CN112409467B - 植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用。本发明提供GmDof41可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

低温、干旱、土壤盐渍化是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家也克隆了许多不同来源的与抗逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但所取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高盐及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。进一步对处于信号传导途径下游的转录因子在植物多种信号途径相互作用中的调控机制进行研究，对深入理解植物的生物胁迫和非生物胁迫应答过程具有重要意义。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用。

第一方面，本发明要求保护GmDof41蛋白或其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmDof41蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述GmDof41蛋白来源于大豆。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述应用具体体现为：所述GmDof41蛋白或能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物耐逆性增加。

第二方面，本发明保护培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmDof41蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述GmDof41蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明要求保护培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmDof41蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；所述GmDof41蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述“向受体植物中导入能够表达GmDof41蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有能够表达GmDof41蛋白的核酸分子的重组表达载体实现的。

可用现有的表达载体构建含有所述GmDof41蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmDof41蛋白的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用GmDof41蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明中，所述重组表达载体具体可为在pBI121的SmaⅠ和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端1至870位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。

在本发明中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体。

.在上述方法中，将携带有所述GmDof41蛋白的编码基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

所述“能够表达GmDof41蛋白的核酸分子”是如下任一所述的DNA分子：

(D1)序列表的序列2所示的DNA分子；

(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述GmDof41蛋白的DNA分子；

(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述GmDof41蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护上述GmDof41蛋白或其相关生物材料，或，以上任一所述的方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的是选育耐逆性高的植物。

以上任一所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

以上任一所述植物为(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)双子叶植物或单子叶植物；

(C2)豆科植物或十字花科植物；

(C3)大豆或拟南芥。

所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)。

所述大豆具体可为大豆Williams 82。

实验证明，本发明的GmDof41可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为野生型和转基因拟南芥耐盐性检测结果。A：盐处理后野生型与转基因植株表型；B:盐处理后存活率；C:相对电导率；D:叶绿素含量；E-H:盐胁迫相关基因的表达。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图2为野生型和转基因拟南芥抗旱性性检测结果。A：干旱处理后野生型与转基因植株表型；B:干旱处理后存活率；C:相对电导率；D:叶绿素含量；E-H:干旱胁迫相关基因的表达。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图3为侵染不同菌株大豆的耐盐性检测结果。A：盐处理大豆植株表型；B,C:DAB和NBT染色结果；D：叶绿素含量的测定；E：脯氨酸含量的测定；F：过氧化氢含量的测定。Control表示正常生长条件下生长。**表示与CK相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图4为侵染不同菌株大豆的检测结果。A：干旱处理大豆植株表型；B-D:DAB,NBT和Evans blue染色结果；E:GmDof41在大豆转化后根部检测其表达量情况；F：叶绿素含量；G：过氧化氢含量；H:脯氨酸含量的测定。Control表示正常生长条件下生长。**表示与CK相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图5为GmDof41在ABA、盐和干旱处理下的表达量。A：ABA处理；B：盐处理；C：干旱处理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pCAMBIA3301载体、GmU6-sgRNA载体、pCAMBIA3301-Cas9载体、发根农杆菌K599和大豆Williams 82均由中国农业科学院作物科学研究所张辉研究员提供，记载在文章DOi:10.1038/srep10342“Sun et al.，Targeted mutagenesis in soybeanusing the CRISPR-Cas9system，Scientific Reports，2015.5.29”))，经张辉研究员同意后公众可从申请人处获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、GmDof41基因可以提高拟南芥的耐盐性和抗旱性

本实施例提供了一种来源于大豆品种铁丰8号(中国农业科学院作物科学研究所)的基因，其名称为GmDof41基因，其cDNA的序列为序列表中序列2，开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第1至870位，编码序列表中序列1所示的GmDof41蛋白质。GmDof41基因及其编码的蛋白质可以提高植物的耐盐性和抗旱性，具体检测步骤如下：

一、重组表达载体的构建

1、GmDof41基因的克隆

根据GmDof41基因的序列设计引物对(GmDof41-121F和GmDof41-121R)，引物末端分别引入SmaⅠ和SacI酶切识别位点，以铁丰8号大豆cDNA为模板PCR扩增GmDof41基因。

GmDof41-121F：5'-TCCCCCGGGATGTTCCCGCAGAGTTTTAA-3'；

GmDof41-121R：5'-GCCGAGCTCAGAAGGACTTGATGAGAAGG-3'。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0(TaKaRa公司,Code No.:DV807A)回收纯化1Kb左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶SmaⅠ和SacI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶SmaⅠ和SacI酶切pBI121载体(Clontech公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒，将序列正确的重组质粒命名为pBI121-GmDof41，pBI121-GmDof41为在pBI121的SmaⅠ和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端1至870位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒，pBI121-GmDof41能表达GmDof41。

二、转基因植物的获得

1、将步骤一得到的重组质粒pBI121-GmDof41导入农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌C58C1-pBI121-GmDof41。将pBI121载体导入农杆菌C58C1中，得到作为对照的重组菌C58C1-pBI121。

2、将重组农杆菌C58C1-pBI121-GmDof41接种于LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)中进行扩大培养，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、步骤3完成后收集菌体，4℃、4000g离心10min，用转化液(该转化液为向MS液体培养基中添加蔗糖和silwet得到的蔗糖和silwet质量百分比浓度分别为10％和0.02％的液体)重悬菌体得到菌体悬液，菌体悬液的OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌体悬液的容器中，使花序在菌体悬液中浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，将T₁代种子播种于含有卡那霉素的培养基(卡那霉素浓度为50μg/L)中利用卡那霉素筛选得到T₁代阳性植株。

T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T₁代阳性植株得到的T₃代植株进行在DNA和cDNA水平鉴定(DNA水平鉴定的引物对：F:5'-ATGTTCCCGCAGAGTTTTAA-3'；R:5'-AGAAGGACTTGATGAGAAGG-3'；预期条带为870bp；cDNA水平鉴定的引物对：F:5'-AGCTTCGTTTCTGGGGACAC；R:5'-ACCATCTTCATCGCCACACA-3'；预期条带为315bp)。从阳性植株中筛选得到在DNA和cDNA水平上的鉴定结果中均含有目的条带转基因植株，记为转GmDof41基因植株。

按照步骤2-5的方法，将C58C1-pBI121-GmDof41替换为C58C1-pBI121，其他步骤均不变，得到转空载体植株。

三、、转基因植物的耐盐性鉴定

分别将T₃代转GmDof41基因植株(Transgenic line)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，用250mM NaCl水溶液进行盐处理两周，具体处理方法为：待长至3周后，将栽培盆放入含有约2L的250mM NaCl水溶液底盆中(和浇水的方式一样，浇水时把水倒入底盆中，然后把栽培小盆放入其中，让其自然渗吸)，让其自然渗吸，两周后统计存活率、相对电导率、叶绿素含量和干旱胁迫相关基因的表达。

相对电导率测定方法：每个株系取叶片1g，并设着五个重复，将叶片分别浸入10ml去离子水中，用真空泵抽气10分钟，然后室温静置1小时。将各称量瓶充分摇匀，用电导仪测定其初始电导值S1。然后将各称量瓶置于沸水中10分钟，后冷却至室温，测电导值S2，测去离子水电导值S0。计算：相对电导率＝(S1-S0)/(S2-S0)。

叶绿素含量测定：采用乙醇丙酮法，各取0.1g叶片置于乙醇丙酮混合液中，过夜，然后利用酶标仪测定其在D652处荧光值。计算：叶绿素总含量＝D652*体积/34.2*叶片重量。

干旱胁迫相关基因定量检测引物：

AtHKT1F:5’-TCAGTGCATATGGAAACGTTGG-3’；

AtHKT1R:5’-CCATTGGACTCCATCGTCCTG-3’；

AtSOS3F:5’-CGCTTCTTCACGAATCCGAACTAGTTC-3’；

AtSOS3R:5’-GGCAAAGTCATGTTCTTGATGAGCGATG-3’；

RD29AF:5’-TGTTCGGCTTTGGATTAAGAAG-3’；

RD29AR:5’-AGACAACACCTCAACAAGTCACA-3’。

结果见图1，结果显示，在经盐处理后，转GmDof41基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，表明，转GmDof41基因植株具有耐盐性，GmDof41基因及其所编码的蛋白质GmDof41可以用来提高拟南芥的耐盐性。

按照上述方法，鉴定转空载体对照植株的耐盐性，结果显示，空载体对照植株在经2L 250mM NaCl水溶液处理两周后其表型与野生型拟南芥拟南芥Col-0无明显区别，且其存活率也与拟南芥拟南芥Col-0无显著差异。

四、转基因植物的抗旱性鉴定

分别将T₃代转GmDof41基因植株(Transgenic line)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行抗旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，干旱处理两周，复水3天，统计植株存活率、相对电导率、叶绿素含量和盐胁迫相关基因的表达。

结果见图2，结果显示，在经干旱与复水处理后，转GmDof41基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，表明，转GmDof41基因植株具有抗旱性，GmDof41基因及其所编码的蛋白质GmDof41可以用来提高拟南芥的抗旱性。

盐胁迫相关基因定量检测引物：

DREB1AF：5’-TCTCTGAACACAAGAGTCGTTT-3’；

DREB1AR：5’-CTTCTTCTCACCGTCTTCAC-3’；

COR47F：5’-GGAGTACAAGAACAACGTTCCCGA-3’；

COR47R：5’-TGTCGTCGCTGGTGATTCCTCT-3’；

AtP5CS1F：5’-GGTTTCCGATTTGGACTTGGTGCAG-3’；

AtP5CS1R：5’-CCATTGTCTCCGTCGACAACTTGTC。

实施例2、GmDof41基因及其编码的蛋白质可以提高毛状根大豆的耐盐性和抗旱性

一、GmDof41植物过表达载体构建

1、根据大豆GmDof41cDNA序列和pCAMBIA3301载体中NcoI，BglII酶切位点两侧序列与同源重组要求[正向引物与载体左臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段正向序列(20-25nt左右)，反向引物与载体右臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段反向序列(20-25nt左右)]设计引物序列如下：

GmDof41-3301-T-F：5'-GGACTCTTGACCATGATGTTCCCGCAGAGTTTTAA-3'；

GmDof41-3301-T-R：5'-ATTCGAGCTGGTCACCAGAAGGACTTGATGAGAAGG-3'。

2、以铁丰8号大豆经反转后的cDNA为模板，使用北京全式金生物技术有限公司的

FastPfu PCR SurperMix进行PCR扩增，得到PCR产物；

3、将步骤2得到的PCR产物经琼脂糖电泳检测后，纯化回收酶切产物；

4、先用NcoI与BglII内切酶酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架；

5、用北京全式金生物技术有限公司的Quick-Fusion Clong Kit将步骤3回收的酶切产物克隆到pCAMBIA3301载体中，将得到的序列正确的重组载体命名为35S：GmDof41。35S：GmDof41为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体，该重组载体能表达GmDof41，GmDof41基因的表达由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。

二、大豆毛状根的转化过程

将35S：GmDof41和pCAMBIA3301载体分别导入发根农杆菌K599中，将得到的重组菌分别命名为K599-35S：GmDof41和K599-pCAMBIA3301。

1、将大豆Williams 82种子播于混合土中(营养土：蛭石＝1：1)1-2cm深。置于温室，白天28℃/晚上20℃，每天浇水；

2、用注射器分别挑取K599-35S：GmDof41和K599-pCAMBIA3301侵染6天大子叶尚未展开的幼苗大豆的子叶节；

3、侵染完用塑料盒盖上；

4、待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30天，每两天交一次水，保持浸染部分的潮湿环境；

5、30天后，当毛状根长到5-10cm时，将主根减去(此时毛状根用于GmDof41基因表达量检测)，得到的植株称为复合体植株，将复合体植株埋入混合土中(营养土：蛭石＝1：1)，每三天浇一次水；

6、45天后，待毛状根恢复到足够健康时，按照实施例1中的方法进行盐处理和干旱处理。

7、盐处理结果和生理指标测定结果见图3；旱处理结果和生理指标测定结果见图4。其中，所测生理指标为叶绿素、脯氨酸和丙二醛，所测叶绿素、脯氨酸和丙二醛分别为叶片的叶绿素、脯氨酸和丙二醛的含量。丙二醛和脯氨酸检测都采用科铭有限公司生产的试剂盒，按照公司所提供的步骤进行操作。

各植株GmDof41基因表达量检测结果显示，侵染了K599-35S：GmDof41的大豆毛状根中GmDof41基因的表达量显著高于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根。

盐处理和干旱处理的结果显示，与侵染K599-pCAMBIA3301的大豆相比，侵染K599-35S：GmDof41的大豆表现出了更强的耐盐性和抗旱性。表明，GmDof41基因及其所编码的蛋白质GmDof41可以用来提高大豆的耐盐性和抗旱性。

实施例3、实时荧光定量PCR分析GmDof41的表达特性

一、胁迫处理

取室温生长20d左右的大豆铁丰8号幼苗进行以下处理：

(1)干旱处理：干旱处理：将大豆幼苗置于滤纸上进行自然干旱处理，在处理0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)高盐处理：将大豆幼苗置于200mM的NaCl水溶液中，在处理1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)ABA处理：用100μMABA喷施大豆叶片，在处理0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。

三、反转录为cDNA

将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因的特异引物对(引物序列为F:5'-AGCTTCGTTTCTGGGGACAC；R:5'-ACCATCTTCATCGCCACACA-3')对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin(RT-Gmactin F：ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT，RT-Gmactin R：CTGTTGGAAGGTGCTGAG)做内参。Q-RT-PCR在ABI

7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.Actin)_{Time x}－(C_T.Target－C_T.Actin)_{Time 0}

Time x表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

结果见图5。结果显示，干旱和高盐处理均可以使GmDof41基因的表达升高，在干旱环境中，在处理的第12小时GmDof41基因的表达量达到最高。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 植物耐逆性相关蛋白GmDof41在调控植物耐逆性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 1

Met Phe Pro Gln Ser Phe Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Gly Leu Glu

1 5 10 15

Gln Leu Leu Gln Pro His His Phe Pro Ser Pro Met Glu Gln Gln Gln

20 25 30

Gln Arg Ser Arg Trp Lys Pro Ser Val Glu Val Ala Pro Asn Cys Pro

35 40 45

Arg Cys Ala Ser Thr Asn Thr Lys Phe Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Gln Pro Arg Tyr Phe Cys Lys Gly Cys Arg Arg Tyr Trp Thr

65 70 75 80

Lys Gly Gly Ser Leu Arg Asn Val Pro Val Gly Gly Gly Cys Arg Lys

85 90 95

Asn Arg Arg Gly Lys Ser Leu Gln Ser Ser Ser Ser Arg Gln Gln Arg

100 105 110

Ala Ser Ser Phe Val Ser Gly Asp Thr Glu Ser Ser Phe Ser Asp Ala

115 120 125

Gln Gln Ile Asn Asn Gly Ser Arg Asp Ile Asp Met Ala Leu Val Phe

130 135 140

Ala Lys Phe Leu Asn Pro Lys Pro Thr Thr Gly Glu Asp Asn Asn Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Ser Asn Asn Phe Thr Pro Glu Ser Val Glu Ile Glu

165 170 175

Asn Asp Ala Val Val Gln Ser Gln Asn Lys Ala Ser Ser Asp Pro Val

180 185 190

Ile Val Glu Ser Glu Asn Leu Ser Leu Gly Glu Ile Asp Glu Leu Glu

195 200 205

Arg Leu Leu Gly Val Cys Gly Asp Glu Asp Gly Leu Trp Ser Asp Ala

210 215 220

Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Trp Glu Pro Pro Leu Lys Glu Leu Glu

225 230 235 240

Tyr Ser Met Pro Leu Asn Glu Asp Asp Asp Asp Ala Gln Leu Leu Pro

245 250 255

Ile Ile Thr Ser Ala Ser Thr Met Ile Ser Asp Ser Cys Trp Ser Asn

260 265 270

Trp Ser Ser Phe Asp Leu Ser Thr Met Glu Ala Phe Ser Ser Ser Pro

275 280 285

Ser

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 2

atgttcccgc agagttttaa cattagtggc ggtggtgccg ggcttgaaca actgttgcag 60

cctcatcact tcccatctcc aatggaacaa caacaacaac gttccaggtg gaaacccagc 120

gtcgaggtgg cacccaattg ccctcgctgc gcctccacca acaccaaatt ctgttactac 180

aacaactaca gcttgtccca gccgaggtac ttctgcaaag gctgcaggcg atactggacc 240

aaaggcggct ctctccgcaa cgtccctgtc ggcggtggct gccgcaagaa ccgccgcgga 300

aaatcgttgc agtcgtcgtc gtcgcggcaa caacgcgctt ctagcttcgt ttctggggac 360

acagagtcat catttagtga tgcccaacag attaacaacg ggtctcgtga tatagacatg 420

gctctcgtgt ttgcaaaatt cttgaaccca aaaccaacca ctggtgagga taacaatggc 480

tcatcttcga cttccaacaa ttttacaccg gaaagtgtag aaattgagaa tgatgcagtg 540

gttcagtctc agaataaggc ttcatccgat cctgttattg tagagtctga gaatttgagt 600

ttgggtgaga ttgatgagtt ggagaggtta ttaggtgtgt gtggcgatga agatggtctt 660

tggtctgatg ctaccttgtc ttcttcggtt acttgggaac caccattgaa ggagttggaa 720

tactcgatgc cgttgaatga ggatgatgat gatgctcaat tgttacccat catcacttct 780

gcatccacaa tgatcagcga ctcttgctgg agtaattgga gttcttttga tctttcaacc 840

atggaagcct tctcatcaag tccttcttaa 870

Claims (7)

1.GmDof41蛋白或其相关生物材料在提高植物耐逆性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmDof41蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用具体体现为：所述GmDof41蛋白或能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子在所述植物中的活性或表达量提高，植物耐逆性增加。

3.培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmDof41蛋白的表达量或活性提高的步骤；

所述GmDof41蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

4.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmDof41蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；

所述GmDof41蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达GmDof41蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有能够表达GmDof41蛋白的核酸分子的重组表达载体实现的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述“能够表达GmDof41蛋白的核酸分子”为序列表的序列2所示的DNA分子。

7.GmDof41蛋白或其相关生物材料，或，权利要求3至6任一所述的方法在植物育种中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmDof41蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述育种的目的是选育耐逆性高的植物；

所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

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