CN110468150B

CN110468150B - Rgs1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

Info

Publication number: CN110468150B
Application number: CN201910772381.8A
Authority: CN
Inventors: 师恺; 王娇; 马巧梅; 胡璋健; 王萍; 王安然; 李依镁; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN110468150A

Abstract

本发明公开了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄RGS1基因编辑的突变体，发现该突变体不仅能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，而且能够显著减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的发生程度，证明了RGS1基因作为负调控因子在减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病病害发生中的用途，可用于抗寡照环境下细菌性叶斑病品种的选育。

Description

RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用。

背景技术

我国蔬菜播种面积在2000年到2015年经历了一个迅速增长的阶段，近几年依旧有缓慢增长的趋势，但基本保持稳定。目前，蔬菜已成为我国市场化程度最大的经济作物。2018年中国统计年鉴数据显示，在农作物种植结构中蔬菜的种植比例由2000年的9.75％上升到2017年的12.0％，居各类经济作物之首(http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2018/indexch.htm)。其中，番茄因其营养丰富，口感鲜美，广受喜爱。同时，番茄也是设施栽培的主要蔬菜之一。随着大气环境不断变化以及农业种植方式的设施化，雾霾和连续阴雨等不适宜天气状况及设施遮阴等带来的寡照问题日益严重。番茄是喜光植物，当光照强度低于150umol m^-2s^-1时，番茄植株易徒长，开花数减少。尤其在寡照环境下，番茄病害爆发严重，各种细菌性、病毒性以及真菌性病害频繁发生，十分猖獗。寡照和病害的共同危害，加之单一的种植模式，对设施栽培番茄产量及品质造成了极大的威胁。

细菌性叶斑病是其中一种高发病害，由丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000)引发的，是一种革兰氏阴性细菌。这种病菌对番茄的危害主要表现在叶片上，也可发生在叶脉和果实，影响番茄的果实品质和产量。寡照环境下番茄细菌性叶斑病的爆发更为严重，给农户造成了更大的经济损失。

一方面，我国主要使用化学农药防治细菌性叶斑病仍为最常见的手段。虽然化学农药防治具有使用方法简便、效率高、见效快的优点，但是也存在着严重的问题：一、长期使用某一种类的农药会使有害生物产生一定的抗性，防治效果逐渐下降；二、大量的化学农药投入严重破坏了农业生态平衡，一些害虫天敌因为农药影响而数量减少，以及有害生物可能产生一定抗性，很有可能出现有害生物再猖獗的情况；三、农药的使用不仅影响环境生态，残留的化学农药也会引发食品安全问题，对人们的身体健康造成威胁。

另一方面，在寡照环境下，可通过补光的措施来提高光照强度，减轻病害。但补光需要搭建设备，会消耗大量的人力、物力、资金。而且一般更针对设施蔬菜栽培，不适合大范围的露地栽培中寡照问题的解决，譬如露地栽培中遇到连续降雨天气，或是秋冬季普遍光照强度低等，小范围、短时间的补光难以从根本上解决日益严重的寡照问题。

综合上述两方面的考虑，寻找出新的、有效的、生态绿色、经济无害的方法，有效提高番茄应对寡照等不良环境下病害频发的能力，是目前蔬菜生产中亟待解决的难题之一，也是当今蔬菜生产和科研工作中的研究热点。而培育能够增强寡照等环境下对番茄病害抵抗性的抗性品种则是一个很好的解决方法，具有重要的实际生产意义。

近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术得到了迅速的发展，相比于传统育种，该技术能够精准敲除基因组中的任何基因，从而精确的改变农作物性状，快速获得理想种质，大大缩短育种时间。并且利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行育种可以不引入外源基因，规避了颇有争议的转基因技术。利用该技术，可以将一些作物本身负调控病害的基因精准敲除，创建、培育抗性品种。因此，寻找作物内负调控病害的基因就显得尤为重要。

发明内容

本发明提供了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的新用途，为培育提高作物抗性，尤其是减轻寡照环境下细菌性叶斑病发生程度的番茄品种提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的新用途，所述RGS1基因的全基因DNA序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白编码区长度为1434bp；所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。该RGS1基因编码的蛋白调控G蛋白的信号，由477个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO.3所示。

在正常光照环境下，植物通过光合作用形成蔗糖等碳水化合物，经过韧皮部运输至细胞间隙，即质外体区域。在该区域通过蔗糖酶分解成葡萄糖和果糖。细胞膜上的RGS1基因可以感知质外体葡萄糖，发生胞吞(endocytosis)，使得RGS1蛋白与G蛋白α亚基GPA1互作减弱，引起下游G蛋白的激活，从而增强植物对细菌性叶斑病的抗性。

而经试验发现，在寡照环境下，外界光强减弱，植物的光合作用减弱，导致番茄质外体葡萄糖含量显著减少；RGS1基因编码的RGS1蛋白通过感知质外体葡萄糖信号发生胞吞的程度减少，细胞膜上的RGS1蛋白依然与G蛋白α亚基GPA1互作，导致不能激活下游的G蛋白信号途径介导的抗病反应过程。本发明建立在上述试验现象的基础上，采用基因编辑技术使RGS1基因突变，引发G蛋白处于激活状态，进而增强植物对细菌性叶斑病的抗性。

本发明首先对番茄RGS1(基因编号：Solyc05g014160，PGSB网站http://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/)进行序列分析，查找PAM序列，将NGG前的20个bp的序列定义为sgRNA，选择定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgRNA序列，该特异性靶向RGS1基因蛋白编码区的sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明通过基因编辑技术和组培技术，构建了RGS1基因CRISPR/Cas9载体，并筛选获得了遗传稳定并且不含外源Cas9蛋白的纯合突变体株系rgs1#1。通过在正常光和寡照环境下接种番茄细菌性叶斑病病原菌，统计发病率，发现rgs1#1植株能够显著减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病病害的发生程度。

进一步地，所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述光照强度＜150umol m^-2s^-1，即光照强度＞0umol m^-2s^-1且＜150umol m^-2s^-1。

此外，本发明还通过液相HPLC的方法，发现将番茄植株置于寡照环境6小时后，番茄叶片质外体葡萄糖含量显著降低；并通过构建35S:RGS1-GFP的农杆菌载体，利用该载体的农杆菌菌液注射烟草后，提取原生质体观察其亚细胞定位，发现RGS1基因定位于细胞膜上(图4a)。

本发明还提供了一种减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，包括：

(1)培育寡照环境下抗番茄细菌性叶斑病的番茄突变体；

(1-a)在番茄RGS1基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以其前20个碱基为依据，设计相应引物，构建CRISPR/Cas9载体；

(1-b)构建含步骤(1-a)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(1-c)用步骤(1-b)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得遗传稳定并且不含外源Cas9蛋白的突变体；

(2)用步骤(1)所述的番茄突变体替换寡照环境下种植的野生型番茄，所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述光照强度＜150umol m^-2s^-1。进一步地，步骤(1-a)中，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄RGS1基因编辑突变体，发现该突变体能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，而且能够显著减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病病害的发生程度，证明了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性的用途，可用于抗细菌性叶斑病番茄品种的选育。

附图说明

图1为实施例2中获得的T1代突变体植株的基因编辑位点；

与未经过基因编辑的普通番茄相比，基因编辑突变体在sgRNA的位置发生碱基缺失。以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照，rgs1#1比对照少一个碱基。

图2为实施例3中对照和RGS1基因突变型番茄在正常光环境和寡照环境下接种细菌性叶斑病病原菌后的病级指数柱形图；

其中，发病越严重，病级指数越高；对照植株在寡照环境下的病级指数显著高于其在正常光下的；对照植株的病级指数均显著高于突变材料的病级指数；突变材料在寡照环境下的病级指数与其正常光下的病级指数没有显著差异，略微升高；小写字母a、b、c代表不同植株之间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例4中寡照环境处理6h后番茄叶片质外体葡萄糖相对含量的测定；小写字母a、b代表不同处理之间在5％水平上的差异显著。

图4为实施例5中外源处理不同浓度的葡萄糖后番茄RGS1蛋白的胞吞情况；

其中，图4中所有荧光观察结果均用烟草原生质体体系。图4a代表未做任何处理下，RGS1-GFP融合蛋白的亚细胞定位图，位于细胞膜上。图4b代表不同浓度的葡萄糖处理30min后，RGS1-GFP绿色荧光蛋白被胞吞的情况，葡萄糖处理的浓度越高，胞吞的越多。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人所熟知，所用原料、试剂盒均为市售商品。

下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种CR(Condine Red)，以未经过基因编辑的普通番茄作为对照。

实施例1含特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建

在PGSB网站http://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/上找到RGS1(Solyc05g014160)的DNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR网站，找出onscore得分高，且GC含量>40％，位于蛋白编码区的一段PAM结构前的20bp碱基序列TCAGAAAGAGACATTGGTGG(SEQ IDNO.4)。

设计CRISPR引物，如下所示：

CRISPR前引物(SEQ ID NO.5):GATTGTCAGAAAGAGACATTGGTGG；

CRISPR后引物(SEQ ID NO.6):AAACCCACCAATGTCTCTTTCTGAC；

取上述CRISPR的前后引物各5μl，混匀后用PCR仪进行退火使其形成双链。中间载体pMD18-T经BbsI单酶切，用普通DNA纯化试剂盒纯化后与载体用T4连接酶连接，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氨苄青霉素。

板上长出部分一定大小的菌落后可挑单克隆菌落，用CRISPR前引物(SEQ IDNO.5)：GATTGTCAGAAAGAGACATTGGTGG和载体后引物(SEQ ID NO.7)：CTACTTATCGTCATCGTCTTTG，进行PCR验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含sgRNA序列，则可从菌液中提取质粒，在Hind III与Kpn I位点对质粒进行双酶切后，可连接至终载体pCAMBIA1301上。再次测序结果显示终载体包含sgRNA，可将所得最终质粒电击入GV3101农杆菌感受态，在28℃恒温条件中培养两天后，挑单克隆菌落进行PCR验证，获得可用于构建其CRISPR/Cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。

实施例2 RGS1基因突变体材料制备与鉴定

将消毒后的种子播种到培养基中，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，子叶长成完整植株，获得T₀代基因编辑番茄材料。

T₀代基因编辑番茄苗检测。利用CTAB法提取T₀代植株的基因组DNA并以其为模板，在包含sgRNA的DNA序列前后约200bp处设计如下引物，进行PCR扩增测序验证：

验证前引物(SEQ ID No.8):TTTTAAGTGCATCGGTGAC

验证前引物(SEQ ID No.9):GACTGGAAAGCAAGGAGG

所得PCR产物送测序公司测序。使用DNAMAN软件将测序结果与该段基因原序列进行比对，sgRNA序列发生碱基缺失、插入，且测序显示单峰的植株即为所需纯合材料，可进行自交繁种，获得T₀代的种子。

上述T₀代种子播种后放置于生长室中，获得T₁代植株。利用上述同样方法检测T₁代植株的sgRNA序列碱基编辑情况。同时，利用CRISPR前引物(SEQ ID NO.5)和载体后引物(SEQ ID NO.7)对T₁代植株进行PCR扩增DNA，检测扩增产物中是否含有Cas9序列。选取检测结果表明，存在sgRNA变异，且不含Cas9的植株，确定为T₁代基因编辑植株的株系，命名为rgs1#1，其基因编辑位点如图1所示。

rgs1#1比对照植株少一个碱基，让该株系自交繁种，获得T₁代种子，播种后获得sgRNA发生变异、不含外源基因Cas9并能稳定遗传的T₂代植株。

以下实施例均以上述纯合株系T₂代植株作为材料进行实验。

实施例3 RGS1基因编辑突变体在正常光和寡照环境下的抗病性研究

将细菌性叶斑病病原菌菌种接种到含25mg/L利福平的固体培养基King’s B上，于28℃培养箱中培养2天，使菌活化，作为原板。从原板挑取菌落在新的King’s B培养基上划板，于28℃培养箱中培养1天。用10mM MgCl₂溶液将菌液悬浮，调节OD₆₀₀＝0.1。加入0.02％的有机硅，喷施在番茄植株叶片背面，让细菌菌液浸润叶片。将植株置于温度25℃，空气相对湿度95％、光照和黑暗时间各12小时，光强450umol m^-2s^-1(正常光)和光强50umol m^-2s^-1(寡照)的环境下培养3天后，观察植株发病情况。

根据叶片发病情况统计病级指数，得到如图2所示结果，对照植株在寡照环境下病级指数明显高于正常光环境；而突变体植株在寡照环境下和正常光下病级指数变化不明显；并且突变体植株在寡照环境下相比正常光下病级指数略高。

病级指数的统计方式为：将发病的番茄叶片进行分级，分级标准为：0级表示未发病，1级表示叶片下表皮可见少数病斑，2级表示叶片下表皮局部密集病斑，3级表示叶片下表皮多部位密集病斑，4级表示叶片下表皮全叶可见病斑分布。0-4级别分别赋值0-4分。根据每个植株每个叶片的发病情况按分级进行分类，加权平均，求得每株病级指数。

由图2可知，RGS1突变体能够显著减轻在寡照环境下细菌性叶斑病的发生。

实施例4寡照环境处理6h后质外体葡萄糖含量的测定

将长势一致的普通番茄植株放在光强450umol m^-2s^-1(正常光)和光强50umol m^- ²s^-1(寡照)的环境下，于处理6h后，提取3g番茄叶片中的质外体液体。并通过HPLC液相色谱的方法，测定其质外体液体中葡萄糖的相对含量。

由图3可知，寡照环境下处理6h后，相比正常光下，其质外体葡萄糖的相对含量显著降低。说明寡照环境下番茄植株叶片质外体的葡萄糖相对含量降低。

实施例5外源处理不同浓度的葡萄糖后番茄RGS1蛋白的胞吞研究

首先，以对照番茄cDNA为模板，扩增RGS1蛋白编码区片段(SEQ ID NO.2)并重组至pAC402-GFP载体，将重组载体电击进GV3101农杆菌感受态里，获得可用于转化侵染的农杆菌菌株。然后，将该农杆菌菌株注射烟草，2d后提原生质体观察RGS1基因的亚细胞定位。

由图4a可知，RGS1基因定位于细胞膜上。

此外，在上述提取完备的原生质体悬浮液中加入葡萄糖溶液，使其葡萄糖终浓度分别为6％、3％、1％，处理30min后，于40倍水镜下观察其亚细胞定位情况。

如图4b所示，当处理葡萄糖后，发现RGS1-GFP融合蛋白的绿色荧光往细胞质内移动，即RGS1蛋白感知葡萄糖发生胞吞现象。并且，随着外源葡萄糖处理的浓度增加，其绿色荧光往细胞质内移动的越多，即胞吞作用增强。

由图4可知，葡萄糖处理可以导致RGS1蛋白的胞吞，且该胞吞作用具有浓度效应，葡萄糖浓度越低，胞吞越不明显。即质外体葡萄糖含量越少，细胞膜上的RGS1蛋白胞吞越少，下游G蛋白信号的激活越弱。

序列表

<110> 浙江大学

<120> RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 1

atggatcacc agaccactct tccgaagctc ttatacatac tgcggcagaa acgacttcta 60

ttgaaagcga cattacctta catgattcac aagattccta ggtccaaagg cagtagcttt 120

tggctagtgg caattcaagt tattgcaagc ttaaatctat tgttgtcgat agtgatggct 180

ctcaattttc tgaagttcag aaagagacat tggtggaggt catgctatct ttgggcagtc 240

tggattgaag gtccactggg atttggtttg ctgttgagct gccgtattac acagatattc 300

caactttatt atatatttgt gaagagacgt ctgccaccac ttagatccta tatttttctt 360

ctgctgattc tcttgccatg gatagctctt gctgcagtta ttcagataaa aaagcctctg 420

aacgaccggt gccacatggg gacgctgtgg atcatcattg ttatgggcct tcatgcatta 480

tatgttgtag ctttgattgc ttttgctggg gctgtgcatc atgtggaatt cagatttcat 540

gaactcaaag acctttggag aggaattctt gtctcttcag cttccattgg aatatgggtg 600

gctgcttatg taatgaatga ggttcgcgaa gatatatcat cgctagaaat tgcctcaaga 660

ttcttattat tggttatgac aagtgtcctt gtactggcat tcttctcttt ctcgatttct 720

caacctcttg tctcagttat gagcttgagg aagaagaatc agaaagaata caagacaatg 780

agtcaggcat taggtatacc tgatagtggg atcctattac agagggaatc gacaagcatt 840

ctagatccta atgaaccttt ggaaaagctc ctgctgaatc gaaggttccg tcagtccttc 900

atggaatttg cagacagttg tctggctgga gagagtgtgc acttctatga tgaagtgcaa 960

cattttgata aaattcctat tcaggattca gttaggagaa tttacatggc acgccacata 1020

atagagaagt atattgctgc aggagcacca atggaggtga acatttctca ccgaatccgg 1080

caggaaattt tgaatactaa tgatctctcc cacactgacc tattcaaaaa cgctctaggt 1140

gaactgatgc agctgatgaa actgaactta gcaagagatt actggtcgtc aatgtacttc 1200

atgaagctgc aagaggatat ccgcatgaga gcagttgatc cggagatgga acatgctagt 1260

ggttggaatt tttccccaag attgagttct gtccattgca gtgatgaccc tttccagaat 1320

gaacatacag aactgatggg ctccagctac ctgattctcc tgttcataaa cgatacgagc 1380

cttcaagacc aaattttgct gtgtgatgtt gcacctcatg ctttgcagac ctga 1434

<210> 2

<211> 477

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 2

Met Asp His Gln Thr Thr Leu Pro Lys Leu Leu Tyr Ile Leu Arg Gln

1 5 10 15

Lys Arg Leu Leu Leu Lys Ala Thr Leu Pro Tyr Met Ile His Lys Ile

20 25 30

Pro Arg Ser Lys Gly Ser Ser Phe Trp Leu Val Ala Ile Gln Val Ile

35 40 45

Ala Ser Leu Asn Leu Leu Leu Ser Ile Val Met Ala Leu Asn Phe Leu

50 55 60

Lys Phe Arg Lys Arg His Trp Trp Arg Ser Cys Tyr Leu Trp Ala Val

65 70 75 80

Trp Ile Glu Gly Pro Leu Gly Phe Gly Leu Leu Leu Ser Cys Arg Ile

85 90 95

Thr Gln Ile Phe Gln Leu Tyr Tyr Ile Phe Val Lys Arg Arg Leu Pro

100 105 110

Pro Leu Arg Ser Tyr Ile Phe Leu Leu Leu Ile Leu Leu Pro Trp Ile

115 120 125

Ala Leu Ala Ala Val Ile Gln Ile Lys Lys Pro Leu Asn Asp Arg Cys

130 135 140

His Met Gly Thr Leu Trp Ile Ile Ile Val Met Gly Leu His Ala Leu

145 150 155 160

Tyr Val Val Ala Leu Ile Ala Phe Ala Gly Ala Val His His Val Glu

165 170 175

Phe Arg Phe His Glu Leu Lys Asp Leu Trp Arg Gly Ile Leu Val Ser

180 185 190

Ser Ala Ser Ile Gly Ile Trp Val Ala Ala Tyr Val Met Asn Glu Val

195 200 205

Arg Glu Asp Ile Ser Ser Leu Glu Ile Ala Ser Arg Phe Leu Leu Leu

210 215 220

Val Met Thr Ser Val Leu Val Leu Ala Phe Phe Ser Phe Ser Ile Ser

225 230 235 240

Gln Pro Leu Val Ser Val Met Ser Leu Arg Lys Lys Asn Gln Lys Glu

245 250 255

Tyr Lys Thr Met Ser Gln Ala Leu Gly Ile Pro Asp Ser Gly Ile Leu

260 265 270

Leu Gln Arg Glu Ser Thr Ser Ile Leu Asp Pro Asn Glu Pro Leu Glu

275 280 285

Lys Leu Leu Leu Asn Arg Arg Phe Arg Gln Ser Phe Met Glu Phe Ala

290 295 300

Asp Ser Cys Leu Ala Gly Glu Ser Val His Phe Tyr Asp Glu Val Gln

305 310 315 320

His Phe Asp Lys Ile Pro Ile Gln Asp Ser Val Arg Arg Ile Tyr Met

325 330 335

Ala Arg His Ile Ile Glu Lys Tyr Ile Ala Ala Gly Ala Pro Met Glu

340 345 350

Val Asn Ile Ser His Arg Ile Arg Gln Glu Ile Leu Asn Thr Asn Asp

355 360 365

Leu Ser His Thr Asp Leu Phe Lys Asn Ala Leu Gly Glu Leu Met Gln

370 375 380

Leu Met Lys Leu Asn Leu Ala Arg Asp Tyr Trp Ser Ser Met Tyr Phe

385 390 395 400

Met Lys Leu Gln Glu Asp Ile Arg Met Arg Ala Val Asp Pro Glu Met

405 410 415

Glu His Ala Ser Gly Trp Asn Phe Ser Pro Arg Leu Ser Ser Val His

420 425 430

Cys Ser Asp Asp Pro Phe Gln Asn Glu His Thr Glu Leu Met Gly Ser

435 440 445

Ser Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Ile Asn Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gln

450 455 460

Ile Leu Leu Cys Asp Val Ala Pro His Ala Leu Gln Thr

465 470 475

<210> 3

<211> 10426

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 3

atggatcacc agaccactct tccgaagctc ttatacatac tgcggcagaa acggtaagaa 60

tggtgtcgcc ggcgatggtc gtgctaataa tggaagaatt ggttttgggt tccaatttga 120

tggatatgct gttggttata attgggtcgg gtgttttaat gtgggtgatg ggtgggtttt 180

ttaattaaag gtaaaatact aatattaaat taaattcaga aaattatttg gatggagaca 240

cgtgtccctc cgttagtcca aagggtaaat acgttctaaa atttagacgg taaggatatc 300

actgtcctaa aagtataacg atgggtattt agataccatt tataatagtt cggggatata 360

tttgttcttt ttccctttta taaaaacatg tgtgccacaa taatgtgatg ctcacagaat 420

gtttgacgcc ttgtctttta ttttatgaag taaagccact ttaatttttc ttgtgctgga 480

gctttttatg attaattttt tcaataattg tttaaagttg cattattttg tatatccatt 540

caatgcttga acttttattt ccatttaagt tacctaagtg ttggtattga ccacttgagt 600

ttcctctgca gacttctatt gaaagcgaca ttaccttaca tgattcacaa gattcctagg 660

tccaaaggca gtagcttttg gctagtggca attcaagtta ttgcaagctt aaatctattg 720

ttgtcgatag tggtatctac ttttcatttc ctttatatgg tgttaatgct tcaaactctg 780

atttaacatt tcaaatcact aatgcgacta tattttaatt tccatataaa attcattagg 840

gcggatgtag ttaacaagca acaggttcat ccgaatccat ccaatgattt taatagattt 900

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata taaacatata 960

tacatatata cacatatata catatatata catatataca tatatatgta gaatcaccaa 1020

atttcaataa atactacatt tgaaaccaga atttttaagt gcatcggtga caaaaatata 1080

gcgattcaac ccataaagtt taatcctaga tctgcctctg atattcatat ggcttctgca 1140

gatggctctc aattttctga agttcagaaa gagacattgg tggaggtcat gctatctttg 1200

ggcaggtaat ttactcttca atccatgaac gcatatgatt ttgttttcat atttcttgcc 1260

ttaatctggt gcttgattgg ttattctgta atacatctaa tcctccttgc tttccagtct 1320

ggattgaagg tccactggga tttggtttgc tgttgagctg ccgtattaca cagatattcc 1380

aactttatta tatatttgtg aagtaagttt gacttttcaa agcaattaat gataactgtt 1440

gttctttgta attgatgaga tgattatgta tcttggcctc atcaatattc aattgagaaa 1500

ctgttaaatg gtgcagcttc ctcaacaagt ctttttcctg gaagaaaata aacaaataga 1560

aataactgca tgtctcctga ggaaaatagg ataatggact atcacatatg taattccggt 1620

ttcacagaaa tgaaaagaag attgattacc tgcagatatt aaaggttgct caaaaatagt 1680

acaccacccc tgagataaag tgatgttata ttcctgttgg catgcccttc ctaaagatat 1740

gtcacaactg aattaaaatg aaacagaatt catctattat gtcttttcta tacttttttt 1800

ccttttcttc cttgtctctc tctctctctc tcatttactc ttttgtcgtt tgaaaaattt 1860

gagatatagc tttaaaagac tatttcttag tgctattgtt gattcatgtt acgtggaaaa 1920

actctttttc gatagtctta tatttctttg ttttgtatgg tgcttcagga gacgtctgcc 1980

accacttaga tcctatattt ttcttctgct gattctcttg ccatggatag ctcttgctgc 2040

aggtaagatt cttcaagttg aactctataa ataagtcttc ttttaagttt cttctattga 2100

aatactaaaa tatatattag tagatgaggg acttagggag ctggtggtgg aggttaggat 2160

gatgaaagac agggtattga cggtcaagct agtcaccgga gggcttactt taaacatgat 2220

tagtgcttac ggcggcaagt gggcttggag gagaagatca agaagtgctt ctgggaggat 2280

ttggatgagg tgttgaggga tatgccacat ttcaaaaagc tattcactgg cagagatttc 2340

aatggtcata ttgggtcaat cactagtggt tttgacagcg gggatggagg ttttggtttt 2400

gggcttagga aaggaggagg agcatcactt cgggattttg ctaaagctta agagttggcg 2460

ataaaaaatt catgcttccc aaaaaaggag gaccacatgg ccttggagat gggagagaag 2520

ttagagtcga tggaggcttg gggaagtagt ggagatgcaa ataacatgtg ggataagata 2580

gctagttgcg ttaggaaagt agtcagagag gtgttaggtt ttttcaggga ctatttttgc 2640

ggccatcaaa gggattggtg gtgaaatgga gatgtacaag gtatcatgaa aagcaaaaaa 2700

gttgctatgc taagttagtg ttgagaaaag atgaggtgga gaggcggaaa aacacgataa 2760

ggtataaggt gatgagaaag gacacgaagt agcatgggac cccagcctta gtgctgagat 2820

ttatacaaaa ccttgttacc tttgtcaaaa aaggaaagga cacgaagtag cagtcataac 2880

ggcaaaaacg acaactttca aacgcttgtt tgtcgatcta ggggacaaag aagaggataa 2940

gaagttgtac aggctcgcca aggcgagaga aaggaatcct cgggacttgg atcaagtgaa 3000

gtacatcaaa gatgaggacg gtaaagtact agtggaagag gcccacatta gacgaagagg 3060

gaaagcatac tttcataaac tcttgaacaa agaaagggtc acaaacattg tgttgggtgt 3120

tatagagaac tcggagagcg agattttgat tacggttggt gttttaaggt tgaagaggtt 3180

aagggtgcta tgtgtaagat gagtcagggt agagtcacta aactagatga attccggtag 3240

agttccaaaa aagcacaaaa agggcgggtt tagcgtggtt gcctaggttg tttaatgtca 3300

tttttaagac ctcaaaaaaa atattagtgt cccccttttt ttttaacgaa tgagcctctt 3360

ttacccattt aactacctac ttttatatgg gtaaaatgag tttgactcat tttttaccca 3420

ttttaaatga gttggatgcc aacatttaag ttgggtaatt tgaatgggta cccatataaa 3480

ttacttattc tgccacctct aaattatggg aggtgactca gagcacttac cagtcgagat 3540

ggggtcgcac caaggatctg cattgcacct gtttctattt gtcttggtga tggataagtt 3600

gatacggcat attctgcatg aggtgtcttg gtgtttgtta tttgtaaatg acattgtttt 3660

aattgaggag actcaggcgg agttaacgat tgattggagg tgttgagaca aatttgacaa 3720

tctaaatggt tcaagttgag ttggaccaag acagaagata tttgcctatt tggagtgtaa 3780

attcagtgat gtgacatagg caggggctga tccaaggttt aaaggctatg ggtgtcgtat 3840

cgccttttaa ataaacgtgt ttattaaatc aattaaatat ttaacctttt tcttaccttg 3900

taaataacct cagacttcag ttcgattatt cgacttttga gttttggaca aattaaatga 3960

attaaaaaaa agataatgac aacttggcgc aaaggaaaaa ttttccaata atatccttta 4020

taattacacc cgctgatcat attctaaata cacttaatga tggcataatt atttatgttt 4080

attaatactt cacgctctat gtaacatgct taataaaaag tggctaaatt tttttcatat 4140

acataatttt agtaacagaa acgaagtctt atgtacttta ttttgtttac attctcgata 4200

agatttaaat tatcataatc taaactattt ctttttatac attgaaatgt tttaataata 4260

gaacaaagag taagaaaaac tcggcgtcat gttttcagaa ttttgaccaa aagagaagat 4320

aattttggag gagaaggttt taagcaaaca ttaatcattt gtttgactat aaattatctc 4380

attaagggcc aaacaaacta aaattgtttc taatatacaa aagtagcatt cttttgtgga 4440

attgtggtag tctaaaaaag aaagtgtatc acgtgaattg agatgaagga aaaaaaagtt 4500

aacaaaataa aaattaaaaa gttttacaac atgttagcat atgtacatta tataatatag 4560

taaagtacat aaatatcatg tagtggccat ggcttaatgg ataaggtgat tcttaattgc 4620

agtgatatat gttggtttga aacatatcgg gaatcgtttt tgcaaaataa aattgttgca 4680

taaatggata actcaaagtg cacctatgcg gaattgaact cgcgtctttg acgacaacaa 4740

gttgacttgc caccagtgac aacatacgcc ccatttgtgc tgtgggtggc aagtttaata 4800

tttatataat ataatgtaca tatatacatg tcttacagaa tatcaatgga gatcattggg 4860

tgttgtggca cccccacggc tatgaataga tccgcccctg gtcgtaggag ccaagcatgg 4920

aaatgagact tgatactcaa gttatcccta agagcgagat ggagatattt aagtatctag 4980

ggtttttgct ccaaggaaat ggggagatca atgataatgt ctcaccgtat tggtgcggca 5040

tagatgaagt ggaggcttgc atctagtgtc ttgtgtgaca agaaggtacc accctaaatt 5100

aaaggtaagt tttatatagt ggtgtttaga ccgactttgg tgcatggggc gatgtgttgt 5160

ctagtcaaga actgccaggt tcagaagaag caagtggcag aaatgaggat attgagatgg 5220

atgtgcgggc atataggagc aatcatatta ggaatgagga tatctgacac gaagtggaag 5280

tggcttcttg gtggacaaga tgtggtggac aagatgaggg aagggagatt gagatatttt 5340

ggacacatga agaggagagg tgcggatgcc acaaaaagga ggtgtgagag gttggatata 5400

ggggttgagg agaggcagag gtaggccgaa gaagttttgt gaagaggtga ttagccaaga 5460

tatgccacat ttttagcgta ttgaggacat gaccttagat aggagggtac acgaataagg 5520

tagaagatta gtaggtgctg agagttgtct tattacttac ctattcatgt ctttggatgg 5580

gtgggagtat agagcgtcat gtgggttgta gtattagcat acacatttag tctttagctt 5640

ttagtatctg attttatttg tggtttactg tgtttaggtg accgcacttt gctgctgctg 5700

ttacaattta cttgcatatc tgctaagcac tgctttgtta ttagctgtca tgtttttctt 5760

ttaattactg ttttgatttg ttggaaccga gagtgggtct gcgtacacta ccctaggttg 5820

ttactgttta cttagtagtt gctttcactg ggtatgttgt tgttgttgtg gaagtatgac 5880

ttgtcttttg cctacacttt tgcagttaag ctactttatg cattttaatt ttgtgtttta 5940

gtatttggta agtttatctt tcagttgagt ctgccaaaac tttgtgcaag tgtgtgaaca 6000

agtatttttt tactttcatt accatgtgac aatttgttga ttttagctca gtcaaattga 6060

ttttgataat cggcattaaa aattgctgaa aaattgcaaa aagtttgatt ttcaacactt 6120

atgtgattag tgtattctgc tcttttcata ttgtcacttc ggcacatgaa ttatctgtca 6180

tccctgatat taatattata agcttcattt gctaaagttg tttatgtaag aaaggatttt 6240

tgatattaat acggagtttg tctgatgaag ttattcagat aaaaaagcct ctgaacgacc 6300

ggtgccacat ggggacgctg tggatcatca ttgttatggg ccttcatgca ttatatgttg 6360

tagctttgat tgcttttgct ggggctgtgc atcatgtgga attcagattt catgaactca 6420

aagacctttg gagaggaatt cttgtctctt cagcttccat tggtttgttt ctatccattt 6480

tcttcgtttg gtttctttcc tggcatgctt ctgtgtcttc ctgtgtgtgc tttggtaggg 6540

gaatgacata ttaaggaatg aagtcagaaa gacatattta gtcttgatta acacttcctc 6600

aatattgttg tccaagcatc taaaggtatt cttacacata ccagaagcac gagcattata 6660

ctgaaatact gtcaaggaaa attcaatgga ggaaagtaac tagcttcagt gtaatggtca 6720

aagtggctga ctttcagatc taatagttga atttgacctt catgactgag acaccaattt 6780

aaaatacttc tcatgcattc ccctcaagtt ggataacatg catatcaaat cgcttacaga 6840

taaaattctt atcttaaatc tcagaaataa attgttatta attgcagctt gatatacagg 6900

gtttagataa tcacagataa caaaggcttc tagtatagga tctgtctata aagtataaac 6960

agtgagacat tttatacccc caatttaata caaaggaaag ttcaggaact acttggttaa 7020

acacaccaca ttatgtagat gtgagaactc aaatcaaagt ttttgatgga aattttaggt 7080

catgtaaatt gtgttgtagc cctggacaca agagtcttag cttggttcta ggaaagcatg 7140

ttatttattg ctttagcaag acttcgtttc ctcctagaga aaatttatac tcccttcact 7200

gtcacattta gcttcctgag aatcaaatag tgtgatattt gaccaagtct tttttgatat 7260

attttcattt ttgtaaggta taattttgaa tgtctaaatt ttaatctaag aaatgaaaat 7320

tctttatcca attatcaata gaattgatca aattgaccat aagcaaaact gtcaaccaaa 7380

ttgtatggga aactggggat gtatagagaa gtttttttcc tatgacttga gattcttgct 7440

gacagaaatg tatacactct tcattctatg tgaccagttg cttttgacac acccaaatgt 7500

gacgacaaaa cttttaaact gtgtattaga cacagttgag gaaaggtttg gtgtttcaaa 7560

gtttctttcg tgaagttagg gtgtgaaagg gatacagtga catgttttgg gggtgggtgg 7620

gtgggttaat tatttggcct atcttcaatc acaggaaaga aaatccttct atccatcaaa 7680

gcgtcattag caggattaac ttctagatct gacatttata agttggctat ataaagccct 7740

cctatgcttg agaaaaataa aaaattgaga ggcactttca acatgttttt gctgcctgtc 7800

tttttctata aaaaaaaaac acctccagtc agttgcttca cagtggcttt gttaactgaa 7860

gtatggttaa tggttaccat acttgataga aaggtgtaca agaagatgca atgaaagacc 7920

ctgatactcc gcatgatgtc aagttggctg caaaggacta ctcaagttct acccttatgc 7980

acactcatcc tgcctataaa aaaatcaagg ttctcctttg ccctcaacac cccaaaagtg 8040

cccttgatag tacaacttct ggagcatggt acttttgaag cacttgcgta aatctgaaga 8100

taatttattc caatcctcca acctcttaga tcgtggtact ggctacttat atcatatgtt 8160

gctcagagtc tccaaaatgt cgcctcactc ttgttgaatc cttcctaaaa tgcactactt 8220

ttggtattca tatacatttt tgaagagtct gagtaacata gcttatatcc ttgtattact 8280

ggggaacaga gatgtccggt ggtgttcgtc cttcctgccc ttccactatg tgatggtgca 8340

agttactaaa tttcatgggg tgaaaggact ctgattggcc tcatgtatcc tctttcatca 8400

tgatagatac aaccacctgc tctaagtaag aaaaggatag aaaattatgt tcagatatta 8460

acgctaggaa gttgtggttt tatttttaaa tgtatgaaga catatgaaac tctgtaatat 8520

cgcaacttgt tttttatctt taatatttat tggtttgtta catcatgctt tattcaaata 8580

catatgttat gactttcatc tgtctgtttc aacattcact gttagttact tgtagttcaa 8640

aactaaattg aaaatgatat ttcttcttag atatttcttc ttagacattt cccaagaata 8700

ttttgtgttg ataccagtct gttttctctg tatcaaggaa tatgggtggc tgcttatgta 8760

atgaatgagg ttcgcgaaga tatatcatcg ctagaaattg cctcaagatt cttattattg 8820

gttatggtac aatttcctga tcttgtgcta ctttgttgat atgtgagtat cagaatatgt 8880

ttgttgactg cctacagttt ttctcttttt attcaacaga caagtgtcct tgtactggca 8940

ttcttctctt tctcgatttc tcaacctctt gtctcagtta tgagcttgag gaagaagaat 9000

cagaaagaat acaagacaat gagtcaggca ttaggtatac ctgatagtgg gatcctatta 9060

cagagggaat cgacaagcat tctagatcct aatgaacctt tggaaaagct cctgctgaat 9120

cgaaggttcc gtcagtcctt catggaattt gcagacaggt tttactcatt ctccttttgc 9180

aaaaatatca ttaaatcttc atgctgcgtg cgtgcatcag cttatcatgt gaagagagaa 9240

gatggtcctg tcttttctcc ttgattttaa cataattgaa cgtcaaaaga aataaaatgt 9300

atgtgatatt cttggaaaca aagaaataac agatataagc agaccaactt ttctagagag 9360

gaactctaac agacaggtct gaaattgatt gcacagtaat agaatgacct ttttttcttt 9420

tactttgttc acatcgtagt tgtctggctg gagagagtgt gcacttctat gatgaagtgc 9480

aacattttga taaaattcct attcaggatt cagttaggag aatttacatg gcacgccaca 9540

taatagagaa gtatattgct gcaggtaagg tcaattcata tatgaagctt ttgatggtca 9600

tattaaatct tcccttcaaa gattctttaa agcaagtttt cttgggaact tgatggatta 9660

tacactttga tttttttttc tgtatcctcc ggtcctccct ctgaaaagta ttctcgtgct 9720

taaattttga tggttctctg acttgcattt gctcattaaa cacctgtagg agcaccaatg 9780

gaggtgaaca tttctcaccg aatccggcag gaaattttga atactaatga tctctcccac 9840

actgacctat tcaaaaacgc tctaggtgaa ctgatgcagc tgatgaaact ggttggtctt 9900

ttacattctg aaccattact tgcttgatta taatggtatt ttgcatattg cttagttatc 9960

ctctttctat ccttccttcc gtctcactct catcatctct tgtactattg ttgaatcgtt 10020

cttcttgtgg acacacaaag aacttagcaa gagattactg gtcgtcaatg tacttcatga 10080

agctgcaaga ggatatccgc atgagagcag ttgatccgga gatggaacat gctagtggtt 10140

ggaatttttc cccaagattg agttctgtcc attgcagtga tgaccctttc cagaatgaac 10200

atacagaact gcgatgatga aacatgtgag tagggtcatg acttcccaac gtgatggagt 10260

tgcatatatt tggccgtaac aggaagagaa gggaacctaa acgagacatg atattcatct 10320

tcacaggatg ggctccagct acctgattct cctgttcata aacgatacga gccttcaaga 10380

ccaaattttg ctgtgtgatg ttgcacctca tgctttgcag acctga 10426

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tcagaaagag acattggtgg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gattgtcaga aagagacatt ggtgg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aaacccacca atgtctcttt ctgac 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ctacttatcg tcatcgtctt tg 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ttttaagtgc atcggtgac 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gactggaaag caaggagg 18

Claims

1.RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用的途径为通过敲除RGS1基因获得番茄突变体，所述番茄突变体在寡照环境下的细菌性叶斑病抗性提高；所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述寡照环境的光照强度为50u mol m^-2s^-1。

2.一种减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，其特征在于，包括：

(1)培育寡照环境下抗番茄细菌性叶斑病的番茄突变体；

(1-a)在番茄RGS1基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以其前20个碱基为依据，设计相应引物，构建CRISPR/Cas9载体；所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(1-b)构建含步骤(1-a)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(2)用步骤(1)所述的番茄突变体替换寡照环境下种植的野生型番茄，所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述寡照环境的光照强度为50umolm^-2s^-1。

3.如权利要求2所述的减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，其特征在于，步骤(1-a)中，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，其特征在于，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。