CN105378087A - 具有一种或多种增强的产量相关性状的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及植物分子生物学领域并且涉及用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸的表达，增强植物中产量相关性状的方法。

Description

具有一种或多种增强的产量相关性状的植物及其制备方法
本申请要求EP13167068.9号的优先权，该申请在此完整引入作为参考。
背景技术
本发明总体上涉及植物分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸表达而调节植物中一种或多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码POI多肽的核酸的增加表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有一种或多种调节的产量相关性状。本发明也提供可用于本发明方法、用途、植物、可收获部分和产品中的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期活力(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。
种子产量是重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
对于众多作物的另一个重要性状是早期活力。改进早期活力是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期活力人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期活力已经限制了基于玉米带种质(CornBeltgermplasm)的玉米(ZeamayesL.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等,Planta218,1-14,2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、养分缺乏、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。
提供POI的具体背景
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
现在已经发现，可以通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸的表达，改善植物中的多种产量相关性状。
发明概述
本发明涉及用于通过增加植物中编码POI多肽的核酸表达增强植物中一种或多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码POI多肽的核酸的增加表达的植物，所述植物与对照植物相比具有一种或多种增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的迄今未知的包含编码POI的核酸的构建体。
优选的实施方案是一种在植物中相对于对照植物增强一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括步骤：增加、优选地通过重组方法增加植物中编码POI多肽的核酸表达，优选地所述核酸是外源的，其中表达优选地处在与编码POI多肽的核酸有效连接的启动子序列控制下，并且培育该植物。本发明的这些方法包括增加植物中编码POI多肽的核酸的表达并且因而与对照相比植物增强所述植物的一种或多种产量相关性状。术语“因而增强”理解为包括增加POI多肽表达的直接作用以及间接作用，只要增加的编码POI多肽的核酸的表达导致增强至少一种产量-相关性状。例如，转录因子A的过量表达可以增加另一种转录因子B的转录，转录因子B转而控制给定途径的许多基因的表达，导致增强的生物量或种子产量。虽然转录因子A不直接增强导致增强的一种或多种产量相关性状的途径的基因表达，但是增加的A表达是增强的产量相关性状的作用的原因。
因此，本发明的一个目的是提供与有益启动子序列有效连接的包含编码POI多肽的核酸的表达盒和载体构建体。提供这类基因构建体用于制备转基因植物的用途，所述转基因植物相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，优选地增加的生物量。
另外，优选实施方案是用本发明的一个或多个表达盒转化并且因此以特定方式表达编码POI蛋白的核酸的转基因植物，其中植物具有一种或多种增强的产量相关性状。本发明转基因植物的可收获部分和源自转基因植物及其可收获部分的产物也是本发明的部分。
附图描述
在全部附图中，对于表A的每条序列，下表A中给出的缩写名用来代表该序列。
本发明现在将参考下图进行描述，其中：
图1显示鉴定的模式序列，即，Prosite注释中的SPY多肽的基序及其在SEQIDNO:2中的位置。这两个模式称为POI模式1&2，其中POI指本申请中定义的SPY。详情参见实施例4。模式以PROSITE格式给出，因此，在任意基序的字母-数字组合-x(a,b)-中，字母x代表Xaa，即，任意氨基酸，整数a和b给出前面x之后的氨基酸Xaa的最小数目和最大数目。
图2表示使用ClustalW(详情参见实施例2)，多个SPY多肽的多重比对。使用氨基酸的单字母密码。黑色阴影中的白色字母表示多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，灰色阴影中的白色字母代表高度保守的氨基酸取代。当使用保守的氨基酸(即，比对序列中相同的氨基酸和/或其他高度保守的氨基酸)时，这些比对结果可以用于限定其他基序或标签序列。POI用以表示SEQIDNO:2的SPY多肽。其他序列用它们的简称表示。表1提供每条序列的详情，例如生物体和SEQIDNO。包含序列SEQIDNO:36仅为了比较，以显示该序列与第3页评述的SPY序列之间的不同。可以看出在它们的基序2中，苯丙氨酸代替SPY多肽的强制性亮氨酸(mandatoryLeucine)；以及序列SEQIDNO:36的C端苏氨酸取代。两者均以箭头示出。
图3显示根据ClustalW的指导树(guidetree)的SPY多肽的系统树。SEQIDNO2与另一杨树SPY多肽聚类得最近，次之是蓖麻(Ricinuscommunis)SPY多肽，再次是大豆SPY多肽。图中POI用以表示SEQIDNO:2的SPY多肽。其他序列用它们的简称表示。表1提供每条序列的详情，例如生物体和SEQIDNO。包含序列SEQIDNO:36仅为了比较。
图4分别显示实施例3A和B的序列同一性分析的MATGAT(图4A)和NEEDLE(图4B)结果。图中POI用以表示SEQIDNO:2的SPY多肽。其他序列用它们的简称表示。图4A的情况下，列的标题显示数字，对应该图4A中的行数，由此鉴定序列。表1提供每条序列的详情，例如生物体和SEQIDNO。包含序列SEQIDNO:36仅为了比较。
图5表示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下，增加POI编码核酸在稻中表达的双元载体。
图6提供显示不同SEQIDNO与前导序列的关系的表。POI代表SEQIDNO：1&2的SPY序列。“P.tri”是毛果杨(Populustrichocarpa)的缩写。
图7提供通过氨基酸(单字母密码提供)、氨基酸的组(例如，酸性氨基酸)和两类tRNA合成酶的使用的发生数目和发生百分比表示的SEQIDNO:2的SPY多肽的组成。可以用SequenceManipulationSuite(StothardP(2000)TheSequenceManipulationSuite:JavaScriptprogramsforanalyzingandformattingproteinandDNAsequences.Biotechniques28:1102-1104)来编辑该结果。
发明详述
本发明显示增加植物编码POI多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。
根据第一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，其包括增加植物中编码POI多肽的核酸表达并且任选地选择具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供一种用于产生相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：增加所述植物中编码如本文所述的POI多糖的核酸表达并且任选地选择具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。
一种用于调节(优选增加)编码POI多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并且表达编码POI多肽的核酸。
下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文定义的POI多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种POI多肽的核酸。在一个实施方案中，对“本发明方法中有用的”蛋白质或核酸的任何谈及理解为意指“在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的”蛋白质或核酸。待引入植物(并且因此在实施本发明的方法中有用)的核酸是编码现在将进行描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“POI核酸”或“POI基因”。
如本文定义的“POI多肽”指任何多肽，优选地包含以增加的优选顺序，与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，优选与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42的全长比较，优选与SEQIDNO:2的全长比较。
在另一实施方案中，本文定义的“POI多肽”意指任意下述多肽，该多肽优选具有小尺寸、高等电点值，并在氮不限制条件下，与对照植物相比其表达增加时，可导致与对照植物相比的增加的产量。
本文的POI多肽在下文中也称为产量的小蛋白(SPY)。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物中如本文提供的产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码如本文定义的SPY多肽的核酸表达。优选地，所述一种或多种增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的地上部分生物量，增加的地下部分生物量、增加的种子产量和/或增加的糖产量(如每株植物、每份鲜重、每份干重或每个面积的可收获糖)。
在一个实施方案中，在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中所用的核酸序列是选自以下的核酸分子：
(i)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41，优选由SEQIDNO:1代表的核酸；
(ii)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41，优选由SEQIDNO:1代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码SPY多肽的核酸，所述SPY多肽以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42，优选SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中给出的基序中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，且优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状的核酸分子；
或编码选自以下的多肽：
(i)由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42，优选SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中给出的基序中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
序列同一性水平可以通过实施例3所描述的MATGAT或NEEDLE软件算法确定。在优选的实施方案中，NEEDLE算法(“NEEDLE”来自EMBOSS软件包，版本号6.3.1.2(欧洲分子生物学开放软件包)；http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/；参见McWilliamH.,ValentinF.,GoujonM.,LiW.,Naraya-nasamyM.,MartinJ.,MiyarT.和LopezR.(2009),网页服务器位于EuropeanBioinformaticsInstitute–2009,NucleicAcidsResearch37:W6-W10；获自EMBLEuropeanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,Cambridge,CB101SD,英国,和http://emboss.sourceforge.net/)使用以下设置：-缺口开放10.0，-缺口延伸0.5，距阵：BLOSUM62(缩写为EBLOSUM62)。
在一个实施方案中，用于本发明方法的核酸是图6的表IA中的前导序列或同源物序列，或是编码表IIA中的前导蛋白质序列或同源物蛋白质序列的核酸，或是包含表IV中所示的共有序列和模式的那些核酸。
优选地，多肽包含如本文中其他地方定义的一个或多个基序。
在一个实施方案中，用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的核酸序列是编码SPY的序列，但排除2009年8月29日公开的国际申请WO2009105612中公开的编码多肽序列(如SEQIDNO:157或158)的那些核酸。
本文中术语“编码SPY的核酸”、“SPY核酸”、“SPY基因”、“SPY核苷酸序列”和“编码SPY的核苷酸序列”互换使用。
优选地，多肽包含如本文中其他地方定义的一个或多个基序。
使用如图2和实施例2中所显示的比对结果并推导共有序列，得出共有序列(SEQIDNO:45)。
在一个实施方案中，SPY多肽包含如SEQIDNO:45中给出的共有序列。
如下文显示的基序1和2如实施例4中所述那样产生。
在又一个实施方案中，如本文所用的SPY多肽包含至少一个以下如下文基序：
POI模式1(SEQIDNO:46)，也称为基序1，且
POI模式2(SEQIDNO:47)，也称为基序2，
其中在任意基序的字母-数字组合-x(a,b)-中，字母x代表Xaa，即，任意氨基酸，整数a和b给出前面x之后的氨基酸Xaa可能的最小数目和最大数目。例如，S-x(0,3)-P表示在氨基酸丝氨酸后可以在脯氨酸残基之前包含任何选择的一个、两个或三个氨基酸，或无氨基酸存在于这个基序的丝氨酸和脯氨酸残基之间。
因此，字母
–x(2)
表示在基序的这个位置处确切地存在任何类型的两个氨基酸。括号内无数字的单个–x表示在基序的这个位置处存在的任何类型的一个氨基酸残基。
另外，替换–x的任何氨基酸残基可以与居其之前或尾随其后的氨基酸残基相同或不同，或在相同或任何其他位置处插入任何其他氨基酸替代–x。
方括号内的残基代表备选残基，例如，模式Y-x(21,23)-[FW]表示保守的酪氨酸与苯丙氨酸或色氨酸之间被最少21个，最多23个氨基酸残基分开。
在一个优选实施方案中，SPY多肽包含
i)以下基序：
基序2(SEQIDNO:47):
R-S-R-S-P-L-G-L-[AG]-[DEH]-R-x(1,3)-I-x-[SV]
或
ii)i)中所述基序2，且另外
基序1(SEQIDNO:46):
H-[ST]-Q-V-x-K-I-[KR]-x-E-[FIM]-[DE]-K-I-x(0,3)-S-[LP]
iii)根据ii)的基序，和另外如SEQIDNO:45所列序列代表的共有序列；在更优选的实施方案中，使用基序1和2的优选的变体，如以上基序1和基序2中粗体字母及的数字所示。
在又一个实施方案中，SPY多肽以增加的优选顺序包含至少一个、至少两个如上文定义的共有序列之外的本文定义的基序。
基序1和2使用MEME算法(Bailey和Elkan，第二届分子生物学智能系统国际会议文集(ProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology)，第28-36页,AAAI印制,MenloPark,California,1994)获得，手工编辑基序1。在MEME基序中的每个位置上，残基显示存在于频率高于0.2的查询序列组中。方括号内的残基代表备选残基。详情参见实施例4。
在一个实施方案中，本发明的POI(即，SPY多肽)是碱性蛋白质，即，它具有至少9.5的等电点值(pI)，优选等于或超过10.0，更优选等于或超过10.3，最优选等于或超过10.4。在另一实施方案中，SPY多肽的pI值低于11.5，优选低于或等于11.3。本领域中可用多种技术和工具来测定给定蛋白质的pI值。在一个实施方案中，用SequenceManipulationSuite(StothardP(2000)TheSequenceManipulationSuite:JavaScriptprogramsforanalyzingandformattingproteinandDNAsequences.Biotechniques28:1102-1104)测定pI值。
在优选的实施方案中，本发明方法中有用的SPY多肽具有的含硫氨基酸(例如但不限于单字母密码的C、M)的含量以数量计等于或小于的5％，即，SPY多肽的每100个氨基酸中，甲硫氨酸、半胱氨酸残基以及其他含硫氨基酸残基(例如硒代半胱氨酸)的数目至多为5或小于5。优选地，半胱氨酸残基证明(makeout)为小于4％。优选这些通过使用SequenceManipulationSuite(StothardP(2000)TheSequenceManipulationSuite:JavaScriptprogramsforanalyzingandformattingproteinandDNAsequences.Biotechniques28:1102-1104)确定。在更优选的实施方案中，SPY多肽的完整多肽链中，含有3个和或更少个半胱氨酸残基，更优选含有2个和或更少个半胱氨酸残基，最优选含有1个和或没有半胱氨酸残基。
在另一优选的实施方案中，本发明方法中有用的SPY多肽包含以数量计至少15％且以数量计至多30％的碱性侧链氨基酸(例如但不限于K、R、H)。优选地，碱性氨基酸以数量计等于或大于18％、19％或20％，且以数量计小于27％。优选这些通过使用SequenceManipulationSuite(StothardP(2000)TheSequenceManipulationSuite:JavaScriptprogramsforanalyzingandformattingproteinandDNAsequences.Biotechniques28:1102-1104)确定。
在另一优选的实施方案中，SPY多肽包含以数量计等于或者小于5％，优选以数量计等于或者小于4％，更优选以数量计等于或者小于3％的芳香族氨基酸(例如但不限于单字母密码的F、W、Y)；和/或以数量计等于或大于16％的酸性氨基酸(例如但不限于单字母密码的B、D、E、N、Q、Z)，但是不超过以数量计30％的酸性氨基酸，优选以数量计等于或者小于29％的酸性氨基酸，更优选以数量计等于或者小于26％的酸性氨基酸。优选这些通过使用SequenceManipulationSuite(StothardP(2000)TheSequenceManipulationSuite:JavaScriptprogramsforanalyzingandformattingproteinandDNAsequences.Biotechniques28:1102-1104)确定。
在另一实施方案中，SPY多肽具有等于或小于15000Da的分子质量，优选等于或小于12000Da的分子质量，更优选等于或小于10000Da的分子质量，甚至更优选等于或小于9500Da的分子质量，最优选等于或小于8800Da的分子质量，其中Da是道尔顿的缩写，一道尔顿是1u。在另一实施方案中，SPY多肽具有等于或大于6000Da的分子质量，更优选等于或大于7000Da的分子质量，甚至更优选等于或大于8000Da的分子质量，最优选等于或大于8800Da的分子质量，其中Da是道尔顿的缩写，一道尔顿是1u。
在本发明的一个实施方案中，SPY多肽是长度短的成熟蛋白质，其长度等于或小于110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79或78个氨基酸。在另一实施方案中，SPY多肽至少40、45、50、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78个氨基酸长。在另一实施方案中，SPY编码核酸的长度等于或小于400、390、385、380、375、370、365、360、355、350、345、340、335、330、325、320、315、310、305、300、295、290、285、280、275、270、267、264、261、258、255、252、249、246、243、240或237。
SPY多肽可来自任何来源，例如古细菌(archaebacteria)、细菌、真菌、酵母或植物。在本发明的一个实施方案中，植物SPY多肽是优选的。在一个例子中，植物SPY多肽用于本发明的方法、用途、构建体、载体和产物中，在一个实施方案中，所用SPY多肽的来源选择双子叶植物；优选当待调节单子叶植物的产量相关性状时，所用SPY多肽的来源选择双子叶植物，即，SPY多肽和/或编码SPY多肽的核酸具有双子叶植物来源。
在一个优选的实施方案中，当用InterProScan软件(见ZdobnovE.M.和ApweilerR.；“InterProScan-用于InterPro中特征标识识别方法的集成平台(InterProScan-anintegrationplatformforthesignature-recognitionmethodsinInterPro)；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro数据库,2013年4月4日发布的版本42.0；也见http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)，和/或使用WelcomeTrustSANGERInstitute,Hinxton,英格兰，英国(http://pfam.sanger.ac.uk/)的HMMer3.0软件包(Pfam版本26.0)的程序“hmmscan”分析时，SPY多肽具有不可检测的PFAM结构域，更优选没有可检测的指定特征。所涉及的InterProScan和HMMer分析及数据库的详情参见实施例4。
在另一优选的实施方案中，当用实施例5中详细描述的TargetP软件(参见http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/&“LocatingproteinsinthecellusingTargetP,Sig-nalP,andrelatedtools”,OlofEmanuelsson,Brunak,GunnarvonHeijne,HenrikNielsen,NatureProtocols2,953-971(2007))分析时，SPY多肽被发现不含对于线粒体、质体或分泌途径的靶向信号，优选没有任何靶向信号。在更优选的实施方案中，当用实施例5中描述的TargetP软件分析时，SPY多肽预测没有特定的胞内定位，即，最高得分在“其他”类别中，而不在cTP、mTP或SP类别中。最优选没有特定的胞内定位的这个预测具有4、3、2或1的可信性级别，优选具有3、2或1的可信性级别，更优选具有2或1的可信性级别。
在优选的实施方案中，本发明方法中有用的SPY多肽以任意组合具有本文上面描述的特征。具体而言，在一个优选的实施方案中，SPY多肽是：
●当用TargetP1.1软件，采用实施例部分中给出的设置分析时，没有可检测的靶向信号的碱性小蛋白质；且
●当用2013年4月4日发布的版本42.0的Interpro软件(详情参见实施例)分析时，无可检测的Interpro结构域；且
●其具有等于或小于15000Da的分子质量；且
●包含以数量计至少15％的碱性侧链氨基酸；且
●包含以数量计不超过30％的碱性侧链氨基酸；且
●具有的含硫氨基酸的含量以数量计等于或小于5％；且
●包含以数量计等于或小于5％的芳香族氨基酸残基；和/或以数量计等于或大于16％的酸性氨基酸，但以数量计不超过30％的酸性氨基酸；
或是这些特征不超过上文描述的更严格限制内的任意组合。
额外地或备选地，SPY蛋白以增加的优选顺序与由SEQIDNO:2代表的氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含任何一个或多个如上文所概述的保守基序(SEQIDNO:46&47)，优选这两个保守基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCGWisconsinPackage,Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。在一个实施方案中，通过在SEQIDNO:2的序列的整个长度范围内比较多肽序列确定序列同一性水平。可选地，通过核酸序列与SEQIDNO:1中编码成熟蛋白的序列比较确定序列同一性。在另一个实施方案中，通过在SEQIDNO:1的序列的编码序列的整个长度范围内比较核酸序列确定核酸序列的序列同一性水平。
在另一个实施方案中，通过将SEQIDNO:2中的一个或多个保守结构域或基序与其他SPY多肽中的相应保守结构域或基序比较，确定序列同一性水平。与总体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。优选地，SPY多肽中的基序以增加的优选顺序，与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47(基序1至2)表示的基序中的任一个或多个，优选与这两者，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域。换句话说，在另一个实施方案中提供一种用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，其中所述SYP多肽包含与SEQIDNO:2中始于氨基酸1直至氨基酸74的保守结构域(或者基序，分别的)，优选始于氨基酸27直至氨基酸72的保守基序，更优选从“氨基酸27至氨基酸45”到“氨基酸62至氨基酸76”的范围内变化，且包含“氨基酸27至氨基酸45”和“氨基酸62至氨基酸76”的保守基序，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域(或基序)。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。
优选地，该多肽序列在构建系统树(如图3中所绘制的系统树)中使用时，与包含由SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列的SPY多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
在另一个实施方案中，本发明的多肽在构建系统树(如图3中所绘制的系统树)中使用时，与不是氨基酸序列SEQIDNO:2的不多于5、4、3或2个层级分支点聚类。
另外，SPY多肽(至少以其天然形式)一般具有植物产量增加活性，尤其是在正常条件下以及环境压力但具有充足的氮供应条件下。用于测量植物产量增加活性的工具和技术是本领域熟知的。具体细节在实施例6至10中提供。另外，当根据本发明方法如实施例7和9中所概述那样在稻中表达时，编码SPY多肽的核酸产生具有增加的产量相关性状、尤其(增加的地上部分生物量、增加的地下生物量、增加的种子产量，和增加的发育及植物生长)的植物。在活的植物细胞中转录并翻译编码SPY多肽的核酸序列时，本发明的这种核酸序列的另一个功能是赋予合成SPY蛋白的信息，所述SPY蛋白增加如本文所述的产量或产量相关性状。
通过用SEQIDNO:1所代表的核酸序列转化植物说明本发明，其中所述核酸序列编码SEQIDNO:2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任何编码SPY的核酸或SPY多肽实施。如本文所用的术语“SPY”或“SPY多肽”还意在包括如下文定义的SEQIDNO:2的同源物。
在本文实施例部分的表A中给出编码SPY多肽的核酸的例子。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A中给出的氨基酸序列是由SEQIDNO:2所代表的SPY的直向同源物和侧向同源物的例子序列，术语“直向同源物”和“侧向同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和侧向同源物；在查询序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的情况下，第二BLAST(反向BLAST)将针对杨树序列。
就本发明的序列，或用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物的序列而言，在一个实施方案中，并非源自高等植物的核酸或多肽序列用于本发明的方法中，或者用于本发明的方法中有用的构建体中。在另一实施方案中，植物来源的核酸或多肽序列用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中，因为该核酸或多肽序列分别具有在植物中表达优选的密码子选择特征，及植物中常见的氨基酸使用和调整位点。来源植物可以是任意植物，但优选本文描述的植物。在另一实施方案中，并非源自高等植物，而是人工调整至具有高等植物的密码子选择的核酸序列用于本发明方法中有用的表达构建体中。
在本发明的一个实施方案中，凡提及一种或多种提高的产量相关性状均意指排除恢复植物中SPY多肽的表达和/或活性，当与原始野生型植物或原始变体相比，该植物中SPY多肽的表达和/或活性已经降低或被抑制。例如，在植物的敲除突变变体中过量表达SPY多肽，在本发明的意义上不认为是提高一种或多种产量相关性状，其中该SPY多肽、直向同源物或侧向同源物已被敲除。
本发明还提供用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的SPY编码核酸和SPY多肽，这些序列是本文上面所定义的那些序列。
在一个实施方案中，SPY编码核酸不是核酸SEQIDNO:35，且SPY多肽不是多肽SEQIDNO:36。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。下述核酸也在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用，所述核酸在实施例部分表A中所给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或侧向同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。
在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码SPY多肽的核酸的部分、与编码SPY多肽的核酸杂交的核酸、编码SPY多肽的核酸的剪接变体、编码SPY多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码SPY多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。
编码SPY多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、侧向同源物或同源物的核酸的一部分。
核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的部分编码了如本文中定义的SPY多肽或至少其部分，并且具有与实施例部分表的A中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或侧向同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少195、198、201、204、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、270、303、306、309个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表A中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或侧向同源物的核酸。最优选地，该部分是由SEQIDNO:1的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列包含如上文定义的基序1和2(分别是SEQIDNO:46&47)，和/或在正常条件下，与对照植物相比，具有增加植物产量的生物活性，和/或与SEQIDNO:2具有至少75％序列同一性。
在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码SPY多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。根据本发明，提供了一种用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，其包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸，所述核酸能够与编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的互补核酸杂交，或与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码表A中给出的任一种蛋白质的直向同源物、侧向同源物或同源物。
在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的杂交序列编码了如本文中定义的SPY多肽，所述多肽具有与实施例部分表的A中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，该杂交序列能够与编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的互补核酸或与这些序列中任一序列的一部分杂交，所述的一部分如本文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或侧向同源物。最优选地，杂交序列能够与核酸的互补核酸或与其部分杂交，其中所述核酸编码如SEQIDNO:2代表的多肽。在一个实施方案中，杂交条件是中等严格的，优选地是高严格的，如本文定义。
优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含如上文定义的基序1和2(分别是SEQIDNO:46&47)，和/或在正常条件下，与对照植物相比，具有增加植物产量的生物活性，和/或与SEQIDNO:2具有至少75％序列同一性。
在另一个实施方案中，提供一种用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的剪接变体或编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、侧向同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是由SEQIDNO:1代表的核酸的剪接变体，或编码SEQIDNO:2的直向同源物或侧向同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1和2(分别是SEQIDNO:46&47)，和/或在正常条件下，与对照植物相比，具有增加植物产量的生物活性，和/或与SEQIDNO:2具有至少75％序列同一性。
在又一个实施方案中，提供一种用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达编码在实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的等位变体，或包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、侧向同源物或同源物。
由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQIDNO:2的SPY和实施例部分的表A中所述的任一氨基酸序列基本上相同的生物活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQIDNO:1的等位变体或编码SEQIDNO:2的直向同源物或侧向同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1和2(分别是SEQIDNO:46&47)，和/或在正常条件下，与对照植物相比，具有增加植物产量的生物活性，和/或与SEQIDNO:2具有至少75％序列同一性。
在另一个实施方案中，可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的多肽序列与SEQIDNO:2的序列相比具有取代、缺失和/或插入，其中所述氨基酸取代、插入和/或缺失可以各自是1至10个氨基酸。
在又一个实施方案中，提供一种用于增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达编码在实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的变体，或包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸的变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、侧向同源物或同源物，所述变体核酸通过基因改组获得。
优选地，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1和2(分别是SEQIDNO:46&47)，和/或在正常条件下，与对照植物相比，具有增加植物产量的生物活性，和/或与SEQIDNO:2具有至少75％序列同一性。
另外，也可以通过位点定向诱变获得核酸变体。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley编著)。与SEQIDNO:2的序列差异一个或几个氨基酸(如本文定义的取代、插入和/或缺失)的SPY多肽可以同等地在本发明的方法和构建体和植物中用来增加植物的产量。
编码SPY肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修改而来。优选地，编码SPY多肽的核酸来自植物，还优选地来自双子叶植物，更优选地更优选地来自杨柳科(Salicaceae)，甚至更优选地来自杨属(Populus)，最优选地核酸来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
用于增强植物中如本文所述的一种或多种产量相关性状的本发明方法包括在植物中引入、优选地通过重组方法引入和表达如本文定义的核酸，并且优选地包括培育植物的又一个步骤和任选地收获植物或其部分的步骤。
在优选的实施方案中，当编码SPY多肽的核酸用于本发明的方法中时，导致与对照植物相比，地上植物面积和/或地上生物量平均增加至少20％。
在优选的实施方案中，当编码SPY多肽的核酸用于本发明的方法中时，导致与对照植物相比，地上植物面积和/或地上生物量平均增加至少10％。
在另一个实施方案中，本发明扩展至包含在本发明方法中有用的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸因为重组方法而存在于该染色体DNA中，但是不位于其天然遗传环境中。在又一个实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含于植物细胞中。包含于细胞、特别地具有细胞壁的细胞如植物细胞内部的DNA受到更好地保护免遭裸核酸序列那样的降解、破坏和/或断裂。这适用于包含在宿主细胞(例如植物细胞)中的DNA构建体。
在优选实施方案中，本发明涉及包含本发明的重组染色体DNA和/或本发明的构建体和宿主细胞、优选地植物细胞的组合物，其中重组染色体DNA和/或构建体包含于宿主细胞内部、优选地包含于具有植物细胞或细胞壁的宿主细胞内部。在又一个实施方案中，所述组合物包含死宿主细胞、活宿主细胞或死宿主细胞和活宿主细胞的混合物，其中本发明的重组染色体DNA和/或构建体可以位于死宿主细胞和/或活宿主细胞中。任选地，组合物还可以包含不包含本发明的重组染色体DNA或本发明的构建体的宿主细胞。本发明的组合物可以用于扩增或分配本发明的重组染色体DNA和/或构建体的过程中，和或可选地用来如上文所解释那样保护本发明的重组染色体DNA和/或构建体免遭分解和/或降解。本发明的重组染色体DNA和/或本发明的构建体可以用作本发明组合物的品质标记，作为来源的指示物和/或作为生产商的指示物。
在优选实施方案中，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。进一步优选植物及其部分，和来自植物及其部分的产物，其中该植物当氮不限制时，具有增加的产量。
在另一实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下、优选地在非生物胁迫条件下实施。
在一个例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在另一例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。在优选的实施方案中，氮缺乏条件是其中除了氮的一种或多种养分受限，但是氮不受限。
养分缺乏可以因缺少养分如磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。
在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语“盐胁迫”不限于食盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中的任意一种或多种。
在又一个例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冰冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在一个优选实施方案中，实施本发明的方法，使用需要增加非生物胁迫耐受性例如耐旱性、盐度和/或冷温度或热温度和/或因一种或多种养分缺乏如缺氮所致的养分利用的耐受性的植物。
本发明方法的实施产生了在氮不受限条件下，具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有早期活力和/或增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。术语“早期活力”、“产量”、“生物量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本发明因此提供一种用于在氮不受限条件下，相对于对照植物，增加植物的产量相关性状(例如氮不限于早期活力和/或产量)、尤其生物量产量和/或种子产量的方法，所述方法包括增加植物中编码如本文定义的SPY多肽的核酸的表达。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了在非胁迫条件和/或氮不受限条件下，相对于对照植物，具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供一种在氮不受限条件下，用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中增加编码如本文中定义的SPY多肽的核酸表达。
在更优选的实施方案中，本发明方法的实施导致在给植物提供植物一生的大部分时间，更优选从播种或种植至开始收获的时间的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的时间的正常生长及发育充足的氮供应的条件下，相对于对照植物，植物具有增加的生长速率。
本发明方法的实施产生这些植物，所述植物具有相对于对照植物的种子产量而言增加的种子产量，和/或增加的地上部分生物量，尤其相对于地上部分生物量和尤其对照植物的茎生物量而言增加的茎生物量，和/或相对于对照植物的根生物量而言增加的根生物量和/或相对于对照植物的甜菜生物量而言增加的甜菜生物量。另外，特别构思了在地上部分、尤其茎(尤其甘蔗植物的茎)中和/或地下部分中、尤其根(包括直根和块茎)中和/或在甜菜根中(尤其在糖料甜菜中)的含糖量(尤其蔗糖含量)相对于对照植物的相应部分中的含糖量(尤其蔗糖含量)而言增加。
相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码SPY多肽的核酸表达。
相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予干旱条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加干旱条件下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码SPY多肽的核酸的表达。
相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏但是并非缺氮条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加养分缺乏下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码SPY多肽的核酸表达。
相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加盐胁迫下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码SPY多肽的核酸表达。
在本发明的一个实施方案中，增加根生物量、优选地增加甜菜和/或直根生物量，更优选地在糖料甜菜植物中增加，并且任选地不增加种子产量和/或地上部分生物量。
在本发明的另一个实施方案中，增加地上部分生物量，优选地增加茎、茎秆和/或茎段(sett)生物量，更优选地在禾本科(Poaceae)中、甚至更优选地在甘蔗属(Saccharum)物种中，最优选地在甘蔗中增加，并且任选地不增加种子产量、地下部分生物量和/或根生长。
在又一个实施方案中，增加可收获总糖，优选地葡萄糖、果糖和/或蔗糖，优选地还增加如本文定义的其他产量相关性状，例如生物量，和更优选地还增加含糖量、优选地葡萄糖、果糖和/或蔗糖含量。
本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码SPY多肽的核酸。可以将基因构建体插入适于转化至植物或宿主细胞中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供构建体，其包含：
(a)编码如上文定义的SPY多肽的分离的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码SPY多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。
具体而言，本发明的基因构建体是植物表达构建体，即，在已经将该构建体引入、优选地通过重组手段引入这种植物、植物细胞或植物组织后允许编码SPY多肽的核酸在植物、植物细胞或植物组织中表达的基因构建体。植物表达构建体可以例如包含编码SPY多肽的该核酸，该核酸与启动子和任选地控制该核酸在一个或多个植物细胞中表达的其他控制序列处于功能性连接，其中启动子和任选的其他控制序列不天然地与该核酸功能性连接。在一个优选实施方案中，当已经将本发明的构建体引入植物、植物细胞或植物组织时，包含启动子的控制序列导致该核酸的过量表达。
本发明的基因构建体可以包含于宿主细胞，例如植物细胞、种子、农产品或植物中。用包含上述任何核酸的基因构建体如载体或表达盒转化植物或宿主细胞。因此，本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物或宿主细胞。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物。所述植物具有如本文所述的增加的产量相关性状。
在一个实施方案中，本发明的基因构建体向此时已经引入该构建体的植物赋予增加的产量或产量相关性状，所述植物表达包含于该基因构建体中并且优选地导致增加SPY多肽丰度的编码SPY的核酸。在另一个实施方案中，本发明的基因构建体向包含其中已经引入该构建体的植物细胞的植物赋予增加的产量或产量相关性状，所述植物细胞表达包含于基因构建体中的编码SPY的核酸。
这种基因构建体中的启动子可以相对于上述核酸是非天然启动子，即与其天然环境下调节SPY核酸表达的启动子不同的启动子。
在具体实施方案中，可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的编码SPY多肽的核酸与启动子处于功能性连接，导致SPY核酸在
－单子叶植物植物、优选地禾本科植物、更优选地甘蔗属物种植物的地上部分生物量、优选地叶子和苗、更优选地茎中，和/或
-双子叶植物、更优选地茄科和/或甜菜属物种植物的叶、地下生物量和/或根生物量、优选地块茎、直根和/或甜菜器官、更优选地直根和甜菜器官中表达。
本发明的表达盒或基因构建体可以包含于宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。
技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。
有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子特别用于所述方法中。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。
组成型启动子优选地是中等强度的遍在组成型启动子。更优选地，它是植物衍生的启动子，例如植物染色体来源的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度并且具有基本上相同表达模式的启动子(功能等同的启动子)，更优选地，该启动子是来自稻的GOS2启动子。更优选地，该组成型启动子由基本上与SEQIDNO:48相似的核酸序列代表，最优选地，该组成型启动子是如SEQIDNO:48所代表的组成型启动子。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。
应当明白本发明的适用性不限于SEQIDNO:1所代表的编码SPY多肽的核酸，当编码SPY多肽的核酸受组成型启动子驱动时，本发明的适用性也不限于GOS2稻启动子。
又一个实施方案涉及可用于本发明方法、载体、构建体、植物、可收获部分和产物中的基因构建体，其中基因构建体包含本发明的SPY核酸，所述本发明的SPY核酸功能性连接至如本文以上公开的启动子并且还功能性连接至以下一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)：
a)如作为WO2011/023537公开的国际专利申请中第27页至第28页上表1中公开和/或SEQIDNO:1至19和/或如所述国际申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或
b)如作为WO2011/023539公开的国际专利申请中第27页上表1中公开和/或SEQIDNO:1至19和/或如所述国际申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或
c)如含于或公开于以下中：
1.2011年7月5日作为EP11172672.5提交的欧洲优先权申请第27页上表1中和/或SEQIDNO:1至14937、优选地SEQIDNO:1至5、14936或14937，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或
2.2011年7月6日作为EP11172825.9提交的欧洲优先权申请第27页上表1中和/或SEQIDNO:1至65560、优选地SEQIDNO:1至3，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或
d)具有基本上相同的增强作用的等同物；和/或
2)功能性连接至一个或多个可靠性增强核酸(RENA)分子
a)如含于或公开于2011年9月15日作为EP11181420.8提交的欧洲优先权申请第26页上表1中和/或SEQIDNO:1至16或94至116666、优选地SEQIDNO:1至16，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项a)的点i)至v)中所定义，其中RENA分子在此通过引用的方式并入；或
b)具有基本上相同的增强作用的等同物。
本发明的优选实施方案涉及可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中并在如本文以上所述的启动子控制下编码处本发明SPY多肽的核酸分子，其中NEENA、RENA和/或启动子相对于SPY核酸分子是异源的。
任选地，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQIDNO:48相似的与编码SPY多肽的核酸有效连接的GOS2启动子。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于引入植物的构建体上。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了例子。
如上文提到，用于调节、优选地增加编码SPY多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中引入、优选地通过重组方法引入并且表达编码SPY多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强一种或多种产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。
本发明也提供一种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中引入并且表达编码如本文所定义的SPY多肽的任意核酸。
更具体地，本发明提供一种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有一种或多种增强的产量相关性状，特别地增加的(种子产量)，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入并且表达编码SPY多肽的重组核酸或包含编码SPY多肽的核酸的基因构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育、优选地促进相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物的植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
优选地，通过重组方法引入编码SPY多肽的核酸。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的SPY多肽的任意核酸。优选地，编码SPY多肽并引入植物的核酸是分离的核酸，或包含在本文所述的基因构建体中。
在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞，可以或可以不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的一个特定实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生成为转化的植物，该植物过量表达本发明的序列。
可以将核酸直接引入植物细胞或引入植物自身中(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物或植物细胞中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
在一个实施方案中，本发明的方法是用于产生相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的转基因禾本科植物、优选地甘蔗属物种植物、其转基因部份或其转基因植物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在该植物或该植物细胞中引入和表达重组POI多肽编码核酸或包含POI多肽编码核酸的基因构建体；和
(ii)如果是植物细胞，从植物细胞再生为植物；和
(iii)在促进植物生长和发育的条件下，培养植物，优选促进植物生长和发育相对于对照植物具有一个或多个增加的产量相关性状；和
(iv)任选地选择由于增加POI多肽和/或POI编码核酸的表达，具有一种或多种增加的产量相关性状的植物；和
(v)从转基因植物收获茎段和/或叶芽，并栽种茎段和/或叶芽，并且将茎段和/或叶芽培育成植物，其中茎段和/或叶芽包含编码POI多肽的外源核酸和与之有效连接的启动子序列。
在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。
本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。植物或植物部分或植物细胞包含如上文定义的、优选地在基因构建体(如表达盒)中包含编码SPY多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代基本展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。
在又一个实施方案中，本发明扩展至重组地包含如上文所述的本发明表达盒、本发明基因构建体或编码SPY的核酸和/或SPY多肽的种子。一般，从本发明种子培育的植物也将显示增强的产量相关性状。
本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的SPY多肽的分离核酸。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。对本发明方法中所用的核酸、构建体、表达盒或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。在一个特定实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。
在又一个实施方案中,本发明涉及包含本发明构建体的转基因花粉粒和/或本发明植物细胞的单倍体衍生物。虽然在一个具体实施方案中，本发明的花粉粒不能用来在不添加其他遗传物质的情况下再生完整植株和/或不能够光合作用，但是本发明的花粉粒可以具有以下用途：通过使用本发明的活花粉粒使另一个植株的卵细胞受精，从受精的卵细胞产生种子并从所产生的种子培育出植物，将增强的产量相关性状引入另一个植株中。另外，使用花粉粒作为地理和/或时间来源的标志物。
本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文中定义的任何植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、糖料甜菜、向日葵、卡诺拉、苜蓿、菜籽、亚麻、棉花、番茄、马铃薯、甜叶菊属(Stevia)物种如但不限于甜叶菊(Steviarebaudiana)和烟草。根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类植物。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。在一个特定实施方案中，本发明的或在本发明方法中所用的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油籽油菜(包括卡诺拉)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿。有利地，本发明方法比已知的方法更高效，原因是与可比较方法中使用的对照植物相比，本发明的植物具有增加的产量和/或增加的针对环境胁迫的胁迫耐受性。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、茎段、甘蔗叶芽、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码如本文定义的SPY多肽的重组核酸。具体而言，这类可收获部分是根如直根、根状茎、果实、茎、甜菜根、块茎、球茎、叶、花和/或种子。在一个实施方案中可收获部分是茎插枝(如甘蔗茎段或甘蔗叶芽)。
本发明还涉及从这种植物的一个或多个可收获部分衍生或产生、优选地从中直接衍生或产生的产物，如干燥颗粒、果肉颗粒、压茎、茎段、甘蔗叶芽、粕或粉末、纤维、含有由本发明植物产生的纤维的布、纸或纸板、油、脂肪和脂肪酸、含糖淀粉、含有由本发明植物产生的糖的纸或纸板、树汁、果汁、糖蜜、糖浆、碎干草或蛋白质。优选的糖类是淀粉、纤维素、糖蜜、糖浆和/或糖，优选地是蔗糖。优选的产物还是残余干纤维，例如，茎(如去除甘蔗汁后来自甘蔗的甘蔗渣)、糖蜜、糖浆和/或滤渣的残余干纤维，优选地来自甘蔗和/或甜菜的残余干纤维。所述产物可以是农产品。
在一个实施方案中，该产品包含编码SPY多肽的重组核酸和/或重组SPY多肽，例如作为该产品特定品质的指示物。在另一个实施方案中，本发明涉及防伪的磨碎种子、磨碎的茎和/或磨碎的根，其具有本发明的植物细胞和/或本发明的构建体以作为来源的指示和/或作为生产商的指示，其中磨碎的根优选地是磨碎的甜菜根，更优选地磨碎的糖料甜菜根。
本发明也包括用于产生产品的方法，其包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物并且d)从或借助该植物或其部分(包括茎、茎段、甘蔗叶芽、根、甜菜和/或种子)产生所述产品。在又一个实施方案中，所述方法包括步骤a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物，d)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和e)从或采用本发明的植物的可收获部分产生所述产品。在一个实施方案中，本发明的方法是制造布匹的方法，其通过：a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)培育能够产生可用于布匹制造的纤维的本发明植物，例如棉花；d)从所述植物取出如本文所述的可收获部分，和e)从所述可收获部分产生纤维；和f)从e)的纤维产生布匹。本发明的另一个实施方案涉及产生用于生物反应器、发酵过程或生物燃气厂的进料的方法，所述方法包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物；d)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和e)产生用于生物反应器、发酵过程或生物燃气厂的进料。在优选实施方案中，本发明的方法是从来自植物材料产生化学品，优选化学商品，更优选醇的方法，所述方法包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物；d)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和e)任选地产生用于发酵过程的进料，或用于转化为化学品的进料，优选用于转化为化学商品的进料；和f)-在步骤d)或e)后-从所述进料或可收获部分产生一种或多种化学品，优选一种或多种化学商品，更优选一种或多种醇，优选地通过使用微生物如真菌、藻类、细菌或酵母或细胞培养物产生。常见例子将是使用含糖类可收获部分例如玉米种子、甘蔗茎部分或糖料甜菜的甜菜根部分生产乙醇。在一个实施方案中，从转基因植物的茎产生产物。在另一个实施方案中，从根，优选从植物直根和/或甜菜根产生产物。
在另一个实施方案中，本发明的方法是用于产生一种或多种聚合物的方法，所述方法包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物；d)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和e)从可收获部分产生一种或多种单体，任选地涉及中间产物，f)通过所述单体至少之一与其他单体反应或所述单体彼此反应产生一种或多种聚合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于产生药物化合物的方法，所述方法包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物；d)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和e)从可收获部分产生一种或多种单体，任选地涉及中间产物，f)从可收获部分和/或中间产物产生药物化合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于产生一种或多种化学品的方法，所述方法包括a)在植物细胞或植物中引入和表达编码SPY多肽的核酸；b)任选从该植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达该核酸的植物；c)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和d)任选从可收获部分产生一种或多种化学结构单元，如但不限于乙酸酯、丙酮酸酯、乳酸酯、脂肪酸、糖、氨基酸、核苷酸、类胡萝卜素、类萜或类固醇，任选地涉及中间产物，d)通过所述结构单元至少之一与其他所述结构单元和/或水和/或一种或多种气体反应或所述结构单元彼此反应产生一种或多种化学品。
本发明也涉及通过如本文所述的用于产生产品的方法获得的产品。在又一个实施方案中，通过本发明的制造方法产生的产物是植物产物，如但不限于食品原料、饲料原料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，这些生产方法用来制备农产品，如但不限于纤维、植物提取物、一个或多个提取过程后的饼粕或压滤饼和其他边角料、粉、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。优选的糖类是糖，优选地是蔗糖。在一个实施方案中，农产品选自由1)纤维、2)木材、3)植物提取物、4)一个或多个提取过程后的饼粕或压滤饼或其他边角料、5)面粉、6)蛋白质、7)糖类、8)脂肪、9)油、10)聚合物例如纤维素、淀粉、木质素、木质纤维素、和11)1)至10)中任一者的组合和/或混合物。在优选的实施方案中，产物或农产品通常不包含活植物细胞，包含如本文所述的表达盒、基因构建体、蛋白质和/或多核苷酸。
在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或构建体包含于农产品中。在一个特定实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质可以用作产品标志物，例如在通过本发明方法产生农产品的情况下。这种标志物可以用来鉴定已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本领域已知的多种方法检测此类标志物，例如，但不限于基于PCR的核酸检测方法或基于抗体的蛋白质检测方法。
本发明的另一实施方案是商业包装(commercialpackage)，其包括：
1.本发明植物的无性繁殖体，例如但不限于甘蔗的茎段或甘蔗叶芽，和/或
2.包含本发明的植物细胞，和/或
3.包含在农产品中，含有本发明的多核苷酸和/或多肽和/或构建体，和/或
4.包含本发明的重组染色体DNA。
本发明的另一实施方案是指成套的试剂盒，其包含农业地点(agriculturallocus)，且该农业地点的土壤与过量表达编码任意前述主张中定义的多肽的核酸的植物物理接触，其中该农业地点的氮供应不限制该植物的生长和发育。农业地点一般是农田。
本发明也包括编码如本文中所述的SPY多肽的核酸的用途，和这些SPY多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的SPY多肽的核酸或SPY多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以与编码SPY多肽的基因遗传连锁的DNA标记。这些核酸/基因或SPY多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标志物随后可以用于育种计划中以在本发明方法中选择具有如本文所定义的一种或多种增强的产量相关性状的植物。另外，编码SPY多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码SPY多肽的核酸也可以用作探针以遗传地和物理地定位这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标志物。此类信息可能用于植物育种中以开发具有所需表型的品系。
在一个实施方案中，与对照植物和对照植物的相应植物部分相比，本发明植物或其部分并且尤其所述植物的可收获部分的总贮藏糖类含量增加。贮藏糖类优选地是糖如，但不限于蔗糖、果糖和葡萄糖，和多糖，如但不限于淀粉、葡聚糖和果聚糖。可以按本领域已知的许多方式测量总贮藏糖类含量和各个类别或种类的糖的含量。例如，作为WO2006066969公开的国际申请在第[79]至[117]段中公开了确定甘蔗的总贮藏糖类含量(包括果聚糖含量)的方法。
另一种用于甘蔗的方法如下：
将转基因甘蔗植物在温室或田间培育10至15个月。使用用于培育植物的标准条件。
收获具有10至15月龄并具有超过10节间的甘蔗植物的茎秆。在已经移除全部叶后，将茎秆的节间从顶部(＝1)至底部(例如＝36)编号。从每个节间的中部切下重量大约1-2g的茎秆圆片。随后将3个节间的茎秆圆片合并以产生一份样品并冷冻在液氮中。
对于糖提取，首先将茎秆圆片在Waring搅拌器(来自Waring，NewHartford，Connecticut，美国)中粉碎。通过在95℃在10mM磷酸钠缓冲液pH7.0中振摇1小时，提取糖。此后，通过经30μm筛过滤移除固形物。随后将所产生的溶液糖用于测定(见下文)。
将转基因甘蔗植物生长10至15个月。在每种情况下，使转基因系和野生型甘蔗植物的甘蔗茎秆脱叶，将茎秆分成具有3个节间的段，并且将这些节间段在密封的50ml塑料容器中冷冻于液氮中。测定样品的鲜重。出于糖测定目的的提取如下文所述那样进行。
通过NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转化成NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，在酶测定法中以光度测定方式确定根据上文描述的糖提取方法所获得的提取物中的葡萄糖含量、果糖含量和蔗糖含量。在还原期间，烟酰胺环处的芳族特征丧失，并且吸收光谱因此改变。可以按光度测定方式检测到吸收光谱的这种改变。借助酶己糖激酶和腺苷三磷酸(ATP)，提取物中存在的葡萄糖和果糖转化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸随后由酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化以产生6-磷酸葡萄糖酸。在这个反应中，NAD+还原以产生NADH，并且以光度测定方式测定形成的NADH的量。形成的NADH和提取物中存在的葡萄糖之间的比率是1:1，因而可以使用NADH的摩尔吸收系数(每摩尔和每cm光路6.31)，从NADH含量算出葡萄糖含量。在葡萄糖-6-磷酸完全氧化后，已经在溶液中同样形成的果糖-6-磷酸由磷酸葡萄糖异构酶转化以产生葡萄糖-6-磷酸，后者转而氧化以产生6-磷酸葡萄糖酸。再次，果糖和形成的NADH的量之间的比率是1:1。此后，提取物中存在的蔗糖由蔗糖酶(Megazyme)切割以产生葡萄糖和果糖。释放的葡萄糖分子和果糖分子随后用上述酶在NAD+依赖性反应中转化以产生6-磷酸葡萄糖酸。一个蔗糖分子转化成6-磷酸葡萄糖酸产生两个NADH分子。同样以光度测定方式测定形成的NADH的量并且使用NADH的摩尔吸收系数，将它用于计算蔗糖含量。
如上所述，在每种情况下将甘蔗茎秆分成3个节间的段。将节间从顶部至底部编号(顶部＝节间1，底部＝节间21)。
另外，可以使用本领域已知的任何方法分析转基因甘蔗植物，所述方法例如是但不限于：
●通过全宽度Hatch采样器对甘蔗采样；ICUMSA(国际糖分析统一方法委员会，http://www.icumsa.org/index.php？id＝4)方法GS5-5(1994)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过取样管法对甘蔗采样；ICUMSA方法GS5-7(1994)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过气相色谱测定糖蜜和工厂产品-官方；和甘蔗汁中的蔗糖；ICUMSA方法GS4/7/8/5-2(2002)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过气相色谱测定甘蔗糖蜜中蔗糖、葡萄糖和果糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS7/4/8-23(2011)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过高效离子色谱测定甘蔗汁、糖浆和糖蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS7/8/4-24(2011)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得。
对于甘蔗之外的作物，相似方法是本领域已知的或可以从用于另一种作物的已知方法容易地改造。例如，可以在针对糖料甜菜修改的情况下，通过上文描述用于甘蔗的任何方法，测定糖料甜菜的贮藏糖类含量。
另外，可以使用本领域已知的任何方法对转基因糖料甜菜植物分析生物量或它们的含糖量或其他表型参数，所述方法例如是但不限于：
●通过酶促方法甜菜汁和加工产物中的葡萄糖和果糖-ICUMSA(国际糖分析统一方法委员会，http://www.icumsa.org/index.php？id＝4)方法GS8/4/6-4(2007)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过HPAEC-PAD测定甜菜糊和甜菜汁中的甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖和蜜三糖；ICUMSA方法GS8-26(2011)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过气相色谱测定甘蔗糖蜜中蔗糖、葡萄糖和果糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS7/4/8-23(2011)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过高效离子色谱测定甘蔗汁、糖浆和糖蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS7/8/4-24(2011)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过酶促方法甜菜汁和加工产物中的葡萄糖和果糖；ICUMSA方法GS8/4/6-4(2007)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得
●通过LuffSchoorl法测定甜菜渣的表观总含糖量；ICUMSA方法GS8-5(1994)，从VerlagDr.AlbertBartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得。
另外，应当理解的是本申请全文中的“包含”在一个实施方案中可以被“基本上由…组成”替换，优选是当“包含”谈及本发明的多核苷酸、构建体、重组染色体DNA和/或多肽时。例如，“包含SPY编码核酸”可以被“基本上由SPY编码核酸组成”替换。
另外，本发明涉及以下具体实施方案，其中表述“如权利要求/项X中定义”意指指导技术人员如项/权利要求X中所公开那样适用该定义。例如，“如项1中所定义的核酸应如此理解，从而如项1中的核酸的定义应适用于该核酸。因此，术语“如项中所定义的”或“如权利要求中定义”可以分别用该项或权利要求的相应定义替换。
另外或备选的实施方案：
1.用于优选当氮不受限时，相对于对照植物增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括调节、优选相对于对照植物增加植物中编码SPY多肽的核酸的表达，其中所述的SPY多肽包含：
i)以下基序：
基序2(SEQIDNO:47):
R-S-R-S-P-L-G-L-[AG]-[DEH]-R-x(1,3)-I-x-[SV]
或
ii)i)中描述的基序2，和另外
基序1(SEQIDNO:46):
H-[ST]-Q-V-x-K-I-[KR]-x-E-[FIM]-[DE]-K-I-x(0,3)-S-[LP]
iii)根据ii)的基序和另外如SEQIDNO:45所列序列代表的共有序列；其中–x代表在任何基序位置存在经常如–x之后括号内最小整数数字或最大整数数字或–x代表在任何基序位置上，存在如–x指示之后的括号内最小整数数字、最大整数数字，或最小数字和最大数字之间任何整数数字所示数量的任何类型的氨基酸残基，其中最小整数数字和最大整数数字可能相同，因此仅一个整数数字存在于–x之后的括号内，并且其中–x(1)缩写为–x，且在-x位置插入的任何氨基酸残基不需要与前一个氨基酸残基或另一个插入的氨基酸残基是相同的类型,
并且优选当氮不受限时，相对于对照植物增强植物中一种或多种产量相关性状。
2.根据实施方案1的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入并且表达编码所述SPY多肽的所述核酸实现。
3.根据实施方案1或2的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的早期活力和/或增加的产量，优选相对于对照植物增加的早期活力和/或增加的种子产量和/或增加的生物量产量，且优选包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
4.根据实施方案1-3中任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
5.根据实施方案1-3中任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是干旱胁迫、盐胁迫或养分缺乏(氮不受限)条件下获得的。
6.根据实施方案1-5中任一项的方法，其中所述SPY多肽是：
(i)当用TargetP1.1软件分析时，没有可检测的靶向信号的碱性小蛋白质；且
(ii)当用2013年4月4日发布的版本为42.0的Interpro软件分析时，无可检测的Interpro结构域；且
(iii)具有等于或小于15000Da的分子质量；且
(iv)包含以数量计至少15％的碱性侧链氨基酸；且
(v)包含以数量计不超过30％的碱性侧链氨基酸；且
(vi)具有的含硫氨基酸的含量以数量计等于或小于5％；且
(vii)包含以数量计等于或小于5％的芳香族氨基酸残基；和/或以数量计等于或大于16％的酸性氨基酸，但以数量计不超过30％的酸性氨基酸。
7.前述任一项实施方案的方法，其中所述SPY多肽由选自以下的核酸分子编码：
(i)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41代表的核酸，优选由SEQIDNO:1代表的核酸；
(ii)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41代表的核酸，优选由SEQIDNO:1代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码SPY多肽的核酸，所述SPY多肽以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中所给出的基序中任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状的核酸分子；
或所述SPY多肽选自以下：
(i)由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中所给出的基序中任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。
8.根据实施方案1至7中任一个实施方案的方法，其中编码SPY多肽的所述核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，更优选地来自杨柳科，甚至更优选地来自杨属，最优选地核酸来自毛果杨。
9.根据实施方案1至8中任一个实施方案的方法，其中所述编码SPY的核酸编码表A中所列的任一种多肽或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸的互补序列杂交的核酸。
10.根据实施方案1至9中任一个实施方案的方法，其中所述核酸序列编码表A中给出的任意多肽的直向同源物或侧向同源物。
11.根据实施方案1至10中任一个实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQIDNO:2代表的多肽。
12.根据实施方案1至11中任一个实施方案的方法，其中所述的核酸与植物来源的组成型启动子有效连接，优选与植物来源的中等强度组成型启动子有效连接，更优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
13.通过根据实施方案1至11中任一个实施方案的方法可获得的植物、其部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案1，和6至11中任一个实施方案中所定义的SPY多肽的重组核酸。
14.过量表达构建体，其包含：
(i)编码如实施方案1，和6至11中任一个实施方案中所定义的SPY的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
15.根据实施方案14的过量表达构建体，其中所述控制序列之一是植物来源的组成型启动子，优选是植物来源的中等强度组成型启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
16.宿主细胞，优选细菌宿主细胞，更优选农杆菌物种宿主细胞，其包含根据实施方案14或15中任一个实施方案的构建体。
17.根据实施方案14或15的构建体在用Ω于制备植物的方法中的用途，所述植物当氮不受限条件时，具有一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的(产量──早期活力)，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。
18.用根据实施方案14或15的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
19.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物当氮不受限条件时，相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量和/或增加的早期活力，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中引入并且表达编码如实施方案1，和6至10中任一个实施方案中所定义的SPY多肽的核酸；并且
(ii)在促进植物生长和发育而无氮的限制的条件下培育所述植物细胞或植物，尤其是相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。
20.转基因植物，其相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的(产量──早期活力)，并且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量，原因在于调节编码如实施方案1，和6至10中任一个实施方案中所定义的SPY多肽的核酸的表达，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。
21.根据实施方案13、18或20的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。
22.根据实施方案13、18、20或21的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选地是苗和或根)生物量和/或种子，其中可收获部分包含如实施方案1，或6至11中所定义的SPY多肽的编码核酸，或包含如实施方案1，或6至11中所定义的SPY多肽。
23.产物，从根据实施方案13、18、20或21的植物和/或从根据实施方案22的植物的可收获部分产生，其中产物包含如实施方案1，或6至11中所定义的SPY多肽的编码核酸，或包含如实施方案1，或6至11中所定义的SPY多肽。
24.编码如实施方案1，和6至11中任一个实施方案中所定义的SPY多肽的核酸的用途，用于在氮不受限条件下，相对于对照植物增强植物中的一种或多种产量相关性状，优选地用于增加产量和/或早期活力，并且更优选相对于对照植物用于增加植物中的种子产量和/或增加生物量。
25.用于产生产品的方法，其包括以下步骤：在氮不受限条件下，培育根据实施方案13、18、20或21的植物，并且从或借助所述植物或其包括种子在内的部分产生所述产品。
26.重组染色体DNA，包含根据实施方案14或15的构建体。
27.产生转基因种子的方法，其包括步骤(i)在植物中引入编码如实施方案1，和6至11中任一个实施方案中所定义的SPY的核酸，或实施方案14或15中所定义的构建体；(ii)通过将所述转基因植物与对照植物相比，选择这样产生的具有增强的产量相关性状的转基因植物；(iii)培育所述植物，以产生种子，其中所述转基因种子包含所述核酸或构建体。
28.实施方案27的方法，其中从所述转基因种子长出的后代植物相对于对照植物，具有增加的多肽表达。
29.根据实施方案14或15的构建体，优选植物表达构建体，或根据实施方案26的重组染色体DNA，其包含在宿主细胞中，优选在植物细胞中，更优选在作物植物细胞中。
30.组合物，其包含实施方案22的重组染色体DNA和/或实施方案14或15的构建体，以及宿主细胞，优选植物细胞，其中重组染色体DNA和/或构建体包含在宿主细胞中。
31.实施方案1-32中任一项的实施方案，其中核酸不是或不编码下述多肽，所述多肽是公开于2009年8月29日公开的国际申请WO2009105612中，分别是SEQIDNO:157或158的序列。
定义
以下定义将在本申请中自始至终使用。本申请中的章节标题和节标题目的仅在于方便和参考目的并且不应当以任何方式影响本申请的含义或解释。通常向本申请范围内所用的技术术语和表述给予在植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。应当理解如本说明书中和权利要求中所用，“a”或“an”可以意指一个或多个，这取决于使用它的上下文。因此，例如，对“一个细胞”的提及可以利用至少一个细胞。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”特别设计处于给予的所述值或范围的20％以内、10％以内或5％以内的值或范围。如本文所用，术语“包含”也包括术语“由……组成”。
肽/蛋白质
除非本文中另外提到，否则术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
术语“核苷酸”指由核碱基、戊糖和至少一个磷酸酯基团组成的核酸结构单元。因此，术语“核苷酸”包括单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与衍生所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶的未修饰蛋白具有基本上相同的生物活性和功能活性。
基因的“同源物”包括这样的核酸序列，它们相对于所讨论的未修饰基因具有核苷酸取代、缺失和/或插入并且与衍生这些核酸序列的未修饰基因具有基本上相同的活性和/或功能特性，或编码多肽，所述多肽与未修饰的核酸序列所编码的多肽具有基本上相同的生物活性和/或功能活性。
直向同源物和侧向同源物是两种不同形式的同源物并且包括用来描述基因或蛋白质的祖先关系的进化概念。侧向同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因或蛋白质；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因或蛋白质，并且也源自共同的祖先基因。
“缺失”指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸或从核酸移除一个或多个核苷酸。
”插入”指将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点内或指将一个或多个核苷酸引入核酸序列中的预定位点内。关于蛋白质，插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
“取代”指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的实例
残基 保守性取代 残基 保守性取代
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)的融合物。
核酸的“衍生物”包括这些核酸，与该核酸的天然存在形式的核苷酸序列相比，它们可以包含缺失，改变或非天然存在的核苷酸添加。与该核酸的天然存在形式的核苷酸序列相比，这些衍生物可以是天然改变或非天然改变的核苷酸。分别在植物中表达或阻遏时，蛋白质或核酸的衍生物仍提供基本上相同的功能，例如增强的产量相关性状。
功能性片段
术语“功能性片段”指任何核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质分别仅包含全长核酸或全长蛋白质的部分，但分别在植物中过量表达或阻遏时仍提供基本上相同的功能，例如增强的产量相关性状。
在需要过量表达核酸的情况下，术语“基本上相同的功能活性”或“基本上相同的功能”意指在植物中表达时，任何同源物和/或片段提供增加/增强的产量相关性状。优选地，基本上相同的功能活性或基本上相同的功能意指与通过外源表达全长的编码SPY的核苷酸序列或SPY氨基酸序列所提供的功能活性相比，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％或更高的增加/增强的产量相关性状。
结构域、基序/共有序列/标签
直向同源物和侧向同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。侧向同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因。
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关的氨基酸序列或核酸序列中短的保守区。对于氨基酸序列，基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864；Letunic等人，(2002)NucleicAcidsRes30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology).AltmanR.,BrutlagD.,KarpP.,LathropR.,SearlsD.编著，第53-61页,AAAIPress,MenloPark；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002))及Pfam蛋白质家族数据库：R.D.Finn,J.Mistry,J.Tate,P.Coggill,A.Heger,J.E.Pollington,O.L.Gavin,P.Gunesekaran,G.Ceric,K.Forslund,L.Holm,E.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.BatemanNucleicAcidsResearch(2010)DatabaseIssue38:211-222)。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:Theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis,NucleicAcidsRes.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)JMolBiol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使缺口数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等人,(1990)JMolBiol215:403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法容易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定相似性和同一性的总体百分数(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(SmithTF,WatermanMS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
交互式BLAST
通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST(以目的序列作为查询序列运行BLAST软件)。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自衍生查询序列的生物中的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到侧向同源物，随后的反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和侧向同源物。
转运肽
“转运肽”(或转运信号，信号肽，信号序列)是指导蛋白质转运、优选地转运至细胞内部的细胞器或转运至某些亚细胞位置或用于分泌蛋白质的短(长3-60个氨基酸)肽链。转运肽也可以称作转运信号、信号肽、信号序列、靶向信号或(亚细胞)定位信号。
杂交
如本文中所定义的术语”杂交"是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]–500x[Lc]-1–0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子
Tm＝79.8℃+18.5(og10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交分子：
对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20–35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01–0.4M范围内是精确的。
b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。
cL＝双链体的长度(以碱基对计)。
dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的实例包括在55℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。在一个优选实施方案中，高严格性条件意指在65℃于包含0.1SDS和任选地5xDenhardt试剂、100μg/ml变性片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1xSSC中杂交，随后在65℃于0.3xSSC中的洗涤。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：alaboratorymanual，第三版ColdSpringHarborLaboratoryPress，CSH，NewYork或参考CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMCBioinformatics.6:25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。
内源的
本文中对“内源”核酸和/或蛋白质的称谓指如植物中以其天然形式(即不存在任何人类干预如重组DNA技术的情况下)存在的所讨论核酸和/或蛋白质，还指处于分离形式的随后被(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达的明显降低和/或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。
外源的
术语“外源”(与“内源的”相反)核酸或基因指已经借助重组DNA技术引入植物中的核酸。“外源”核酸可以不以其天然形式出现在这种植物中，与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸不同，或可以与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸相同，但是不整合在其天然遗传环境内部。“外源”的相应含义在蛋白质表达的背景下适用。例如，与内源基因表达相比时，含有转基因(即，外源核酸)的转基因植物可以遭遇相应的基因或蛋白质表达总体上大幅度增加。本发明的转基因植物包括整合在任何基因座处的外源SPY核酸，并且任选地，所述植物还可以包括在天然遗传背景内部的内源基因。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
表达盒
如本文所用的“表达盒”是能够在宿主细胞中或在体外表达系统中表达的DNA。优选地，DNA、DNA部分或形成表达盒的遗传元件的排列是人造的。技术人员非常清楚为了成功表达而必须在表达盒中存在的遗传元件。表达盒包含与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接的待表达的目的序列。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如用于增加的表达/过量表达的定义部分中所描述，也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。
表达盒可以整合至宿主细胞的基因组中并且随所述宿主细胞的基因组一起复制。
构建体/基因构建体
这是在所含遗传元件的排列中部分或完全人造的DNA，能够一般通过在宿主细胞中复制来增加或减少目的DNA和/或蛋白质的表达并用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物中。复制可以在整合入宿主细胞的基因组后或因构建体作为载体或人工染色体的部分存在于宿主细胞内部发生。
本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任何细胞。技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。
一般而言，构建体/基因构建体是表达构建体并且包含一个或多个可以导致目的基因过量表达(过量表达构建体)或减少表达的表达盒。构建体可以由表达盒组成。目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如用于增加的表达/过量表达的定义部分中所描述，也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。
本发明的遗传构建体可以还包括用于特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是遗传构建体需要作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述遗传构建体可以任选地包含一种选择标记基因。在本文的“定义”部分中更详细地描述选择标记。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
载体构建体/载体
这是在所含遗传元件的排列中部分或完全人造的DNA(如但不限于质粒或病毒DNA)，能够在宿主细胞中复制并用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物中。载体可以是构建体或可以包含至少一个构建体。载体可以在不整合至宿主细胞基因组中的情况下复制，例如细菌宿主细胞中的质粒载体，或它可以将其部分或全部DNA整合至宿主细胞的基因组中并且因此导致其DNA的复制和表达。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任何细胞。技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。一般，载体包含至少一个表达盒。一个或多个目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之结合的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”或“启动子序列”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括–35盒序列和/或–10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3'调节区如终止子或远离ORF的其他3'调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18SrRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”意指以下的启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其在全部情况以低于受35SCaMV启动子控制时所获得水平的水平表达。
有效地连接
术语“有效地连接”或“功能性连接”互换地使用，并且如本文所用，指启动子序列与目的基因之间功能性连接，以至于启动子序列能够指导目的基因转录。
就调节元件而言，术语“功能性连接”或“功能性连接的”理解为意指例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列并且根据需要与其他调节元件(例如，终止子、如本文所述的NEENA或如本文所述的RENA)以如此方式依次排列，从而每种调节元件可以履行其目的功能以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。作为同义词，可以使用“有效连接”或“有效连接的”。表达可以根据所述核酸序列的排列导致有义或反义RNA。为此目的，不是必需要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从远离的位置或甚至从其他DNA分子对靶序列产生其作用。优选的排列是这样的排列，其中待表达的核酸序列重组地位于充当启动子的序列之后，从而这两个序列相互共价地连接。该启动子序列与待重组表达的核酸序列之间的距离优选地小于200碱基对、特别地优选小于100碱基对、非常特别优选地小于50碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列以如此方式位于启动子之后，其中转录起点与本发明RNA的所希望的开端相同。功能性连接和表达构建体可以借助如(例如，在ManiatisT，FritschEF和SambrookJ(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)；Silhavy等人(1984)ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)；Ausubel等人(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience；Gelvin等人(编著)(1990)PlantMolecularBiologyManual；KluwerAcademicPublisher,Dordrecht,TheNetherlands)所述的惯用重组和克隆技术产生。然而，其他序列，例如充当带限制性酶特定切割位点的接头或充当信号肽的序列，也可以位于这两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节性区域例如启动子和待表达核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在并且被插入植物基因组，例如通过转化法。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
遍在启动子
遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学品(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。
下表2b中列出根特异性启动子的实例。
表2b：根特异性启动子的实例
种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。下表2c至2f中显示种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例。种子特异性启动子的其他实例在QingQu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2,113-125,2004)中给出，所述文献的公开内容通过引用方式如完整给出那样并入本文。
表2c：种子特异性启动子的实例
表2d：胚乳特异性启动子的实例
表2e：表2e：胚特异性启动子的实例
表2f：糊粉特异性启动子的实例
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下表2g中显示。
下表2g中显示可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。
表2g：绿色组织特异性启动子的实例
组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。下表2h中显示可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。
表2h：分生组织特异性启动子的实例
终止子
术语”终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。
选择标记(基因)/报道基因
"选择标记"、"选择标记基因"或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或萦光(绿色萦光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。
因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其他更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，"转基因的"、”转基因”或"重组"就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
c)a)和b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350、US200405323或WO00/15815中描述。另外，天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用的蛋白质的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–在这种表达盒未整合在天然遗传环境中，而因将所述表达盒从其天然遗传环境分离并在不同遗传环境再插入而导致整合于不同遗传环境中时，变成重组表达盒。
应当进一步指出，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别视为同义于“重组核酸”或“重组多肽”，并且分别指不位于其天然遗传环境或细胞环境和/或已经通过重组方法修饰过的核酸或多肽。分离的核酸序列或分离的核酸分子是这样一种核酸序列或分子，它不处于其天然环境或其天然核酸邻居中，然而它与其他核酸序列或核酸分子物理地和功能地连接并且作为核酸构建体、载体序列或染色体的部分存在。
为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中所使用的核酸不存在于所述植物的基因组中或不源于其中，或存在所述植物的基因组中，但是不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
如本文所用，术语“转基因”指生物例如转基因植物，指生物，例如，植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分，其外源地含有本文所述的核酸、构建体、载体或表达盒或其部分，所述核酸、构建体、载体或表达盒或其部分优选地是通过基本上不是生物转化法的方法、优选地通过农杆菌介导转化法或粒子轰击法引入。为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指本文中所述的核酸不存在于或不源于所述植物的基因组中，或存在所述植物的基因组中，但是不处在所述植物基因组中它们的天然基因环境内，所述核酸有可能同源或异源地表达。
调节
相对于表达或基因表达，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比，表达水平因所述的基因表达而改变，该表达水平可以增加或减少。原初的、未调节的表达可以是任何类型的结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA表达，伴随后续翻译。为了本发明的目的，原始未调节的表达也可以是不存在任何表达。就本发明方法、构建体、表达盒、载体、植物、种子、宿主细胞和用途中所用的蛋白质或核酸而言，术语“调节活性”或术语“调节表达”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，所述变化导致植物中增加或减少的产量相关性状。表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或遗传构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括翻译mRNA和随后合成所编码的蛋白质，即，蛋白质表达。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。本文中对“增加的表达”，“增强的表达”或“过量表达”的谈及意指相对于对照植物而言基因表达的增加，和/或只要谈及多肽，增加的多肽水平和/或增加的多肽活性。与对照植物相比，表达、多肽水平或多肽活性的增加以增加的优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％、或100％或甚至更多。与对照植物相比，表达的增加可以以增加的优选顺序是至少100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％或5000％或甚至更多。当对照植物仅具有非常少量表达、所讨论序列和/或重组基因的多肽水平或多肽活性处在强力调节元件控制下时的情况下，与对照植物相比，表达、多肽水平或多肽活性的增加可以是至少100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、5000倍、10000倍、20000倍、50000倍、100000倍或甚至更多倍。在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。
若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其他真核基因。
内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cellbiol.8：4395-4405；Callis等(1987)GensDev1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5'末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
为了获得多肽的增加表达或过量表达，最常见地，使编码这种多肽的核酸按有义方向伴随多聚腺苷化信号的情况下过量表达。除了适于以预期表达模式驱动表达的启动子之外，可以使用内含子或其他增强性元件。与此相反，相同核酸序列作为反义构建体的过量表达将不导致蛋白质的增加表达，而导致蛋白质的减少表达。
减少的表达
本文中对“减少的表达”或“降低或基本消除”表达的称谓意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％,或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。
为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、侧向同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中导入(优选通过重组方法)并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、侧向同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、侧向同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含控制序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等(1998)WO98/53083；Waterhouse等(1999)WO99/53050)。
本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。
一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、侧向同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。"反义"核酸序列包含与编码蛋白质的"有义"核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区"指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区"指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5'和3'非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、侧向同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和'加帽'及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其他的核苷酸修饰是本领域众所周知的。
这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(insitu)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。
根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)NuclAcRes15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)NuclAcRes15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)PlantJ.20(3)：357-62)、(AmpliconVIGSWO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其他人描述的策略而实现。
当在内源基因上存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。
另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，AnticancerDrugRes.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。
其他方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。
通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwabetal.,Dev.Cell8,517–527,2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwabetal.,PlantCell18,1121-1133,2006)。
为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会容易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
转化
如本文中所提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。备选地，可以选择不能再生成植株的植物细胞作为宿主细胞，即所产生的转化的植物细胞不具有再生成(完整)植株的能力。
外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；NegrutiuI等(1987)PlantMolBiol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(ShillitoR.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(CrosswayA等，(1986)Mol.GenGenet202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(KleinTM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(inplanta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16，735–743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(PlantMolBiol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(PlantJ6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,在：TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143及在PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，VectorsforGeneTransferinHigherPlants；在TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208：1-9；FeldmannK(1992)。在：编者CKoncz，N-HChua和JShell，MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)PlantJ.5：551-558；Katavic(1994)MolGenGenet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。CRAcadSciParisLifeSci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)ThePlantJ.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[NatureBiotechnology22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology).JMolBiol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology).TrendsBiotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。
可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。备选地，基因修饰的植物细胞不可再生成完整植株。
通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如本文所述的选择标记)的存在。
在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新导入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如，在植物中，嫁接至未转化接穗的转化砧木)。
在本申请通篇范围内，用构建体转化或互换地由构建体转化或者用或由核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞将理解为因通过生物技术手段引入这种构建体或这种核酸而携带所述构建体或所述核酸作为转基因的植物、植物部分、种子或植物细胞。这种植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含这种重组构建体或这种重组核酸。引入后，在传代中不再包含该重组构建体或该重组核酸的任意植物、植物部分、种子或植物细胞被称为失效分离子(null-segregant)、失效合子或失效对照，不认为这样的构建体或这样的核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞在本申请含义范围内。
T-DNA激活标签化
“T-DNA激活”标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILLING
用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(RedeiGP和KonczC(1992)在MethodsinArabidopsisResearch，KonczC，ChuaNH，SchellJ，Singapore编辑，WorldScientificPublishingCo，第16–82页；Feldmann等，(1994)在MeyerowitzEM，SomervilleCR编辑，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第137-172页；LightnerJ和CasparT(1998)在JMartinez-Zapater，JSalinas编者，MethodsonMolecularBiology第82卷.HumanaPress，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)NatRevGenet5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBOJ9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)NatBiotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2)：132-8)进行了描述，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等人,NatureBiotechnol.25,778-785,2007)。
产量相关性状
“产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可以包括以下非限制特征清单中的一个或多个：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期活力、绿度指数、生长速率、农艺性状如例如淹没耐受性(这导致稻中增加的产量)、水使用效率(WUE)等。
术语“一种或多种产量相关性状”理解为指与对照植物相比，一种植物的一个产量相关性状，或两个、或三个、或四个、或五个、或六或七个或八个或九个或十个或超过十个产量相关性状。
本文中对“增强的产量相关性状”的谈及意指相对于对照植物而言，完整植物或某植物的一个或多个部分的产量相关性状(例如早期活力和/或生物量)的增加，所述的部分可以包括(i)地上部分、优选地上可收获部分和/或(ii)地下部分、优选地可收获地下部分。
具体而言，这类可收获部分是根如直根、茎、甜菜根、块茎、叶、花或种子。
在本申请通篇范围，植物针对一种或多种农业化学品的耐受性和/或抗性，例如除草剂耐受性，不视为本申请该术语含义范围内的产量相关性状。植物针对一种或多种农业化学品的改变的耐受性和/或抗性，例如改善的除草剂耐受性，不是如本申请通篇范围所用的“增强的产量相关性状”。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间段有关。基于其数目、大小和/或重量，个体植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。
术语植物的“产量”并且“植物产量”在本文中可互换地使用，并意指营养体生物量如根和/或苗生物量，意指繁殖器官，和/或意指繁殖体，如该植物的种子。
玉米中的花是单性的；雄性花序(雄穗)源自顶端茎并且雌性花序(雌穗)来自腋芽顶端。雌性花序在中轴(玉米芯)表面上产生成对小穗。雌性小穗的每一个包封两朵能育性小花，一旦受精，它们中至少一朵将通常成熟为玉米谷粒。因此，玉米中的产量增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的谷穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、谷穗长度/直径的增加、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加，及其他。
稻植物中的花序命名为圆锥花序。圆锥花序携带小穗，小穗是圆锥花序的基本单位并由花梗和小花组成。小花生于花梗上并且包括花，花由两片保护性颖片覆盖：较大颖片(外稃)和较短颖片(内稃)。因此，以稻为例，产量增加可以自身表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加、千粒重增加，及其他。
早期开花时间
如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一圆锥花序出现之间的日数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。
早期活力
“早期活力”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期活力的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期活力可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其他因素而确定。
增加的生长速率
增加的生长速率可以专指植物的一个或多个部分(包括种子)，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸多因素如萌发速度、早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期阶段间，增加的生长速率可以反映增强的生长势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物更晚播种和/或更早收获，而这本来是不可能的(在开花时间更早情况下，可以获得相似的效果)。如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规的生长时期内)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的情况下，从相同砧木收获额外的次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产的增加(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比野生型对应物更广泛的地理区域内栽培，因为栽培某作物的地域限制往往由栽种时间(早季)或收获时间(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线推算多项参数来确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所耗费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所耗费的时间)，以及其他参数。
胁迫抗性
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫引起的受损生长往往是对农业而言不受欢迎的特征。
将“生物性胁迫”理解为由其他活生物如细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫、其他动物或其他植物对植物产生的不利影响。“生物性胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、植物、线虫和昆虫或其他动物引起的那些胁迫，这些胁迫可以对植物生长和/或产率产生不利作用。
将“非生物胁迫”理解为特定环境中非活力因素对活植物的不利影响。非生物胁迫或环境胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归因于干旱)、盐胁迫或冷冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物性胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冷冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。如Wang等人(Planta(2003)218:1-14)中所报道，非生物性胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以递增的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。
增加/改善/增强
在产量相关的性状背景中的术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比产量相关性状(如但不限于更多产量和/或生长)至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％增加。
种子产量
增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：
a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米而言计算；
b)每株植物增加的花数；
c)增加的种子数；
d)增加的种子充实率(其表述为充实小花数除以小花总数之间的比率)；
e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)的产量除以植物地上部分的生物量的比率；和
f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的充实种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子尺寸和/或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加引起。
术语“充实的小花”和“充实的种子”可以视为同义词。
种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。
绿度指数
如本文中所用的“绿度指数”从植物的数字图像计算。对于属于该图像上植物目标的每个像素，计算绿色值对红色值的比率(以编码颜色的RGB模式)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素的百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。
生物量
如本文所用的术语“生物量”意指植物或植物部分的总重量。总重量可以计量为干重、鲜重或湿重。在生物量的定义范围内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述的部分可以包括以下的任何一项或多项：
-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；
-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量、茎生物量、茎段等；
-地下部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；
-地下可收获部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；
-部分地下的可收获部分，如但不限于甜菜和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎；
-营养体生物量如根生物量、苗生物量等；
-繁殖器官；和
-繁殖体如种子。
在本申请通篇范围的一个优选实施方案中，对“根”作为生物量或作为可收获部分或例如作为含糖量增加的器官的任何谈及理解为谈及部分地插在土地中或与土地实际接触的可收获部分，如但不限于甜菜根和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎，但是不包括叶，以及地下可收获部分，如但不限于根、直根、块茎或球茎。
在另一个实施方案中，将地上部分或地上可收获部分或地上部分生物量理解为不包括种子和/或果实的地上部分营养体生物量。
标记辅助育种
此类育种计划有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理来导入等位变异；或者，所述计划可以始于一组并非故意造成的所谓“自然”来源性等位变体。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。而后是步骤：选择所讨论序列的并且导致产量增加的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一株植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。
用作(基因作图)中的探针
编码目的蛋白的核酸用于对基因进行遗传和物理作图的用途仅需至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(SambrookJ，FritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual)可以用编码目的蛋白的核酸探测。所得的带型随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)，进行遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸可以用来探测含有一组个体的限制性内切核酸酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表确定的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离被注意到并且用来计算编码目的蛋白的核酸在先前使用这个群体所获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变型对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等人，在：Non-mammalianGenomicAnalyasis：APracticalGuide，Academicpress1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，所述核酸探针可以用于直接萦光原位杂交(FISH)作图中(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。尽管现有的FISH作图法支持大克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)GenomeRes.5:13-20)的使用，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
多种基于核酸扩增的用于遗传作图及物理作图的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用来设计并且产生在扩增反应或在引物延伸反应中所使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，可能需要鉴定在对应于本发明核酸序列的区域内作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，对作图法而言，这通常不是必需的。
植物
如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidiaspp.)、秋葵属物种(Abelmoschusspp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyronspp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Alliumspp.)、苋属物种(Amaranthusspp.)、欧洲海滨草(Ammophilaarenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、落花生属物种(Arachisspp.)、木波罗属物种(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassicarapassp.)[卡诺拉、油菜(oilseedrape)、蔓青(turniprape)])、Cadabafarinosa、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicumspp.)、Carexelata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castaneaspp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属物种(Citrusspp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、芋头(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorussp.)、芫荽(Coriandrumsativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、番红花(Crocussativus)、南瓜属物种(Cucurbitaspp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、菜蓟属(Cynaraspp.物种)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蝗属物种(Desmodiumspp.)、龙眼(Dimocarpuslongan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloaspp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusinecoracana)、画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotryajaponica)、桉属(Eucalyptussp.)、红仔果(Eugeniauniflora)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、水青冈属物种(Fagusspp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragariaspp.)、银杏(Ginkgobiloba)、大豆属(Glycinespp.)(例如大豆、大豆(Sojahispida)或大豆(Sojamax))、陆地棉(Gossypiumhirstum)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeumspp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglansspp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrusspp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchichinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、Luzulasylvatica、番茄属(Lycopersiconspp.)(例如番茄(Lycopersiconesculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、苹果属物种(Malusspp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属物种(Manihotspp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotusspp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotianaspp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属(Oryzaspp.)(例如稻、阔叶稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passifloraedulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetumsp.)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、芹菜(Petroselinumcrispum)、虉草(Phalarisarundinacea)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、猫尾草(Phleumpratense)、刺葵属物种(Phoenixspp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属物种(Physalisspp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、豌豆属物种(Pisumspp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populusspp.)、牧豆草属物种(Prosopisspp.)、李属物种(Prunusspp.)、番石榴属物种(Psidiumspp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanussativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salixsp.)、接骨木属物种(Sambucusspp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamumspp.)、白芥属物种(Sinapissp.)、茄属(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanumtuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、万寿菊属物种(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecalerimpaui、小麦属(Triticumspp.)(例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(Triticummacha)、普通小麦(Triticumsativum)、一粒小麦(Triticummonococcum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitisspp.)、玉蜀黍、Zizaniapalustris、枣属物种(Ziziphusspp.)等等。
对照植物
合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是因分离而丢失转基因的个体。另外，将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育，即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
繁殖材料/繁殖体
“繁殖材料”或“繁殖体”是能够发育成完整植物的植物器官、组织或细胞的任何一种。“繁殖材料”可以基于营养性繁殖(也称作营养繁殖、营养增殖或营养性克隆)或有性繁殖。繁殖材料可以是因此种子或非繁殖器官的部分，如茎或叶。具体地，就禾本科而言，合适的繁殖材料也可以是茎的切片，即，茎插枝(如茎段或叶芽)。
茎秆
“茎秆”是属于禾本科的植物的茎，并且又称作“有效茎”。在禾本科的情况下，“茎秆”、“茎”、“苗”或“分蘖”互换使用。
茎段
“茎段”是来自禾本科的植物的一段茎，其合适作为繁殖材料使用。“茎段”的同义表述是“种蔗(seed-cane)”、“茎插枝”、“茎秆切片”和“种段(seedpiece)”。
叶芽
“叶芽”或“甘蔗叶芽”是甘蔗茎上切下的部分，通常是就这些茎的表面而言是圆形或椭圆形，且包含茎的节的部分，优选具有分生组织，且适合再生为甘蔗植株。
实施例
本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是说明性的。以下实施例不意在限制本发明的范围。具体而言，使用了在所描述的实验中使用的植物，因为拟南芥、烟草、稻和玉米植物是检验转基因的模式植物。因检验相对容易，它们广泛地用于本领域中，同时具有结果向农业中所用其他植物的良好可转移性，所述其他植物是如，但不限于玉米、小麦、稻、大豆、棉花、菜籽油菜(包括卡诺拉)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿，或其他双子叶或单子叶植物作物。
除非另外说明，否则本发明采用植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的常规技术和方法。
DNA操作：除非另外说明，否则重组DNA技术根据(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH,NewYork)或Ausubel等人(1994),CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。在BIOS科学出版有限责任公司(BIOSScientificPublicationsLtd(英国))和Blackwell科学出版社(BlackwellScientificPublications)(英国)出版的R.D.D.Cray的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)中描述了用于植物分子研究工作的标准材料和方法。
实施例1：鉴定与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；和Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相关的(全长cDNA、ESTs或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQIDNO:1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。
表A提供与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相关的一系列核酸序列。
表A:SPY核酸、多肽和其他相关序列的实例：
(1)仅为对比示出，SEQIDNO:35和36分别不是SPY编码核酸或SPY多肽。
序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。例如，真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物(例如针对某些原核生物)创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(JointGenomeInstitute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。
实施例2：SPY多肽序列的比对
多肽序列的比对用ClustalW(版本1.83)进行并且由Thompson等人,(NucleicAcidsResearch22,4673(1994))描述。独立程序的源代码是公众从德国海德堡欧洲分子生物学实验室可获得的。使用ClustalWv1.83的默认参数(缺口开口罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA末端缺口：-1；蛋白质/DNA缺口距离：4)，进行分析。SPY多肽比对于图2中。
黑色阴影中的白色字母表示多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，灰色阴影中的白色字母代表高度保守的氨基酸取代。
构建SPY多肽的系统树(图3)。为此，使用在ClustalW比对(参数如上所示)期间产生的引导树。
共有序列(SEQIDNO:45)来自表A中所列序列的多重比对，且如上所述。字母表示单字母氨基酸密码，指示在至少80％比对的蛋白质中保守的氨基酸，而字母X代表在至少80％比对的蛋白质中不保守的氨基酸。共有序列始于所研究序列的比对中的第一个保守的氨基酸，终于所研究序列的比对中最后一个保守的氨基酸。
实施例3：计算多肽序列之间的总体同一性百分数
使用两种方法：MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.CampanellaJJ,BitinckaL,SmalleyJ；软件由LedionBitincka提供)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间全局相似性百分比和同一性百分比。MatGAT为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(执行一系列逐对比对，计算相似性和同一性，并且随后将结果置于距离矩阵中。
来自EMBOSS软件包(欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)；http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)的软件程序“needle”。
图4A中显示在这些多肽序列的全长范围内总体同一性百分数的MatGAT分析结果。分析中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一缺口：12，延伸缺口：2。与SEQIDNO:2相比，在实施本发明方法中有用的SPY多肽序列之间的序列同一性(以％计)可以低至33％(但是通常高于50％)。
与对全长序列类似的，可以生成基于特定结构域的顺序的表。基于SPY多肽的多重比对结果，例如实施例2的一个多重比对结果，技术人员可以选择保守序列并且作为输入提交用于相似性/同一性分析。这种方法用于SPY蛋白之间总体序列保守性相当低的情况下。
作为备选的且是通常优选的方法，通过来自EMBOSS软件包，版本号6.3.1.2(欧洲分子生物学开放软件包；http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/；参见McWilliamH.,ValentinF.,GoujonM.,LiW.,Naraya-nasamyM.,MartinJ.,MiyarT.和LopezR.(2009),网页服务器位于EuropeanBioinformaticsInstitute–2009,NucleicAcidsResearch37:W6-W10；获自EMBLEuropeanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,Cambridge,CB101SD,UK,和http://emboss.sourceforge.net/)的程序“NEEDLE”确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的总体同一性百分数。
图4B中显示在多肽序列的全长范围内总体同一性百分数的分析结果。分析中使用的参数是：-缺口开放0.0，-缺口延伸0.5，矩阵：BLOSUM62(缩写为EBLOSUM62)。
实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的基序
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所(WelcomeTrustSANGERInstitute,Hinxton,英格兰,UK(http://pfam.sanger.ac.uk/))服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
使用来自HMMer3.0软件包的程序“hmmscan”搜索高品质WelcomeTrustSANGERInstitute,Hinxton,英格兰,英国(http://pfam.sanger.ac.uk/)SPY“PFAM-A”部分，未发现特征或结构域。HMMER是SeanEddy及其同事开发的用于蛋白质序列分析的隐马尔科夫方法(profilehiddenMarkovmethods)的集合(HMMER网络服务器:交互式序列相似性检索R.D.Finn,J.Clements,S.R.EddyNucleicAcidsResearch(2011)WebServer发布39:W29-W37)，可获自http://hmmer.wustl.edu/和http://hmmer.janelia.org/。
如SEQIDNO:2所代表的多肽序列的InterProScan结果(见ZdobnovE.M.和ApweilerR.；“InterProScan-InterProScan-用于InterPro中特征标识识别方法的集成平台”；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro数据库，2013年4月4日发布的版本42.0)。使用默认参数(DB遗传密码＝标准；转录物长度＝20)。
保守基序的鉴定
用软件工具MEME版本3.5鉴定保守样式。MEME由美国圣迭戈市加利福尼亚州立大学计算机科学与工程系TimothyL.Bailey和CharlesElkan开发并且由TimothyL.Bailey和CharlesElkan描述(Fittingamixturemodelbyexpectationmaximizationtodiscovermotifsinbiopolymers(通过期望最大化拟合混合模型以发现生物聚合物中的基序)，第二届分子生物学智能系统国际会议文集(ProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology)，第28-36页,AAAIPress,MenloPark,California,1994)。独立程序的源代码是公众从圣迭戈超级计算机中心(http://meme.sdsc.edu)可获得的。
为了用软件工具MEME鉴定全部序列中的共同基序，使用以下设置：-最大尺寸500000，-nmotifs15，-evt0.001，-maxw60，-距离1e-3，-用于分析的序列的最少位点数。用于MEME的输入序列是FASTA格式的未比对序列。在这个版本软件中在默认设置下使用其他参数。
用软件工具2.1版Pratt或手工地生成保守结构域的PROSITE样式。Pratt由挪威卑尔根大学信息学系Jonassen开发并由Jonassen等人描述(I.Jonassen,J.F.Collins和D.G.Higgins,Findingflexiblepatternsinunalignedproteinsequences(找到未比对的蛋白质序列中的柔性样式),ProteinScience4(1995),第1587-1595页；I.Jonassen,Effi-cientdiscoveryofconservedpatternsusingapatterngraph(使用样式图高效发现保守样式),1997年2月提交至CABIOS]。独立程序的源代码(ANSIC)是公众可获得的，例如在设立的生物信息中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)处。
为了用软件工具Pratt生成样式，使用以下设置：PL(最大样式长度)：100，PN(最大样式符号数)：100，PX(最大连续x's数目)：30，FN(柔性间隔区最大数目)：5，FL(最大柔性)：30，FP(最大柔性乘积)：10，ON(最大样式数目)：50。Pratt的输入序列是蛋白质序列的如从软件工具MEME鉴定为显示高度相似性的不同区域。将必须匹配所生成样式的最小序列数目(CM，匹配Seq的最小数目)设定为所提供序列的至少80％。
POI模式1来自通过程序MEME和PRATT，从SPY蛋白质的ClustalW比对中计算得到的模式序列。该模式然后手动调节达到POI模式1。
POI模式2通过使用上述MEME和PRATT产生。
假设在PROSITE模式格式中，给定多肽序列中基序的存在可以通过程序Fuzzpro鉴定，如在“欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)“(EMBOSS)，版本6.3.1.2(TrendsinGenetics,16(6)，276(2000))中那样执行。
在一个实施方案中，SPY多肽包含与SEQIDNO:2中所含的2个保守基序(如图1中，通过其起始位置和结束位置所示)中任一个基序和/或SEQIDNO:45的共有序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基序。
实施例5：SPY多肽序列的拓扑结构预测
TargetP1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何N端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测的存在进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必须相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。对于预测含有N端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。在丹麦技术大学(TechnicalUniversityofDenmark)的服务器上维护TargetP(见http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/和“LocatingproteinsinthecellusingTargetP,SignalP,andrelatedtools(使用TargetP、SignalP和相关工具定位细胞中的蛋白质)”,OlofEmanuelsson,Brunak,GunnarvonHeijne,HenrikNielsen,NatureProtocols2,953-971(2007))。
在分析序列前，必须选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。TargetP设置是：“植物”；临界值(cutoff)cTP＝0；临界值mTP＝0；临界值SP＝0；其他临界值＝0。包括切割位点预测。
如SEQIDNO:2所代表的多肽序列的TargetP1.1分析结果显示没有预测到特定的靶向。已经选择“植物”生物组别，没有限定临界值，并且对预测的转运肽长度提出要求。如SEQIDNO:2所代表的多肽序列的亚细胞定位可能在细胞质或细胞核中，预测没有转运肽。
表C：如SEQIDNO:2所代表的多肽序列的TargetP1.1分析结果。缩写：Len，长度；cTP，叶绿体转运肽；mTP，线粒体转运肽；SP，分泌途径信号肽；other，其他亚细胞靶向；Loc，预测的位置；RC，可信性级别
许多的其他算法可以用来执行此类分析，它们包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM
·PSORT(URL:psort.org)
·PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)。
实施例6：克隆编码SPY的核酸序列
使用定制的毛果杨cDNA文库作为模板，通过PCR扩增核酸序列。
用于克隆的cDNA文库从毛果杨的不同组织(例如叶、根)定制。所使用的毛果杨的幼株从比利时收集。
使用在50μlPCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的TaqDNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm15175(SEQIDNO:43；有义，起始密码子为粗体字)：
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggagaacaatagcagcaac3’
和prm15176(SEQIDNO:44；反向、互补)：
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctggtgaattctctgctacaac3’，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法((LifeTechnologiesGmbH,FrankfurterStraβe129B,64293Darmstadt,德国)的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pSPY。作为技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen(LifeTechnologiesGmbH,FrankfurterStraβe129B,64293Darmstadt,德国)购买。
包含SEQIDNO:1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQIDNO:48)位于这个Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2::SPY(图5)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。
实施例7：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在次氯酸钠溶液中孵育30分钟至60分钟、优选地30分钟(取决于污染等级)，随后用无菌蒸馏水洗涤3至6次，优选地4次。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在光照下孵育6日后，将盾片衍生的愈伤组织用如下文所述的农杆菌转化。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。将愈伤组织浸入该悬液1至15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。在洗去农杆菌后，将愈伤组织在光照下在含有2,4-D的培养基上于28℃-32℃在选择剂存在下培育10至14日(indica的生长时间：3周)。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织。在转移这种材料至再生培养基后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后的4至6周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。
稻栽培品种indica的转化也可以根据技术人员熟知的技术以上文给出的相似方式进行。
对于一个构建体，产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996,Chan等人,1993,Hiei等人,1994)。
作为替代，可以根据以下方法产生稻植物：
将含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，将愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。随后将混悬液转移至培养皿内，并且将愈伤组织浸入悬液中15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗于28℃下在选择剂存在下于含2,4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。
对于一个构建体，产生大约35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996,Chan等人,1993,Hiei等人,1994)。
实施例8：其他作物的转化
玉米转化
玉米的转化根据对Ishida等(1996.NatureBiotech14(6)：745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对TexasA&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜/卡诺拉转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，PlantCellRep17:183-188)转化。商业栽培品种Westar(AgricultureCanada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/lBAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5–10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/lBAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839–847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(AgricultureCanada)或如BrownDCW与AAtanassov(1985.PlantCellTissueCulture4:111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839–847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
棉花转化
使用根癌农杆菌，根据US5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人,Exp.CellRes.50:151-158(1968))、0.1mg/l2,4-D、0.1mg/l6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/mlMgCL2以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周继代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。将转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管内，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠基腺嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。
糖料甜菜转化
将糖料甜菜(甜菜(BetavulgarisL.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，随后在20％次氯酸盐漂白粉(例如常规漂白粉(从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA94612,USA可商业获得))中摇动20分钟。将种子用无菌水冲洗并且晾干，随后铺种到萌发培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige,T.和Skoog,1962.Physiol.Plant,第15卷,473-497)上，所述培养基包含B5维生素(Gamborg等人；Exp.CellRes.,第50卷,151-8)，补充有10g/l蔗糖和0.8％琼脂)。根据Hussey和Hepher，将下胚轴组织基本上用于苗培养的启动(Hussey,G.和Hepher,A.,1978.AnnalsofBotany,42,477-9)并且在pH5.8的基于MS的培养基上在23-25℃以16小时光周期维持，所述培养基补充有30g/l蔗糖外加0.25mg/L苄氨基嘌呤和0.75％琼脂。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因，例如nptII。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约1。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH5.5的包含乙酰丁香酮的接种培养基(O.D.约1)中。将苗基组织切成小片(大约1.0cmx1.0cmx2.0mm)。将组织浸入细菌液体接种培养基中30秒。通过滤纸吸干除去多余的液体。在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上的共培育进行24-72小时，随后是一个非选择时期，包括在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上孵育，所述培养基含有诱导苗发育的1mg/LBAP和用于消除农杆菌的头孢噻肟。在3-10日后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418(依赖基因型，50-100mg/L)的相似选择培养基。将组织每2-3周转移至新鲜培养基以维持选择压力。非常快的苗启动(在3-4日后)表示现存分生组织的再生，而非新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮传代培养后，将小苗转移至含有5mg/LNAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基。采取额外的步骤以减少产生嵌合(部分转基因的)转化植物的可能性。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于糖料甜菜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey和Gallois的那些方法(Linsey,K.和Gallois,P.,1990.JournalofExperimentalBotany；第41卷,第226期；529-36)或在作为WO9623891A公开的国际申请中所公布的方法。
甘蔗转化
从田间培育的6月龄甘蔗植物分离纺锤体(Spindle)(见Arencibia等人,1998.TransgenicResearch,第7卷,213-22；Enriquez-Obregon等人,1998.Planta,第206卷,20-27)。通过在20％次氯酸盐漂白粉(例如常规漂白粉(从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA94612,USA可商业获得))中浸泡，将材料消毒。将约0.5cm的横断切片以顶朝上的方向置于培养基上。将植物材料在基于MS(Murashige,T.和Skoog,1962.Physiol.Plant,第15卷,473-497)的培养基上在23℃于黑暗下培育4周，所述培养基包含B5维生素(Gamborg,O.等人,1968,Exp.CellRes,第50卷,151-8)，补充有20g/l蔗糖、500mg/L酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg/L2,4-D。在4周后，将培养物转移到相同的新鲜培养基上。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因，例如hpt。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH5.5的包含乙酰丁香酮的基于MS的接种培养基(O.D.约0.4)中。基于形态学特征如致密结构和黄颜色，将甘蔗胚发生性愈伤组织片(2-4mm)分离并且在层流罩(flowhood)干燥20分钟，随后浸入细菌接种液体培养基中10-20分钟。通过滤纸吸干除去多余的液体。在黑暗下于滤纸上共培育3-5日，其中所述滤纸置于包含B5维生素的含有1mg/L2,4-D的基于MS的培养基顶部。在共培育后，愈伤组织用无菌水洗涤，接着是在相似培养基上的一个非选择培养时期，所述相似培养基含有500mg/l头孢噻肟以消灭剩余的农杆菌细胞。在3-10日后，将外植体转移至包含B5维生素的基于MS的选择培养基持续另外3周，所述选择培养基含有1mg/L2,4-D，载有25mg/L潮霉素(依赖于基因型)。全部处理在23℃在黑暗条件下进行。抗性愈伤组织进一步在缺少2,4-D的包含1mg/LBA和25mg/L潮霉素的培养基上以16小时光周期培育，导致苗结构的发育。将苗分离并且在选择性生根培养基(基于MS，包含20g/l蔗糖、20mg/L潮霉素和500mg/L头孢噻肟)上培育。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例如来自作为WO2010/151634A公布的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。
对于通过粒子轰击法转化，可以通过Snyman等人的方法实施愈伤组织的诱导和甘蔗转化(Snyman等人,1996,S.Afr.J.Bot62,151-154)。构建体可以随在pEmu启动子(Last等人,Theor.Appl.Genet.81,581-588)控制下表达npt[pi]基因的载体pEmuKN一起共转化(Beck等人,Gene19,1982,327-336；GenBank登录号V00618)。通过Snyman等人2001年的方法(ActaHorticulturae560,(2001),105-108))，105-108)再生植物。
实施例9：表型评价程序
9.1评价建立
产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1子代以3:1比例对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下所培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并确保满足植物完整生长和发育的需要，除非这些植物用于胁迫筛选中。
使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
按照如对T1世代相同的评价方法，可以在T2世代中进一步评价T1事件，例如采用更少的事件和/或每个事件采用更多个体。
干旱筛选
早期干旱筛选
将T1或T2植物在正常条件下萌发并正常转移至盆栽土壤中。盆栽植株至它们的盆中后，将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将土壤湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。随后将植物再转移至正常条件。在营养期间，重复干旱循环两次，在第一个干旱循环完成之后进行再浇水之后马上开始第二个循环。每个干旱周期之前和之后，使植物成像。
栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下所培育的植物相同。如正常条件下所详述那样记录生长和产量参数。
繁殖干旱筛选
将T1或T2植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。然后它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将土壤湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。随后将植物再转移至正常条件。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下所培育的植物相同。如正常条件下所详述那样记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
将T1或T2植物在由椰子纤维和焙烤粘土颗粒(Argex)(3:1比率)构成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。
9.2统计分析：F-检验
使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
9.3测量的参数
使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)，如WO2010/031780中所述。将这些量值用来测定不同的参数。
生物量相关的参数测量
通过测量植物地上面积(或绿色生物量)确定植物地上部分的生物量，其中通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数(AreaMax)确定所述植物地上面积。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physicalsurfacevalue)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大绿色生物量的时间点上所测量的面积。
根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量，“RootMax”)；或表述为根/苗指数增加(“RootShInd”)，度量为在根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例。换句话说，将根/苗指数定义为在根和苗活跃生长时期中根生长速度对苗生长速度的比率。这个参数是根生物量和发育的指标。
还可以测量根直径，高于某个厚度水平(thicknesslevel)和低于某个薄度水平(thinnesslevel)的根的量。可以使用如WO2006/029987中所述的方法确定根生物量。稻植物的根生物量可用作其他植物中地下生物量和/或根来源器官生物量(例如，糖料甜菜的甜菜生物量或马铃薯块茎)的指示物。
可以测量绝对高度(“HeightMax”)。植物高度的替代性稳健指标是测量重力中心的位置，即确定地上部分绿色生物量的重心的高度(以mm计)。基于曲线拟合的渐近线或如果该拟合不令人满意，则基于最大绝对值(“GravityYMax”)，这避免受单片直立叶影响。
与发育时间相关的参数
早期活力是萌发后3周的植物地上面积。通过计数来自植物地上部分中与背景区别的像素总数确定早期活力。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physicalsurfacevalue)。
“萌发活力(EmerVigor)”是早期植物生长的指示。它是将已建立的幼苗从其萌发盘重新上盆入其最后的花盆一周后的植物地上生物量。它是成像中的叶生物量所覆盖的面积(mm2)。它通过计数来自区别于背景的地上植物部分的像素总数来测定。针对在同一时间点从不同角度拍摄的照片对此值进行平均，并通过计算转化为以平方毫米表示的物理表面值。
“AreaEmer”是快速早期发育的指标，当与对照植物相比时这个值下降。它是植物需要产生30％最终生物量的时间和需要产生90％其最终生物量的时间之间的比率(以％表述)。
可以使用如WO2007/093444中所述的方法确定植物的“至开花时间”、“TTF”或“开花时间”。
相对生长速率(“RGR”)是第二时间点测量的地上生物量(称为“总面积(TotalArea)”)的自然对数减去第一时间点的地上生物量的自然对数除以这两个时间点之间的天数([log(总面积2)-log(总面积1)]/天数)。时间点对同一实验中的所有植物而言是相同的。选择第一时间点作为在栽植后25和41天之间进行的最早测量。如果该实验中该时间点的测量(植物)的数目小于该实验每个时间点进行的测量的最大数目的三分之一，则采用下一个时间点(同样对测量的数目具有相同的限制)。第二时间点简单地是下一时间点(同样对测量的数目具有相同的限制)。
测量植物的绿度
绿度指数计算为1减去浅绿色(光谱中的频点(bin)2-21)像素数除以像素总数乘以100(100*[1-(浅绿色像素数/总像素数)])。
早期绿度：
开花时间点之前的时间点的绿度指数(“GNbfFlow”或“EarlyGN”)，在该实验达到无效植物的最大平均绿度时。开花时间点定义为检测到超过3株具有圆锥花序的植物的时间点。也可以从数字图像测量开花前绿度(GNbfFlow)。它是植物在开花之前绿度的指标。在开花之前中最后成像时绿色像素和深绿色像素的比例(表述为％)。它是发育时间相关的参数和生物量相关的参数。
时间点对实验中的所有植物而言是相同的。如果该时间点的有效观察的数目为30或更少，则选择开花前无效植物具有第二高的平均绿度的时间点。从不选择第一时间点作为开花时间点。
晚期绿度：
开花时间点之后或开花时间点时的时间点的绿度指数(“LateGN”)，在该实验达到无效植物的最小平均绿度时。开花时间点定义为检测到超过3株具有圆锥花序的植物的时间点。
时间点对实验中的所有植物而言是相同的。如果该时间点的有效观察的数目为30或更少，则选择开花后或开花时无效植物具有第二低的平均绿度的时间点。
干旱后的绿度
干旱胁迫后的植物绿度(“GNafDr”)可以测量为干旱处理后的第一次成像中绿色像素和深绿色像素的比例(表示为％)。
种子相关的参数测量值
将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子通常由干燥外部覆盖物-谷壳覆盖。使用鼓风装置，将充实粒(本文也称为充实小花)与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。在分析天平上将充实粒称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定种子总数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总重量(“种子总产量”，“TWS”)。
通过计数从一株植物收获的籽粒(无论是否充实)数确定每株植物的种子(或小花；“nrtotalseed”)总数。
从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒重(“TKW”)。
本发明中的收获指数(“harvestindex”，HI)定义为种子总重量与地上部分面积(mm2)之间的比率，乘以系数106。
如本发明中定义的每圆锥花序花数(“flowersperpanicle”；“fpp”)是种子总数与成熟主穗数目之间的比率。
如本发明中定义的“种子填充率”或“种子充实率”(“nrfilledseed”)是充实种子(即含有种子的小花)对种子总数(即小花总数)的比例(表述为％)。换句话讲，种子充实率是填充有种子的小花的百分比。
而且，可以确定首次开花时的圆锥花序数目(“firstpan”)和每圆锥花序的花数目(fpp)(估计植物上每个圆锥花序的平均小花数的计算参数(首次开花时的植物小花数/圆锥花序数))。
实施例10：转基因植物的表型评价结果
下文在表D中呈现非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，所述转基因稻植物处于T1世代并且表达了编码SEQIDNO:2的SPY多肽的核酸。在非胁迫条件下培育时，观察到地上部分生物量(AreaMax,GravityYmax)、根生物量(RootMax,RootThinMax,和RootThickMax)，以及种子产量(包括种子总重量、种子数、充实率、收获指数)开花前绿度增加至少5％。
此外，表达SPY核酸的植物显示更快的生长速率，与对照植物所需的时间相比，表示为负值-5.2％，即，从播种到植株达到其最终生物量的90％的那天(AreaCy-cle)需要更短的时间(以天计)。同时示为萌发活力(EmerVigor)的早期生长增加得更多。
增加的发育和生物量也可见于开花前(GNbfFlow)的最大高度值(HeightMax)和绿度值，两者均平均增加4.3％。过量表达SPY编码核酸SEQIDNO:1的那些植物的更快生长和发育的趋势也可以在直至开花所需的更短的时间(TimetoFlower)方面观察到，平均减少2.4％，虽然P-值仅为0.149。
在不同的事件上平均，根冠比(root-to-shootindex)是负数。显示增加的根生长和根生物量效果的六个事件(而不是更强增加的地上部分生物量超过地下植物部分的增加的生长的事件)之一的植物在很大程度上影响这个指标。大部分其他事件显示相似的趋势，但是在两类生物量的增加之间没有这种区别。
表D：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示T1世代植株的总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。
参数 总体增加
AreaMax 21.0
GravityYMax 6.3
HeightMax 4.3
EmerVigor 18.4
GNbfFlow 4.3
EarlyGN 9.0
AreaCycl -5.2
RootMax 10.5
RootThickMax 8.5
RootThinMax 6.1
totalwgseeds 32.4
nrtotalseed 21.9
flowerperpan 19.5
fillrate 7.4
harvestindex 10.2
nrfilledseed 33.0
具体的统计学显著性是AreaMax(大部分的植物增加；P-值＝0.003),根冠比(所有的事件均降低，由于更强的地上部分生长；p-值＝0.002)，种子总重量(大部分的植物增加，p-值＝0.003),每圆锥花序花数(5个事件增加，p-值＝0.001),充实种子数(所有的事件均增加，p-值＝0.002)以及重心高度(GravityYMax，p-值＝0.001)。
种子产量的增加不是由于种子数量的增加，而是由于种子重量的降低。千粒重(TKW)没有被显著影响。

Claims (15)

1.用于在氮不受限条件下，相对于对照植物增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括相对于对照植物，在植物细胞或植物中引入和表达编码多肽的核酸，其中所述多肽：
(i)是碱性小蛋白质；且
(ii)当用2013年4月4日发布的版本为42.0的Interpro软件分析时，无可检测的Interpro结构域；且
(iii)具有等于或小于15000Da的分子质量；且
(iv)包含以数量计至少15％的碱性侧链氨基酸；且
(v)包含以数量计不超过30％的碱性侧链氨基酸；且
(vi)具有的含硫氨基酸的含量以数量计等于或小于5％；且
(vii)包含以数量计等于或小于5％的芳香族氨基酸残基；和/或以数量计等于或大于16％的酸性氨基酸，但以数量计不超过30％的酸性氨基酸；
-所述多肽在下文中称为SPY多肽，且
-当氮不受限时，在促进植物生长和发育的条件下，培育所述植物细胞或植物，尤其是培育相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述SPY多肽具有：
a)当用TargetP1.1软件，采用下述设置分析时，没有可检测的靶向信号，所述设置是：“植物”；临界值cTP＝0；临界值mTP＝0；临界值SP；其他临界值＝0；且进行切割位点预测；和/或
b)当用2013年4月4日发布的版本为42.0的Interpro软件，采用默认参数(DB遗传密码＝标准；转录物长度＝20)分析时，无可检测的Interpro结构域。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述SPY多肽具有至少9.5的等电点值(pI)。
4.根据权利要求1或2或3的方法，其中所述SPY多肽是长度等于或小于110氨基酸的成熟蛋白质。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述的SPY多肽包含：
i)以下基序：
基序2(SEQIDNO:47):
R-S-R-S-P-L-G-L-[AG]-[DEH]-R-x(1,3)-I-x-[SV]
或
ii)i)中描述的基序2，和另外
基序1(SEQIDNO:46):
H-[ST]-Q-V-x-K-I-[KR]-x-E-[FIM]-[DE]-K-I-x(0,3)-S-[LP]
iii)根据ii)的基序和另外如SEQIDNO:45所列序列代表的共有序列；
其中–x代表在任何基序位置上，存在如–x指示之后的括号内最小整数数字、最大整数数字，或最小数字和最大数字之间任何整数数字所示数量的任何类型的氨基酸残基，其中最小整数数字和最大整数数字可能相同，因此仅一个整数数字存在于–x之后的括号内，并且其中–x(1)缩写为–x，且在-x位置插入的任何氨基酸残基不需要与前一个氨基酸残基或另一个插入的氨基酸残基是相同的类型。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述的多肽是由选自以下的核酸分子编码的多肽：
(i)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41代表的核酸，优选由SEQIDNO:1代表的核酸；
(ii)由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39或41代表的核酸，优选由SEQIDNO:1代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码SPY多肽的核酸，所述SPY多肽以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中所给出的基序中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状的核酸分子；
或所述SPY多肽选自以下：
(i)由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列以增加的优选顺序与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40或42代表的氨基酸序列，优选SEQIDNO:2代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQIDNO:46至SEQIDNO:47中给出的基序中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述SPY多肽是植物来源的。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
9.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或养分缺乏但是氮不受限条件下获得。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是增加的早期活力和/或增加的种子产量和/或增加的生物量产量。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸与GOS2启动子有效连接。
12.从植物产生产品的方法，其包括a)在植物细胞或植物中引入和表达如任意项权利要求定义的编码多肽的核酸；b)任选从所述植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达所述核酸的植物并且d)从或借助所述植物或其部分产生所述产品，其中所述植物部分包括茎、茎段、根、甜菜和/或种子，
其中所述产品包含如权利要求1-7中任一项定义的编码多肽的核酸，和/或包含如权利要求1-7中任一项定义的多肽，和/或包含构建体，所述构建体包含：
(i)编码如权利要求1，2或3中定义的SPY多肽的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列，其中至少一个控制序列是植物来源的中等强度组成型启动子；和任选地
(iii)转录终止序列。
13.从植物材料产生醇的方法，其包括a)在植物细胞或植物中引入和表达如权利要求1-7中任一项定义编码多肽的核酸；b)任选从所述植物细胞再生一株或多株植物；c)在氮不受限的条件下培育过量表达所述核酸的植物；d)从所述植物中取出如本文所述的可收获部分和e)任选地产生用于发酵过程的进料，或转化为化学品的进料，优选转化为化学商品的进料；和f)-在步骤d)或e)后-从所述进料或可收获部分产生一种或多种醇。
14.如权利要求1-7中任一项定义的编码多肽的核酸的用途，用于在氮不受限条件下，相对于对照植物增强转基因植物中的产量相关性状。
15.成套的试剂盒，其包含
a)农业地点，和
b)所述农业地点的土壤与过量表达任意前述权利要求中定义的多肽的编码核酸的植物物理接触，
其中所述农业地点的氮供应不限制所述植物的生长或发育。
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