact ttatgtttaa aaaa 1544

Claims (2)

1.氨基酸序列为序列1的蛋白质相关的生物材料在提高拟南芥抗旱性中的应用；
所述生物材料为下述B1）至B14）中的任一种：
B1）编码所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；
B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；
B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；
B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；
B9）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10）含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织；
B12）含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；
B13）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官；
B14）含有B2）所述表达盒的转基因植物器官。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为序列表中序列2的第128-991位的DNA分子。
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