CN113755508B

CN113755508B - 百草枯抗性基因EiKCS及其应用

Info

Publication number: CN113755508B
Application number: CN202110962351.0A
Authority: CN
Inventors: 罗琪宇; 陈勇; 刘耀光
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113755508A

Abstract

本发明公开了百草枯抗性基因EiKCS及其应用。本发明从具有百草枯抗性的牛筋草植株中发现了百草枯抗性基因EiKCS，并通过构建植物表达载体以及农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建，成功将EiKCS基因的表达载体转化至牛筋草和水稻中，发现EiKCS基因赋予其对百草枯的抗性，且抗性提升效果显著，同时还可以提高转基因植物的抗氧化能力。此外，本发明还发现EiKCS可以促进转基因植物中多胺的合成，通过调控植物多胺的代谢提高其对百草枯抗性，为培育抗除草剂的农作物品种提供了理论和技术基础。

Description

百草枯抗性基因EiKCS及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及百草枯抗性基因EiKCS或其编码蛋白在提高宿主百草枯抗性、多胺合成以及抗氧化能力中的应用。

背景技术

除草剂的频繁应用使植物对除草剂抗药性迅速进化，这是农田杂草治理和农业生产中的重大难题。全球范围内已发现了对23种除草剂产生了抗药性的262种杂草(514个生物型)，其中，在我国农田中发现了对11类除草剂产生抗药性的44种杂草，抗药性杂草的数量居世界第6位。因此，利用现代基因组学、蛋白组学、生物化学和基因工程等技术阐明除草剂抗药性分子机制的问题亟待解决。

通过基因工程手段培育的多个除草剂抗性作物品种现已广泛应用于农业生产中。培育转基因除草剂抗性作物的主要价值体现在提高除草效果、降低除草成本、利于采用保护性耕作、有助于机械化种植以及减轻环境污染等方面。相较于传统农作物，转基因作物具有更强的抗逆和抗除草剂等优良性状，对于保障全球粮食安全和防治除草剂对生态环境的污染具有重要作用。2021年是全球转基因农作物开始商业化并且在多个国家和地区大规模种植的第26年，占转基因作物面积最大(60％)的是抗除草剂转基因作物。

百草枯(1,1'-二甲基-4,4'-联吡啶二氯化物，paraquat)是一种光系统I抑制剂，其通过中断光系统I的正常电子流，产生有毒的活性氧，进而破坏植物细胞膜，能迅速杀死杂草等绿色植物，现已广泛应用于农业和园艺生产中，是应用最广泛的除草剂之一。百草枯的抗性机制有三种假设：第一种是非靶标抗性，第二种是隔离或转运，第三种是代谢途径，但其抗药性的作用机制复杂，尚未得到阐明。目前，植物对百草枯抗性的报道主要是集中在影响百草枯体内运输或增强抗性酶的活性，缺乏发现调控代谢增强百草枯抗性的基因和蛋白的研究。因此，寻找来源于抗性杂草的百草枯抗性基因可为阐明百草枯抗性机制提供新的思路，并可以通过转基因技术高植物对百草枯的抗性，对农作物的高效生产具有重要意义。

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，简称KCS)是超长链单不饱和脂肪酸生物合成途径的关键酶。中国专利CN 109402079A公开了的花生β-酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoA synthase，KCS)基因AhyA.KCS1和AhyB.KCS在植物脂肪酸改良及培育生产高附加值油料作物方面具有重要的应用价值。但目前还未有关于将3-酮酯酰-CoA合酶基因用于提高宿主对百草枯抗性中的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供百草枯抗性基因EiKCS或其编码蛋白在提高宿主百草枯抗性、多胺合成以及抗氧化能力中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明在对田间杂草进行抗药性检测的过程中，发现了具有百草枯抗性的牛筋草种群，对牛筋草的百草枯抗性生物型种群和敏感生物型种群进行转录组测序以及分析生信数据，发现了一个表达差异明显的基因。通过设计特异性引物，从抗性牛筋草植株中扩增得到了该基因的全长序列，如SEQ ID NO.1所示，其所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。序列比对分析结果发现该基因属于3-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoAsynthase，KCS)家族，结合牛筋草种名(Eleusine indica(L.)Gaertn.)，将该基因命名为EiKCS，其编码的蛋白为EiKCS。本发明通过植物表达载体以及农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建，将EiKCS基因转化至牛筋草和水稻中发现EiKCS基因可以赋予转基因植物对百草枯的抗性，且抗性提升效果显著。

本发明首先提供了一种百草枯抗性基因EiKCS，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了百草枯抗性基因EiKCS所编码的蛋白EiKCS，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，蛋白EiKCS中包含4条特征性肽段，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3～4所示的特征性肽段可用于EiKCS蛋白质含量的特异性定量检测。

本发明还提供含有所述百草枯抗性基因EiKCS的重组表达载体。

本发明还提供含有所述重组表达载体的宿主菌。

本发明通过植物表达载体以及农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建，发现将EiKCS基因转化至牛筋草和水稻中发现EiKCS基因可以赋予转基因植物对百草枯的抗性，提升其抗氧化能力。

因此，本发明申请保护SEQ ID NO.1所示百草枯抗性基因EiKCS或SEQ ID NO.2所示蛋白EiKCS在提高宿主对百草枯抗性中的应用。

本发明还申请保护SEQ ID NO.1所示百草枯抗性基因EiKCS或SEQ ID NO.2所示蛋白EiKCS在提高宿主抗氧化能力中的应用。

本发明还发现EiKCS基因可以促进转基因植物中多胺(polyamines)的合成。多胺是生物体中的天然脂肪族多价阳离子胺类物质，有促进植物生长的作用，属于生长调控因子，与百草枯在化学结构上具有一定的相似性。本发明发现EiKCS基因可以提高植物中多胺的合成，通过对内外源多胺的代谢缓解百草枯药害，从而提高植物对百草枯的抗性。此外，本发明发现转基因水稻的内源多胺在苯甲酰化反应中的所有N-位都结合了苯环，其多胺衍生产物的分子为C₁₈H₂₀N₂O₂(腐胺)、C₂₈H₃₁N₃O₃(亚精胺)和C₃₈H₄₂N₄O₄(精胺)。

多胺除可提高百草枯抗药性外，还能用于治疗癌症，本发明提供的植物中与多胺合成相关的EiKCS基因还可能具有药用价值。目前已有文献报道肿瘤细胞中的精胺和亚精胺可以抑制细胞凋亡(Amin et al.,2021)。多胺是由精氨酸和脯氨酸代谢合成的，多胺途径是癌症中化学预防的一个潜在靶点(Lee et al.,2020；Li et al.,2020)。多胺通路中的鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因使多胺合成与癌症相关，具有治疗干预作用(Gerner et al.,2004；Casero et al.,2007)。

因此，本发明还申请保护SEQ ID NO.1所示百草枯抗性基因EiKCS或SEQ ID NO.2所示蛋白EiKCS在提高宿主多胺合成中的应用。

具体地，所述多胺为内源多胺。

具体地，所述应用为构建EiKCS基因的表达载体并转化到宿主中。

优选地，所述表达载体为pCUbi1390。

优选地，所述宿主为植物。

优选地，所述植物为禾本科植物。

优选地，所述禾本科植物为水稻或牛筋草。

优选地，所述构建EiKCS基因的表达载体并转化到宿主中的方法为农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建。

本发明建立和优化了一套完整的牛筋草遗传转化与再生体系，利用农杆菌介导的遗传转化和再生体系成功将EiKCS基因的表达载体转入牛筋草中。

具体地，所述农杆菌介导的遗传转化体系的构建过程如下：

1)种子的处理：将牛筋草种子储存在牛皮纸袋中暴晒7天后，套上塑料封口袋，于-20℃冰箱冷冻处理3个月；3个月后去壳，清洗，暴晒约6小时后装入无菌的牛皮纸袋并套封口袋，于-20℃冰箱冷冻处理1个月；诱导前用75％的酒精浸泡1min，HgCl₂(0.05％)浸泡10min，用无菌ddH₂O漂洗后自然干燥约1小时。

2)愈伤组织的诱导：诱导培养基成分为N6培养基粉末(24.1g)，脯氨酸(0.5g)、水解酪蛋白(0.6g)、蔗糖(10g)、植物凝胶(3g)和0.5mg/L 2,4-D(1mL)，ddH₂O定容(1L)，pH调至5.8；倒入20个一次性无菌培养皿(120×20mm)中制成诱导培养皿；将处理后的种子置于诱导培养皿中，于24℃/24h的暗室中培养至少30天。

3)愈伤组织的继代培养：继代培养基成分为N6培养基粉末(24.1g)，脯氨酸(0.5g)、水解酪蛋白(0.6g)、蔗糖(10g)、琼脂(7g)和0.5mg/L 2,4-D(0.5mL)，ddH₂O定容(1L)，pH调至5.8；倒入20个一次性无菌培养皿(120×20mm)中制成继代培养皿，使用前于灭菌超净台中吹干约3小时；将牛筋草愈伤组织置于继代培养皿中，于24℃/24h暗室中培养至预期大小。

4)农杆菌的侵染条件：将携带目标表达载体(pCUbi1309::EiKCS)的农杆菌(EHA105)在含50mg/L利福平、20mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的YEP培养基(100mL)中，培养至O.D.(600)为0.5～0.6之间。

5)农杆菌的侵染过程：4℃冷处理愈伤1～2天，以(4)中的农杆菌侵染30min，干燥3～4h，在AS浓度为200μmol/L的培养基共培养3d，水洗3～5次(每次5分钟)，在100mg/L特美汀中浸渍30min，干燥3～4h。

6)愈伤组织的筛选：A：诱导培养基中含终浓度为15mg/L的潮霉素、200mg/L的羧苄青霉素和100mg/L的特美汀；B：诱导培养基含终浓度为15mg/L潮霉素、300mg/L羧苄青霉素和100mg/L特美汀；诱导培养基中3g植物凝胶改为7g琼脂，ddH₂O定容(1L)，pH值调节至6.0；农杆菌侵染后的愈伤组织于培养基A中，在24℃/24h黑暗培养20天后转入B。

具体地，所述农杆菌介导的再生体系的构建过程如下：

1)愈伤组织的分化：分化培养基成分为MS培养基粉末(41.74g)，生长激素6-BA(0.5mg)、KT(0.5mg)、NAA(0.05mg)、IAA(0.05mg)和特美汀(100mg)，ddH₂O定容(1L)，pH值调节至5.7±0.1；筛选后的愈伤组织于24℃黑暗培养10小时后光照培养14小时(光照80μmol/m²·s)。

2)愈伤组织生根：生根培养基成分为1/2MS粉末(39.45g)，潮霉素(20mg)和特美汀(100mg)，ddH₂O定容(1L)；24℃黑暗培养10小时后光照培养14小时(光照80μmol/m²·s)。

3)炼苗、移栽、PCR鉴定(EiKCS、hptII基因3条特异片段)与繁殖。

优选地，所用牛筋草种子为MZ04百草枯敏感型。

本发明具有以下有益效果：

本发明从具有百草枯抗性的牛筋草植株中发现了百草枯抗性基因EiKCS，并通过构建植物表达载体以及农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建，成功将EiKCS基因的表达载体转化至牛筋草和水稻中，发现EiKCS基因可以赋予转基因植物对百草枯的抗性，且抗性提升效果显著，转基因牛筋草在高浓度百草枯(20.13mM)条件下仍存活，因而可将其应用于提高宿主对百草枯抗性中。此外，本发明还发现EiKCS可以提高转基因植物的抗氧化能力，促进转基因植物中多胺的合成，通过调控植物多胺的代谢提高其对百草枯抗性，为培育抗除草剂的农作物品种提供了理论和技术基础。

附图说明

图1为重组超表达载体pCubi1390::EiKCS的示意图；其中，图A为pCubi1390载体的示意图，图B为EiKCS插入位点的示意图。

图2为牛筋草遗传转化和再生体系中影响因子的优化；其中，图A为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤诱导率；图B为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤长菌率；图C为培养基干燥处理对胚型愈伤的影响；图D为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤分布频数；图E为诱导和继代培养过程中MZ04牛筋草种子在添加琼脂或植物凝胶的培养基中胚性(Ⅰ型)愈伤的诱导率；图F为筛选培养基中不同浓度的特美汀对抑制牛筋草转化体长菌率的影响。

图3为牛筋草种子(MZ04)的遗传转化体系；其中，图A为牛筋草种子诱导形成的愈伤组织；图B为牛筋草的胚性(Ⅰ型)愈伤组织；图C为牛筋草愈伤组织的继代培养；图D为低温(4℃)处理的愈伤；图E为农杆菌的单菌落活化；图F为愈伤组织感染；图G为愈伤组织筛选；图H为转化体的分化。

图4为牛筋草种子(MZ04)的再生体系；其中，图A为转化体的分化前期；图B为转化体的分化后期；图C为转化体的生根诱导前期的丛生叶；图D为转化体的生根诱导后期的根系生长；图E为转基因牛筋草的炼苗；图F为转基因牛筋草的移栽；图G为转基因牛筋草的单株育种；图H为各批次转基因牛筋草的温室培养。

图5为转基因牛筋草的PCR检测结果；其中，图A分别为T₀代和T₁代牛筋草中EiKCS基因和潮霉素抗性基因的PCR扩增结果；图B为T₂代牛筋草中EiKCS基因的PCR扩增结果；图C为T₅代牛筋草中EiKCS基因的PCR扩增结果；图A～C中所示W为野生型牛筋草MZ04，作阴性对照。

图6为转基因牛筋草(T₂～T₄代)的百草枯抗性表型；其中，图A为在营养期和生殖期分别喷施田间推荐全剂量3750mg/L(或20.13mM)的百草枯后转基因牛筋草(T₂和T₃代)的抗药性表型；图B为在喷施全剂量和半计量百草枯后，转基因牛筋草(T₄代)的抗药性表型。

图7为转基因牛筋草T₅代的百草枯抗性表型；其中，图A为喷施田间推荐剂量的百草枯后，6～9叶期转基因牛筋草和野生型牛筋草的抗药性表型；图B为喷施270mg/L(或1.45mM)的百草枯后，敏感生物型牛筋草(JM)、转基因牛筋草的两个株系和抗性生物型牛筋草(QY05)的抗性表型。

图8为转基因牛筋草EiKCS基因及其蛋白的表达量检测(RT-PCR)；其中，图A为RT-PCR检测EiKCS基因的表达量的结果；图B为PRM靶向蛋白技术检测EiKCS蛋白及其相关蛋白的表达量的结果；T₂代转基因牛筋草叶片(Z)和MZ04牛筋草叶片(W)的三个处理分别为ddH₂O、百草枯(P)和百草枯加预施亚精胺(P-S)。

图9为转基因水稻(KCSox)的构建与鉴定；其中，图A为牛筋草EiKCS及其同源蛋白的进化树分析；图B为转基因水稻KCSox(T₀～T₃代)中EiKCS的PCR扩增产物电泳图，以潮霉素抗性标记基因(289bp)和pCUbi1309::PqST3载体序列(3413bp)为对照。

图10为转基因水稻KCSox抗百草枯的表型，分别为喷施270mg/L(或1.45mM)百草枯溶液后0、12、24、36、48、60、160h的生长情况。

图11为水稻叶片提取液中内源多胺成分的HPLC-MS/MS检测；其中，图A为HPLC法下测定的多胺(腐胺，亚精胺，精胺)标准品的保留时间；图B为HPLC-MS/MS法下测定的KCSox水稻叶片中多胺(腐胺，亚精胺，精胺)的保留时间和准确分子质量；图C为衍生化后水稻中多胺(腐胺，亚精胺，精胺)的分子结构。

图12为普通水稻内源多胺的定量分析；其中，图A为腐胺的定量分析结果；图B为亚精胺的定量分析结果；图C为精胺的定量分析结果；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。

图13为转基因水稻KCSox内源多胺的定量分析；其中，图A为腐胺的定量分析结果；图B为亚精胺的定量分析结果；图C为精胺的定量分析结果；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。

图14为多胺通路相关蛋白在KCSox水稻中的表达情况，15个靶蛋白水平的变化倍数显示为KCSox和WT中KCSox/WT比率的log₂值；其中，第1组为多胺生物合成通路，第2组为多胺降解通路，第3组为TCA和脂肪酸生物合成通路，第4组为脂肪酸伸长通路。

图15为普通水稻在百草枯加预施亚精胺(Spd+para)、百草枯(Para)和ddH₂O(Ck)处理下SOD、POD和CAT活性的抗氧化酶分析，普通水稻为WT(RHY)；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。

图16为转基因水稻KCSox在百草枯加预施亚精胺(Spd+para)、百草枯(Para)和ddH₂O(Ck)处理下SOD、POD和CAT活性的抗氧化酶分析，WT(ZH11)水稻作为对照；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 EiKCS基因的克隆

本发明在对田间杂草进行抗药性检测的过程中，采集并保存了牛筋草的百草枯抗药性种群。其中，百草枯抗性生物型牛筋草(R-NX)采集于广东省广州市番禺区宁西教研农场(东经113°409ˊ，北纬22°809ˊ)，该农场使用百草枯多年。百草枯敏感生物型(S-HN)牛筋草采集于华南农业大学校园(东经113°36ˊ，北纬23°16ˊ)，尚未使用过百草枯。两种不同生物型牛筋草的抗药性测定使用抑制杂草50％生长量所需的百草枯进行计量，结果显示，两者的抗药性倍数相差59.48倍。本发明从上述抗性牛筋草种群的转录组测序结果中获得了显著性差异表达基因(EiKCS)的转录本序列，通过设计特异性引物，从抗性牛筋草植株中扩增得到了该基因的全长序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。序列比对分析结果发现该基因属于3-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，KCS)家族，再结合牛筋草种名(Eleusine indica(L.)Gaertn.)，将此基因命名为EiKCS。EiKCS基因所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增EiKCS基因所用特异性引物的序列如下所示：

EiKCS-F：5’-AATCAGGTCCATCAAGTGTCA-3’

EiKCS-R：5’-GGCGG TGTTATCTTCCCT-3’

以发现的百草枯抗性牛筋草植株的DNA为模板，用引物EiKCS-F/R进行扩增，克隆获得EiKCS基因的全长序列，用于重组表达载体的构建。

实施例2重组超表达载体的构建及转化

将实施例1中获得的EiKCS基因的全长序列插入pCUbi1390(载体示意图如图1所示，其中图1A为pCubi1390载体的示意图，图1B为EiKCS插入位点的示意图)的BamHI和SpeI位点之间构建重组超表达载体并筛选阳性菌落。

使用载体引物pCUbi1390-F/R检测阳性菌落，其扩增范围为从Ubi启动子到Nospoly-A的整个基因序列。使用潮霉素基因引物Hyg-F/R扩增潮霉素抗性基因(hptII)序列(289bp)。并从载体的Nos Poly-A上设计一条反向的测序引物5‘-ATGTATAATTGCGGGACTCT-3’(NosR-Primer)用于测序空载体(包括多克隆位点区)。

载体引物pCUbi1390-F/R的序列如下所示：

pCUbi1390-F：5'-TTTAGCTCATACG-3'

pCUbi1390-R：5'-TTGCGGGACTATCATAA-3'

潮霉素基因引物Hyg-F/R的序列如下所示：

Hyg-F：5'-ACGGTGTCGCATCAGTTGCC-3'

Hyg-R：5'-TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGA-3'

将成功构建的表达载体通过电激法转化农杆菌菌株EHA105。以成功转化的农杆菌EHA105菌株通过侵染愈伤组织分别转化牛筋草和水稻。

实施例3转基因牛筋草的培育

由于牛筋草生物型中，MZ04(GR₅₀ 24.29g a.i.ha^-1)、PY07(GR₅₀ 54.15g a.i.ha^-1)和QY04(GR₅₀ 67.29g a.i.ha^-1)对百草枯危害最为敏感，且其种子储藏量较大。因此，本发明以牛筋草MZ04、PY07和QY04生物型的健康种子为材料进行转基因牛筋草的组织培养。N6、MS和1/2MS培养基均来自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，货号分别为HBZ0601(N6培养基)、HB8469(MS培养基)和HB8469-6(1/2MS培养基)。

本发明通过对培养基的重新配置以及使用材料，侵染过程等的调整，优化了牛筋草的遗传转化与再生体系，使其能成功培养出转基因牛筋草。其中，以N6为诱导、继代和筛选培养基，MS为分化培养基，1/2MS为生根培养基。

牛筋草遗传转化和再生体系中影响因子的优化结果如图2所示。其中，图2A为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤诱导率；图2B为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤长菌率；图2C为培养基干燥处理对胚型愈伤的影响；图2D为不同的百草枯敏感生物型牛筋草种子的愈伤分布频数；图2E为诱导和继代培养过程中MZ04牛筋草种子在添加琼脂或植物凝胶的培养基中胚性(Ⅰ型)愈伤的诱导率；图2F为筛选培养基中不同浓度的特美汀对抑制牛筋草转化体长菌率的影响。

由图2A可知，实验的三种生物型牛筋草种子的诱导率大小关系为MZ04(78.86％)＞PY07(66.67％)＞QY04(53.50％)，表明牛筋草不同种群间的愈伤诱导率差异显著，敏感程度越高的牛筋草种子更易被诱导为愈伤(MZ04是三种中最敏感的)。同时，三种敏感型牛筋草(MZ04、PY07和QY04)的愈伤诱导率的分布也存在差异，诱导35天后，MZ04牛筋草诱导率的频数最高，达到了90％(图2D)。而且，虽然对三种牛筋草的种子进行相同的处理来打破休眠和消毒灭菌，但是对PY07和QY04的杂菌生长率明显，PY07的杂菌污染率达到11.83％，QY04杂菌污染率达到21.89％(图2B)。综上，选择MZ04种子进行后续转基因牛筋草的创建。

此外，为了控制牛筋草遗传转化体系中愈伤的水渍化现象，本发明还测定了7g的琼脂和3g的植物凝胶在诱导培养基和继代培养基的水分控制效果，如图2E所示，结果表明继代培养皿中添加7g琼脂时胚型愈伤(Ⅰ型)的诱导率(71.67％)高于3g的植物凝胶(26.56％)；而诱导培养基中的诱导率差异不大，因此，相比诱导培养基，每升继代培养基中除了2，4-D的浓度减半之外，还将植物凝胶换成琼脂。同时，为了控制继代培养基表面的水分，本发明还对其进行了干燥处理，结果如图2C所示，结果发现干燥3小时有助于Ⅱ型愈伤转变为胚型(Ⅰ型)愈伤，转变率达到93.89％，降低愈伤组织水渍率，并保持100％的胚型(Ⅰ型)愈伤自身的生长。

进一步研究表明，牛筋草阳性愈伤组织的分化是牛筋草再生体系中最为关键的一步。在经过筛选后，全部愈伤组织都会变成褐色。分化培养基中一半以上的牛筋草愈伤组织都会干枯与死亡。有些绿色愈伤组织开始生长白色的农杆菌，部分随着农杆菌的增多会死亡(愈伤变黑)，部分会继续生长出绿色的新芽。为了抑制多余的农杆菌，本发明对菌类抑制剂特美汀的最适浓度进行了测试，结果如图2F所示，特美汀浓度为100mg/L时其长菌率最低，故在筛选，分化，生根的培养基中都添加100mg/L的特美汀溶液。

本发明建立并优化了一套完整的牛筋草遗传转化与再生体系，利用农杆菌介导的遗传转化和再生体系对牛筋草进行抗除草剂的转基因工程研究，过程具体如下：

1、牛筋草遗传转化体系：

4)农杆菌的侵染条件：将携带目标表达载体(pCUbi1309::EiKCS)的农杆菌(EHA105)在含50mg/L利福平、20mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的YEP培养基(100mL)中，培养至OD(600)在0.5～0.6之间。

6)愈伤组织的筛选：A：诱导培养基中含终浓度为15mg/L的潮霉素、200mg/L的羧苄青霉素和100mg/L的特美汀；B：诱导培养基中加潮霉素(15mg)、羧苄青霉素(300mg)和特美汀(100mg)；诱导培养基中7g琼脂改为3g植物凝胶，ddH₂O定容(1L)，pH值调节至6.0；农杆菌侵染后的愈伤组织于培养基A中，在24℃/24h黑暗培养20天后转入B。

牛筋草的遗传转化体系如图3所示，其中图3A为牛筋草种子诱导形成的愈伤组织；图3B为牛筋草的胚性(Ⅰ型)愈伤组织；图3C为牛筋草愈伤组织的继代培养；图3D为愈伤的低温处理(4℃)；图3E为农杆菌的单菌落活化；图3F为愈伤组织感染；图3G为愈伤组织筛选；图3H为转化体的分化。由图3可知，本发明成功构建了牛筋草的遗传转化体系。

2、牛筋草再生体系：

3)炼苗、移栽、PCR鉴定(EiKCS、hptII基因3条特异片段)与繁殖。

牛筋草的再生体系如图4所示，其中图4A为转化体的分化前期；图4B为转化体的分化后期；图4C为转化体的生根诱导前期的丛生叶；图4D为转化体的生根诱导后期的根系生长；图4E为转基因牛筋草的炼苗；图4F为转基因牛筋草的移栽；图4G为转基因牛筋草的单株育种；图5H为各批次转基因牛筋草的温室培养。由图4可知，本发明成功获得了转基因牛筋草的再生体系。

3、转基因牛筋草植株的鉴定

转基因牛筋草植株的鉴定除了使用引物pCubi1390-F/R和Hyg-F/R，另外还设计了另一对特异性引物5'-CCTGCCTTCATACGCTATTT-3'(KCS1-F)和5'-ATCTTGCGCTGAAGTCC-3'(KCS1-R)，用于检测T₂代和T₅代转基因牛筋草中载体上携带的EiKCS基因片段(450bp)，其中含有BamHI酶切位点(Tm 50℃)。

转基因牛筋草植株的鉴定如图5所示，其中图5A分别为T₀代和T₁代牛筋草中EiKCS基因和潮霉素抗性基因的PCR扩增结果；图5B为T₂代牛筋草中EiKCS基因的PCR扩增结果；图5C为T₅代牛筋草中EiKCS基因的PCR扩增结果；图A～C中所示W为野生型牛筋草MZ04，作阴性对照。由图5可知，本发明成功获得了转基因牛筋草。

实施例4转基因牛筋草的百草枯抗性表型鉴定

本发明对T₂～T₅代的转基因牛筋草(超表达EiKCS基因株系)进行了百草枯抗性表型鉴定。转基因牛筋草(T₂～T₄代)的百草枯抗性表型鉴定结果如图6所示。其中，图6A为在营养期和生殖期分别用喷雾塔喷施田间推荐全剂量3750mg/L(2.5pts/a，或20.13mM)的百草枯后，转基因牛筋草(T₂和T₃代)的抗药性表型，以野生型MZ04百草枯敏感生物型牛筋草作为对照，MZ04具有和转基因牛筋草一样的生物学背景(同种群)。图6B为在喷施全剂量和半计量百草枯后，转基因牛筋草(T₄代)的抗药性表型，以相同处理的野生型MZ04牛筋草作为对照。由图6可知，本发明获得的转基因牛筋草植株具有百草枯抗性，其百草枯抗性从T₃代开始稳定遗传，也证明EiKCS基因是百草枯抗性基因之一。

转基因牛筋草T₅代的百草枯抗性表型鉴定结果如图7所示，其中，图7A为喷施田间推荐全剂量的百草枯后，6～9叶期转基因牛筋草和野生型牛筋草(MZ04)的抗药性表型；图7B为喷施270mg/L的百草枯后，敏感生物型牛筋草(JM，GR₅₀ 66.11g a.i.ha^-1)、转基因牛筋草的两个株系和抗性生物型牛筋草(QY05，GR₅₀ 314.43g a.i.ha^-1)的抗性表型。由图7可知本发明提供的转基因牛筋草具有较高的百草枯抗性水平，其抗性水平等同或大于自然筛选条件下进化的百草枯抗性生物型牛筋草的抗药性水平。

实施例5 EiKCS基因及其EiKCS蛋白在转基因牛筋草中的表达量测定

本发明对EiKCS基因及其编码的EiKCS蛋白在转基因牛筋草中的表达量进行了测定。EiKCS基因表达量鉴定所用RT-PCR引物为KCSP-F/R，其序列如下所示：

KCSP-F：5'-CAAGGTGCTCAAGCGGAAA-3'

KCSP-R：5'-GGCTCCATGTGCCAGTCC-3'。

同时使用引物Actin-F(5'-GACGAGTCTGACCCATCCATT-3')和Actin-R(5'-GTTGAAAACTTTGTC CACGCTA-3')检测内源Actin基因的表达量作为内参来标定EiKCS基因的相对表达量。

转基因水稻EiKCS蛋白的鉴定发现其具有四个独特的多肽，根据EiKCS基因编码的蛋白质序列设计并合成了四条EiKCS蛋白质的特异性非同位素标记肽段，进行还原烷基化实验，最后进行PRM分析。其中的两条特异性肽段SGLGEETYLPAAVLR(SEQ ID NO.3)和CFGCVTQEEDGEGR(SEQ ID NO.4)可以用于EiKCS蛋白质含量的特异性定量检测。

T2代转基因牛筋草叶片(Z)和MZ04牛筋草叶片(W)的RT-PCR结果如图8A所示。分别对转基因和野生型牛筋草进行了水、百草枯以及百草枯加预施亚精胺三种处理(W-H₂O、W-P、W-P-S、Z-H₂O、Z-P和Z-P-S)，每种各三个生物学重复，共计18个样品。百草枯加预施亚精胺处理(Para12h+spd)为喷施1.5mM亚精胺12小时后喷施270mg/L百草枯溶液，百草枯处理为喷施270mg/L百草枯溶液，百草枯溶液通过百草枯原液(水剂，产自先正达中国)稀释配置。RT-PCR结果显示，转基因牛筋草超表达了EiKCS基因，比敏感型牛筋草中的表达量提高了2.28倍。百草枯促进了转基因牛筋草中EiKCS基因的超表达，在百草枯(270mg/L)处理条件下，转基因牛筋草比敏感型牛筋草的EiKCS基因表达量提高了15.35倍。在喷施百草枯前12h预施亚精胺(1.5mmol/L)处理条件下，转基因牛筋草比敏感型牛筋草的EiKCS基因表达量提高的倍数降低了，仅提高了1.28倍，表明EiKCS基因的表达可被外源多胺调控，与多胺通路有关。

PRM靶向蛋白技术检测EiKCS蛋白及其相关蛋白的表达量的结果如图8B所示，处理同RT-PCR。转基因牛筋草转录组学与蛋白组学关联分析表明，转基因牛筋草EiKCS蛋白的同源蛋白为EiQ0J9M3，转基因牛筋草的内源多胺合成为鸟氨酸脱羧酶(ODC)途径，EiKCS基因编码EiKCS蛋白参与调控多胺合成通路蛋白的表达来提升百草枯的抗药性，尤其是EiQ9SMB1(亚精胺合成酶Ⅰ)。转基因牛筋草比敏感型牛筋草中EiQ9SMB1蛋白的表达量提高1.20倍，在百草枯处理下提高1.31倍，在预施亚精处理下降0.99倍。牛筋草中EiKCS的CER辅因子为CER26，百草枯胁迫下转基牛筋草相比普通牛筋草的CER26蛋白高表达(5.12倍)。

实施例6转基因水稻的培育及鉴定

本发明以粳稻品种中花11号(ZH11)的成熟种子的胚为外植体进行水稻愈伤组织诱导，培育步骤与实施例3类似。

使用pCUbi1390-F/R和Hyg-F/R引物对转基因水稻KCSox进行鉴定，此外还设计了另一对引物PqE-1-F/R用于扩增EiKCS基因的特异性序列，进一步证实转基因水稻中目的基因的存在。PqE-1-F/R引物的序列如下所示：

PqE-1-F：5'-ATTGCTAACTTGCCAGTTCTCTC-3'

PqE-1-R：5'-ACGACCAGATGCCGATGT-3'

转基因水稻KCSox的鉴定结果如图9所示，其中图9A为EiKCS及其同源蛋白的进化树分析结果，与EiKCS相似性最高的蛋白序列以灰色背景显示。由图9A可知EiKCS(KEGG通路号为EC 2.3.1.199)与水稻中同源的KCS基因(Oryza_sativa_subsp_indica_A2X281)最接近，EiKCS基因的百草枯抗性功能可以实际地应用于大田作物。图9B为转基因水稻KCSox(T₀～T₃代)的PCR扩增产物的电泳图，以潮霉素抗性标记基因(289bp)和pCUbi1309::PqST3载体序列(3413bp)为对照，由图9B可知，EiKCS基因已成功转入水稻中。

用浓度为270mg/L的百草枯溶液喷施转基因水稻KCSox，观察其在喷施百草枯0、12、24、36、48、60、160小时后的抗性表型，结果如图10所示，由图可知，转基因水稻KCSox对百草枯具有明显抗性。由于本实验每个时间点的实验组有9个以上的生物学重复，对照组也至少有3个生物学重复，但由于版面有限，每个时间点仅展示4株，只挑出0，60h两个时间点的来全部展示，见图10的最后两行。通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系，获得了EiKCS基因超表达水稻株系KCSox。称量结果显示，在百草枯(270mg/L)处理下，普通水稻地上部分鲜重降低32.22％，而KCSox水稻地上部分鲜重降低19.57％(P<0.05)，百草枯的抗药性得到了显著的提高。

实施例7转基因水稻的内源多胺鉴定与定量测定

由于测定内源多胺含量需要对水稻中游离的多胺进行苯甲酰化和提取的操作，本发明参照文献(Naka et al.,2010；Takahashi et al.,2018)中使用的HPLC分析法进行了适当的修改。

本发明的方法如下：取0.2g处于6～9叶期的水稻样品在液氮中用研钵研磨成粉末，置于10mL离心管中，加入5％(v/v)冷高氯酸(PCA)1.5mL，冰上放置1h，4℃条件下10000×g离心30min；取上清液，加入1mL NaOH(2mol/L)溶液并摇匀；然后加入10mL苯甲酰氯，涡旋震荡，室温孵育20min；向该样品中添加2mL室温饱和NaCl与2mL乙醚并涡旋使其充分混合，在4℃条件下3000×g下离心10min；取1mL上清液，用过滤膜(孔径0.2mm)过滤，将滤液分置到2mL样品瓶中，有机溶剂相用热空气蒸发，将残渣在1mL甲醇中再悬浮。水稻叶片提取液中内源多胺成分的HPLC-MS/MS检测结果如图11所示，使用多胺(腐胺，亚精胺，精胺)标准品作为内参。其中图11A为HPLC法下测定的多胺(腐胺，亚精胺，精胺)标准品的保留时间，图11B为HPLC-MS/MS法下测定的KCSox水稻叶片中多胺(腐胺，亚精胺，精胺)的保留时间和准确分子质量，多胺标准品在苯甲酰化后为3.112min(腐胺)、3.910min(腐胺)和4.414min(精胺)，各色谱峰之间分离且清晰，KCSox水稻和WT水稻叶片样品中多胺衍生物的保留时间与标准品保持一致，多胺衍生产物的准确质量分别为297.2(Put)、458.2(Spd)和619.3(Spm)。

为了进一步验证该方法，本发明还分析了多胺苯甲酰化衍生物的所有可能分子式，结果如图11C所示，图为衍生化后水稻中多胺(腐胺，亚精胺，精胺)的分子结构。酰胺化反应是一个经典的反应，当酰氯与酰胺发生完全反应时，多胺的每个N位点都有可能结合苯环，多胺衍生物结构有九种可能的分子结构，其中，腐胺有2种，亚精胺有3种，精胺有4种可能的结构。但是，结合HPLC-MS/MS结果单一清晰的质谱峰和明确的分子质量，明确表明多胺标样和水稻样品中多胺衍生产物的分子为C₁₈H₂₀N₂O₂(腐胺)、C₂₈H₃₁N₃O₃(亚精胺)和C₃₈H₄₂N₄O₄(精胺)，即结构为多胺所有的N-位都在苯甲酰化反应发生中结合了苯环。

此外，本发明采用液相色谱-质谱法(HPLC-MS，Uplc1290-6470A QQQ，eclipseplus，2.1×50mm，1.8um，Agilent)对普通水稻和转基因水稻内的酰基化多胺进行了定量分析，处理分为百草枯加预施亚精胺(Spd+para)、百草枯(Para)和ddH₂O(Ck)处理下，WT(RHY)水稻的内源多胺含量。在Spd+para处理下KCSox有4个重复，其他有3个重复。流动相为0.2％甲酸水溶液和乙腈，采用外标法测定了三种多胺苯甲酰氯衍生物的含量，用腐胺、亚精胺和精胺标准品(Sigma-Aldrich，SKU-Pack)分别配制1.5mL(1mmol)的精胺、亚精胺和腐胺溶液，然后配制成2mL乙醚相。取体积为0.5mL的多胺乙醚相，并分配在2mL样品瓶中，乙醚溶液挥发后加入1mL甲醇。基于样品的线性和最佳浓度，使用标准曲线对三种衍生多胺、腐胺(C₁₈H₂₀N₂O₂，297>105)、亚精胺(C₂₈H₃₁N₃O₃，458>162)和精胺(C₃₈H₄₂N₄O₄，619>497)进行定量。多胺的检出限为5ng/mL，定量限为1ng/mL，上机检测。

普通水稻内源多胺的定量分析结果如图12所示；其中图A为腐胺的定量分析结果；图B为亚精胺的定量分析结果；图C为精胺的定量分析结果；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。由图12可知百草枯胁迫和预施亚精胺，对水稻内源多胺含量的影响不大。

转基因水稻KCSox内源多胺的定量分析结果如图13所示，其中图A为腐胺的定量分析结果；图B为亚精胺的定量分析结果；图C为精胺的定量分析结果；不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。由图13可知，超表达EiKCS基因赋予转基因水稻KCSox对百草枯的抗药性，并增加了水稻内源多胺的生物合成，EiKCS基因或EiKCS蛋白的超表达促进了内源腐胺，精胺，尤其是亚精胺的增加。称量结果显示，喷施百草枯前12h预施1.5mmol/L的亚精胺缓解了百草枯对水稻的影响，使水稻鲜重下降最少；相比喷施百草枯后立即施加1.5mmol/L亚精胺，鲜重少下降了22.89％，喷施ddH₂O作对照。定量测定结果显示内源多胺的含量增加，特别是内源精胺含量在普通水稻中小于5μg/mL，而在KCSox水稻中达到30μg/mL(P<0.01)。

实施例8 EiKCS蛋白在转基因水稻中的表达量测定

图14为多胺通路相关蛋白在KCSox水稻中的表达情况。使用检测方法为PRM靶向蛋白技术，同实施例5。转基因水稻KCSox中多胺合成是通过精氨酸脱羧酶(ADC)途径，EiKCS蛋白同样促进多胺合成通路中Q9SMB1(亚精胺合成酶Ⅰ)的表达，以应对百草枯胁迫。水稻中有两个与EiKCS蛋白同源的蛋白(Q2R3A1和Q0J9M3)也在NCBI中被比对出来。本发明还鉴定出同源EiKCS蛋白的三个CERs辅因子Q9FTH0、Q9LGQ6和Q9FTG9。15个靶蛋白水平的变化倍数显示为KCSox和WT中KCSox/WT比率的log2值。其中，第1组为多胺生物合成通路，第2组为多胺降解通路，第3组为TCA和脂肪酸生物合成通路，第4组为脂肪酸伸长通路。由图14可知，百草枯胁迫下转基因水稻(KCSox)相比对照水稻(ZH11)的表达差异倍数分别为Q9FTG9(1.41倍)、Q9LGQ6(1.61倍)和Q9FTH0(1.98倍)。

实施例9转基因水稻的抗氧能力测定

本发明还对普通水稻和转基因水稻样品中的抗氧化酶活性进行了检测，分别检测了百草枯加预施亚精胺(Spd+para)、百草枯(Para)和ddH₂O(Ck)处理下，WT(RHY)水稻的SOD、POD和CAT活性。以与内源多胺检测相同的材料，在液氮中将0.1g的水稻叶粉碎成粉末。SOD、POD和CAT均按照试剂盒的说明书进行测量。

普通水稻的抗氧化酶分析结果如图15所示，图中不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。转基因水稻KCSox的抗氧化酶分析结果如图16所示，图中不同字母表示在P<0.05时有显著性差异，*表示P<0.01时显著差异。上述结果表明KCSox水稻响应百草枯胁迫下抗氧化能力增强，即EiKCS基因能够提高水稻的抗氧化能力抵抗逆境胁迫。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 百草枯抗性基因EiKCS及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1551

<212> DNA

<213> 牛筋草(Eleusine indica (L.) Gaertn.)

<400> 1

atggacaacc ccgcggcgcc gagcaatgcc tcgaccgagc cttccccttc gcggcggctg 60

ccggacttcc agcagtcggt gcgtctcaag tacgtgaagc tggggtacca ctacctcatc 120

acccacggca tgtacctcct cctcaccccg ctgatggtcc tcgtggccgt gcacctctcc 180

acgctctccc cgcacgacgt ggccgacctg tgggcccacc tccggctgaa cctcgtctcc 240

gtggtggcct gctccacgct gctcgtcttc ctcggcaccg cctacctctt cacccgcccg 300

cgcccggtgt acctggtcga cttcgcgtgc tacaagccgg gacccgagcg ccggtgcacg 360

cgcgacacgt tcatgcgctg ctcgcggctg acgggctcct tcaccgacgc gagcctggac 420

tttcagcgca agatcctgga gcggtcgggt ctcggcgagg agacctacct ccccgcggcc 480

gtgctccggg tcccgcccaa cccgtccatg gacgaggccc gcttggaggc gcgcgaggtc 540

atgttcggcg ccgtcgacga ggtgctggcc aagacgggcg tgaagcccaa ggacatcggc 600

atcctggtcg tcaactgcag cctgttcaac ccgacgccgt cgctgtcggc gatgatcgtg 660

aaccactaca agttgcgcgg gaacgtggtg agcttcaacc tgggcgggat ggggtgcagc 720

gcgggattgc tctccgtggc gctggccaag gacctcctcc aggtgtaccc gggttcctac 780

gcgctggtgg tcagcacgga gaacatcacg ctcaactggt actcgggcaa cgaccggtcc 840

aagctcgtgt ccaactgcct gttccggatg ggcggcgccg ccgtgctgct ctcgaaccgg 900

ggcggcgacc ggcgccgggc aaagtacgag ctggtgcacg cggtgcgcac gcacaggggc 960

gccgacgacc ggtgcttcgg atgcgtgacg caggaggagg acggggaagg ccgggtcggc 1020

gtgtcgctgt cgagggacct catggcagtg gcgggggagg cgctcaagac caacatcacc 1080

acgctgggcc cgctcgtgct gccgctgtcg gagcagctgc tgttcgcggc cacgctcttc 1140

gcgcgcaagg tgctcaagcg gaaaggggtc aagccgtaca tacccgactt caagctcgcg 1200

ttcgagcact tctgcatcca cgcgggcggg agggccgtgc tggacgagct ggagagcaac 1260

ctggcgctca cggactggca catggagccg tccaggatga cgctgcaccg gttcgggaac 1320

acgtccagca gctcgctctg gtacgagctc gcctacagcg aggccaaggg caggatcagg 1380

cggcgggaca gggtgtggca gatcgccttc gggtccgggt tcaagtgcaa cagcgccgtg 1440

tggagggcgc tacggtcggt caacccggcg gaggagacca acccgtggat ggacgagatc 1500

gataggttcc ccgtggaagt gcccaaggtt tccaagcttt ccagcgaatg a 1551

<210> 2

<211> 516

<212> PRT

<213> 牛筋草(Eleusine indica (L.) Gaertn.)

<400> 2

Met Asp Asn Pro Ala Ala Pro Ser Asn Ala Ser Thr Glu Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Pro Asp Phe Gln Gln Ser Val Arg Leu Lys Tyr Val

20 25 30

Lys Leu Gly Tyr His Tyr Leu Ile Thr His Gly Met Tyr Leu Leu Leu

35 40 45

Thr Pro Leu Met Val Leu Val Ala Val His Leu Ser Thr Leu Ser Pro

50 55 60

His Asp Val Ala Asp Leu Trp Ala His Leu Arg Leu Asn Leu Val Ser

65 70 75 80

Val Val Ala Cys Ser Thr Leu Leu Val Phe Leu Gly Thr Ala Tyr Leu

85 90 95

Phe Thr Arg Pro Arg Pro Val Tyr Leu Val Asp Phe Ala Cys Tyr Lys

100 105 110

Pro Gly Pro Glu Arg Arg Cys Thr Arg Asp Thr Phe Met Arg Cys Ser

115 120 125

Arg Leu Thr Gly Ser Phe Thr Asp Ala Ser Leu Asp Phe Gln Arg Lys

130 135 140

Ile Leu Glu Arg Ser Gly Leu Gly Glu Glu Thr Tyr Leu Pro Ala Ala

145 150 155 160

Val Leu Arg Val Pro Pro Asn Pro Ser Met Asp Glu Ala Arg Leu Glu

165 170 175

Ala Arg Glu Val Met Phe Gly Ala Val Asp Glu Val Leu Ala Lys Thr

180 185 190

Gly Val Lys Pro Lys Asp Ile Gly Ile Leu Val Val Asn Cys Ser Leu

195 200 205

Phe Asn Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ala Met Ile Val Asn His Tyr Lys

210 215 220

Leu Arg Gly Asn Val Val Ser Phe Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser

225 230 235 240

Ala Gly Leu Leu Ser Val Ala Leu Ala Lys Asp Leu Leu Gln Val Tyr

245 250 255

Pro Gly Ser Tyr Ala Leu Val Val Ser Thr Glu Asn Ile Thr Leu Asn

260 265 270

Trp Tyr Ser Gly Asn Asp Arg Ser Lys Leu Val Ser Asn Cys Leu Phe

275 280 285

Arg Met Gly Gly Ala Ala Val Leu Leu Ser Asn Arg Gly Gly Asp Arg

290 295 300

Arg Arg Ala Lys Tyr Glu Leu Val His Ala Val Arg Thr His Arg Gly

305 310 315 320

Ala Asp Asp Arg Cys Phe Gly Cys Val Thr Gln Glu Glu Asp Gly Glu

325 330 335

Gly Arg Val Gly Val Ser Leu Ser Arg Asp Leu Met Ala Val Ala Gly

340 345 350

Glu Ala Leu Lys Thr Asn Ile Thr Thr Leu Gly Pro Leu Val Leu Pro

355 360 365

Leu Ser Glu Gln Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu Phe Ala Arg Lys Val

370 375 380

Leu Lys Arg Lys Gly Val Lys Pro Tyr Ile Pro Asp Phe Lys Leu Ala

385 390 395 400

Phe Glu His Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Glu

405 410 415

Leu Glu Ser Asn Leu Ala Leu Thr Asp Trp His Met Glu Pro Ser Arg

420 425 430

Met Thr Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Leu Trp Tyr

435 440 445

Glu Leu Ala Tyr Ser Glu Ala Lys Gly Arg Ile Arg Arg Arg Asp Arg

450 455 460

Val Trp Gln Ile Ala Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val

465 470 475 480

Trp Arg Ala Leu Arg Ser Val Asn Pro Ala Glu Glu Thr Asn Pro Trp

485 490 495

Met Asp Glu Ile Asp Arg Phe Pro Val Glu Val Pro Lys Val Ser Lys

500 505 510

Leu Ser Ser Glu

515

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Gly Leu Gly Glu Glu Thr Tyr Leu Pro Ala Ala Val Leu Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Phe Gly Cys Val Thr Gln Glu Glu Asp Gly Glu Gly Arg

1 5 10

Claims

1.一种百草枯抗性基因EiKCS，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.由权利要求1所述抗性基因所编码的蛋白EiKCS，其特征在于，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述百草枯抗性基因EiKCS或权利要求2所述蛋白EiKCS在提高宿主对百草枯抗性中的应用。

4.权利要求1所述百草枯抗性基因EiKCS或权利要求2所述蛋白EiKCS在提高宿主多胺合成中的应用。

5.权利要求1所述百草枯抗性基因EiKCS或权利要求2所述蛋白EiKCS在提高宿主抗氧化能力中的应用。

6.根据权利要求3～5任一所述应用，其特征在于，所述应用为构建EiKCS基因的表达载体并转化到宿主中。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述宿主为植物。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻或牛筋草。

10.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述转化的方法为农杆菌介导的遗传转化与再生体系的构建。