CN107176983B - 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质PpLEA3‑3在调控植物抗逆性中的应用。所述蛋白质PpLEA3‑3为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。实验证明，与野生型拟南芥相比，过表达PpLEA3‑3基因的拟南芥的抗逆性显著增加。本发明对植物抗逆性的新材料的选育具有重要应用价值。

Description

蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

植物的生长发育过程中经受的环境胁迫多种多样，主要有干旱和高盐等。运用基因工程技术改良农作物可以提高其对逆境的抵抗能力，从而提高农作物产量，这是现在现代生命科学研究的热点话题。近年来人们从生理、生化、代谢、生态、遗传等角度对于植物响应各种非生物胁迫做了大量研究。随着后来分子生物学的发展，人们从分子水平上对于植物抗逆机制有了更进一步研究，在基因组成、表达调控和信号传导等方面都积累了丰富的资料，为基因工程改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径，其中最关键的技术瓶颈问题是有效抗逆基因的筛选与功能发现。

苔藓植物是5亿年前古奥陶纪出现的陆地先锋植物，其中“茎叶体”的配子体在其生活史中是主要营养生长阶段。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，缺乏输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。当原始“苔藓植物”离水登陆时，由于缺乏水分输导和调控系统，水分亏损和温度骤变会成为主要的两大胁迫。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于维管植物(如蕨类、种子植物)的逆境应对机制，如存在于苔藓植物细胞内的一些抗逆基因可以保护细胞免于逆境伤害。

小立碗藓是一种苔藓植物，是研究水生植物向陆生植物进化过程的理想物种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质PpLEA3-3为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2可由554个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质PpLEA3-3，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质PpLEA3-3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质PpLEA3-3的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述应用中，所述调控植物抗逆性具体可为增加植物抗逆性。

编码所述蛋白质PpLEA3-3的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述编码所述蛋白质PpLEA3-3的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1665个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的蛋白质PpLEA3-3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质PpLEA3-3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质PpLEA3-3且具有蛋白质PpLEA3-3的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia。

上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

为解决上述问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性转基因植物的方法，包括使所述蛋白质PpLEA3-3在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质PpLEA3-3的活性，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性提高。

上述方法中，所述“使所述蛋白质PpLEA3-3在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质PpLEA3-3的活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过表达所述蛋白质PpLEA3-3、或提高所述蛋白质PpLEA3-3的活性的效果。

上述方法中，所述“使所述蛋白质PpLEA3-3在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质PpLEA3-3的活性”具体可为向受体植物中导入所述蛋白质PpLEA3-3的编码基因。

上述方法中，所述蛋白质PpLEA3-3的编码基因可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子。

其中，序列表中序列1由1665个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述受体植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia。

上述方法中，所述“向受体植物中导入所述蛋白质PpLEA3-3的编码基因”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述蛋白质PpLEA3-3的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP。所述重组质粒

35S::PpLEA3-3:eGFP具体可为将载体pPZP111的限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ识别序列间的片段(载体pPZP111被限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1自5’末端起第1至1662位所示的DNA分子，得到中间载体；将中间载体的限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列间的片段(中间载体被限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列3自5’末端起第7位至第726位所示的DNA分子。

所述重组载体具体可为重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP。所述重组质粒

LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP具体可为将重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP的限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列间的片段(重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP被限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的DNA分子。

所述重组载体具体可为重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3。所述重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3具体可为将载体pPZP111的限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ识别序列间的片段(载体pPZP111被限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列1所示的DNA分子，得到中间载体；将该中间载体的限制性内切酶PstⅠ和BamH Ⅰ识别序列间的片段(中间载体被限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的DNA分子。

所述“与受体植物相比，转基因植物的抗逆性提高”具体体现为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)和/或(c5)和/或(c6)：

(c1)逆境条件下，转基因植物的根长长于所述受体植物；

(c2)逆境条件下，转基因植物的存活率高于所述受体植物；

(c3)逆境条件下，转基因植物叶片中的叶绿素含量高于所述受体植物；

(c4)逆境条件下，转基因植物叶片中的丙二醛含量低于所述受体植物；

(c5)逆境条件下，转基因植物叶片中的脯氨酸含量高于所述受体植物；

(c6)逆境条件下，转基因植物叶片中的SOD含量高于所述受体植物。

所述存活率具体可为在组织培养的条件下或营养土培养的条件下的统计结果。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质PpLEA3-3的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。

上述任一所述方法中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

所述抗逆性为抗旱性时，所述逆境条件具体可在干旱环境中生长。所述干旱环境具体可为Mannitol含量为100mM以上的环境。

所述抗逆性为抗盐性时，所述逆境条件具体可为在高盐环境中生长。所述高盐环境具体可为NaCl含量为50mM以上的环境。

上述任一所述的方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明所提供的蛋白质PpLEA3-3能提高植物的抗逆性：与野生型拟南芥相比，T₃代纯合拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥株系Line1、T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP拟南芥株系Line4和T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3拟南芥株系Line7的抗盐性和抗旱性显著增加。因此，可以利用蛋白质PpLEA3-3调控植物抗逆性。本发明对植物抗逆性的新材料的选育具有重要应用价值。

附图说明

图1为不同逆境胁迫下PpLEA3-3基因的表达模式。

图2为重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP、重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP和重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3的结构示意图。

图3为转PpLEA3-3基因拟南芥的分子检测结果。

图4为转PpLEA3-3基因拟南芥的转录分析检测结果。

图5为鉴定转PpLEA3-3基因拟南芥的抗逆性。

图6PpLEA3-3蛋白的亚细胞定位分析。

具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小立碗藓和BCD固体培养基均记载在如下文献中：Cove DJ，Perroud PF，CharronAJ，McDaniel SF，Khandelwal A，Quatrano RS.Isolation of DNA，RNA，and protein fromthe moss Physcomitrella patens gametophytes.Cold Spring Harb Protoc.2009 Feb；2009(2):pdb.prot5146.doi:10.1101/pdb.prot5146.公众可从首都师范大学(即申请人处)获得小立碗藓，以重复本申请实验。

载体pPZP111记载在如下文献中：Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P.The small，versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol.1994 Sep；25(6)：989-94.公众可从首都师范大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

野生型拟南芥Columbia记载在如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，KimM，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses andflowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.公众可从首都师范大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。野生型拟南芥Columbia在下文中简称野生型拟南芥。

pEASY-Blunt Simple载体为北京全式金生物技术有限公司产品。

光照培养是指在温度25℃、相对湿度70％进行连续光照培养，光照强度为40～60μmol/m².s^-1。

实施例1、蛋白质PpLEA3-3的发现与PpLEA3-3基因的克隆

一、蛋白质PpLEA3-3的发现

1、样本的制备

取在BCD固体培养基上光照培养7天的小立碗藓茎叶体，转移至浸湿的滤纸上，然后共同置于500mL烧杯中，吸水纸封口，然后置于温度为24±1℃、相对湿度为30±5％的培养室中处理3天，得到干旱处理的小立碗藓茎叶体。

按照上述方法，将“温度为24±1℃、相对湿度为30±5％的培养室”替换为“温度为24±1℃、相对湿度为70±5％的培养室”，其它步骤均不变，得到正常处理的小立碗藓茎叶体。

2、蛋白质PpLEA3-3的发现

利用酚抽提法提取干旱处理的小立碗藓茎叶体的蛋白质，命名为干旱处理-蛋白质；然后采用IEF/SDS-PAGE双向电泳技术和荧光差异凝胶电泳法分离，获得干旱处理-蛋白质的蛋白质图谱。

按照上述方法，将“干旱处理的小立碗藓茎叶体”替换为步骤1中得到的正常处理的小立碗藓茎叶体，其它步骤均不变，得到正常处理-蛋白质的蛋白质图谱。

用ImageMaster 2D Platinum软件和DeCyder 2D Version 6.5 Software分析干旱处理-蛋白质的蛋白质图谱和正常处理-蛋白质的蛋白质图谱，与正常处理相比，获得若干干旱处理的小立碗藓茎叶体中丰度变化超过2倍的蛋白质点(简称差异蛋白点)。分离差异蛋白点，然后分别用胰蛋白酶处理，得到的多肽用MALDI TOF/TOF MS和NCBI数据库进行鉴定。

实验结果表明，与正常处理相比，有一种蛋白质在IEF/SDS-PAGE双向电泳凝胶上被上调了9.6倍，在荧光差异凝胶电泳凝胶上被上调了14.6倍，推测可能与小立碗藓的抗逆性相关；在下文中，将该蛋白质命名为蛋白质PpLEA3-3，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、PpLEA3-3基因的克隆

本发明的申请人从小立碗藓中克隆出蛋白质PpLEA3-3的编码基因。具体方法如下：

1、模板的获得：采用Trizol法提取小立碗藓的茎叶体的总RNA，然后用逆转录酶反转录出第一链cDNA。

2、人工合成引物CDS-F：5’-GGATCCATGAATCAGTACGGAAGAGA-3’(下划线为限制性内切酶BamH Ⅰ的识别序列)和CDS-R：5’-GGTACCGTGGTGCAGCTTCTCCTTG-3’(下划线为限制性内切酶Kpn Ⅰ的识别序列)。

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的CDS-F和CDS-R为引物进行PCR扩增，得到约1700bp的双链DNA分子,然后进行纯化、回收，得到DNA片段1。

4、将DNA片段1连接至pEASY-Blunt Simple载体，得到重组质粒pEASY-PpLEA3-3。

根据测序结果，重组质粒pEASY-PpLEA3-3含有序列表中的序列1自5’末端起第1至1662位所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质PpLEA3-3。

实施例2、不同逆境胁迫下的PpLEA3-3基因的表达模式

1、取在BCD固体培养基上光照培养7天的小立碗藓茎叶体，置于含150mM NaCl的BCD固体培养基中处理24h，得到高盐处理茎叶体1。

2、按照步骤1的方法，将24h替换为48h，得到高盐处理茎叶体2。

3、按照步骤1的方法，将24h替换为96h，得到高盐处理茎叶体3。

4、取在BCD固体培养基上光照培养7天的小立碗藓茎叶体，置于BCD固体培养基处理24h，得到正常处理茎叶体1。

5、按照步骤4的方法，将24h替换为48h，得到正常处理茎叶体2。

6、按照步骤4的方法，将24h替换为96h，得到正常处理茎叶体3。

7、取在BCD固体培养基上光照培养7天的小立碗藓茎叶体，置于含250mM甘露醇的BCD固体培养基中处理24h，得到渗透胁迫处理茎叶体1。

8、按照步骤7的方法，将24h替换为48h，得到渗透胁迫处理茎叶体2。

9、按照步骤7的方法，将24h替换为96h，得到渗透胁迫处理茎叶体3。

提取高盐处理茎叶体1、高盐处理茎叶体2、高盐处理茎叶体3、正常处理茎叶体1、正常处理茎叶体2、正常处理茎叶体3、干旱处理茎叶体1、干旱处理茎叶体2或干旱处理茎叶体3的总RNA，并对各总RNA中的PpLEA3-3基因的表达量进行实时定量分析，引物为5’-CGCCGTGTTGAACCTGGATATG-3’和5’-ACCGTGATGGCCAAGATCAGTAAG-3’。内参为ACTIN2基因，内参的引物为5’-GTCGTACAACCGGTATTGTG-3’和5’-GAGCTGGTCTTTGAGGTTTC-3’。

以正常处理茎叶体1中的PpLEA3-3基因的表达量作为1，各处理茎叶体中的PpLEA3-3基因的相对表达量见图1(图1中，Pp CK 24h为正常处理茎叶体1，Pp CK 48h为正常处理茎叶体2，Pp CK 96h为正常处理茎叶体3，Pp NaCl 24h为高盐处理茎叶体1，Pp NaCl48h为高盐处理茎叶体2，Pp NaCl 96h为高盐处理茎叶体3，Pp Manitol 24h为渗透胁迫处理茎叶体1，Pp Manitol 48h为渗透胁迫处理茎叶体2，Pp Manitol 96h为渗透胁迫处理茎叶体3)：与正常处理茎叶体1相比，PpLEA3-3基因在高盐处理茎叶体1、高盐处理茎叶体2、高盐处理茎叶体3、渗透胁迫处理茎叶体1、渗透胁迫处理茎叶体2和渗透胁迫处理茎叶体3中均上调表达，表达倍数分别为13000倍、44000倍、71000倍、174000倍、142000倍和92000倍。结果表明，PpLEA3-3基因在响应高盐胁迫和渗透胁迫的过程中均发挥重要作用。

实施例3、转PpLEA3-3基因的拟南芥的获得和抗逆性鉴定

一、重组质粒的构建

1、重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP的构建

(1)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切实施例1步骤2构建的重组质粒pEASY-PpLEA3-3，回收约1665bp的DNA片段2。

(2)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切载体pPZP111，回收约8.9Kb的载体骨架1。

(3)将DNA片段2与载体骨架1连接，得到重组质粒甲。

(4)人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子。

(5)用限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切步骤(4)合成的双链DNA分子，然后进行纯化、回收，得到DNA片段3。

(6)用限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切重组质粒甲，回收约9.3Kb的载体骨架2。

(7)将DNA片段3与载体骨架2连接，得到重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP。

根据测序结果，对重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP进行结构描述如下：将载体pPZP111的限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ识别序列间的片段(载体pPZP111被限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列1自5’末端起第1至1662位所示的DNA分子，得到中间载体；将中间载体的限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列间的片段(中间载体被限制性内切酶Sac Ⅰ和Xho Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列3自5’末端起第7位至第726位所示的DNA分子。重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP的结构示意图见图2中A。

2、重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP的构建

(1)人工合成序列表中序列4所示的双链DNA分子。序列表中序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的DNA分子为野生型拟南芥中启动AtLEA3-3基因的启动子序列。

(2)用限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切步骤(1)合成的双链DNA分子，然后进行纯化、回收，得到DNA片段4。

(3)用限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP，回收约11.0kb的载体骨架3。

(4)将DNA片段4与载体骨架3连接，得到重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP。

根据测序结果，对重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP进行结构描述如下：将重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP的限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列间的片段(重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP被限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的DNA分子。重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP的结构示意图如图2中B。

3、重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3的构建

(1)人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。

(2)向载体pPZP111的限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ识别序列间插入步骤(1)合成的双链DNA分子，得到重组质粒乙；

(3)用限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切步骤(2)构建的重组质粒乙，回收约8.9Kb的载体骨架4。

(4)将步骤2中(2)得到的DNA片段4和载体骨架4连接，得到重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3。

根据测序结果，对重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3进行结构描述如下：将载体pPZP111的限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ识别序列间的片段(载体pPZP111被限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列1所示的DNA分子，得到中间载体；将中间载体的限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列间的片段(中间载体被限制性内切酶Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中的序列4自5’末端起第7位至第1742位所示的DNA分子。重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3的结构示意图如图2中C。

二、拟转35S::PpLEA3-3:eGFP的植株的获得

1、将重组质粒35S::PpLEA3-3::eGFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/35S::PpLEA3-3:eGFP。

2、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤1获得的GV3101/35S::PpLEA3-3:eGFP转至野生型拟南芥中，获得T₁代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子。

3、将步骤2获得的T₁代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP阳性苗，T₁代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP阳性苗收到的种子即为T₂代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子。

4、将步骤3筛选得到的不同株系的T₂代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为PpLEA3-3基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子。

5、将步骤4筛选得到的T₃代拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥种子再次播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥。将其中3个T₃代纯合拟转35S::PpLEA3-3:eGFP拟南芥株系分别命名为Line1、Line2和Line3。

三、拟转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP的植株的获得

按照上述步骤二的方法，将重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP替换为重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP，其它步骤均相同，得到T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP拟南芥。将其中3个T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP拟南芥株系分别命名为Line4、Line5和Line6。

四、拟转LEA3_pro::PpLEA3-3的植株的获得

按照上述步骤二的方法，将重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP替换为重组质粒LEA3_pro::PpLEA3-3，其它步骤均相同，得到T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3拟南芥。将其中3个T₃代纯合拟转LEA3_pro::PpLEA3-3拟南芥株系分别命名为Line7、Line8和Line9。

五、转空载体拟南芥的获得

按照上述步骤二的方法，将重组质粒35S::PpLEA3-3:eGFP替换为载体pPZP111，其它步骤均相同，得到T₃代纯合拟转空载体拟南芥，简称拟转空载体拟南芥。

六、分子检测和转录分析

1、分子检测

以野生型拟南芥、拟转空载体拟南芥的T₃代植株、Line1的T₃代植株、Line2的T₃代植株、Line3的T₃代植株、Line4的T₃代植株、Line5的T₃代植株、Line6的T₃代植株、Line7的T₃代植株、Line8的T₃代植株或Line9的T₃代植株的基因组DNA为模板，以实施例1步骤二中2人工合成的引物CDS-F和CDS-R为引物，进行PCR扩增。

PCR扩增的实验结果见图3(WT为野生型拟南芥)。结果表明，Line1的T₃代植株、Line2的T₃代植株、Line3的T₃代植株、Line4的T₃代植株、Line5的T₃代植株、Line6的T₃代植株、Line7的T₃代植株、Line8的T₃代植株或Line9的T₃代植株均能够扩增得到约1700bp的条带，而野生型拟南芥和拟转空载体拟南芥均不能扩增得到约1700bp的条带。因此，Line1、Line2和Line3的T₃代植株均鉴定为T₃代纯合转35S::PpLEA3-3:eGFP的拟南芥，Line4、Line5和Line6的T₃代植株均鉴定为T₃代纯合转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP的拟南芥，Line7、Line8和Line9的T₃代植株均鉴定为T₃代纯合转LEA3_pro::PpLEA3-3的拟南芥，拟转空载体拟南芥鉴定为转空载体拟南芥。

T₃代纯合转35S::PpLEA3-3:eGFP的拟南芥、T₃代纯合转LEA3_pro::PpLEA3-3:eGFP的拟南芥和T₃代纯合转LEA3_pro::PpLEA3-3的拟南芥均称为T₃代纯合转PpLEA3-3基因的拟南芥。

2、转录分析

(1)取5粒野生型拟南芥种子，先播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养7天；然后转移至含150mM NaCl的1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养1天，得到盐处理-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(1)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到盐处理-转空载体拟南芥幼苗、盐处理-Line1拟南芥幼苗、盐处理-Line4拟南芥幼苗和盐处理-Line7拟南芥幼苗。

(2)按照步骤(1)的步骤，将含150mM NaCl的1/2MS培养基替换为1/2MS培养基，其它步骤均不变，得到对照-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(2)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到对照-转空载体拟南芥幼苗、对照-Line1拟南芥幼苗、对照-Line4拟南芥幼苗和对照-Line7拟南芥幼苗。

(3)按照步骤(1)的步骤，将含150mM NaCl的1/2MS培养基替换为含400mM Manitol的1/2MS培养基，其它步骤均不变，得到渗透胁迫处理-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(3)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到渗透胁迫处理-转空载体拟南芥幼苗、渗透胁迫处理-Line1拟南芥幼苗、渗透胁迫处理-Line4拟南芥幼苗和渗透胁迫处理-Line7拟南芥幼苗。

(4)完成步骤(1)、(2)和(3)后，提取各拟南芥幼苗的总RNA，用逆转录酶反转得到cDNA，对cDNA中PpLEA3-3基因的表达量进行实时定量分析并取平均值，引物为5’-CGCCGTGTTGAACCTGGATATG-3’和5’-ACCGTGATGGCCAAGATCAGTAAG-3’。内参为ACTIN2基因，内参的引物为5’-GTCGTACAACCGGTATTGTG-3’和5’-GAGCTGGTCTTTGAGGTTTC-3’。

实验结果见图4(C为对照，S为盐处理，O为渗透胁迫处理)。结果表明，与野生型拟南芥相比，T₃代纯合转PpLEA3-3基因的拟南芥(Line1的T₃代植株、Line4的T₃代植株和Line7的T₃代植株)中PpLEA3-3基因的表达量显著上调(如：35S启动子可使PpLEA3.3基因上调300000倍以上，野生型拟南芥中启动AtLEA3-3基因的启动子可使PpLEA3.3基因上调10倍以上)，而转空载体拟南芥中PpLEA3-3基因的表达量则无显著差异。

七、转PpLEA3-3基因的拟南芥的抗逆性鉴定

待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子或Line7的T₃代种子。

1、根长统计

(1)取5粒待测拟南芥种子，先播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养6天；然后转移至盐处理培养基(含50mM NaCl的1/2MS培养基、含100mM NaCl的1/2MS培养基、含125mMNaCl的1/2MS培养基或含150mM NaCl的1/2MS培养基)上，20℃光暗交替培养4天，测量根长并取平均值。

(2)取5粒待测拟南芥种子，播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养10天，测量根长并取平均值(作为对照)。

(3)取5粒待测拟南芥种子，先播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养6天；然后转移至胁迫处理培养基(含100mM Manitol的1/2MS培养基、含200mM Manitol的1/2MS培养基、含300mM Manitol的1/2MS培养基或含400mM Manitol的1/2MS培养基)上，20℃光暗交替培养4天，测量根长并取平均值。

以对照的根长作为1，统计其它处理的相对根长。实验结果见图5中A和B(CK为对照)。

2、存活率统计

A、采用营养土培养方式统计存活率

(1)将30粒待测拟南芥种子播种于营养土中，正常培养42天，得到正常处理的待测拟南芥植株。

(2)将30粒待测拟南芥种子播种于营养土中，正常培养21天；第22天开始通过停止浇水进行渗透胁迫，干旱胁迫14天；第36天开始正常浇水，复水处理7天，得到干旱胁迫的待测拟南芥植株。

(3)将30粒待测拟南芥种子播种于营养土中，正常培养21天；第22天开始通过施加150mM NaCl水溶液进行高盐胁迫(每隔7天施加一次；每次取150mM NaCl水溶液4L，置于种植有拟南芥的盆外部，待盆中的营养土饱和吸收后，弃去盆外部的剩余溶液)，高盐胁迫21天，得到高盐胁迫的待测拟南芥植株。

统计正常处理的待测拟南芥植株、干旱胁迫的待测拟南芥植株和高盐胁迫的待测拟南芥植株的存活率。存活率＝存活的拟南芥幼苗数/30×100％。

实验结果见图5中C(未处理为正常处理的待测拟南芥植株)。

B、采用组织培养方式统计存活率

取30粒待测拟南芥种子，播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养6天，然后转移至1/2MS培养基、含150mM NaCl的1/2MS培养基或含400mM Manitol的1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养6天，统计存活率。存活率＝存活的拟南芥幼苗数/30×100％。

实验结果见图5中D(未处理为1/2MS培养基，高盐胁迫为含150mM NaCl的1/2MS培养基，渗透胁迫为含400mM Manitol的1/2MS培养基)。

3、转PpLEA3-3基因的拟南芥的抗逆性相关生理指标的测定

A、样本的制备

(1)取5粒野生型拟南芥种子，先播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养7天；然后转移至含150mM NaCl的1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养7天，得到盐处理-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(1)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到盐处理-转空载体拟南芥幼苗、盐处理-Line1拟南芥幼苗、盐处理-Line4拟南芥幼苗和盐处理-Line7拟南芥幼苗。

(2)按照步骤(1)的步骤，将含150mM NaCl的1/2MS培养基替换为1/2MS培养基，其它步骤均不变，得到对照-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(2)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到对照-转空载体拟南芥幼苗、对照-Line1拟南芥幼苗、对照-Line4拟南芥幼苗和对照-Line7拟南芥幼苗。

(3)按照步骤(1)的步骤，将含150mM NaCl的1/2MS培养基替换为含400mM Manitol的1/2MS培养基，其它步骤均不变，得到渗透胁迫处理-野生型拟南芥幼苗。

按照上述步骤(3)的方法，将野生型拟南芥种子分别替换为转空载体拟南芥的T₃代种子、Line1的T₃代种子、Line4的T₃代种子和Line7的T₃代种子，其它步骤均不变，得到渗透胁迫处理-转空载体拟南芥幼苗、渗透胁迫处理-Line1拟南芥幼苗、渗透胁迫处理-Line4拟南芥幼苗和渗透胁迫处理-Line7拟南芥幼苗。

B、转PpLEA3-3基因的拟南芥的抗逆性相关生理指标的测定

测量步骤1制备的各样本的叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸和SOD含量含量并取平均值，从而评价转PpLEA3-3基因的拟南芥的抗逆性。测量叶绿素含量和丙二醛含量的方法均记载于如下文献中：Song X，Fang J，Han X，He X，Liu M，Hu J，ZhuoR.Overexpression of quinone reductase from Salix matsudana Koidz enhancessalt tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.Gene.2016 Jan.576(1Pt 3):520-7。测量脯氨酸含量的方法记载于如下文献中：Szabados，L.L.，&Savourcb，A.(2010).Proline:a multifunctional amino acid.Trends in Plant Science，15(2)，89-97.测量SOD含量的方法记载于如下文献中：Ali，Akram，F.Alqurainy，N.Motohashi.Activitiesof antioxidants in plants under environmental stress.2006.实验均重复三次取平均值。

实验结果见图5中E、F、G和H(E为叶绿素含量的测定结果，F为丙二醛含量的测定结果，G为脯氨酸含量的测定结果，H为SOD含量的测定结果；未处理为步骤1中(2)中的拟南芥植株，即正常生长条件下的拟南芥植株；高盐胁迫为步骤1中(1)中的拟南芥植株；渗透胁迫为步骤1中(3)中的拟南芥植株)。

上述实验结果表明，在正常生长条件下，野生型拟南芥植株、转空载体拟南芥的T₃代植株、Line1的T₃代植株、Line4的T₃代植株和Line7的T₃代植株中的相对根长、存活率、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、SOD含量均无显著差异。但在组织培养条件下进行高盐胁迫或渗透胁迫时，或者，在营养土培养条件下进行高盐胁迫或干旱胁迫时，与野生型拟南芥植株相比，T₃代纯合转PpLEA3-3基因的拟南芥(Line1的T₃代植株、Line4的T₃代植株和Line7的T₃代植株)的根长显著增加且存活率显著增加，而转空载体拟南芥的根长和存活率则无显著差异。与野生型拟南芥植株相比，在逆境胁迫下，T₃代纯合转PpLEA3-3基因的拟南芥(Line1的T₃代植株、Line4的T₃代植株和Line7的T₃代植株)中叶绿素含量显著提高、丙二醛含量显著降低、脯氨酸含量显著提高和SOD含量显著提高；与转空载体拟南芥相比无显著差异。

结果表明，与野生型拟南芥相比，Line1、Line4和Line7的抗盐性和抗旱性均显著增加，抗盐性和抗旱性均显著增加具体体现为根长增加、存活率提高、叶绿素含量增加、丙二醛含量减少、脯氨酸含量增加和SOD含量增加。

实施例4、PpLEA3-3蛋白的亚细胞定位

1、取实施例3获得的Line1的T₃代植株的叶片，置于3.5％(体积百分比)戊二醛水溶液，避光处理1h。

2、完成步骤1后，弃上清，加入pH9.0、0.1M EDTA溶液，55℃温育2h。

3、完成步骤2后，加入适量DAPI染色液母液，得到染色体系(染色体系中DAPI染色液的浓度为0.03mM)，然后染色5min。

4、完成步骤3后，利用荧光共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss公司产品，产品型号为ZEISSLSM 780 LASER CONFOCAL MICROSCOPE)观察。

按照上述方法，将Line1的T₃代植株替换为野生型拟南芥，其它步骤均不变，作为空白对照。

实验结果见图6(DIC为微分干涉差显微镜通道下细胞明场图，GFP+Chl为绿色荧光蛋白及叶绿体自发荧光图，DAPI为DAPI染色后的细胞核荧光，Merge为上述各通道的叠加图)。结果表明，PpLEA3-3蛋白定位在细胞质和细胞核中。

<110> 首都师范大学

<120> 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1665

<212> DNA

<213> 小立碗藓（Physcomitrella patens）

<400> 1

atgaatcagt acggaagaga acagcaagat actggcctcg tcggctctgg tacaggacat 60

cgcgatgaat acggcaatcc caggcaagag ggtataatgg acaaggtgaa aaatgccgta 120

ggcatgggcc ccagttcagg aaccggctac aacaatcagc ctggttatga caattacggt 180

aacccaaggc aagaaggatt agtagacaag gcgaaggacg ccgtgggcat gggtccgagt 240

ttaggaactg gctacaataa ccagcctggt tatgacagtt acgggaatcg tgagggcatt 300

gtggacaggg cgaaagatgc ggtagggatg ggtccgaatt caggaactgg ctacaacaac 360

cagcctggat acgacaatta cggtgaccga aggcatgaag gattggcaga cagagcgaag 420

gatgctgtag gtatggggcc taactcaggt tacaaccacc agcctggata tgacaactac 480

ggcaatcgtg agggcgttgt ggacaaggcg aaggatgcgg taggcatggg tccgaattca 540

ggaactggct acaacaacca gcctggttat gacagttatg gtacccggag acaggaagga 600

ttggtagata gagcaaagga tgccgtcggc atgggcccca attcgggcac cggctataac 660

aatcagcccg gatatgacaa ctacggtaac ccaagacgcg aaggagtggt agacagggcg 720

aaggatgctg taggtatggg gcctaactca ggttacaaca atcagcccgg atatgacaac 780

tacggcaatc gtgagggcat tgtggacaaa gccaaggatg cagtcggtgt tggcccccac 840

tcgggtactg gctaccacaa ccagcccagc tacgacaact atggcaaccc taggcaagag 900

ggaatcgtgg atagagcgaa agacgctgtg gggatgggac caaactctgg aactggctac 960

aacaaccagt ctgattatga cagttatggc aacccaaggc acgaaggcat gcttgacaag 1020

gcgaaggatg actttgatat gggccccaat tccggcactg gctataacaa ccggcccggc 1080

tatgacacct atggggaccg aaggcacgag ggaattggtg acaaggtgag ggacgcaatc 1140

ggtactggcc caaactccgg atatgacagc cgcacaccca ccggaaccga cgcttacgtg 1200

catggcaacc atccccctgg tatgcaagac agaatcactg gcgtgaacga gccctcgatc 1260

ttaggtggac gtgagaatgt agaccgccat ggttttggac acgatggtcg ccaacatcac 1320

ggtctgctag ataatgttac tcttcaaagt ggccatattc ctgagactat ggtaggcggg 1380

cgccgtgttg aacctggata tgatatgacc aagagtgctg gacatcatct tactgatctt 1440

ggccatcacg gtaacgatag cggtgtcact ggattgggcc atcacgacac tgattacgat 1500

gagaggaggg gaaaaggatt tgaagacccg attgataaca aaaccggact tggatcagac 1560

tacgatacga ccgagaccgg atctggttat ggtgccaccg atactggtgc tgcacctcac 1620

aagaagggaa tcataactaa gatcaaggag aagctgcacc actag 1665

<210> 2

<211> 554

<212> PRT

<213> 小立碗藓（Physcomitrella patens）

<400> 2

Met Asn Gln Tyr Gly Arg Glu Gln Gln Asp Thr Gly Leu Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Thr Gly His Arg Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Arg Gln Glu Gly Ile

20 25 30

Met Asp Lys Val Lys Asn Ala Val Gly Met Gly Pro Ser Ser Gly Thr

35 40 45

Gly Tyr Asn Asn Gln Pro Gly Tyr Asp Asn Tyr Gly Asn Pro Arg Gln

50 55 60

Glu Gly Leu Val Asp Lys Ala Lys Asp Ala Val Gly Met Gly Pro Ser

65 70 75 80

Leu Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gln Pro Gly Tyr Asp Ser Tyr Gly Asn

85 90 95

Arg Glu Gly Ile Val Asp Arg Ala Lys Asp Ala Val Gly Met Gly Pro

100 105 110

Asn Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gln Pro Gly Tyr Asp Asn Tyr Gly

115 120 125

Asp Arg Arg His Glu Gly Leu Ala Asp Arg Ala Lys Asp Ala Val Gly

130 135 140

Met Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asn His Gln Pro Gly Tyr Asp Asn Tyr

145 150 155 160

Gly Asn Arg Glu Gly Val Val Asp Lys Ala Lys Asp Ala Val Gly Met

165 170 175

Gly Pro Asn Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gln Pro Gly Tyr Asp Ser

180 185 190

Tyr Gly Thr Arg Arg Gln Glu Gly Leu Val Asp Arg Ala Lys Asp Ala

195 200 205

Val Gly Met Gly Pro Asn Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gln Pro Gly

210 215 220

Tyr Asp Asn Tyr Gly Asn Pro Arg Arg Glu Gly Val Val Asp Arg Ala

225 230 235 240

Lys Asp Ala Val Gly Met Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asn Asn Gln Pro

245 250 255

Gly Tyr Asp Asn Tyr Gly Asn Arg Glu Gly Ile Val Asp Lys Ala Lys

260 265 270

Asp Ala Val Gly Val Gly Pro His Ser Gly Thr Gly Tyr His Asn Gln

275 280 285

Pro Ser Tyr Asp Asn Tyr Gly Asn Pro Arg Gln Glu Gly Ile Val Asp

290 295 300

Arg Ala Lys Asp Ala Val Gly Met Gly Pro Asn Ser Gly Thr Gly Tyr

305 310 315 320

Asn Asn Gln Ser Asp Tyr Asp Ser Tyr Gly Asn Pro Arg His Glu Gly

325 330 335

Met Leu Asp Lys Ala Lys Asp Asp Phe Asp Met Gly Pro Asn Ser Gly

340 345 350

Thr Gly Tyr Asn Asn Arg Pro Gly Tyr Asp Thr Tyr Gly Asp Arg Arg

355 360 365

His Glu Gly Ile Gly Asp Lys Val Arg Asp Ala Ile Gly Thr Gly Pro

370 375 380

Asn Ser Gly Tyr Asp Ser Arg Thr Pro Thr Gly Thr Asp Ala Tyr Val

385 390 395 400

His Gly Asn His Pro Pro Gly Met Gln Asp Arg Ile Thr Gly Val Asn

405 410 415

Glu Pro Ser Ile Leu Gly Gly Arg Glu Asn Val Asp Arg His Gly Phe

420 425 430

Gly His Asp Gly Arg Gln His His Gly Leu Leu Asp Asn Val Thr Leu

435 440 445

Gln Ser Gly His Ile Pro Glu Thr Met Val Gly Gly Arg Arg Val Glu

450 455 460

Pro Gly Tyr Asp Met Thr Lys Ser Ala Gly His His Leu Thr Asp Leu

465 470 475 480

Gly His His Gly Asn Asp Ser Gly Val Thr Gly Leu Gly His His Asp

485 490 495

Thr Asp Tyr Asp Glu Arg Arg Gly Lys Gly Phe Glu Asp Pro Ile Asp

500 505 510

Asn Lys Thr Gly Leu Gly Ser Asp Tyr Asp Thr Thr Glu Thr Gly Ser

515 520 525

Gly Tyr Gly Ala Thr Asp Thr Gly Ala Ala Pro His Lys Lys Gly Ile

530 535 540

Ile Thr Lys Ile Lys Glu Lys Leu His His

545 550

<210> 3

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gagctcatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 600

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 660

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 720

aagtaactcg ag 732

<210> 4

<211> 1748

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctgcagaata gagagaggtg aaggtactaa caacattctt aaggaagaca caacagtagt 60

gtcgtttaca tgcatagaga attgcggagc cttcccattg ttatttccat gttggacgtt 120

ggagatatgg attaatacac tatcgacaag actctttgca atattcaaca gaagttgaat 180

ataaaaaggc ctccaacaaa gcatgcttga ttcttatcta agctagattt cctattattt 240

tttctatcca caaagtcata ttcttctatc aaggtcataa ctaataactt acaagaatta 300

taactttatt actgtagaac catgtaaatt cttccatttt tttttacttt atcatggatt 360

ataacttatt aagagataaa ttagcaaagg taatattcta tttatattca tatgtatgta 420

tgttaaaatt taaatcaaac taaatattta tagttttcta ttctctatca agtttgatct 480

ctattaaatg tggatttatg acccctttta atttatagta aaaaattcac atatatttca 540

ctaaaaatta ttctaattta ttgttgtcta aaaataacaa catataaaca ctcaaatcaa 600

tatcttcaca ttcaatgatt gcacaacaac aaaatttata tatatatata tatatatata 660

tatacttact caaaaaaaaa tatatatata tatatatata tatatatact tactcaaaaa 720

atatgtatat atatatatac ttactcaata tatatatata tatatatata tacttactca 780

aaataataaa ttaaacttaa ataaagcaat ttttagacac ggtatatggc aatttttaag 840

tcgaacttaa ggttgcacca aatgatctcc ataaacccca tataaaactt ttttgtgtca 900

ttaatcaagt atctggacca acagtttttt tacacaaaat atatcaactt tgggagaaag 960

tctaacttta atacactttc cttccaaata acaactttag ttgaattcag ttatcatggt 1020

ggtcatcttt caaaaaagaa attactccac atcagcgtct atttctttta caatttaata 1080

tccaggccat actaaatggt aacacaaatt cacctcacaa ggcgtcccct ccacgtcgtc 1140

gtttttccag ctgtcgaatt tgctgactca gcccaccgaa ctaccacgtg gcagaggatt 1200

ctatccacgt ggcatcggag gaaaaatcca tttggcgacg cgacagtgtg aaaaagggat 1260

ggagggtccc atgagcggga cagatgccgt cttctctccc gctgtcgtgt tttgtttcaa 1320

attgacgtcc ttatggttga tccattatct caattgtgag ccaatacatt gtttgcatcg 1380

accggtgtag tgatttcagg taaatgcgaa tgagatctcg tgcgatcgag ttgctctagt 1440

ttttgttgtt ctcatcttgc tcactgacta tatgcaagtg ccaactcgtg ggtgtgtgtg 1500

tgcgcgtgtg tgagtgcgtg tgtgtttgtg tgcttgtgag tatgatagtt ctttaagttt 1560

ttgctttttt cttttctttt catggattgt ggcgttagtt gagcaaaaaa ctgcgtaatc 1620

atgtacgtat gattaatgcg tgcgttggat tttgctacag ataattcgag agaccttgtg 1680

ctgcgatttt acttgtcgga gagggtgtgt ttaagttgca agaaagtcta aaaagagata 1740

gaggatcc 1748

Claims (7)

1.蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质PpLEA3-3为序列表中序列2所示的蛋白质；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；

所述植物为拟南芥。

2.编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；

所述植物为拟南芥。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的核酸分子为如下b1）或b2）或b3）或b4）所示的DNA分子：

b1）编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3）与b1）或b2）限定的核苷酸序列具有75%以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子；

b4）在严格条件下与b1）或b2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的DNA分子。

4.如权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述拟南芥为野生型拟南芥Columbia。

5.一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括使权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3在受体植物中表达或过表达，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性提高；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；

所述植物为拟南芥。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述拟南芥为野生型拟南芥Columbia。

7.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质PpLEA3-3的含量，从而提高植物的抗逆性；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；

所述植物为拟南芥。

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