CN109354620A

CN109354620A - 水稻转录因子Os07g05010基因及其应用

Info

Publication number: CN109354620A
Application number: CN201811580529.XA
Authority: CN
Inventors: 林荣呈; 莫伟平; 唐为江
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2038-12-24
Also published as: CN109354620B

Abstract

本发明公开了水稻转录因子Os07g05010基因及其应用。本发明提供了1、如下1)‑3)中任一种物质在如下a‑e中的应用：1)蛋白OS07G05010；2)编码蛋白OS07G05010的DNA分子；3)含有编码蛋白OS07G05010的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；a)调控水稻中胚轴伸长；b)调控植物耐盐性；c)调控水稻出苗；d)调控水稻净光合速率；e)筛选或培育或开发适合盐碱地的直播品种。本发明通过试验证明：Os07g05010基因超表达的植株表现出中胚轴伸长、盐胁迫耐受性增强的表型，说明Os07g05010基因具有调控植物中胚轴伸长以及耐盐的功能。

Description

水稻转录因子Os07g05010基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻转录因子Os07g05010基因及其应用。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物。由于劳动力短缺，水稻直播作为一种简便、高效的栽培方式，在生产中广为使用，但是出苗难是这一播种方式的缺点。出苗难直接影响了直播稻的用种量，提高了生产成本。水稻在出苗过程中需要中胚轴的伸长提供出土的动力，同时还需要响应土壤环境。我国水稻的主产区主要集中在东北地区和长江中下游，而东北地区大部分水稻种植区域属于盐碱地地区，对水稻来说是一种胁迫环境。因此挖掘出既调控水稻中胚轴伸长，又提高水稻对盐胁迫耐受性和光能高效利用的基因，能够为开发适合盐碱地的直播品种提供理论依据。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在如下a-e中至少一种中的应用：

1)蛋白Os07g05010；

2)编码蛋白Os07g05010的DNA分子；

3)含有编码蛋白Os07g05010的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

a)调控植物中胚轴伸长；

b)调控植物地上部分长度；

c)调控植物出苗或出土；

d)调控植物耐盐性；

e)筛选或培育或开发适合盐碱地的直播植物品种。

上述应用中，所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列1第1-1254位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述应用中，所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性；

或所述调控植物耐盐性为在盐胁迫下调控植物地上部分鲜重、根系长度、根系鲜重和/或净光合速率。

上述应用中，所述调控植物中胚轴伸长为促进植物中胚轴伸长；

或所述调控地上部分长度为增加地上部分长度；

或所述调控植物出苗或出土为促进植物出苗或出土；

或所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性；

或所述调控地上部分鲜重为增加地上部分鲜重；

或所述调控根系长度为增加根系长度；

或所述调控根系鲜重为增加根系鲜重；

或所述调控植物净光合速率为提高植物净光合速率。

上述1)-3)中任一种物质在培育水稻中胚轴伸长植物中的应用；

或上述1)-3)中任一种物质在培育水稻净光合速率提高植物中的应用；

或，上述1)-3)中任一种物质在培育耐盐性植物或高耐盐性植物中的应用。

本发明另一个目的是提供一种培育中胚轴长度增长、地上部分长度增长和/或耐盐性提高转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白Os07g05010的含量和/或活性，得到转基因植物，

所述转基因植物的中胚轴长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的地上部分长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

本发明第3个目的是提供一种培育中胚轴长度增长、地上部分长度增长和/或耐盐性提高转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白Os07g05010编码基因的表达量和/或活性，得到转基因植物，

所述转基因植物的中胚轴长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的地上部分长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物体现在如下1)-4)中至少一种：

1)在盐胁迫下所述转基因植物的地上部分鲜重大于所述目的植物；

2)在盐胁迫下所述转基因植物的根系长度大于所述目的植物；

3)在盐胁迫下所述转基因植物的根系鲜重大于所述目的植物；

4)在盐胁迫下所述转基因植物的净光合速率大于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中蛋白Os07g05010的含量和/或活性为将所述编码蛋白Os07g05010的DNA分子导入目的植物；

和/或，所述提高目的植物中蛋白Os07g05010编码基因的表达量和/或活性为将所述编码蛋白Os07g05010的DNA分子导入目的植物；

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明从水稻中克隆到了调控水稻中胚轴伸长、盐胁迫耐受性相关基因Os07g05010，并构建了Os07g05010基因超表达的植株。通过试验证明：Os07g05010基因超表达的植株表现出中胚轴伸长、盐胁迫耐受性增强的表型，说明Os07g05010基因具有调控植物中胚轴伸长以及耐盐的功能。通过超表达该基因可以提高优良品种对直播方式、盐胁迫的受性，从而打破水稻优良品种的地域限制，为提高其他地区优良品种的低光强下的光能利用能力，迅速扩大东北地区和长江中下游地区，尤其是东北地区等水稻主产区的品种资源，培育出更优良、高产的水稻品种提供了基础。

附图说明

图1为Os07g05010过表达水稻在黑暗中生长10天的表型。

图2为Os07g05010过表达水稻在黑暗中生长10天的表型数据统计。

图3为Os07g05010过表达水稻在0.1M NaCl条件下生长10天后的表型。

图4为Os07g05010过表达水稻在0.1M NaCl条件下生长10天后的表型数据统计。

图5为Os07g05010过表达水稻净光合速率以及对NaCl的响应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Os07g05010基因的获得

1、植物cDNA的获得

从中花11水稻叶片中提取RNA，反转录，得到cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用F和R引物进行PCR扩增，得到1254bp的PCR扩增产物。

引物序列如下：

正向引物F:5’-GGATCCGAATTCTCTAGAATGGATGCGGGTGCAAC-3’；

反向引物R:5’-AAGCTTCTCGAGTTTTATGGTCCCATCAGATGAGGATG-3’。

3、Os07g05010基因的获得

对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化后进行测序。

测序结果表明：通过PCR扩增得到大小为1257bp的产物，将其命名为Os07g05010基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，该基因的开放阅读框为序列1第1-1254位；Os07g05010基因编码的Os07g05010蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、过表达Os07g05010基因水稻的获得及耐逆性分析

一、过表达Os07g05010基因水稻的获得

1、过表达Os07g05010基因的重组载体的制备

以中花11水稻幼苗cDNA为模板，利用正向引物F和反向引物R，进行PCR扩增，得到1254bpPCR扩增产物(Os07g05010开放读码框ORF，其核苷酸序列为序列1第1-1254位)。

将上述PCR扩增产物连接到pEASY-Blunt-Simple克隆载体上，得到pEASY-Os07g05010。

用EcoRI/XhoI酶切pEASY-Os07g05010获得1254bp Os07g05010ORF全长，连到EcoRI/SalI酶切的p1302-UBQp-HYN-GFP载体(武汉天问生物科技有限公司)上得到Os07g05010-GFP。

经过测序，过表达Os07g05010基因的重组载体Os07g05010-GFP为将序列表中序列1第1-1254位所示的Os07g05010基因替换p1302-UBQp-HYN-GFP载体中EcoRI和SalI酶切位点间得到的载体。

2、过表达Os07g05010基因的水稻植株

上述1得到的重组载体Os07g05010-GFP电击转入农杆菌EHA105(武汉天问生物科技有限公司)中，得到重组农杆菌EHA105/Os07g05010-GFP。

将重组农杆菌EHA105/Os07g05010-GFP采用常规方法转入经中花11水稻(以下称为野生型水稻)种子诱导得到的愈伤组织(武汉天问生物科技有限公司)中，培养基为常规转化培养基，详细方法如下：

将成熟种子去壳，消毒，接入诱导愈伤组织培养基，黑暗条件诱导30d。再将愈伤组织转入继代培养基，黑暗条件培养20d。用已经在含50mg/L卡那霉素培养基上活化的农杆菌侵染愈伤组织，弃去菌液，转入共培养基培养3d。用灭菌蒸馏水及含有抗生素水溶液清洗愈伤组织，吸干愈伤组织表面水分后，愈伤组织转入含有50mg/L潮霉素筛选培养基筛选。再将具有抗性的愈伤组织转入分化培养基，光照培养40d。分化苗转入生根培养基，光照培养15d，多次繁种得到T4代转Os07g05010纯合水稻。

将空载体p1302-UBQp-HYN-GFP采用同样的方法导入中花11水稻中，得到T4代转空载体纯合水稻，图中以Control标注。

二、过表达Os07g05010基因的水稻植株耐逆性分析

1、促进水稻中胚轴的伸长

将T4代转Os07g05010水稻株系(Os07g05010OE#1、Os07g05010OE#2)和T4代转空载体纯合水稻(Control)的幼苗在正常温度(28℃)和黑暗中浸种催芽3天后，将露白的水稻转移到生根袋(购于北京启维益成科技有限公司)中，利用1/2的木村营养液暗中培养7天后观察表型。以野生型水稻为对照。

上述木村营养液成分如下大量元素(mM)：(NH₄)₂SO₄(0.5)，MgSO₄·7H₂O(0.54)，KNO₃(1)，Ca(NO₃)₂·4H₂O(0.37)，K₂SO₄(0.09)，KH₂PO₄(0.18)，and Na₂SiO₃·9H₂O(1.6)；以及微量元素(μM)：MnCl₂·4H₂O(9.14)，H₃BO₃(46.2)，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(0.08)，ZnSO₄·7H₂O(0.76)，CuSO₄·5H₂O(0.32)，和Fe(II)-EDTA(40)，并将溶液pH调至5.8。

结果如图1所示：在黑暗中正常温度(28/26℃)下T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE)有明显中胚轴伸长的表型，而转空载体纯合水稻(Control)没有观察到中胚轴伸长的表型。

统计各个表型数据，结果如图2所示，T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE)中胚轴和地上部分长度高于转空载体纯合水稻(Control)。

由此可见过表达Os07g05010能够促进水稻中胚轴的伸长，为直播水稻提供更足的出土动力。

T4代转空载体水稻与野生型水稻无显著差异。

2、盐胁迫耐受

将T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE#1、Os07g05010OE#2)和T4代转空载体纯合水稻(Control)的幼苗在催芽后转入含有0.1M NaCl的1/2MS培养基中，在正常光周期(14/10h)进行处理，处理7天后分别观察表型。以野生型水稻为对照。以转入不含NaCl的1/2MS培养基为对照(Mock)。

表型观察如图3；表型具体数据统计如图4所示；可以看出，正常光周期(14/10h)条件下在含有0.1M NaCl的1/2MS生长7天后，T4代转空载体纯合水稻和T4代转Os07g05010水稻地上部生长均受到抑制，但是T4代转Os07g05010水稻地上部仍高于T4代转空载体纯合水稻，表现为对盐胁迫耐受，具体体现在地上部长度、地上部鲜重。对比根系部分，可以看出，T4代转Os07g05010水稻的根系长度和根系鲜重也高于T4代转空载体纯合水稻。

T4代转空载体水稻与野生型水稻无显著差异。

3、水稻的净光合速率

在自然环境中，土壤盐化会影响水稻的整个生长期。将T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE#1、Os07g05010#2)在含有75mM NaCl的土壤中，在生长3个月之后，利用植物二氧化碳固定及环境监测系统(PTM-48A，以色列)测定水稻叶片的净光合速率(Ben-AsherJ,Garcia A G Y,Hoogenboom G.Effect of high temperature on photosynthesis andtranspiration of sweet corn(Zea mays,L.var.rugosa)[J].Photosynthetica,2008,46(4):595-603)。以T4代转空载体水稻(Control)和野生型水稻为对照。以在不含NaCl的土壤中为对照(Mock)。

结果如图5所示，在正常条件下T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE)净光合速率高于T4代转空载体水稻；当长时间生长在盐胁迫环境下，水稻的净光合速率受到了抑制，但是T4代转Os07g05010水稻(Os07g05010OE)仍高于T4代转空载体水稻，表现为对盐胁迫耐受。

T4代转空载体水稻与野生型水稻无显著差异。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>水稻转录因子Os07g05010基因及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1257bp

<212> cDNA

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 1

atggatgcgg gtgcaactgc aaggtcgtcg tcgtcgtcgg cgatgatgat gaaccagaag 60

aagcccttgc tctcggatgg cgagctggtg gagctcctgt ggcaggacgg gggcgtcgtc 120

gcgcacgcgc agacgcgcca ccgatcgtcc gacgtcctcg cccggagcgg cgtcaccggc 180

gaggaggaga cggcgtccgc gtggttcgcg gatggcggtg gcggcggcgg cggcgacgac 240

gacgcgctgg gcctgggcat gggcagggac atctactcgc agctctggca cagcttcgcc 300

aatgtcgacg ggcacgcggc gggcgcgctc gcgctcgcga cgccgacgcc gacgccgcgg 360

gcggcggcga ggagcgacga cgtgtcgagc cgtctcgacg aggccgacct gagcatctgc 420

ggcagcaacg cggtcgtggc gccggcgctg cccgcggacg acgacgacga catcgacgcc 480

gccgcgccgc gcgaggagga ggaggaggag gaggaggggc cgggcgccgc gcgcgccgcc 540

ggcgcgtcgt cgtcgggcgg gtcggggagc gggagcggga gctacccgct gttcaagcgg 600

gggagggagg agctggttga cagccttagc gaggtcgccg acgagacccg gccgtcgaag 660

cggccggcgg cgaagcgccg gactcgcgcc gccgaggtcc acaacctgtc agagcgtaga 720

agaagggata ggatcaatga gaagttgaga gcattgcaag aactggtacc tcattgcaac 780

aagactgaca aagcatccat actagatgaa gcaattgagt acttgaagtc cctgcaaatg 840

caagttcaga tcatgtggat gactaccggg attgtgccga tgatgttccc cggtacccac 900

cagctcatgc caccgatggg catgggattg aacacggcat gcatgcctgg ggctcaagct 960

caaggcctga atcagatgca aagaacaaca tattacatga acaattctct gccaaaccag 1020

atgcctcaga tcccttctcc agctatgaat gcacccagtg ttccagacga tatgcagaat 1080

gataatcgca tccgcgggcc aagaaatcct tttcttcatt gcaatgatac actgacagca 1140

acagctcagg tgccaggttt gtttacctat ggatctcaaa ttgcagaaca aaatgagatt 1200

caggagttac tctctggcgc tgtcattcca tcctcatctg atgggaccat aaaataa 1257

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213>水稻（Oryza Sativa）

<400> 2

Met Asp Ala Gly Ala Thr Ala Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ala Met Met

1 5 10 15

Met Asn Gln Lys Lys Pro Leu Leu Ser Asp Gly Glu Leu Val Glu Leu

20 25 30

Leu Trp Gln Asp Gly Gly Val Val Ala His Ala Gln Thr Arg His Arg

35 40 45

Ser Ser Asp Val Leu Ala Arg Ser Gly Val Thr Gly Glu Glu Glu Thr

50 55 60

Ala Ser Ala Trp Phe Ala Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp

65 70 75 80

Asp Ala Leu Gly Leu Gly Met Gly Arg Asp Ile Tyr Ser Gln Leu Trp

85 90 95

His Ser Phe Ala Asn Val Asp Gly His Ala Ala Gly Ala Leu Ala Leu

100 105 110

Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Arg Ala Ala Ala Arg Ser Asp Asp Val

115 120 125

Ser Ser Arg Leu Asp Glu Ala Asp Leu Ser Ile Cys Gly Ser Asn Ala

130 135 140

Val Val Ala Pro Ala Leu Pro Ala Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asp Ala

145 150 155 160

Ala Ala Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Pro Gly Ala

165 170 175

Ala Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser

180 185 190

Gly Ser Tyr Pro Leu Phe Lys Arg Gly Arg Glu Glu Leu Val Asp Ser

195 200 205

Leu Ser Glu Val Ala Asp Glu Thr Arg Pro Ser Lys Arg Pro Ala Ala

210 215 220

Lys Arg Arg Thr Arg Ala Ala Glu Val His Asn Leu Ser Glu Arg Arg

225 230 235 240

Arg Arg Asp Arg Ile Asn Glu Lys Leu Arg Ala Leu Gln Glu Leu Val

245 250 255

Pro His Cys Asn Lys Thr Asp Lys Ala Ser Ile Leu Asp Glu Ala Ile

260 265 270

Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Met Gln Val Gln Ile Met Trp Met Thr

275 280 285

Thr Gly Ile Val Pro Met Met Phe Pro Gly Thr His Gln Leu Met Pro

290 295 300

Pro Met Gly Met Gly Leu Asn Thr Ala Cys Met Pro Gly Ala Gln Ala

305 310 315 320

Gln Gly Leu Asn Gln Met Gln Arg Thr Thr Tyr Tyr Met Asn Asn Ser

325 330 335

Leu Pro Asn Gln Met Pro Gln Ile Pro Ser Pro Ala Met Asn Ala Pro

340 345 350

Ser Val Pro Asp Asp Met Gln Asn Asp Asn Arg Ile Arg Gly Pro Arg

355 360 365

Asn Pro Phe Leu His Cys Asn Asp Thr Leu Thr Ala Thr Ala Gln Val

370 375 380

Pro Gly Leu Phe Thr Tyr Gly Ser Gln Ile Ala Glu Gln Asn Glu Ile

385 390 395 400

Gln Glu Leu Leu Ser Gly Ala Val Ile Pro Ser Ser Ser Asp Gly Thr

405 410 415

Ile Lys

Claims

1.如下1)-3)中任一种物质在如下a-e中至少一种中的应用：

1)蛋白Os07g05010；

2)编码蛋白Os07g05010的DNA分子；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a)调控植物中胚轴伸长；

b)调控植物地上部分长度；

c)调控植物出苗或出土；

d)调控植物耐盐性；

e)筛选或培育或开发适合盐碱地的直播植物品种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列1第1-1254位所示的DNA分子；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述调控植物中胚轴伸长为促进植物中胚轴伸长；

或所述调控地上部分长度为增加地上部分长度；

或所述调控植物出苗或出土为促进植物出苗或出土；

或所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性；

或所述调控地上部分鲜重为增加地上部分鲜重；

或所述调控根系长度为增加根系长度；

或所述调控根系鲜重为增加根系鲜重；

或所述调控植物净光合速率为提高植物净光合速率。

5.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育水稻中胚轴伸长植物中的应用；

或，权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育高光效植物或水稻净光合速率提高植物中的应用；

或，权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育耐盐性植物或高耐盐性植物中的应用。

6.一种培育中胚轴长度增长、地上部分长度增长和/或耐盐性提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白Os07g05010的含量和/或活性，得到转基因植物，

所述转基因植物的中胚轴长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的地上部分长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

7.一种培育中胚轴长度增长、地上部分长度增长和/或耐盐性提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白Os07g05010编码基因的表达量和/或活性，得到转基因植物，

所述转基因植物的中胚轴长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的地上部分长度大于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物；

所述蛋白Os07g05010为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:

所述转基因植物的耐盐性大于所述目的植物体现在如下1)-4)中至少一种：

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述提高目的植物中蛋白Os07g05010的含量和/或活性为将所述编码蛋白Os07g05010的DNA分子导入目的植物；

和/或，所述提高目的植物中蛋白Os07g05010编码基因的表达量和/或活性为将所述编码蛋白Os07g05010的DNA分子导入目的植物。

10.根据权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。