CN103119170A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节编码CER2样(CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽)多肽、或At1g68440样(来自毛果杨的推定的IMP脱氢酶/GMP还原酶)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有CER2样多肽或At1g68440样多肽的编码核酸的受调节表达的植物，该植物相对于相应的对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于实施本发明方法的迄今未知的编码核酸和包括该核酸的构建体。本发明还一般地涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过降低或基本去除编码内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达和/或DEAD-盒RNA解旋酶多肽在所述植物中的水平和/或活性来增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有降低或基本去除编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的内源核酸的表达的植物，该植物相对于相应的对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于实施本发明方法的迄今未知的DEAD-盒RNA解旋酶编码核酸和包括该核酸的构建体。
Description
本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及通过调节编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样(来自毛果杨(Populus trichocarpa)的推定的IMP脱氢酶/GMP还原酶)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有DEAD-盒RNA解旋酶多肽编码核酸的受调节表达的植物，该植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于本发明方法的构建体。
不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地推动了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，这些异质的遗传组分可能不总是导致期望的性状自亲本植物传递。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。此类技术有能力输送具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。
具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常定义为作物的可测量的具有经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产生、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期生长势也可以是决定产量的重要因素。因此优化上述因素可以促进作物产量的增加。
种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，或是通过对种子本身的直接消耗，或是通过对饲养自加工的种子的肉类产品的消耗。它们也可以是工业加工中所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的苗和根的来源)和胚乳(萌发期和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳可以同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以充盈籽粒。
对于许多作物而言，另一重要的性状是早期生长势。提高早期生长势是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速透水出苗的情况下，较长的苗均与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期生长势的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期生长势弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉米，Zea mays L.)杂交种。
再一重要的性状为提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物平均产量降低50％以上(Wang等，Planta 218，1-14，2003)。非生物胁迫可以因为干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在否则将不可能进行作物栽培的地区和不利条件下进行作物栽培。
因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。
视最终用途而定，对某些产量性状的修饰可能优于对其他产量性状的修饰。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料源等应用，可能期望植物营养部分的增加，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增强。即便是在种子参数之中，取决于应用，一些参数也可能优于其它参数。多种机制可以促成增加的种子产量，无论是以增加的种子大小还是以增加的种子数量的形式。
增强植物产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或者参与植物生长或防御机制的多种信号传递路径。
现已发现，可通过调节植物中DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的编码核酸在植物中的表达来增强植物的多种产量相关性状。
背景技术
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
DEAD-盒蛋白在RNA新陈代谢中具有重要作用且它们的作用似乎非常特异。在酵母中，研究显示DEAD-盒蛋白参与调控核糖核蛋白(RNP)复合体的临时重构。文献中，显示一些DEAD-盒蛋白具有RNA依赖的ATP酶和ATP依赖的RNA解旋酶的体外活性。此解旋酶活性需要能量且允许双链核酸(dsDNA或dsRNA)解旋。DEAD-盒和相关的DEAH、DExH和DExD家族，共同归类为DExD/H解旋酶家族，是SF2家族的成员，且共享九个高度保守基序(Gorbalenya和Koonin，1993；Tanner和Linder，2001；Caruthers和McKay，2002)。这些密切相关的家族可由它们保守基序内的不同来区分。DEAD-盒家族迄今是最大的一族，且特征是具有与ATP酶和解旋酶活性和它们的调节有关的九个保守基序(Tanner等，2003)。DExD/H解旋酶的保守基序聚簇于跨度为350-400个氨基酸的中央核心区(Tanner和Linder，2001；Caruthers和McKay，2002)。相比之下，N突出端和C突出端在大小和组成上非常多变(Caruthers和McKay，2002)。
DEAD-盒RNA解旋酶形成在所有真核生物和大多数原核生物中发现的蛋白质大家族(Aubourg等，1999；de la Cruz等，1999；Rocak和Linder，2004)。例如，在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的基因组中鉴定到将近30个编码DEAD-盒RNA解旋酶的基因(Boudet等，2001年)。在拟南芥中，已鉴定到超过50个DEAD-盒RNA解旋酶成员(Aubourg等，1999；Boudet等，2001)。Aubourg等(1999)在拟南芥中表征出六个DEAD-盒RNA解旋酶亚家族。发现了这些亚家族成员和来自其他生物的已知DEAD-盒RNA解旋酶间的相似性以表明可能的功能(Auburg等，1999)。
尽管DEAD-盒RNA解旋酶参与许多多样生物过程，它们的准确功能和调节很大程度上有待鉴定。
2.CER2样多肽
植物表面蜡在保护组织免受环境胁迫中的至关重要性反映在表皮细胞大量投入于角质层形成(Samuels等(2008)，Ann.Rev.Plant Biol.59：683-707)。植物遭受广泛的非生物胁迫，且其角质层蜡层提供了保护性屏障，其主要由长链碳水化合物组成，包括烷烃、伯醇、醛、仲醇、酮、酯和其他衍生化合物(Sheperd等(2006).New Phytol.171(3)：469-99)。通过调节不同酶的编码基因在该通道的表达可实现叶角质层蜡积累的修饰。在拟南芥中，鉴定到一系列在角质层蜡生物合成中受影响的所谓的CER突变体且克隆了一些对应基因。Xia和同事发现拟南芥CER2基因以器官和组织特异的方式表达。此外，CER2以高水平只表达在幼角果(youngsilique)和茎的表皮(Xia等(1996).Plant Cell.8(8)：1291-304)。与CER2启动子在下胚轴中的活性一致，角质层蜡以CER2依赖的方式积累在此器官。在叶中，CER2表达限于保卫细胞、藻丝和叶柄(Xia等(1997).PlantPhysiol.115(3)：925-37)。表达谱特征显示蜡生物合成的发育调节。尽管光和渗透胁迫诱导一些类似CER6的基因，令人惊讶地，CER2在拟南芥中的表达不受非生物胁迫影响(Cha等(2007).Anal Chem.81(8)：2991-3000；Cha等(2008).Plant J.55(2)：348-360)。Broun等(2004，PNAS.101(13)：4706-11)在基因表达分析中证明，如已知参与蜡生物合成的CER1、KCS1和CER2，大量基因被诱引入WIN1，ERF型转录因子。此外，Islam等显示叶蜡积累的修饰改变稻的干旱应激。稻属基因GLOSSY1(GL1)与编码参与茎蜡积累和花粉生育性的醛脱羧酶(decarbonylase)的拟南芥CER1密切相关(Islam等(2009).Plant Mol.Boil.70(4)：443-456)。
3.At1g68440样多肽
通过对蔗糖饥饿的拟南芥细胞培养物进行DNA微阵列分析鉴定其中的拟南芥直向同源物At1g68440为翻译受调节的基因(Nicolai，M.等.PlantPhysiol.2006年6月；141(2)：663-73)。转录和翻译基因列表的比较突出了影响参与细胞周期和细胞生长的基因的转录调节(大部分抑制)的重要性，这些基因在翻译调节基因中所占比例过高，提供了吸引饥饿后的细胞增殖的分子框架。此外，Baxter等(Plant Physiol.2007年1月；143(1)：312-25)显示参与新陈代谢的转录物富集有巨大变化，该转录物如At1g68440，其用于启动备选的碳储备和重构代谢通量以绕开部分受抑制通道，来对付由于暴露于氧化胁迫产生的代谢抑制。此外，证明At1g68440在植物脂笼蛋白家族成员，脱脂载脂蛋白D直向同源物AtTIL敲除的拟南芥中被下调节(Charron Jean-Benoit F等，BMC Plant Biol.2008年7月31日；8：86)。AtTIL脂笼蛋白参与调节对氧化胁迫的耐受性。AtTIL敲除植物对温度突然下降和百草枯处理非常敏感，且黑暗生长的植物在转到光下后很快死亡。
发明概述
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
令人惊讶地，现已发现，减少或基本去除编码内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
根据一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物改善植物中产量相关性状的方法，其包括减少或基本除去内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的编码核酸在植物中的表达。
本说明书的章节主题和标题仅为方便和参考之目的，绝不以任何方式影响本说明书的意图和解释。
2.CER2样多肽
令人惊讶地，现已发现，调节编码如本文定义的CER2样多肽的核酸的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
根据另一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物改善植物中如本文提供的产量相关性状的方法，其包括调节编码如本文定义的CER2样多肽的核酸在植物中的表达。
3.At1g68440样多肽
令人惊讶地，现已发现，调节编码最新鉴定到的如本文定义的白杨直向同源物At1g68440(其所以被定义为At1g68440样多肽)的核酸的表达，产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
根据又一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物改善植物中如本文提供的产量相关性状的方法，其包括调节编码如本文定义的At1g68440样多肽的核酸在植物中的表达。
本说明书的章节主题和标题仅为方便和参考之目的，绝不以任何方式影响本说明书的意图和解释。
定义
以下定义用于本说明书全文。
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在文中可互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸的聚合物。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中可互换使用，是指任何长度的无支链形式的核苷酸聚合物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者两者的组合。
同源物
蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其源自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。
缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。
插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般，氨基酸序列内的插入将小于N-或C-末端的融合，约1到10个残基左右。N-或C-末端融合蛋白或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG
表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。
取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以是成簇取代，并且可以是1到10个氨基酸；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域公知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
表1：保守氨基酸取代的实例
| 残基 | 保守取代 | 残基 | 保守取代 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu；Val |
可通过本领域公知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法在本领域公知。例如，本领域的技术人员公知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案(见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989，逐年更新))。
衍生物
“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与蛋白质如目的蛋白质的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与多肽的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其他配体，例如与氨基酸序列结合以有利于其检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然的氨基酸残基。此外，“衍生物”还可以包括天然形式的蛋白质与标签肽(tagging peptide)例如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(关于标签肽的综述，参见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。
结构域、基序/共有序列/标签序列(Signature)
术语“结构域”是指在进化相关蛋白质的序列比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”通过在蛋白质同源物家族的比对序列中其高度的保守性而鉴定，其能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是结构域的高度保守的部分，但也可以包括仅仅部分的结构域，或者可以是位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。
存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology)Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编辑，53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res 31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定。
为比较而进行序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48：443-453)来寻找两序列之间匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。同源物可以例如，使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等，(2003)BMC Bioinformatics，10：29.2003 Jul 10；4：29.MatGAT：anapplication that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，WatermanMS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
交互BLAST
通常，这包括一次BLAST，即以查询序列(例如，利用实施例部分表A中所列的任何序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，而理想地反向BLAST导致查询序列在最高命中事件中，则鉴定到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，且优选地反向BLAST导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直向同源物。
分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还可以对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助对相关基因的聚簇进行可视化和鉴定直向同源物和旁系同源物。
杂交
本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。
术语“严格性”是指进行杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，在确定的离子强度和pH，对于特定序列而言，低严格条件选择为比热解链温度(Tm)低大约30℃。中等严格条件为温度比Tm低20℃，而高严格条件为温度比Tm低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。
Tm是在确定的离子强度和pH值时，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度特异性杂交。在低于Tm值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度不超过0.4M时，这一作用明显(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃进行，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。取决于杂交体的类型，Tm值可以利用下列公式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交体：
＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或用于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内准确。
b仅对于在30％到75％范围内的％GC是准确的。
cL＝双链体的碱基对长度。
d寡，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一种来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行一系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％降至0％)。本领域技术人员知晓可以在杂交过程中改变而保持或者改变严格条件的各种参数。
除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般，适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的适宜严格条件如上文所示设置。也可以选择更高或更低的严格条件。本领域技术人员知晓可以在洗涤过程中改变从而保持或者改变严格条件的各种参数。
例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50％甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50％甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989及年度更新资料)。
剪接变体
本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持了蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6：25)。
等位基因变体
等位基因或等位基因变体为位于相同的染色体位置的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然多态性品系中SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。
内源基因
本文述及“内源”基因不仅指见于植物之中的天然形式的所讨论基因(即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的所述基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可遭遇该转基因表达的实质性下降和/或该内源基因表达的实质性下降。该分离的基因可从生物体分离或可以例如通过化学合成进行人造。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化是重复进行DNA改组以及继之的适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
构建体
人工DNA(例如包括但不限于质粒或病毒DNA)能够在宿主细胞中复制并用于目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞的任意细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)或农杆菌属(Agrobacterium)细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细胞或植物细胞。本领域技术人员熟知必定出现在基因构建体中，以成功转化、选择和繁殖包含目的序列的宿主细胞的基因元件。目的序列与入本文所述的一个或多个调控序列(至少启动子)有效链接。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于实施本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外)可以有蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。
本发明的遗传构建体可以还包括为在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为染色体外遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。一旦不再需要标记基因可从转基因细胞将其除去或切除。用于标记去除的技术在本领域内是已知的，有用的技术描述于上文中定义部分。
调控元件/控制序列/启动子
术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，取其广义，是指能够影响与之相连的序列表达的调控性核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与识别和结合RNA聚合酶及其他蛋白质，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括对于精确的转录起始是必需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)，以及其他调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)——它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸序列分子的表达。
“植物启动子”包括可以介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。因此，植物启动子不必是植物来源的，还可来源于病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”还可来源于植物细胞，例如，来源于待用欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外，还可以通过修饰启动子的序列而增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须，如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，所述启动子将在恰当的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。
为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将候选启动子与报告基因有效连接、测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。公知的适宜报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活来测定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的密度计量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 GenomeMethods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”表示每个细胞约1/10,000个转录物到约1/100,000个转录物、到约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说每个细胞约1/10个转录物到约1/100个转录物、到约1/1000个转录物。一般，“中等强度启动子”表示以低于强启动子的水平，尤其是以在所有情况下都低于在35S CaMV启动子控制下所获得水平的水平，驱动编码序列表达的启动子。
有效连接
本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。
组成型启动子
“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必然是所有阶段，在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
遍在启动子
遍在启动子基本上在生物体所有的组织或细胞中都有活性。
发育调控型启动子
发育调控型启动子在某些发育阶段或在经历发育改变的植物部分有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子响应化学品(综述参见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境或物理刺激而诱导或增加转录起始，或者可以是“胁迫诱导型”，即当植物接触多种胁迫条件时被激活，或者是“病原体诱导型”，即当植物接触多种病原体时被激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性的启动子是能够在某些器官或组织(如叶、根、种子组织等)中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中，基本上排除在植物的任何其他部分中，具有转录活性的启动子，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。
根特异性启动子的实例列于下表2b。
表2b：根特异性启动子的实例
种子特异性启动子主要在种子组织中，但不必仅在种子组织中(渗漏表达的情况下)，具有转录活性。种子特异性启动子可以在种子发育和/或萌发期间具有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉层/胚特异性的。种子特异性启动子(胚乳/糊粉层/胚特异性的)的实例列于下表2c至表2f中。种子特异性启动子的更多实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，其公开内容作为参考并入本文，如同充分阐述的那样。
表2c：种子特异性启动子的实例
表2d：胚乳特异性启动子的实例
表2e：胚特异性启动子的实例
| 基因来源 | 参考文献 |
| 稻OSH1 | Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996 |
| KNOX | Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999 |
| PRO0151 | WO 2004/070039 |
| PRO0175 | WO 2004/070039 |
| PRO005 | WO 2004/070039 |
| PRO0095 | WO 2004/070039 |
表2f：糊粉特异性启动子的实例
如文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中，基本上排除在任何其他植物部分中，具有转录活性的启动子，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例示于下表2g。
表2g：绿色组织特异性启动子的实例
组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中，基本上排除在任何其他植物部分中，具有转录活性，但仍允许在这些其他植物部分的任何渗漏表达。可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例示于下表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的实例
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。
可选择标记(基因)/报告基因
“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，其中该表型在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因通过一系列不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性、引入新的代谢性状或允许可视选择的标记。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予抗例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗Basta
抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予抗例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲抗性的基因)、或者提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这仅仅是一小部分可能标记的名单。技术人员熟悉此类标记。取决于生物体和选择方法，优选不同的标记。
已知对于核酸在植物细胞中的稳定或瞬时整合，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入该外来DNA，以及，如果期望的话，整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够在例如突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。
由于一旦成功引入了核酸后将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明用于引入核酸的方法最好采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体接收或者对于植物而言(高达40％或以上的转化体)含有两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合在转座子中的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体来瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行了转化，转座子会跳离宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子会跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交以消除标记基因。在微生物学领域，已经研发了使得可以或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于所谓的重组系统；其优势在于可以免除杂交消除。最著名的这类系统是称为Cre/lox系统的系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化成功后，其会因Cre1重组酶的表达而得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：
(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或
(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)(a)和(b)
不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然组合——经非天然的合成(“人工”)方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US 5,565,350或WO 00/15815中。
因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在所述植物的基因组中，本发明方法中所用的核酸不处在或源自所述植物基因组；或处在所述植物基因组中但不在所述植物基因组的天然基因座内，该核酸可以进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。
还要说明在本发明的上下文中，术语“分离核酸”或“分离多肽”在一些实例中被分别认为是“重组核酸”或“重组多肽”的同义词，且指不处在自然基因环境和/或用重组方法修饰过的核酸或多肽。
调节
与表达或基因表达相关的术语“调节”是指与对照植物相比，所述基因表达的表达水平被改变的过程，其中表达水平可增加或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。为了本发明的目的，原初未调节的表达也可以是不存在任何表达。术语“调节活性”应理解为本发明核酸序列或编码蛋白质的任何表达改变，该改变导致植物产量增加和/或生长增加。表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。
表达
术语“表达”或“基因表达”是指特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地是指基因(一个或多个)或基因构建体至结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的转录，有或无后者至蛋白质的随后翻译。该过程包括DNA的转录和所获得的mRNA产物的加工。
增加的表达/过表达
如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。为了本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。
增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，且包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。
如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。
也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见TheMaize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。
降低的表达
本文述及“降低的表达”或者表达“减小或基本上消除”应理解为表示，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。所述减小或基本上消除按照递增的优选顺序为，与对照植物相比，减小至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多。
为减小或基本上消除植物中内源基因的表达，需要一段足够长度的、基本上连续核苷酸的核酸序列。为进行基因沉默，这可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，可选地，这可以多至完整的基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。此基本上连续的核苷酸链可以源自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)，或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸链能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸链按照递增的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列相同。对于本文所讨论的用于减小或基本上消除内源基因表达的各种方法而言，编码(功能性)多肽的核酸序列并非必需的。
减小或基本上消除表达可以利用常规工具和技术来实现。减小或基本上消除内源基因表达的一个优选方法是通过向植物中引入和表达基因构建体，其中，核酸(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码任一目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)以被间隔子(非编码DNA)分隔开的、(部分或完全地)反向重复的形式克隆在该构建体中。
在这样的优选方法中，利用核酸或其部分(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)的反向重复(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默，实现减小或基本上消除内源基因的表达。将该反向重复序列克隆进包含控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔子，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成该反向重复的两个反向核酸之间。该反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可以整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的siRNA。RISC进而切割mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。关于其他一般细节，参见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明的方法的实施不依赖于向植物中引入和表达其中以反向重复形式克隆了核酸分子的基因构建体，而是可以使用几种公知的“基因沉默”法中的任一个或多个来实现相同的效应。
用于减小内源基因表达的一个这样的方法是RNA介导的基因表达的沉默(下调)。在该情况下沉默在植物中由双链RNA序列(dsRNA)触发，所述双链RNA序列基本上与靶内源基因相似。该dsRNA被植物进一步加工成称为短干扰RNA(siRNA)的大约20至大约26个核苷酸。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录物，从而实质性减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选，双链RNA序列相应于靶基因。
RNA沉默法的另一实例包括以有义取向，向植物中引入核酸序列或其部分(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)。“有义取向”是指与其mRNA转录物同源的DNA序列。从而至少一个拷贝的核酸序列被引入植物。该额外的核酸序列将减小内源基因的表达，从而产生称为共抑制的现象。如果将几个额外拷贝的核酸序列引入植物，则基因表达的减小将更明显，因为在高转录水平与共抑制的触发之间存在正相关。
RNA沉默法的另一实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”中。术语“编码区”是指包含将翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”是指连接在编码区侧翼的5′和3′序列，其可被转录但不被翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。
可根据沃尔森和克里克碱基配对法则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与整个核酸序列(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)互补，但也可以是仅对核酸序列的部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起始位点的区域互补。适宜的反义寡核苷酸序列的长度在本领域内是已知的并且可以开始于长大约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少。可使用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应，构建根据本发明的反义核酸序列。例如，反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)可使用天然存在的核苷酸或各种修饰核苷酸来化学合成，所述修饰核苷酸经设计用以增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例在本领域是公知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”和用类似物例如肌苷对一个或多个天然存在的核苷酸的取代。核苷酸的其他修饰在本领域是公知的。
可使用已将核酸序列以反义取向(即，从插入的核酸转录的RNA针对目的靶核酸是反义取向)亚克隆入其中的表达载体，生物学地产生反义核酸序列。优选，植物中，通过稳定地整合的包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的核酸构建体，产生反义核酸序列。
用于在本发明的方法中进行沉默的核酸分子(无论引入植物的还是原位产生的)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达。杂交可通过常规核苷酸互补性以形成稳定的双链体或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中的特定相互作用而产生。可通过转化或在特定组织位置直接注射，将反义核酸序列引入植物。可选地，可修饰反义核酸序列以靶向选择的细胞，然后全身性施用。例如，为了进行全身性施用，可以修饰反义核酸序列，以便其特异性结合选择的细胞表面上表达的受体或抗原(例如，通过将反义核酸序列连接至结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体)。还可使用本文中描述的载体将反义核酸序列递送至细胞。
根据另一方面，反义核酸序列是α-异头物核酸序列。α-异头物核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与常见的b单元(b-units)不同，链走向彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列还可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)NuclAc Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215，327-330)。
还可使用核酶减少或基本上消除内源基因的表达。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，该分子能够切割与其具有互补区的单链核酸序列例如mRNA。因此，核酶(例如，锤头核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591)中描述的)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA的数量。可设计具有对于核酸序列的特异性的核酶(参见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。可选择地，可以使用相应于核酸序列的mRNA转录物，从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶用于在植物中进行基因沉默的用途在本领域是已知的(例如，Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
基因沉默还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3)：357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)等所述的策略来实现。
如果在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸上存在突变，那么基因沉默也可发生。减少或基本上消除可通过非功能性多肽引起。例如，多肽可能结合多种相互作用的蛋白质；因此，可以通过一个或多个突变和/或截短，提供仍然能够结合相互作用的蛋白质(例如受体蛋白)但不能展示其正常功能(例如信号转导配体)的多肽。
进行基因沉默的另一方法是通过用与基因的调控区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列来打靶以形成三螺旋结构，所述结构阻止基因在靶细胞中的转录。参见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992；和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。
其他方法，例如应用针对内源多肽的抗体在植物原位(in planta)抑制其功能、或干扰多肽所参与的信号传递通路，对于技术人员是公知的。特别地，可预期人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能，或用于干扰其中靶多肽参与的信号转导途径。
可选择地，可设置筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有减少的活性的多肽。这样的天然变体也可用于例如进行同源重组。
人工和/或天然微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，一般长度19-24个核苷酸。它们主要用于调控基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物microRNA(miRNA)具有与其靶序列完全或几乎完全的互补性。然而，存在具有达到5个错配的天然靶。miRNA利用Dicer家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长的非编码RNA加工而来。一旦加工后，它们通过结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白，而掺入到RNA诱导沉默复合物中。MiRNA充当RISC的特异性组件，因为它们与细胞质中的靶核酸(大多数为mRNA)碱基配对。随后的调控事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的效应常反映为靶基因的降低的mRNA水平。
人工微小RNA(amiRNA)一般长度21个核苷酸，可以特异地遗传改造以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素在本领域公知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且可用来辅助设计特异性amiRNA(Schwab等，(2005)Dev Cell 8：517-527，2005)。设计和生成amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，(2006)Plant Cell 18(5)：1121-1133，2006)。
为优化性能，用来减小植物中内源基因表达的基因沉默技术需要应用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，而使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列来源于与其待引入的植物相同的植物物种并非是绝对必需的。内源靶基因与待引入的核酸之间基本上同源就足够了。
上文描述了减小或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地调整上述沉默方法，以便例如通过应用适当的启动子而实现内源基因在整株植物或其部分中的表达减小。
转化
本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。
外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，(1882)Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等，(1987)Nature 327：70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White，Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页。
除了转化之后不得不再生为完整植株的体细胞，还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208：1-9；Feldmann K(1992).在C Koncz，N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等，2004[NatureBiotechnology 22(2)，225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenicplastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28给出。最近报道了其他生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者
和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子(酌情在灭菌后)，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。
DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。
T-DNA激活标记
T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将T-DNA[通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)]插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶基因的表达。通常破坏天然启动子对靶基因表达的调控，而使基因落入新引入的启动子的控制下。启动子一般包含于T-DNA中。此T-DNA可以例如通过农杆菌感染而随机插入植物基因组中，并导致所插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物由于位于引入的启动子附近的基因的修饰表达而表现出显性表型。
TILLING
术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于生成和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C，(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑，新加坡，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第137-172页；Lightner J和Caspar T，(1998)In J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on MolecularBiology，82卷Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中合并物中存在的杂双链体在色谱图上检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol 18：455-457，由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许向基因组中的规定选定位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或剑叶藓(physcomitrella)的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2)：132-8)，并且存在无论靶生物种类的通常可应用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量相关性状
产量相关性状是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可包含以下非限制性特征系列的一项或多项：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期生长势、绿度指数、增加的生长速率、改善的农艺性状，如提高的水淹耐受性(其导致增加的稻产量)、改善的水使用效率(WUE)、改善的氮使用效率(NUE)等)。
产量
术语“产量”通常表示具有经济价值的可测量产出，其一般是与规定的作物、面积和/或时期相关的。各植物部分基于其数量、大小和/或重量对产量直接做出贡献，或者实际产量是年作物每平方米的产量，用总产量(既包括收获的产量也包括估定的产量)除以种植的平方米来确定。
术语植物的“产量”和“植物产量”在本文可互换使用且指营养性生物量如根和/或苗生物量、繁殖器官、和/或繁殖体如该植物种子。
玉米花是单性的；雄性花序(雄花花穗)源自茎顶端(apical stem)且雌性花序(复穗状花序)源自腋芽顶端。雌性花序在中轴(穗轴)表面上产生若干对小穗。每个雌性小穗包含两个可育的小花，一旦受精其中之一通常将成熟为玉米颗粒。因此玉米产量增加可表现为以下一个或多个方面：每平方米建植的植物数的增加、每株植物的复穗状花序数的增加、行数、行粒数、粒重、千粒重、复穗状花序长度/直径的增加；种子饱满率(为饱满小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100)的增加等。
稻植物中花序被称为圆锥花序。圆锥花序带有小穗，它是该圆锥花序的基本单位且由花梗和小花组成。小花生长在花梗上，且包括由两个保护性颖壳：较大的颖片(外稃)和较小的颖片(内稃)覆盖的花。因此，以稻为例，产量增加可表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数量、每株植物圆锥花序数量、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花(或花梗)数量的增加；种子饱满率(饱满小花(即含有种子)数除以总小花数并乘以100的数)的增加等。
早期开花时间
如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一花序出现之间的天数“至开花的时间”，进行评估。可以例如使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。
早期生长势
“早期生长势”是指活跃健康充分均衡的生长(特别是在植物生长的早期阶段)，其可以因植物适应性(fitness)增强引起，例如，由于植物更好地适应其环境(即，优化能源资源的利用以及在苗和根之间的分配)引起。具有早期生长势的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗，这往往产生高均匀度的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到各发育阶段)，以及往往是更优更高的产量。因此，早期生长势可以通过测量多种因素来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和苗生物量，等等。
增加的生长速率
增加的生长速率可以特异于植物的一个或多个部分(包括种子)，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为指，从成熟干种子生长至植物已经产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如萌发速度、早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段，或者发生在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许再次播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再次播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一砧木收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过自生长曲线获得多种参数，确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90％所需的时间)等等。
胁迫抗性
相对于对照植物，产量和/或生长速率的增加可以发生在植物处于非胁迫条件下或发生在植物暴露于各种胁迫的情况下。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长且丧失重新开始生长的能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致受胁迫植物的生长，与非胁迫条件下的对照植物相比，下降不到40％、35％、30％或25％、更优选下降不到20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、农药处理)的发展，栽培的作物植物往往并不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱发的受损的生长通常成为农业中不期望的性质。轻度胁迫是植物接触的日常的生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或冻结温度而引起。
“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
“非生物胁迫”可以是因水胁迫，例如由于干旱、盐胁迫或冻结胁迫引起的渗透胁迫。非生物胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冻结胁迫”意指归因于冻结温度(即，在此温度下可利用的水分子冻结并变成冰)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10℃以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度下水分子不冻结。如Wang等(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的特别高程度的“交叉对话”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传递通路和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、可混溶溶质的累积以及生长阻抑。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员知道给定位置的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件(在非胁迫条件下生长)的植物通常按照递增的优选次序产生这样的植物在给定的环境中的平均产量的至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％。可基于收获和/或季节，计算平均产量。本领域技术人员将知晓作物的平均产量产出。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在另一实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下实施。
在实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在另一实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
养分缺乏可以因诸如氮、磷酸及其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼等养分的缺乏所致。
在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语盐胁迫不局限于食盐(NaCl)，而可以是如下之一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等等。
在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷或冻结胁迫下实施，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
增加/提高/增强
术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本申请意义上表示与文中所定义的对照植物相比，产量和/或生长多出至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％。
种子产量
增加的种子产量自身可表现为如下一项或多项：
(a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以是基于单粒种子和/或每植株和/或每平方米的增加；
(b)每植株花数的增加；
(c)增加的种子数；
(d)增加的种子饱满率(其表达为饱满小花数与小花总数的比率)；
(e)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产量除以地上植物部分的生物量的比率；
(f)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。
可以认为术语“饱满小花”和“饱满种子”是同义词。
种子产量的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。
绿度指数
如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值相对于红值之比(在RGB模型中用于色度编码)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在养分可利用度下降的生长条件下，在开花前的末次成像中测量植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物绿度指数。
生物量
如本文所用的术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述的部分可以包括以下的任意一个或任意多个：
-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；
-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；
-地下部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；
-地下可收获部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；
-局部地下的可收获部分，如但不限于植物的块根和其他下胚轴区域、根茎、匍匐茎或匍匐根茎；
-根生物量、块茎、球茎等；
-营养体生物量，如根生物量、苗生物量等；
-繁殖器官；
-繁殖体如种子。
标记辅助育种
这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以起始于一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，该变体提供增加的产量。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括使经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。
在(遗传作图)中用作探针
利用编码目的蛋白质的核酸进行基因的遗传和物理作图仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。此类核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用编码目的蛋白质的核酸探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用所述核酸探测含有一组如下个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述该组个体为规定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算编码目的蛋白质的核酸在先前用此群体所获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
有关在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和使用，描述于Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员公知的。
核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。
用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸序列进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸的序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员公知的。在采用基于PCR的遗传作图的方法中，可能需要鉴定作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
植物
本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自包括如下的列表：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschusspp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍茎剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthusspp.)、滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachisspp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、簕竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica rapa ssp.)[芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、Ceiba pentandra、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusinecoracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagusspp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzula sylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersiconpyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malusspp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammeaamericana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)(如稻，阔叶稻(Oryza latifolia))、黍糜(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinumcrispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucusspp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状磨擦禾(Tripsacum dactyloides)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(如小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticummonococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、旱金莲(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizaniapalustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等。
对照植物
选择适宜的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物一般与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子。无效合子(或失效对照植物)是因分离而失去转基因的个体。另外，将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育，即在本发明植物附近并且同时培育。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且还指植物部分，包括种子和种子部分。
发明详述
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，现已令人惊讶地发现，减少或基本去除编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达可以产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
关于CER2样多肽，现已令人惊讶地发现，调节编码CER2样多肽的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
关于At1g68440样多肽，现已发现，调节编码At1g68440样多肽的核酸在植物中的表达，产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，根据第一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括减少或基本去除编码内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
根据另一实施方案，本发明提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，所述方法包含步骤减少或基本去除编码如本文所述内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在所述植物中的表达以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
在优选的实施方案中，内源DEAD-盒RNA解旋酶基因的表达和/或内源DEAD-盒RNA解旋酶蛋白的水平和/或活性的减少或基本去除通过引入与所述内源DEAD-盒RNA解旋酶基因基本同源的DEAD-盒RNA解旋酶核酸或其片段实现，更优选所述分离核酸能形成发夹结构，还优选该分离核酸受组成型启动子的调控。
关于CER2样多肽，根据第一实施方案，本发明提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码CER2样多肽的核酸在植物中的表达以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。优选地，提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码CER2样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达，其中所述CER2样多肽或其同源物包含CER2样相关结构域。
用于调节，优选增加编码如本文提供的CER2样多肽或其同源物的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码CER2样多肽或所述同源物的核酸。
在实施方案中，提供了方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量。
在一实施方案中，提供了方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
在另一实施方案中，提供了方法，其中所述增强的产量相关性状在渗透胁迫条件下(例如干旱胁迫、寒冷胁迫和/或盐胁迫)、或在缺氮调节获得。
关于At1g68440样多肽，根据第一实施方案，本发明提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码At1g68440样多肽的核酸在植物中的表达以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
用于调节，优选增加编码At1g68440样多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码At1g68440样多肽的核酸。
在一个实施方案中“在本发明方法中有用的蛋白质”意指如本文中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作DEAD-盒RNA解旋酶核酸”或“DEAD-盒RNA解旋酶基因”。
如本文定义的“DEAD-盒RNA解旋酶多肽”指任意多肽，其包含标签模型[LIVMF]-[LIVMF]-D-E-A-D-[RKEN]-X-[LIVMFYGSTN](SEQID NO：159)。
Aubourg等(1999)建议25个拟南芥DEAD-盒RNA解旋酶多肽的关系树(见图6)。当在此系统进化树中分析时，DEAD-盒RNA解旋酶趋向一起聚簇于6个独特的亚家族。
在优选实施方案中，用于本发明方法的DEAD-盒RNA解旋酶多肽是如Aubourg等(1999)所述DEAD-盒RNA解旋酶的6个亚家族中的亚家族VI的直向同源物或旁系同源物。
在更优选的实施方案中，DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含一个或多个以下MEME基序(motif)：
(i)Motif 1：[LM][VI]ATDVA[AS]RGLD[IV][KP]D[VI][EK]VV[IV]N[YF][SD][YF]P[LN][TD][IT][ED]DYVHRIGRTGRA(SEQ ID NO：3)，
(ii)Motif 2：[RSN]L[NR][DR]V[TS][YF][LV]VLDEADRMLDMGFEP[EQ][IV]R[AK]I[VL](SEQ ID NO：4)，
(iii)Motif 3：P[TS]PIQA[YQ][AS][WI]P[YI][AL][LM][DS]GRD[FL][IV][GA]IA[KA]TGSGKT(SEQ ID NO：5)
在还更优选的实施方案中，DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含一个或多个以下MEME基序：
(i)Motif 4：ATDVA[SA]RGLD[IV][KP]D[VI][EKR][VY]V[IV]NY[DS][YF]P[LT][TG][TLV]EDYVHRIGRTGR[TA]G[RAK][KT]G[VLT]A[HY]TFFT(SEQ ID NO：6)
(ii)Motif 5：[MS][GR][IV][CIT][RNS]L[NR][DRQE]V[ST][YF][LV]VLDEADRMLDMGFEP[QE][IV]R[KA]I[VL][SG][QE][TI][ARP][PS][VD]RQ[TM][LV]M[FWY][ST]ATWP(SEQ ID NO：7)
(iii)Motif 6：GF[ES][REK]P[ST]PIQ[AS][YQ][SAG]WP[YIMF][AL][LM][DKQ]GRD[FLI][IV][GA]IA [AKE]TGSGKT[IL][AG][FY][LG][VLI]P[AG][LFI][MV]H[VIL](SEQ IDNO：8)
还更优选地，DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含一个或多个以下MEME基序：
(i)Motif 7：[IV]ATDVA[AS]RGLDIPDVE[VY]VINY[ST][YF]PLTTEDYVHRIGRTGRAGK[KT]G[VL]AHTFF(SEQ ID NO：9)
(ii)Motif 8：VLDEADRMLD[ML]GFEPE[VI]R[AS]I[LA][GS]QT[ACR][SA][DV]RQ[MT]VMFSATWP[PL][AS]V[HQ][KQ]LAQEFMD(SEQ ID NO：10)
(iii)Motif 9：VL[DE]C[CT]KGF[EQ][KR]PSPIQ[AS][YHQ]AWP[YFI]LL[DS]GRD[FL][IV]GI AATGSGKT[LI]AFG[VI]PALMH[VI](SEQ ID NO：11)
最优选地，DEAD-盒RNA解旋酶多肽以增加的优选顺序包含基序10到17中的基序1、2、3、4、5、6、7或全部：
(i)motif 10：FXXPSPIQ(SEQ ID NO：160)
(ii)motif 11：AXTGSGKT(SEQ ID NO：161)
(iii)motif 12：PTRELAXQ(SEQ ID NO：162)
(iv)motif 13：TPGR(SEQ ID NO：163)
(v)motif 14：VLDEADRMLD(SEQ ID NO：164)
(vi)motif 15：MFSATWP(SEQ ID NO：165)
(vii)motif 16：ATDVA[AS]RGLDI(SEQ ID NO：166)
(viii)motif 17：RIGRTGRAG(SEQ ID NO：167)
在备选的，更优选的实施方案中，DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含基序1、4和7中的一个基序和/或2、5和8中的一个基序和/或3、6和9中的一个基序。
使用MEME算法(Bailey和Elkan，第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings of the Second International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology)，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)获得基序1至9。在MEME基序内部的每个位置，显示在查询序列集合中以高于0.2的频率存在的残基。方括号内的残基代表备选残基。
基序10至17获自如图2所示的多重比对。基序10至17是DEAD-盒RNA解旋酶多肽中的高度保守结构域。从图2的比对可推导出更保守结构域。
额外地和/或备选地，DEAD-盒RNA解旋酶蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白质包含如上文所概括的保守基序中的任一个或多个基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。优选地，DEAD-盒RNA解旋酶多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11所代表的任一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。更优选地，DEAD-盒RNA解旋酶多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：167所代表的任一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在另一实施方案中“在本发明方法中有用的蛋白质”意指如本文中定义的CER2样多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种CER2样多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作CER2样核酸”或“CER2样基因”。
“CER2样多肽”如本文定义指包含属于酰基转移酶家族的蛋白质或多肽的任意Pfam PF02458结构域。这些蛋白质参与多个生物合成途径包括，但不限于植物抗毒素、文多灵(vondoline)及角质层蜡生物合成以及有毒代谢产物的解毒。所述酰基转移酶属于两个主要类：
-进化支A成员，包括拟南芥CER2和玉米光滑(glossy)2，其可能参与蜡生物合成(见图9)。
-由进化支B成员(见图9)代表并由保守D[FL]G[GW]Gx[PE]基序表征的DAT样酰基转移酶。
例如，具有所述活性的酶包括：氨基苯甲酸盐N-羟基肉桂/苯甲酰基移酶、参与文多灵生物合成最后步骤的脱乙酰基文多灵4-O-乙酰基转移酶(DAT，EC：2.3.1.107)。更尤其，此亚家族由HxxxDG三联体和DFGWGKP共有序列表征。例如，此家族还包括单端孢霉烯3-O-乙酰基转移酶，其参与单端孢霉烯的减毒。前面已描述这些多肽参与如上文所述的植物中角质层蜡生物合成。如本文所用的术语“CER2样多肽”还意在包括如本文在“CER2样多肽”下定义的同源物。
在优选实施方案中，用于本文的CER2样多肽包含CER2样相关结构域。在优选实施方案中，CER2样相关结构域与Pfam PF02458对应。
在优选实施方案中，CER2样多肽包含一个或多个以下基序：
i)基序18a：FKCGGL[SA][LI]G[LV][SG]W[AS]HI[LV][GA]D[GA]FSASHFIN[SA]W(SEQ ID NO：274)。优选所述基序是FKCGGLSVGLSWAHILGDAFSAFNFITKWSHILAGQSQPKS(基序18b；SEQ ID NO：275)。
ii)基序19a：SGR[PL]E[IVL]KCNDEG[VA][RL][FI][VI]EAE[CA]D(SEQ ID NO：276)。优选地，所述基序是SGRPFIKCNDAGVRIAESQCDK(基序19b；SEQ ID NO：277)；
iii)基序20a：xY[ST][TR][FY]E[AI]L[AST][AG][HL][IV]W[RK][CS]I[AC]KARG(SEQ ID NO：278)。优选地，所述基序是DTKYFEIISATIWKCIAQIRG(基序20b；SEQ ID NO：279)。
在一优选的实施方案中，CER2样多肽还包含一个或多个以下基序：
i)基序21a：VQ[VF]TxFKCGG[LM][SA][LIV]GLS[WC]AH[IVL]LGD[APV]FSA[ST]TF[FIM][NK]KW(SEQ ID NO：280)。优选地，所述基序是：VFVKFTSFKCGGLSVGLSWAHILGDAFSAFNFITKW(基序21b；SEQID NO：281)；
ii)基序22a：[EA]SGR[PW][YF][IV]KCND[AC]GVRIVEA[KHR]CDK(SEQ ID NO：282)。优选地，所述基序是：KSGRPFIKCNDAGVRIAESQCDK(基序22b；SEQ ID NO：283)；
iii)基序23a：SR[VT][GE][EP][GN]Kx[HY]E[LP][ST]x[LM]DLAMKLHY[LVI]R[GA]VY[FY][FY](SEQ ID NO：284)。优选地，所述基序是：GEHNLNYMDLLMKLHY(基序23b；SEQ ID NO：285)；
这些基序18至23基本存在于如本文所述多肽的进化支A组的CER2样多肽中。
在又一优选的实施方案中，CER2样多肽还包含一个或多个以下基序：
i)基序24：FKCGG[VIF][SA][LI]G[VL]G[MI]SHx[VLM]ADGxSALHFI[NS][SAT]W(SEQ ID NO：286)。
ii)基序25：NPNLL[IV][TV]SWT[RT][LF]P[ILF][YH][DE]ADFGWG[KR]PI[FY]MGP(SEQ ID NO：287)；
iii)基序26：[SA]LS[KE][VT]L[VT][HP][FY]YP[ML]AGR(SEQ IDNO：288)；
这些额外基序7至9基本存在于如本文所述进化支B组代表的DAT样酰基转移酶的CER2样多肽中。
如本文所使用的，字母“X”指任意氨基酸且[AB]指A或B氨基酸可能在此位置。
使用MEME算法(Bailey和Elkan，第二届分子生物学智能系统国际会议文集，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)获得基序18至26。在MEME基序内部的每个位置，显示在查询序列集合中以高于0.2的频率存在的残基。方括号内的残基代表备选残基。
更优选地，CER2样多肽包含以增加的优选顺序至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序，所述基序选自基序18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25和26。在甚至更优选的实施方案中，CER2样多肽包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序，所述基序选自基序18a、19a、20a、21a、22a、23a。在尤其优选的实施方案中，CER2样多肽包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序，所述基序选自基序18b、19b、20b、21b、22b、23b。
额外地和/或备选地，CER2样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：169所代表的氨基酸具有至少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白质包含如上文所概括的保守基序18至26中的任一个或多个基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。优选地，CER2样多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：274至SEQ ID NO：285(基序18至23)所代表的任一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
另外，在另一实施方案中提供了方法，其中所述CER2样多肽包含保守结构域(或基序)，其与SEQ ID NO：169的氨基酸位置(coordinate)73至189的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何称谓意指如本文中定义的At1g68440样多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种At1g68440样多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作At1g68440样核酸”或“At1g68440样基因”。
“At1g68440样多肽”优选包含跨膜结构域。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。
在优选实施方案中，At1g68440样多肽包含一个或多个以下基序：
i)基序27a：Y[SN]F[WC][KT]WGALILA[LV][FVL]A(SEQ ID NO：364)。优选所述基序是YSFWKWGALILALAA(基序27b；SEQ ID NO：365)。
ii)基序28a：ME[IV][PT][VE][IL]N[RL]I[SG]DF(SEQ ID NO：366)。优选地，所述基序是MEIPVINRISDF(基序28b；SEQ ID NO：367)；
iii)基序29a：[SN]VV[KQ]LWD[SN]LG[LF](SEQ ID NO：368)。优选地，所述基序是NVVKLWDNLGL(基序29b；SEQ ID NO：369)。
在一个优选实施方案中，At1g68440样多肽还包含一个或多个以下基序：
i)基序30a：SQ[VI][SL]A[LV]SG[IV][GE]K[FI][YH]Q[AT]Y[NSH][FL]WKWGALILAL[IAV]ASF[TS][TA]IINR[VI]K[AI]L[IV][IV][KR][LF][QK][KN]HP(SEQ ID NO：370)。优选地，所述基序是：SQILALSGVEKIHQAYSFWKWGALILALAASFTAIINRIKILIIRFKNHP(基序30b；SEQ ID NO：371)；
ii)基序31a：[MDE][MF]T[SN]GK[NS]VVKLWDNLGLG[LF]GL(SEQ ID NO：372)。优选地，所述基序是：DFTNGKNVVKLWDNLGLSLGL(基序31b；SEQ ID NO：373)；
iii)基序32a：MEI[LP]V[IV]NRI[IS]DFE[TA][NGS][IL][NAS][PS][SL][LQ][VN](SEQID NO：374)。优选地，所述基序是：MEIPVINRISDFETGLASLQN(基序32b；SEQ ID NO：375)；
基序27至32基本存在于如本文所述多肽的进化支A组的At1g68440样多肽中。
如本文所使用的，字母“X”指任意氨基酸且[AB]指A或B氨基酸可能在此位置。
使用MEME算法(Bailey和Elkan，第二届分子生物学智能系统国际会议文集，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)获得基序1至6。在MEME基序内部的每个位置，显示在查询序列集合中以高于0.2的频率存在的残基。方括号内的残基代表备选残基。
更优选地，At1g68440样多肽包含以增加的优选顺序至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序，所述基序选自基序27a、28a、29a、30a、31a和32a。在尤其优选的实施方案中，At1g68440样多肽包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序，所述基序选自基序27b、28b、29b、30b、31b和32b。
如本文所用的术语“At1g68440样多肽”还意在包括如本文在“At1g68440样多肽”下定义的同源物。
额外地和/或备选地，At1g68440样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：292所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白质包含如上文所概括的保守基序27至32中的任一个或多个基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。优选地，At1g68440样多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：370至SEQ ID NO：375(基序27至32)所代表的任一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
另外，在另一实施方案中提供了方法，其中所述At1g68440样多肽包含跨膜结构域，其与SEQ ID NO：292的氨基酸位置46至64的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，优选地，该多肽序列在构建进化系统进化树，如图3中所绘制的系统进化树中使用时，聚簇于包含SEQID NO：2所代表氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(优选Aubourg等(1999)定义的VI亚组)，而不聚簇于与任何其他组。
另外，DEAD-盒RNA解旋酶多肽(至少以其天然形式)通常具有RNA解螺活性。用于测量解旋酶活性的工具和技术使本领域公知的，例如Okanami等(1998)Nucleic Acid Res.(26)：2638-2643。
此外，根据实施例部分概括出的本发明方法，将DEAD-盒RNA解旋酶多肽从转基因植物例如稻中减少或基本去除时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
关于CER2样多肽，优选地，该多肽序列在构建进化系统进化树，如图9中所绘制的系统进化树中使用时，聚簇于包含SEQ ID NO：167所代表氨基酸序列的A进化支的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组。
另外，CER2样多肽(至少以其天然形式)通常具有酰基转移酶活性。用于测量酰基转移酶活性的工具和技术使本领域公知的。优选地，CER2样多肽属于EC2.3.1。根据酰基转移酶的类型，本领域中具有多种测定法来测量此活性。例如，Power等，1985，(Archives of Biochemistry andBiophysics，279卷，370-376页)描述了如何测定脱乙酰基文多灵4-O-乙酰基转移酶的活性。实施例部分提供了进一步详述。
此外，根据实施例部分概括出的本发明方法，将CER2样多肽表达于稻中时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的总种子重量、增加的种子饱满率、增加的收获指数、增加的饱满种子数的植物。
关于At1g68440样多肽，优选地，该多肽序列在构建进化系统进化树，如图14中所绘制的系统进化树中使用时，聚簇于包含SEQ ID NO：292所代表氨基酸序列的A进化支的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组。
此外，根据实施例部分概括出的本发明方法将At1g68440样多肽表达于稻中时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的种子产量、饱满种子数、种子饱满率、总种子重量或收获指数的植物。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，本发明通过用SEQ ID NO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何编码DEAD-盒RNA解旋酶的核酸或DEAD-盒RNA解旋酶多肽实施，条件是此DEAD-盒RNA解旋酶基因减少或基本去除内源DEAD-盒RNA解旋酶多肽的表达。
编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A1中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所代表的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，第二BLAST(反向BLAST)将针对稻序列。
本发明还提供了编码迄今未知的DEAD-盒RNA解旋酶的核酸和DEAD-盒RNA解旋酶多肽，其用于在植物中赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：
(i)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸；
(ii)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ IDNO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：
(i)由SEQ ID NO：13或15代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。
关于CER2样多肽，本发明通过用SEQ ID NO：168所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：169的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何编码CER2样的核酸或CER2样多肽实施。
在本文实施例部分的表A2中给出编码CER2样多肽的核酸的其他实例。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A2中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：169所代表的CER2样多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物，其中查询序列是SEQ ID NO：168或SEQID NO：169，第二BLAST(反向BLAST)将针对苜蓿序列。
本发明还提供了编码迄今未知的CER2样的核酸和CER2样多肽，其用于在植物中赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：
(i)由SEQ ID NO：168代表的核酸；
(ii)由SEQ ID NO：168代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码CER2样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：274至SEQID NO：288中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
(v)编码CER2样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列和表A2中的任意其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：
(i)由SEQ ID NO：169代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：274至SEQ ID NO：288中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与由(任一)SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列和表A2中的任意其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)以上(i)或(iii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
关于At1g68440样多肽，本发明通过用SEQ ID NO：291所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：292的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何At1g68440样编码核酸或At1g68440样多肽实施。
在本文实施例部分的表A3中给出编码At1g68440样多肽的核酸的实例。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：292所代表的At1g68440样多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物，其中查询序列是SEQ ID NO：291或SEQ ID NO：292，第二BLAST(反向BLAST)将针对白杨序列。
本发明还提供了编码迄今未知的At1g68440样1的核酸和At1g68440样多肽，其用于在植物中赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：
(i)由SEQ ID NO：291代表的核酸；
(ii)由SEQ ID NO：291代表的核酸的互补核酸；
(iii)编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ IDNO：292所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
(v)编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ IDNO：292所代表的氨基酸序列和表A3中的任意其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：
(i)由SEQ ID NO：292代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQ ID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A1至A3中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A1至A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与其衍生自的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。
在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸的部分、与编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸杂交的核酸、编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸的剪接变体、编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。
编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并且表达在实施例部分的表A1至A3中给出的任一个核酸序列的部分或编码在实施例部分表A1至A3中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。
核酸的部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A1中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分的表A1中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：1的核酸的部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中当用于构建进化系统进化树(如图3所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(更优选，Aubourg等(1999)所述的亚家族VI)，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含如上文所述任一基序1至9和/或具有解旋酶活性和/或与SEQ ID NO：2具有至少45％序列同一性。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
关于CER2样多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的CER2样多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A2中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A2中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分具有至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000个连续核苷酸长度，该连续核苷酸属于在实施例部分的表A2中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：168的核酸的部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中当用于构建进化系统进化树(如图9所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列的进化支A的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组；和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序：18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25、26，和/或具有酰基转移酶生物活性。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码CER2样多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
关于At1g68440样多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的At1g68440样多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A3中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分具有至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100个连续核苷酸长度，该连续核苷酸属于在实施例部分的表A3中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQID NO：291的核酸的部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列当用于构建进化系统进化树(如图14所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列的进化支A的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序：27a、28a、29a、30a、34a、35a。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码At1g68440样多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中降低或基本去除能够与实施例部分的表A1至A3中给出的任一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表A1至A3中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A1中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任意序列的部分杂交，所述的部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所代表的核酸的互补核酸或与其部分杂交。
优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列当为全长并且用于构建进化系统进化树(如图3所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(更优选，Aubourg等(1999)所述的亚家族VI)，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含如上文所述任一基序1至9和/或具有解旋酶活性和/或与SEQ ID NO：2具有至少45％序列同一性。
关于CER2样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的CER2样多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A2中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A2中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任意序列的部分杂交，所述的部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：168所代表的核酸的互补核酸或与其部分杂交。
优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列用于构建进化系统进化树(如图9所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列的进化支A的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序：18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25、26和/或具有酰基转移酶生物活性。
关于At1g68440样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的At1g68440样多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A3中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任意序列的部分杂交，所述的部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：291所代表的核酸的互补核酸或与其部分杂交。
优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为全长并且用于构建进化系统进化树(如图14所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列的进化支A的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序，所述基序选自27a、28a、29a、30a、31a、32a。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中降低或基本去除在实施例部分的表A1至A3中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码在实施例部分的表A1至A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列在用于构建进化系统进化树(如图3所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(更优选，Aubourg等(1999)所述的亚家族VI)，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含如上文所述任一基序1至9和/或具有解旋酶活性和/或与SEQ ID NO：2具有至少45％序列同一性。
关于CER2样多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：168所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：169的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图9所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQID NO：169所代表的氨基酸序列的进化支A的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序：18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25、26，和/或具有酰基转移酶生物活性。
关于At1g68440样多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：291所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：292的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图14所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列的进化支A的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序：27a、28a、29a、30a、31a、32a。
在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中降低或基本去除在实施例部分的表A1至A3中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中降低或基本去除下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表表A1至A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：2的DEAD-盒RNA解旋酶多肽和实施例部分的表A1中所述的任意氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：1的等位变体或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图3所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(更优选，Aubourg等(1999)所述的亚家族VI)，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含如上文所述任一基序1至9和/或具有解旋酶活性和/或与SEQ ID NO：2具有至少45％序列同一性。
关于CER2样多肽，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：169的CER2样多肽和实施例部分的表A2中所述的任意氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：168的等位变体或编码SEQ ID NO：169的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图9所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列的进化支A的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序：18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25、26，和/或具有酰基转移酶生物活性。
关于At1g68440样多肽，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：292的At1g68440样多肽和实施例部分的表A3中所述的任意氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：291的等位变体或编码SEQ ID NO：292的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图14所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列的进化支A的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序：27a、28a、29a、30a、31a、32a。
基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并且表达在实施例部分的表A1至A3中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中引入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A1至A3中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，优选地，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图3所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的DEAD-盒RNA解旋酶多肽组(更优选，Aubourg等(1999)所述的亚家族VI)，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含如上文所述任一基序1至9和/或具有解旋酶活性和/或与SEQ ID NO：2具有至少45％序列同一性。
关于CER2样多肽，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图9所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：169所代表的氨基酸序列的进化支A的CER2样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或全部9个基序：18a、19a、20a、21a、22a、23a、24、25、26和/或具有酰基转移酶生物活性。
关于At1g68440样多肽，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统进化树(如图14所绘制的进化系统进化树)时，聚簇于包含由SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列的进化支A的At1g68440样多肽组，而不聚簇于与任何其他组，和/或包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个基序：27a、28a、29a、30a、31a、32a。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。
编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸是来自植物，进一步优选来自单子叶植物，更优选地来自禾本科，最优选地来该核酸来自稻。在备选优选实施方案中，该核酸来自玉米。
编码CER2样多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地编码CER2样多肽的核酸是来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选地来自豆科，最优选地该核酸来自蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)。
编码At1g68440样多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地编码At1g68440样多肽的核酸是来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选地来自杨柳科，最优选地该核酸来自毛果杨(Populus trichocarpa)。
本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本文中对增强的产量相关性状的称谓意指植物的一个或多个部分的早期生长势和/或生物量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量，具有增加的种子产量的植物。
本发明提供了用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状，尤其是植物种子产量的方法，所述方法包含调节植物中编码如本文定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的核酸表达。
由于根据本发明的转基因植物具有增加的种子产量，相对于对照植物在其生命周期的对应阶段，有可能这些植物展示出增加的生长速率(至少在其生命周期)。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，根据本发明的另一优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括降低或基本去除植物中编码如本文中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸表达。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，根据本发明的另一优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的CER2样多肽的核酸表达。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括降低或基本去除植物中编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸表达。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码CER2样多肽的核酸表达。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下，尤其是缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏下培育的植物中产量的方法，所述方法包括降低或基本去除植物中编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸表达。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下，尤其是缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码CER2样多肽的核酸表达。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括降低或基本去除植物中编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸表达。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包含调节植物中编码CER2样多肽的核酸表达。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予干旱胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加干旱胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括降低或基本去除植物中编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸表达。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予干旱胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加干旱胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包含调节植物中编码CER2样多肽的核酸表达。
本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的反向重复的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，更具体地，本发明提供构建体，其包含：
(a)DEAD-盒RNA解旋酶基因或片段的反向重复，其能够下调内源靶标DEAD-盒RNA解旋酶；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。
关于CER2样多肽，更具体地，本发明提供构建体，其包含：
(a)编码如上文定义的CER2样多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码CER2样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。
关于At1g68440样多肽，更具体地，本发明提供构建体，其包含：
(a)编码如上文定义的At1g68440样多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码At1g68440样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。
本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物，所述植物具有如本文所述的增加的产量相关性状。
植物用包含上述任意核酸的载体转化。本领域技术人员非常清楚必须在所述载体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。
有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动核酸序列表达，不过优选的启动子是植物来源的。组成型启动子在所述方法中尤其有用。优选地，组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：1代表的编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
组成型启动子优选地是中等强度启动子。更优选地它是源自植物的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(功能上等同的启动子)，更优选地该启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选地，这种组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：156相似的核酸序列代表，最优选地，这种组成型启动子与SEQ ID NO：156相同。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。
任选地，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：156相似的GOS2启动子和编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于引入植物的构建体上。
关于CER2样多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：168代表的编码CER2样多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码CER2样多肽的核酸在受组成型启动子驱动时或当受根特异启动子驱动时的表达。
组成型启动子优选地是中等强度启动子。更优选地它是源自植物的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(功能上等同的启动子)，更优选地该启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选地这种组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：289相似的核酸序列代表，最优选地这种组成型启动子由SEQ ID NO：289代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。
任选地，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：289相似的GOS2启动子和编码CER2样多肽的核酸。更优选地，该表达盒包含SEQ ID NO：290代表的序列(pPRO::CER2样基因::t-玉米醇溶蛋白序列)。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于引入植物的构建体上。
关于At1g68440样多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ IDNO：291代表的编码At1g68440样多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码At1g68440样多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
该组成型启动子优选地是中等强度启动子。更优选地它是源自植物的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(功能上等同的启动子)，更优选地该启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选地这种组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：363相似的核酸序列代表，最优选地这种组成型启动子是由SEQ ID NO：363代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。
任选地，可以在引入植物的构建体中使用一个或多更多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：363相似的GOS2启动子和编码At1g68440样多肽的核酸。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，根据本发明的优选特征，受调节的表达是降低或基本去除的表达。本领域中充分记录了用于降低或去除核酸或基因或基因表达的方法并且在定义部分中提供了实例。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了实例。
如上文提到，用于调节编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中引入并且表达编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样(CER2样酰基转移酶)多肽、或At1g68440样多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA灭活、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。
关于DEAD-盒RNA解旋酶多肽，本发明也提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中降低或基本去除编码如上文所定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的任意核酸的表达。
更具体地，本发明提供用于产生转基因植物的方法，该转基因植物具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量，该方法包括：
(i)在植物或植物细胞中降低或基本去除编码如本文定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸的表达；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的任意核酸。
关于CER2样多肽和At1g68440样多肽，本发明也提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并且表达编码如上文所定义的CER2样多肽或At1g68440样多肽的任意核酸。
更具体地，本发明提供用于产生转基因植物的方法，该转基因植物具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量，该方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入并且表达编码CER2样多肽或At1g68440样多肽的核酸，或引入并且表达包含CER2样多肽编码核酸的基因构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的CER2样多肽或At1g68440样多肽的任意核酸。
可以将核酸直接引入植物细胞或引入植物自身中(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化作用引入植物中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本发明明确地扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其包括种子的部分。这些植物或其部分包含编码如上文定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是该子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些子代相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的分离的核酸。本发明的优选宿主细胞是植物细胞、细菌、酵母或真菌细胞。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文定义的任何植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族，尤其是单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、糖用甜菜、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油籽油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一实施方案，植物是谷类植物。谷类植物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的重组核酸。本发明进一步涉及源自、优选直接源自这种植物的可收获部分中的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明也包括编码如本文中所述的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸的用途，和这些DEAD-盒RNA解旋酶多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸或DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以遗传地与编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的多肽基因连锁的DNA标记。这些核酸/基因或DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽自身可以用来限定分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以用于育种计划中以选择具有如上文在本发明方法中所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽、或CER2样多肽、或At1g68440样多肽的核酸也可以用作探针，以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。项目
1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码CER2样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述CER2样多肽包含PF02458结构域和/或具有转移酶活性。
2.根据项1的方法，其中所述受调节的表达通过向植物中引入和表达编码所述CER2样多肽的核酸来实现。
3.根据项1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量和/或早期生长势，且优选包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
4.根据项1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
5.根据项1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
6.根据项1至5的任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含一个或多个以下基序：
基序18a：FKCGGL[SA][LI]G[LV][SG]W[AS]HI[LV][GA]D[GA]FSASHFIN[SA]W(SEQ ID NO：274)，
基序19a：SGR[PL]E[IVL]KCNDEG[VA][RL][FI][VI]EAE[CA]D(SEQ ID NO：276)，
基序20a：xY[ST][TR][FY]E[AI]L[AST][AG][HL][IV]W[RK][CS]I[AC]KARG(SEQ ID NO：278)。
7.根据项1至5的任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含：
基序21a：VQ[VF]TxFKCGG[LM][SA][LIV]GLS[WC]AH[IVL]LGD[APV]FSA[ST]TF[FIM][NK]KW(SEQ ID NO：280)
基序22a：[EA]SGR[PW][YF][IV]KCND[AC]GVRIVEA[KHR]CDK(SEQ ID NO：282)
基序23a：SR[VT][GE][EP][GN]Kx[HY]E[LP][ST]x[LM]DLAMKLHY[LVI]R[GA]VY[FY][FY](SEQ ID NO：284)。
8.根据项1至5的任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含：
基序24：FKCGG[VIF][SA][LI]G[VL]G[MI]SHx[VLM]ADGxSALHFI[NS][SAT]W(SEQ ID NO：286)
基序25：NPNLL[IV][TV]SWT[RT][LF]P[ILF][YH][DE]ADFGWG[KR]PI[FY]MGP(SEQ ID NO：287)
基序26：[SA]LS[KE][VT]L[VT][HP][FY]YP[ML]AGR(SEQ ID NO：288)。
9.根据项1至8的任一项的方法，其中所述编码CER2样(多肽)的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，又优选地来自豆科，更优选苜蓿科(Medicago)，更优选蒺藜苜蓿。
10.根据项1至9的任一项的方法，其中所述编码CER2样的核酸编码表A2中所列的任一多肽，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
11.根据项1至10的任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
12.根据项1至11的任一项的方法，其中所述编码CER2样多肽的核酸对应SEQ ID NO：291。
13.根据项1至12的任一项的方法，其中所述核酸有效地连接至组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子、优选与植物启动子、更优选与GOS2启动子、最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
14.可通过根据项1至13的任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如项1和5至12的任意项定义的编码CER2样多肽的重组核酸。
15.构建体，其包含：
(i)编码如项1和6至12的任意项中定义的CER2样的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
16.根据项15的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子、优选是植物启动子、更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
17.根据项15或16的构建体在用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的产量，且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量的植物的方法中的用途。
18.利用根据项15或16的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
19.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：
(i)向植物细胞或植物中引入和表达编码如项1和5至12的任意项中定义的CER2样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。
20.相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物，其产生自编码如项1和6至12的任意项中定义的CER2样多肽的核酸的受调节的表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
21.根据项14、18或20的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
22.根据项21的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
23.产品，其来自根据项21的植物和/或来自根据项22的植物的可收获部分。
24.编码项1和6至12的任意项中定义的CER2样多肽的核酸在相对于对照植物增强植物中产量相关性状、优选增加产量、且更优选相对于对照植物增加种子产量和/或增加生物量中的用途。
25.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码At1g68440样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述At1g68440样多肽包含跨膜结构域。
26.根据项25的方法，其中所述受调节的表达通过向植物中引入和表达编码At1g68440样多肽的核酸来实现。
27.根据项25或26的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
28.根据项25至27的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
29.根据项25至27的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
30.根据项25至29的任一项的方法，其中所述At1g68440样多肽包含一个或多个以下基序：
-基序26a：Y[SN]F[WC][KT]WGALILA[LV][FVL]A(SEQ ID NO：364)，
-基序27a：ME[IV][PT][VE][IL]N[RL]I[SG]DF(SEQ ID NO：366)，
-基序28a：[SN]VV[KQ]LWD[SN]LG[LF](SEQ ID NO：368)。
31.根据项25至30的任一项的方法，其中所述编码At1g68440样的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，优选来自杨柳科(Salicaceae)、更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。
32.根据项25至30的任一项的方法，其中所述编码At1g68440样的核酸编码表A3中所列的任一多肽，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
33.根据项25至32的任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A3中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
34.根据项25至33的任一项的方法，其中所述编码At1g68440样多肽的核酸对应SEQ ID NO：291。
35.根据项25至34的任一项的方法，其中所述核酸有效地连接至组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子、优选与植物启动子、更优选与GOS2启动子、最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
36.可通过根据项25至34的任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如项25和30至34的任意项定义的编码At1g68440样多肽的重组核酸。
37.分离的核酸分子，其选自：
-由SEQ ID NO：291代表的核酸；
-由SEQ ID NO：291代表的核酸的互补核酸；
-编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
-与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
-编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列和表A3中的任意其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
38.分离的多肽，其选自：
-由SEQ ID NO：292代表的氨基酸序列；
-氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQ ID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
-以上(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
39.构建体，其包含：
-编码如项25和30至34的任意项中定义的At1g68440样的核酸；
-能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
-转录终止序列。
40.根据项39的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子、优选是植物启动子、更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
41.根据项39或40的构建体在用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的产量，且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量的植物的方法中的用途。
42.利用根据项39或40的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
43.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：
-向植物细胞或植物中引入和表达编码如项25和30至34的任意项中定义的At1g68440样多肽的核酸；和
-在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。
44.相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物，其产生自编码如项25和30至34的任意项中定义的At1g68440样多肽的核酸的受调节表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
45.根据项36、42或44的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
46.根据项45的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
47.产品，其来自根据项45的植物和/或来自根据项46的植物的可收获部分。
48.编码项25和30至34的任意项中定义的At1g68440样多肽的核酸在相对于对照植物增强产量相关性状、优选增加产量、且更优选相对于对照植物增加种子产量和/或增加生物量中的用途。
49.用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括降低或基本去除编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达和/或DEAD-盒RNA解旋酶多肽的水平和/或活性，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含标签模型[LIVMF]-[LIVMF]-D-E-A-D-[RKEN]-X-[LIVMFYGSTN](SEQ ID NO：159)。
50.根据项49的方法，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽是如Aubourg等(1999)所述DEAD-盒RNA解旋酶的6个亚家族中的亚家族VI的直向同源物或旁系同源物。
51.根据项49或50的方法，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含一个或多个以下基序：
(i)基序1：[LM][VI]ATDVA[AS]RGLD[IV][KP]D[VI][EK]VV[IV]N[YF][SD][YF]P[LN][TD][IT][ED]DYVHRIGRTGRA(SE Q ID NO：3)，
(ii)基序2：[RSN]L[NR][DR]V[TS][YF][LV]VLDEADRMLDMGFEP[EQ][IV]R[AK]I[VL](SEQ ID NO：4)，
(iii)基序3：P[TS]PIQA[YQ][AS][WI]P[YI][AL][LM][DS]GRD[FL][IV][GA]IA[KA]TGSG KT(SEQ ID NO：5)。
52.根据项49至51的任意项的方法，其中所述编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸编码表A1中所列的任一蛋白质，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
53.根据项49至52的任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
54.根据项49至53的任意项的方法，其中所述降低或基本去除由RNA-介导的基因表达下调实现。
55.根据项54的方法，其中所RNA-介导下调节由共抑制实现。
56.根据项55的方法，其中所RNA-介导下调节由使用反义DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列实现。
57.根据项49至53的任意项的方法，其中所述降低或基本去除由使用DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列或其片段的反向重复实现。
58.根据项49至53的任意项的方法，其中所述降低或基本去除由使用微RNA实现。
59.根据项49至53的任意项的方法，其中所述降低或基本去除由插入突变实现。
60.根据项49至59的任意项的方法，其包括将与所述编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸基本同源的DEAD-盒RNA解旋酶核酸或其片段引入宿主植物。
61.根据项49至59的任意项的方法，其中所述降低或基本去除以组成型方式优选使用组成型启动子、更优选使用GOS2启动子、最优选使用来自稻的GOS2启动子实现。
62.根据项60或61的方法，其中所述引入的核酸来自与宿主植物相同的科、更优选来自与宿主植物相同的属、甚至更优选来自与宿主植物相同的种。
63.根据项60至62的任意项的方法，其中所述引入的DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列包含足够长度的SEQ ID NO：1的基本连续核苷酸，或其直向同源物或旁系同源物，且所述宿主植物是谷类植物，优选是稻。
64.根据项63的方法，其中所述核酸编码由任一SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155代表的蛋白质。
65.根据项63或64的方法，其中所述核酸由任一SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154代表。
66.根据项49至65的任意项的方法，其中所述增强的产量相关性状是相对于对照植物的增加的种子产量。
67.根据项66的方法，其中所述增加的种子产量选自下列一种或多种：a)增加的种子生物量，例如种子重量；b)增加的饱满种子数；c)增加的饱满率和(b)增加的收获指数。
68.根据项49至67的任意项的方法，其中所述增加的产量在非胁迫条件下获得。
69.根据项49至67的任意项的方法，其中所述增加的产量在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
70.可通过根据项49至69的任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分，其中所述植物或其部分包含编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的重组核酸。
71.构建体，其包含：
(a)DEAD-盒RNA解旋酶基因或片段的反向重复，其能够下调节内源靶标DEAD-盒RNA解旋酶；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
72.根据项71的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
73.根据项71或72的构建体在用于制备具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
74.利用根据项71或72的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
75.用于产生相对于对照植物具有增加的产量、优选具有增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：
(i)向植物细胞中引入和表达根据项71或72的构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
76.DEAD-盒RNA解旋酶核酸在降低或基本去除植物中内源DEAD-盒基因表达，以相对于对照植物增加植物中的产量的用途。
77.根据项76的用途，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
78.根据项77的用途，其中所述增加的种子产量选自下列一种或多种：a)增加的种子生物量，例如种子重量；b)增加的饱满种子数；c)增加的饱满率和(b)增加的收获指数。
79.根据项76至78的任一项的用途，其中所述产量增加在胁迫条件下出现。
80.分离的核酸分子，其选自：
(a)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸；
(b)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸的互补核酸；
(c)编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸，所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
(d)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
81.分离的多肽，其选自：
(i)由SEQ ID NO：13或15代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
82.相对于对照植物具有增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物，其产生自编码如项49或50中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸的降低或基本去除表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
83.根据项70或74的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
84.根据项82和83的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
85.产品，其来自根据项82和83的植物和/或来自根据项84的植物的可收获部分。
附图说明
现参考以下附图描述本发明，其中：
图1代表具有保守MEME基序的SEQ ID NO：2的结构域结构。
图2代表图3所示进化支A的多种DEAD-盒RNA解旋酶多肽的多重比对。星号表示在多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，并且点号代表保守性较小的氨基酸置换；在其余位置内不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序。
图3显示DEAD-盒RNA解旋酶多肽系统进化树，用于构建该树的蛋白质序列由Auburg等(1999)的图4所述Genbank登录号所指。
图4显示用于图3所示进化支A的MATGAT表。
图5显示双元载体，用于Os DEAD-盒RNA解旋酶RNA在稻中沉默，使用在GOS2启动子(pGOS2)控制下的发夹构建体。
图6Auburg等(1999)公布的拟南芥中邻接系统进化树DEAD-盒RNA解旋酶家族。显示了DEAD-盒RNA解旋酶被划分于其中的不同亚家族，包括亚家族VI。
图7代表具有保守基序或结构域的SEQ ID NO：169的结构域结构。
图8代表多种CER2样多肽的多重比对。当使用保守氨基酸时，这些比对可用于定义其他基序。
图9显示CER2样多肽的系统进化树，CER2样相关蛋白质的系统进化关系。使用MAFT(Katoh和Toh(2008).Briefings in Bioinformatics9：286-298.)比对蛋白质。使用QuickTree 1.1(Houwe等.(2002)，Bioinformatics 18(11)：1546-7)计算邻接树。使用Dendroscope 2.0.1(Huson等.(2007)，BMC Bioinformatics 8(1)：460)绘制环状系统进化树(cladodrogram)。当e＝1e-10时，回收拟南芥转移酶基因。使用每个聚簇的代表性成员产生该树。优选的CER2样多肽是来自苜蓿的苜蓿_转移酶CER2样#1，并以红线标出其密切相关的同源物，用黄色突出显示在该树中。都涉及角质层蜡生物合成的拟南芥CER2和玉米光滑2以绿色突出显示。
图10显示MATGAT表(实施例3)。
图11代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码CER2样的核酸在稻中表达的双元载体。
图12代表具有保守基序或结构域的SEQ ID NO：292的结构域结构。
图13代表属于多种At1g68440样多肽的多重比对结果。星号表示在多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，并且点号代表保守性较小的氨基酸置换；在其余位置内不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序。
图14显示At1g68440样多肽的进化系统树。
图15显示MATGAT表(实施例3)。
图15显示双元载体，用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制之下增加At1g68440样编码核酸在稻中的表达。
实施例
现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版。
实施例1：鉴定与本发明方法所用核酸序列相关的序列
利用了数据库序列搜索工具，例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)NucleicAcids Res.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所保持的序列中，鉴定了与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、或与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169、或与SEQ ID NO：291和SEQ ID NO：292相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间的局部相似的区域。例如，在TBLASTN算法中，利用了SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：291的核酸编码的多肽，其中使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在一些情况下，可调整缺省参数来改变搜索的严格性。例如增加E值以显示不太严格的匹配。这样，可鉴定到短的几乎完全的匹配。
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
表A1提供了与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的核酸序列的列表
表A1：DEAD-盒RNA解旋酶核酸和多肽的实例
2.CER2样多肽
表A2提供了与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169相关的核酸序列的列表。
表A2：CER2样核酸和多肽的实例：
3.At1g68440样多肽
表A3提供了与SEQ ID NO：291和SEQ ID NO：292相关的核酸序列的列表。
表A3：At1g68440样核酸和多肽的实例(用灰色突出显示的实例指进化支A组(SEQ ID NOs：291-320))：
序列已经由研究机构如基因组研究机构(Institute for GenomicResearch，TIGR；始于TA)尝试性地进行了装配并向公众公开。可以通过关键词搜索，或是采用BLAST算法，运用目的核酸序列或多肽序列，利用真核基因直向同源物(Eukaryotic Gene Orthologs，EGO)数据库来鉴定这样的相关序列。已经针对特定的生物创建了特定的核酸序列数据库，例如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。此外，对私有数据库的使用也已允许鉴定新型核酸和多肽序列。
实施例2：比对与本发明方法所用的多肽序列相关的序列
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
多肽序列的比对利用MAFT(Katoh等(2008)，Briefings inBioinformatics 9：286-298)进行。
多肽序列的比对利用Clustal W 2.0渐近比对算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic AcidsRes 31：3497-3500)，使用标准设置(慢比对，相似性矩阵：Gonnet或Blosum 62(如果比对多肽)、空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2))来进行。进行微小的手工编辑以进一步优化比对。在图2中比对DEAD-盒RNA解旋酶多肽。
使用如QuickTree 1.1(Houwe等.(2002)，Bioinformatics 18(11)：1546-7)提供的邻接聚簇算法构建DEAD-盒RNA解旋酶多肽系统进化树(图3)，使用Dendroscope 2.0.1(Huson等.(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)。使用MAFT(Katoh和Toh(2008).Briefings in Bioinformatics9：286-298.)比对蛋白质。
2.CER2样多肽
使用Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻接聚簇算法，构建了CER2样多肽的系统进化树(图9)。
使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)Briefings in Bioinformatics 9：286-298)产生比对。使用QuickTree(Howe等.(2002)，Bioinformatics 18(11)：1546-7)计算邻接树，100次自引重复。使用Dendroscope绘制环状系统发生图(Hudson等(2007)，BMC Bioinformatics 8(1)：460)。100次自引重复的置信度指出主分支。
3.At1g68440样多肽
使用Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻接聚簇算法，构建了At1g68440样多肽的系统进化树(图14)。
使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)Briefings in Bioinformatics 9：286-298)产生比对。使用QuickTree(Howe等.(2002)，Bioinformatics 18(11)：1546-7)计算邻接树，100次自引重复。使用Dendroscope绘制环状系统发生图(Hudson等(2007)，BMC Bioinformatics 8(1)：460)-图14。100次自引重复的置信度指出主分支。
实施例3：计算可以用于实施本发明方法的多肽序列之间的全局同一性百分比
全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比，利用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：anapplication that generates similarity/identity matrices using protein orDNA seq uences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由LedionBitincka托管)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
作为实例，图4显示了所选的表A1的DEAD-盒RNA解旋酶即图3中进化支A序列针对全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比的软件分析结果。序列相似性示于分割线下半部，而序列同一性示于对角分割线上半部。比较所用的参数为：记分矩阵：Blosum 62，首个空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：2相比较，可以用于实施本发明方法的DEAD-盒RNA解旋酶多肽序列之间的同一性(％)可低至45％(通常高于45％)。
表B1：图4蛋白质的描述
| DEAD-盒RNA解旋酶蛋白质.Plant Source_Chomosome locus |
| 1.A.thaliana_AT1G31970 |
| 2.Aquilegia_sp_TC27171 |
| 3.Chlorella_36420 |
| 4.G.max_Glyma01g01390 |
| 5.G.max_GM06MC17187_5965495216891#1_A |
| 6.G.raimondii_TC4727 |
| 7.H.vulgare_TC183460 |
| 8.M.truncatula_CU459038_20 |
| 9.O.lucimarinus_38084 |
| 10.O.RCC809_33138 |
| 11.O.sativa_LOC_Os07g20580 |
| 12.O.taurii_19637 |
| 13.P.patens_205380 |
| 14.S.bicolor_Sb02g009590 |
| 15.V.carteri_103394 |
| 16.V.vinifera_GSVIVT00003606001 |
| 17.Z.mays_ZM07MC20090_BFb0116P0620039#1_A |
2.CER2样多肽
图10显示了针对全长多肽序列之间的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性示于分割线下半部，而序列同一性示于对角分割线上半部。比较所用的参数为：记分矩阵：Blosum 62，首个空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：169相比较，可以用于实施本发明方法的CER2样多肽序列之间的同一性(％)通常高于16％。
3.At1g68440样多肽
图15显示了针对全长多肽序列之间的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性示于分割线下半部，而序列同一性示于对角分割线上半部。比较所用的参数为：记分矩阵：Blosum 62，首个空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：292相比较，可以用于实施本发明方法的At1g68440样多肽序列之间的同一性(％)可低至21％。
实施例4：鉴定可以用于实施本发明方法的多肽序列中所含的结构域
蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索的、常用标签数据库的一个整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息来产生蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的、多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合。Pfam由位于英国的桑格研究所服务器(Sanger Institute server)托管。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
SEQ ID NO：2代表的多肽序列的InterPro扫描结果示于以下表C1中。
表C1：SEQ ID NO：2代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主登录号)。
2.CER2样多肽
SEQ ID NO：169代表的多肽序列的InterPro扫描结果示于以下表C2中。
表C2：SEQ ID NO：169代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主登录号)。
3.At1g68440样多肽
SEQ ID NO：292代表的多肽序列的InterPro扫描结果示于以下表C3中。
表C3：SEQ ID NO：292代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
| 蛋白质长度 | 跨膜区 | E-值 | SEQ ID NO 292上的氨基酸位置 |
| 332 | TMHMM | NA | 起始于：46；终止于：64 |
实施例5：用于实施本发明方法的多肽序列的拓扑学预测
TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配所基于的是如下任一N-末端前序列的预测性存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所基于的分值并非真正的概率，且加起来并不必为1。不过，根据TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之间的关系(可靠性级别)可作为所述预测的可靠性的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器维护。
对于经预测包含N末端前序列的序列，还可预测潜在切割位点。
可以选择许多参数，例如生物组别(非植物或植物)、截断值设置(无、预定的截断值设置、或用户指定的截断值设置)和预测切割位点的计算(是或否)。
许多其他算法可用于实施此类分析，包括：
●在丹麦技术大学的服务器上托管的ChloroP 1.1；
●在澳大利亚布里斯班的昆士兰大学分子生物科学学院(Institutefor Molecular Bioscience)的服务器上托管的Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor 1.2版；
●在Edmonton，Alberta，Canada的阿尔伯特大学(University ofAlberta)的服务器上托管的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5；
●在丹麦技术大学的服务器上托管的TMHMM；
●PSORT(URL：psort.org)
●PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
实施例6：与可以用于实施本发明方法的多肽序列相关的测定法
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
测量解旋酶活性的工具和技术如Okanami等(1998)Nucleic AcidRes.(26)：2638-2643所描述。
2.CER2样多肽
用于DAT的放射性同位素测定法可以改编自De Luca等，1985，J.Plant Physiol，121卷，417-428页。可含有DTT的测定缓冲液可由含有抗坏血酸的缓冲液B替换，产生具有降低的背景放射性的DAT酶测定。测定混合物可含有10μl蛋白质溶液(各种浓度)、18μM脱乙酰基文多灵、和37μM[l-14Cj乙酰辅酶A(sp act 54mCi/mmol)和缓冲液B，最终容积为100μl。在1.5ml Eppendorf微量离心管中进行测定。在30℃水浴10分钟后，用100μl的0.1M NaOH停止反应。可用250μl乙酸乙酯在Eppendorf 5432型混合器上萃取经放射性标记的产物5分钟。在Eppendorf 235C型微量离心器中以13000转/分钟离心2分钟，将水相和有机相分离。可将来自每次测定的100微升有机相与2.5ml甲苯中的0.4％的PPO混合，并可用LKB1219 Rackbeta液体闪烁计数器计数测定。
实施例7：用于本发明方法的核酸序列的克隆
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
使用稻幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增稻DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列。将提取自幼苗的RNA逆转录后，将cDNA克隆至pCMV Sport 6.0。库的插入序列平均大小是1.5kb并且克隆的最初数目是1.59×107cfu量级。在6×1011cfu/ml的第一轮扩增后测定原始滴度是9.6×105cfu/ml。在质粒提取后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。将引物prm14820(SEQ ID NO：157；有义：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggtcgcagtatgcttc-3’)和prm14821(SEQ ID NO：158；反义，互补：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacgaagaaaagaccagcaaat-3’)用于PCR扩增，其包括用于Gateway重组的AttB位点。在标准条件中使用Hifi TaqDNA聚合酶进行PCR。还使用标准方法扩增并纯化预期大小的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为Gateway
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；和旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组(因此来自进入克隆的目的序列以有义和反义方向整合)的Gateway盒。用于组成型特异表达的稻GOS2启动子(SEQID NO：156)位于此Gateway盒的上游。
在LR重组步骤之后，根据本领域公知的方法，将所产生的表达载体pGOS2::DEAD-盒RNA解旋酶(图5)转化进农杆菌菌株LBA4044。
2.CER2样多肽
使用客户定制的蒺藜苜蓿幼苗cDNA文库作为模板通过PCR扩增核酸序列。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶，在50μl PCR mix中使用200ng模板进行PCR。使用的引物是：prm13662(SEQ ID NO：272；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggttcattgccaaattta-3’和prm13663(SEQ ID NO：273；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcacaacacaattccaccaact-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”，pCER2样。作为Gateway
技术一部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。
含有SEQ ID NO：168的进入克隆随后与用于稻转化的目的载体一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；和旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：289)位于此Gateway盒的上游。
在LR重组步骤之后，根据本领域公知的方法，将所产生的表达载体pGOS2::CER2样(图11)转化进农杆菌菌株LBA4044。
3.At1g68440样多肽
使用客户定制的毛果杨幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增核酸序列。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶，在50μl PCR mix中使用200ng模板进行PCR。使用的引物是：prm14292(SEQ ID NO：361；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaag caggcttaaacaatggagatcccagtgatcaat-3’和prm14293(SEQ ID NO：362；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccgcgttatcaaacagattt-3’，包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入克隆”，pAt1g68449。作为Gateway
技术一部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。
含有SEQ ID NO：291的进入克隆随后与用于稻转化的目的载体一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；和旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：363)位于此Gateway盒的上游。
在LR重组步骤之后，根据本领域公知的方法，将所产生的表达载体pGOS2::At1g68440样(图16)转化进农杆菌菌株LBA4044。
实施例8：植物转化
稻转化
用含表达载体的农杆菌转化稻植物。使粳稻栽培种日本晴(Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟，接着用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使消毒的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下盾片来源的胚发生愈伤组织，并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中传代培养另外2周来扩增或者增殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适抗生素的AB培养基上，并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至光密度(OD600)约为1。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液中15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固化的共培养培养基中，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上于28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移至再生培养基并在光照下孵育之后，释放了胚发生潜力，在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下，并在含生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。
一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植后三至五个月收获种子。该方法以超过50％的比率产生了单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等，1993，Hiei等，1994)。
实施例9：其他作物的转化
玉米转化
用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方案进行玉米转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型适于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后约11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植物。切离的胚依次生长在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基、和玉米再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
小麦转化
运用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法，进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(可从CIMMYT，墨西哥获得)常用来进行转化。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基，和再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
大豆转化
根据Texas A&M专利US 5,164,310所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(可以得自伊利诺斯种子公司(Illinois Seed foundation))常用来进行转化。对大豆种子消毒以进行体外播种。从七日龄幼苗中切出下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切离这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。切离再生的芽，置于芽伸长培养基中。将长度不超过1厘米的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
油菜籽/芸苔转化
利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养并根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子表面消毒以进行体外播种。从体外幼苗中切离附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来接种农杆菌(含有表达载体)。随后外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
苜蓿转化
利用(McKersie等1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.PlantCell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的任何其它商业苜蓿品种。可选的，选择RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，但该培养基不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的幼苗移植到花盆中并在温室中生长。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
棉花转化
按照US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。于3％次氯酸钠溶液中20分钟，对棉花种子表面消毒，并且在具有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中进行洗涤。然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵(benomyl)的SH培养基中进行萌发。从4至6日龄的幼苗中取出下胚轴，切成0.5厘米的小块，置于0.8％琼脂上。将农杆菌悬浮液(每ml大约108个细胞，从用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物稀释的)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3天后，将组织转移至具有Murashige和Skoog盐和B5维生素(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-糠氨基嘌呤(6-furfurylaminopurine)和750μg/ml MgCL2、以及50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素(以杀死残留细菌)的固体培养基(1.6g/lGelrite)。在2至3个月(每4至6周进行一次传代培养)后分离单细胞系并且将其在选择培养基上进一步培养以进行组织扩增(30℃，16小时光周期)。接着将转化的组织在非选择培养基上进一步培养2至3个月以产生体细胞胚。将至少4毫米长的健康外貌的胚转移至具有SH培养基(于细小蛭石中)的试管中，所述培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠氨基嘌呤和赤霉酸。将胚在30℃和16小时的光周期下进行培养，将2至3叶期的小植株转移入具有蛭石和营养物的花盆。植物变硬，然后转移至温室以进一步栽培。
实施例10：表型评估方法
10.1评估设置
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室进行生长并收获T1种子。保留6个其中T1代发生转基因的存在/缺乏的3∶1分离的事件。对于每一个此类事件，通过监测可视标记的表达，选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗、以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
2.CER2样多肽
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室进行生长并收获T1种子。保留5个其中T1代发生转基因的存在/缺乏的3∶1分离的事件。对于每一个此类事件，通过监测可视标记的表达，选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗、以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。对在非胁迫条件下生长的植物定期浇水，以确保水和养分是非限制性的以及满足完成生长和发育的植物需要。
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
按照与T1代相同的评估程序，对T1事件在T2代中进行了进一步的评估，例如每个事件采用更少和/或更多的个体。
3.At1g68440样多肽
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室进行生长并收获T1种子。保留6个其中T1代发生转基因的存在/缺乏的3∶1分离的事件。对于每一个此类事件，通过监测可视标记的表达，选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗、以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。对在非胁迫条件下生长的植物定期浇水，以确保水和养分是非限制性的以及满足完成生长和发育的植物需要。
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
按照与T1代相同的评估程序，对T1事件在T2代中进行了进一步的评估，例如每个事件采用更少和/或更多的个体。
干旱筛选
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
在正常条件下在花盆土中培养来自T1种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干”区，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC降至一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录了生长和产量参数。
2.CER2样多肽
在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干”区，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC降至一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录了生长和产量参数。
3.At1g68440样多肽
在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干”区，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC降至一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录了生长和产量参数。
氮利用效率筛选
在除营养液以外为正常的条件下在花盆土中栽培来自T1或T2种子的稻植物。从植物移植到成熟，用特定的营养液对花盆进行灌溉，所述营养液含有减小的氮(N)含量，通常少7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如对正常条件下生长所详细描述的那样，记录了生长和产量参数。
盐胁迫筛选
植物生长在由椰壳纤维和argex(3∶1)制成的基质上。在小植株移植到温室后的头两周期间应用正常营养液。过了头两周之后，向营养液中添加25mM盐(NaCl)，直至收获植物。然后测量种子相关参数。
10.2统计学分析：F检验
利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行总体评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行了F检验。进行F检验以检查基因在所有转化事件上的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指示存在基因效应，这意味着引起表型上差异的不仅仅是基因的存在或位置。
10.3测量的参数
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)如WO2010/031780所述。这些测量用于测定不同参数。
生物量相关参数测量
植物地上面积或者说叶生物量通过计数数码图像中区别于背景的地上植物部分的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。该地上面积是在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。
早期生长势是萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。根生物量增加表达为根总生物量(测量为在植物一生中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/苗指数(测量为在根和苗活跃生长期中根生物量和苗生物量之间的比值)的增加。
根生物量的增加可表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根/苗指数增加(度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例)。可使用WO 2006/029987中所述的方法确定根生物量。
与发育时间相关的参数
早期生长势是萌发后3周的植物即幼苗地上部分面积。通过计数来自植物部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值。
AreaEmer是快速早期发育的指示当与对照植物比较该值被降低时。它是植物达到30％的最终生物量所需的时间与达到90％其最终生物量所需的时间的比(以％表示)。
可以使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。
种子相关参数测量
收获成熟的一级圆锥花序(primary panicles)、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后使圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置使饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数，确定饱满种子数。通过称重从植物收获的所有饱满谷壳来测量种子总重量。通过计数从植物收获的谷壳数来测量每株植物的种子总数。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重或TKW。收获指数或HI在本发明中定义为种子总产量和地上面积(mm2)之间的比值再乘以因子106。每圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟一级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以％表示)。
可使用WO 2006/029987中所述的方法确定根生物量。
实施例11：转基因植物的表型评价结果
1.DEAD-盒RNA解旋酶多肽
下文呈现在干旱条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物处于T1世代并且表达包含SEQ ID NO：1中最长可读框的核酸。关于产生所述转基因植物的细节，见前述实施例。
下文呈现在干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果。观察到种子总产量包括总种子重量、饱满种子数、饱满率和收获指数增加至少5％、和超过2.5％的千粒重的增加。
下文呈现在干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达DEAD-盒RNA解旋酶核酸(表D1)。
实例：
下表D1呈现在干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物处于T1世代并且表达编码SEQ ID NO：2的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸。在干旱胁迫条件下生长时，观察到种子总产量包括总种子重量、饱满种子数、饱满率和收获指数增加至少5％。
表D1：转基因稻植物干旱条件下数据总结；对于每一个参数，如果该参数达到p值均为＜0.05且大于5％阈值，显示总体增加百分比。
| 参数 | 整体增加 |
| 总种子重量 | 23.2 |
| 饱满种子数 | 19.1 |
| 收获指数 | 35.0 |
| 饱满率 | 25.3 |
2.CER2样多肽
下文呈现在干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达CER2样核酸。观察到种子总种子重量、饱满种子数、饱满率、收获指数和植物叶生物量的重心(高度)增加至少5％(表D2)。AreaCycl是播种和植物第一圆锥花序萌发间隔时间测量，即植物累积生物量的时间。计算为播种到植物达到90％最终生物量日期所需时间(以天计)。通常用于估计植物生长速率的测量。
表D2：转基因稻植物数据总结；对于每一个参数，显示了总体增加百分比用于验证(T1代)，对于每一个参数，p值均为＜0.05。
| 参数 | 整体增加 |
| 总种子重量 | 52.1 |
| 充实率 | 54.2 |
| 收获指数 | 49.7 |
| 充实种子数 | 46.9 |
| GravityYMax | 5.3 |
| AreaCycl | 5.4 |
3.At1g68440样多肽
下文呈现在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，所述的转基因稻植物处于T1世代并且表达包含SEQ ID NO：291中最长可读框的核酸。关于产生所述转基因植物的细节，见前述实施例。
下文呈现在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果。观察到种子总产量、充实种子数、充实率、每圆锥花序花数、收获指数、总种子重量增加至少5％、且(2.5-3)％的千粒重的增加。
下文呈现在干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达At1g68440样核酸。观察到总种子重量、充实种子数、充实率、收获指数和千粒重的增加(表D3)。
下表D3呈现在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物处于T1世代并且表达编码SEQ ID NO：292的DEAD-盒RNAAt1g68440样多肽的核酸。在非胁迫条件下生长时，观察到种子产量(包括总种子重量、饱满种子数、饱满率和收获指数)增加至少5％。
表D3：转基因稻植物数据总结；对于每一个参数，显示了总体增加百分比用于验证(T1代)，对于每一个参数，p值均为＜0.05。
| 参数 | 整体增加 |
| 总种子重量 | 38.1 |
| 饱满率 | 28.5 |
| 收获指数 | 34.4 |
| 饱满种子数 | 32.7 |
Claims (85)
1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码CER2样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述CER2样多肽包含PF02458结构域和/或具有转移酶活性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述受调节的表达通过向植物中引入和表达编码所述CER2样多肽的核酸来实现。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
4.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
5.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
6.根据权利要求1至5中任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含一个或多个以下基序：
基序18a：FKCGGL[SA][LI]G[LV][SG]W[AS]HI[LV][GA]D[GA]FSASHFIN[SA]W(SEQ ID NO：274)，
基序19a：SGR[PL]E[IVL]KCNDEG[VA][RL][FI][VI]EAE[CA]D(SEQ ID NO：276)，
基序20a：xY[ST][TR][FY]E[AI]L[AST][AG][HL][IV]W[RK][CS]I[AC]KARG(SEQ ID NO：278)。
7.根据权利要求1至5的任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含：
基序21a：VQ[VF]TxFKCGG[LM][SA][LIV]GLS[WC]AH[IVL]LGD[APV]FSA[ST]TF[FIM][NK]KW(SEQ ID NO：280)
基序22a：[EA]SGR[PW][YF][IV]KCND[AC]GVRIVEA[KHR]CDK(SEQ ID NO：282)
基序23a：SR[VT][GE][EP][GN]Kx[HY]E[LP][ST]x[LM]DLAMKLHY[LVI]R[GA]VY[FY][FY](SEQ ID NO：284)。
8.根据权利要求1至5中任意项的方法，其中所述CER2样多肽包含：
基序24：FKCGG[VIF][SA][LI]G[VL]G[MI]SHx[VLM]ADGxSALHFI[NS][SAT]W(SEQ ID NO：286)
基序25：NPNLL[IV][TV]SWT[RT][LF]P[ILF][YH][DE]ADFGWG[KR]PI[FY]MGP(SEQ ID NO：287)
基序26：[SA]LS[KE][VT]L[VT][HP][FY]YP[ML]AGR(SEQ ID NO：288)。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述编码CER2样的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，又优选地来自豆科，更优选苜蓿科，更优选蒺藜苜蓿。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述编码CER2样的核酸编码表A2中所列的任一多肽，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述编码CER2样多肽的核酸对应SEQ ID NO：291。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述核酸有效地连接至组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子有效连接、优选与植物启动子有效连接、更优选与GOS2启动子有效连接、最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
14.可通过根据权利要求1至13中任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求1和5至12中任意项定义的编码CER2样多肽的重组核酸。
15.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1和6至12中任意项定义的CER2样的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
16.根据权利要求15的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子、优选是植物启动子、更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
17.根据权利要求15或16的构建体在用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的产量，且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量的植物的方法中的用途。
18.利用根据权利要求15或16的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
19.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：
(i)向植物细胞或植物中引入和表达编码如权利要求1和5至12中任意项定义的CER2样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。
20.相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物，其产生自编码如权利要求1和6至12中任意项定义的CER2样多肽的核酸的受调节的表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
21.根据权利要求14、18或20的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
22.根据权利要求21的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
23.产品，其来自根据权利要求21的植物和/或来自根据权利要求22的植物的可收获部分。
24.编码权利要求1和6至12中任意项定义的CER2样多肽的核酸在相对于对照植物增强植物中产量相关性状、优选增加产量、且更优选相对于对照植物增加种子产量和/或增加生物量中的用途。
25.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码At1g68440样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述At1g68440样多肽包含跨膜结构域。
26.根据权利要求25的方法，其中所述受调节的表达通过向植物中引入和表达编码At1g68440样多肽的核酸来实现。
27.根据权利要求25或26的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
28.根据权利要求25至27中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
29.根据权利要求25至27中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
30.根据权利要求25至29中任一项的方法，其中所述At1g68440样多肽包含一个或多个以下基序：
-基序27a：Y[SN]F[WC][KT]WGALILA[LV][FVL]A(SEQ ID NO：364)，
-基序28a：ME[IV][PT][VE][IL]N[RL]I[SG]DF(SEQ ID NO：366)，
-基序29a：[SN]VV[KQ]LWD[SN]LG[LF](SEQ ID NO：368)。
31.根据权利要求25至30中任一项的方法，其中所述编码At1g68440样的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，优选来自杨柳科、更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。
32.根据权利要求25至30中任一项的方法，其中所述编码At1g68440样的核酸编码表A3中所列的任一多肽，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
33.根据权利要求25至32中任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A3中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
34.根据权利要求25至33中任一项的方法，其中所述编码At1g68440样多肽的核酸对应SEQ ID NO：291。
35.根据权利要求25至34中任一项的方法，其中所述核酸有效地连接至组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子有效连接、优选与植物启动子有效连接、更优选与GOS2启动子有效连接、最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
36.可通过根据权利要求25至34中任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求25和30至34中任意项定义的编码At1g68440样多肽的重组核酸。
37.分离的核酸分子，其选自：
-由SEQ ID NO：291代表的核酸；
-由SEQ ID NO：291代表的核酸的互补核酸；
-编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
-与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子；
-编码At1g68440样多肽的核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：292所代表的氨基酸序列和表A3中的任意其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
38.分离的多肽，其选自：
-由SEQ ID NO：292代表的氨基酸序列；
-氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：364至SEQ ID NO：375中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
-以上(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
39.构建体，其包含：
-编码如权利要求25和30至34中任意项定义的At1g68440样的核酸；
-能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
-转录终止序列。
40.根据权利要求39的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子、优选是植物启动子、更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
41.根据权利要求39或40的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的产量，且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量。
42.利用根据权利要求39或40的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
43.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：
-向植物细胞或植物中引入和表达编码如权利要求25和30至34中任意项定义的At1g68440样多肽的核酸；和
-在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。
44.相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的产量、且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物，其产生自编码如权利要求25和30至34中任意项定义的At1g68440样多肽的核酸的受调节表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
45.根据权利要求36、42或44的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
46.根据权利要求45的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
47.产品，其来自从根据权利要求45的植物和/或来自根据权利要求46的植物的可收获部分。
48.编码权利要求25和30至34中任意项定义的At1g68440样多肽的核酸在相对于对照植物增强产量相关性状、优选增加产量、且更优选相对于对照植物增加种子产量和/或增加生物量中的用途。
49.用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括降低或基本去除编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸在植物中的表达，和/或降低或基本去除DEAD-盒RNA解旋酶多肽在所述植物中的水平和/或活性，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含标签模型[LIVMF]-[LIVMF]-D-E-A-D-[RKEN]-X-[LIVMFYGSTN](SEQ ID NO：159)。
50.根据权利要求49的方法，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽是如Aubourg等(1999)所述DEAD-盒RNA解旋酶的6个亚家族中的亚家族VI的直向同源物或旁系同源物。
51.根据权利要求49或50的方法，其中所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽包含一个或多个以下基序：
(i)基序1：[LM][VI]ATDVA[AS]RGLD[IV][KP]D[VI][EK]VV[IV]N[YF][SD][YF]P[LN][TD][IT][ED]DYVHRIGRTGRA(SEQ ID NO：3)，
(ii)基序2：[RSN]L[NR][DR]V[TS][YF][LV]VLDEADRMLDMGFEP[EQ][IV]R[AK]I[VL](SEQ ID NO：4)，
(iii)基序3：P[TS]PIQA[YQ][AS][WI]P[YI][AL][LM][DS]GRD[FL][IV][GA]IA[KA]TGSGKT(SEQ ID NO：5)。
52.根据权利要求49至51中任意项的方法，其中所述编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸编码表A1中所列的任一蛋白质，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸杂交的核酸。
53.根据权利要求49至52中任一项的方法，其中所述核酸序列编码在表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
54.根据权利要求49至53中任意项的方法，其中所述降低或基本去除由RNA-介导的基因表达下调实现。
55.根据权利要求54的方法，其中所RNA-介导下调节由共抑制实现。
56.根据权利要求55的方法，其中所RNA-介导下调节由使用反义DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列实现。
57.根据权利要求49至53中任意项的方法，其中所述降低或基本去除由使用DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列或其片段的反向重复实现。
58.根据权利要求49至53中任意项的方法，其中所述降低或基本去除由使用微RNA实现。
59.根据权利要求49至53中任意项的方法，其中所述降低或基本去除由插入突变实现。
60.根据权利要求49至59中任意项的方法，其包括将与所述编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸基本同源的DEAD-盒RNA解旋酶核酸或其片段引入宿主植物。
61.根据权利要求49至59中任意项的方法，其中所述降低或基本去除以组成型方式优选使用组成型启动子、更优选使用GOS2启动子、最优选使用来自稻的GOS2启动子实现。
62.根据权利要求60或61的方法，其中所述引入的核酸来自与宿主植物相同的科、更优选来自与宿主植物相同的属、甚至更优选来自与宿主植物相同的种。
63.根据权利要求60至62中任意项的方法，其中所述引入的DEAD-盒RNA解旋酶核酸序列包含足够长度的SEQ ID NO：1的基本连续核苷酸，或其直向同源物或旁系同源物，且所述宿主植物是谷类植物，优选是稻。
64.根据权利要求63的方法，其中所述核酸编码由任一SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155代表的蛋白质。
65.根据权利要求63或64的方法，其中所述核酸由任一SEQ IDNO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154代表。
66.根据权利要求49至65中任意项的方法，其中所述增强的产量相关性状是相对于对照植物的增加的种子产量。
67.根据权利要求66的方法，其中所述增加的种子产量选自下列一种或多种：a)增加的种子生物量，例如种子重量；b)增加的饱满种子数；c)增加的饱满率和(b)增加的收获指数。
68.根据权利要求49至67中任意项的方法，其中所述增加的产量在非胁迫条件下获得。
69.根据权利要求49至67中任意项的方法，其中所述增加的产量在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
70.可通过根据权利要求49至69中任一项的方法获得的植物、其包括种子的部分，其中所述植物或其部分包含编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的重组核酸。
71.构建体，其包含：
(a)DEAD-盒RNA解旋酶基因或片段的反向重复，其能够下调节内源靶标DEAD-盒RNA解旋酶；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
72.根据权利要求71的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
73.根据权利要求71或72的构建体在用于制备具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
74.利用根据权利要求71或72的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
75.用于产生相对于对照植物具有增加的产量、优选具有增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：
(i)向植物细胞中引入和表达根据权利要求71或72的构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
76.DEAD-盒RNA解旋酶核酸在降低或基本去除植物中内源DEAD-盒基因表达，以相对于对照植物增加植物中的产量的用途。
77.根据权利要求76的用途，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
78.根据权利要求77的用途，其中所述增加的种子产量选自下列一种或多种：a)增加的种子生物量，例如种子重量；b)增加的饱满种子数；c)增加的饱满率和(b)增加的收获指数。
79.根据权利要求76至78中任一项的用途，其中所述产量增加在胁迫条件下出现。
80.分离的核酸分子，其选自：
(a)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸；
(b)由SEQ ID NO：12或14代表的核酸的互补核酸；
(c)编码DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸，所述DEAD-盒RNA解旋酶多肽以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(d)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
81.分离的多肽，其选自：
(i)由SEQ ID NO：13或15代表的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：13或15所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：11中所给出基序中的任一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)以上(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
82.相对于对照植物具有增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物，其产生自编码如权利要求49或50中定义的DEAD-盒RNA解旋酶多肽的核酸的降低或基本去除表达或源于所述转基因植物的转基因植物细胞。
83.根据权利要求70或74的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
84.根据权利要求82和83的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
85.产品，其来自根据权利要求82和83的植物和/或来自根据权利要求84的植物的可收获部分。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130522 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |