CN109609527A

CN109609527A - Cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用

Info

Publication number: CN109609527A
Application number: CN201910079902.1A
Authority: CN
Inventors: 师恺; 丁淑婷; 胡璋健; 李建鑫; 周艳虹; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN109609527B

Abstract

本发明公开了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用，所述CDPK18L基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄CDPK18L基因缺失的突变体，发现该突变体不仅能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，而且对高温的抗性也明显强于对照，证明了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的用途，可用于抗细菌性叶斑病和抗高温番茄品种的选育。

Description

CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用。

背景技术

番茄，茄科茄属，是一种重要的蔬菜和经济作物，在全世界范围内广泛种植。因其营养丰富，口感鲜美，广受喜爱。同时，番茄也是设施栽培的主要蔬菜之一。

然而，近年来，随着大气环境不断发生变化以及农业种植方式的改变，番茄病害爆发日益严重，全球气温的不断升高也使得番茄面临高温胁迫。设施内相对密闭，极易造成高温高湿的环境，加之单一的种植模式，使番茄很容易受到生物与非生物的双重胁迫。

细菌性叶斑病是其中一种高发病害，由丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000)引发的。它是一种革兰氏阴性细菌，对番茄的危害主要表现在叶片上，也可发生在叶脉和果实，影响番茄的果实品质和产量。现阶段对细菌性叶斑病的主要防治方式为喷施农药。虽然可以一定程度上减少产量损失，但随之而来的是农药残留，环境污染以及产生抗药性细菌等一系列问题。

番茄对高温非常敏感，持续的高温会严重影响番茄的营养生长和生殖生长。高温不仅抑制番茄的光合作用，还会导致花粉活力丧失，影响开花坐果。高温胁迫会引发植物体内一系列的反应，包括活性氧积累，细胞失水，酶活性的丧失等。

CDPKs是一种钙离子依赖型蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类CaM结构域组成(Ludwig AA等，“CDPK-mediatedsignaling pathways:specificity and cross-talk.”Journal of ExperimentalBotany,2004,55(395):181-188)。

前人研究表明，CDPKs参与到多种生物及非生物胁迫相关的信号通路中，且作用机制各不相同。例如，拟南芥CPK3和CPK13通过调控热激转录因子HsfB2a激活PDF1.2的转录，从而增强植物对食草昆虫的抗性 (Kanchiswamy C.N.等，“Regulation of Arabidopsisdefense responses against Spodopteralittoralis by CPK-mediated calciumsignaling.”BMC Plant Biology,2010,10:97)。在冷害和盐害/干旱的胁迫下，水稻CDPK7基因的表达量上升。增加CDPK7的含量能够提高水稻对冷害和盐害/干旱的抗性。在盐害/干旱的胁迫下，过表达植株抗性相关的基因表达量显著高于对照，而在冷害的胁迫下则没有这一现象出现，说明CDPK7对冷害和盐害/干旱的抗性机制通过两条独立的途径展开。(Saijo Y等，“Overexpression of a single Ca²⁺-dependent protein kinase confersboth cold and salt/drought tolerance on rice plants.”The Plant Journal,2000,23:319-327)。拟南芥 CPK23则负调控抗逆性，拟南芥CPK23基因突变后拟南芥对干旱的抗性显著提高。过表达CPK23后拟南芥的气孔导度变大，从而影响其对干旱的抗性(Ma SY,WuWH.“AtCPK23 functions in Arabidopsis responses to drought and salt stresses.”Plant Molecular Biology,2007,65:511-518)。

番茄CDPK18L作为CDPKs家族中的一员，鲜有其在生物和非生物抗性中的研究。因此，研究番茄CDPK18L基因应对细菌性叶斑病和高温的抗性机制具有理论和实际应用价值。

近年来发展的CRISPR/Cas9基因编辑技术能够精准敲除基因组中的任何基因，从而精确的改变农作物性状，快速获得理想种质，大大缩短育种时间。同时，相比于转基因育种，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行育种可以不引入外源基因。在利用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑之后，植株可以通过自交筛选出目标基因发生编辑且不含Cas9的株系，可在很多情况下避免使用颇具争议性引入外源基因的转基因技术。尽管在园艺作物中建立高效的基因编辑体系刚刚起步，利用基因编辑技术实现对某些基因的突变，不仅为研究园艺作物的复杂性状及复杂功能提供了重要途径，对于推动园艺作物的遗传改良也具有重要意义。

发明内容

本发明提供了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的新用途，为培育抗细菌性叶斑病和抗高温的番茄品种提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述CDPK18L基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全基因序列如SEQID NO.6所示，其蛋白编码区长度为 1713bp。

该CDPK18L基因编码的蛋白为钙离子依赖型蛋白激酶，由570个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO.2所示，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类CaM结构域组成，当与钙离子结合时，该蛋白被激活。

本发明首先对番茄钙离子依赖型蛋白激酶CDPK18L(基因编号：XM _004232444，NCBI网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列分析，查找PAM序列，将NGG前的20个bp的序列定义为sgRNA，选择定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgRNA序列，该特异性靶向CDP K18L基因蛋白编码区的sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过酵母双杂交实验发现，CDPK18L基因编码的蛋白与谷氨酰胺合成酶存在互作。

所以，进一步地，CDPK18L基因编码的蛋白作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

进一步地，所述蛋白通过与谷氨酰胺合成酶互作，负调控番茄细菌性叶斑病的抗性。

所述的负调控是指CDPK18L通过与谷氨酰胺合成酶互作，改变植物体内的氮代谢过程，削弱植物对细菌性叶斑病的抗性。

CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄高温抗性中的应用，所述 CDPK18L基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了抗细菌性叶斑病和抗高温番茄的培育方法，包括：

(1)在番茄CDPK18L基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，进行引物设计，构建CRIPR/Cas9载体；

(2)构建含步骤(1)所述CRIPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9 蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系。

进一步地，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述PAM结构为NGG，N代表任意碱基。

进一步地，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄CDPK18L基因编辑突变体，发现该突变体能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，证明了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的用途，可用于抗细菌性叶斑病番茄品种的选育。

(2)本发明还发现CDPK18L基因缺失的突变体能够显著增强对高温的抗性，证明了CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄高温抗性中的用途，可用于抗高温番茄品种的选育。

附图说明

图1为实施例2中获得的T₁代突变体植株的基因编辑位点；

与未经过基因编辑的普通番茄相比，基因编辑突变体在sgRNA的位置发生碱基缺失。以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。

CDPK18L#1比对照少两个碱基，CDPK18L#2比对照少一个碱基。

图2为实施例3中对照和CDPK18L基因突变型番茄接种细菌性叶斑病病原菌后的病级指数柱形图；

其中，发病越严重，病级指数越高；对照植株病级指数显著高于突变体植株；小写字母a、b代表不同植株之间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例3中对照和CDPK18L基因突变型番茄接种细菌性叶斑病病原菌后的发病叶片台盼蓝染色图；

其中，斑点越多越大，表示发病越严重。

图4为实施例4中对照和CDPK18L基因突变型番茄进行高温处理之后的表型。

图5为实施例5中酵母双杂交的结果图；

其中，pBD-CDPK18L+pAD表示含有CDPK18L的pGBKT7质粒和 pGADT7质粒共转化入酵母感受态细胞；pBD+pAD-谷氨酰胺合成酶表示 pGBKT7质粒和含有谷氨酰胺合成酶的pGADT7质粒共转化入酵母感受态细胞；pBD-CDPK18L+pAD-谷氨酰胺合成酶表示含有CDPK18L的 pGBKT7质粒和含有谷氨酰胺合成酶的pGADT7质粒共转化入酵母感受态细胞；SD-Trp-Leu表示缺少Trp和Leu两种氨基酸的酵母固体培养基； SD-Trp-Leu-His-Ade表示缺少Trp、Leu、His和Ade四种氨基酸的酵母固体培养基；若酵母在缺少氨基酸的酵母培养基上生长，则说明两个蛋白之间存在互作。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人所熟知，所用原料、试剂盒均为市售商品。

下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种CR(Condine Red)，将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。

实施例1含特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建

在NCBI网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上找到CDPK18L(XM_00 4232444)的DNA序列，其序列如SEQ ID NO.6所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/ CRISPR2/CRISPR网站，找出onscore得分高，且GC 含量>40％，位于蛋白编码区的一段PAM结构前的20bp碱基序列CACG GCGGCGGTATTTGTGG(SEQ ID NO.3)。

设计CRISPR引物，如下所示：

CRISPR前引物(SEQ ID NO.4):GATTGCACGGCGGCGGTATTT GTGG；

CRISPR后引物(SEQ ID NO.5):AAACCCACAAATACCGCCGCC GTGC；

取上述CRISPR前引物和后引物各5μl，混匀后用PCR仪退火成双链。中间载体pMD18-T经BbsI单酶切，普通DNA纯化试剂盒纯化后，将双链与载体用T4连接酶连接，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氨苄青霉素。

挑单克隆菌落，用CRISPR前引物(SEQ ID NO.4)：GATTGCACGG CGGCGGTATTTGTGG和载体后引物(SEQ ID NO.7)：CTACTTATCGTC ATCGTCTTTG，进行PCR验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含s gRNA序列，提质粒，经Hind III与Kpn I双酶切后，连接至终载体pCA MBIA1301上。再次测序结果显示终载体包含sgRNA，将所得最终质粒电击入GV3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行PCR验证，获得可用于构建其CRISPR/Cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。

实施例2CDPK18L基因突变体材料制备与鉴定

在播种培养基播种已消毒的种子，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，获得T₀代基因编辑番茄。

T₀代基因编辑番茄苗检测。利用CTAB法提取T₀代植株的基因组DNA 并以其为模板，在包含sgRNA的DNA序列前后约200bp处设计如下引物，进行PCR扩增测序验证：

验证前引物(SEQ ID No.8):GAGGGCTTATGGTTTTCTTC

验证前引物(SEQ ID No.9):CAATTCTCTTGACAGCCACA

所得PCR产物送测序公司测序。测序结果与该段基因原序列利用 DNAMAN软件进行比对，选取sgRNA序列发生碱基缺失、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得T₀代的种子。

上述T₀代种子种植于生长室中，获得T₁代植株。利用上述同样方法检测T₁代植株的sgRNA序列碱基编辑情况。同时，利用CRISPR前引物 (SEQ ID NO.4)和载体后引物(SEQ IDNO.7)对T₁代植株的DNA进行PCR 扩增，检测是否含有Cas9序列。选取sgRNA发生变异，但不含Cas9的 T₁代植株，确定为基因编辑植株的两个株系，分别命名为CDPK18L#1和 CDPK18L#2，其基因编辑位点如图1所示。

CDPK18L#1比对照植株少两个碱基，CDPK18L#2比对照植株少一个碱基。对上述两个株系进一步自交繁种，获得T₁代种子。上述两个株系 T₁代种子播种后，获得不含外源基因Cas9，且sgRNA发生变异的稳定遗传的T₂代植株。

以下实施例均以上述两个纯合株系T₂代植株作为材料进行实验。

实施例3CDPK18L基因编辑突变体的抗病性研究

细菌性叶斑病病原菌菌种接种在含25mg/L利福平的固体King’s B培养基上，于28℃培养箱中培养2天后得以活化，作为原板。从原板挑取菌落重新在新的板King’s B培养基上划板，28℃培养箱中培养1天。用10mM MgCl₂溶液将菌液悬浮，调节OD600＝0.1。加0.02％的有机硅，对番茄植株叶背进行喷施，使得细菌菌液能够浸润叶片。将植株置于25℃，95％空气相对湿度、12小时光照12小时黑暗，光强200umol m^-2s^-1的环境下培养3天后，观察植株发病情况。

根据叶片发病情况统计病级指数，如图2所示，对照植株的发病情况明显较突变体更严重；取发病叶片进行台盼蓝染色，如图3所示，对照植株的染色面积明显多于突变体。

病级指数的统计方式为：将发病的番茄叶片进行分级，分级标准为： 0级表示未发病，1级表示叶片下表皮可见少数病斑，2级表示叶片下表皮局部密集病斑，3级表示叶片下表皮多部位密集病斑，4级表示叶片下表皮全叶可见病斑分布。0-4级别分别赋值0-4分。根据每个植株每个叶片的发病情况按分级进行分类，加权平均，求得每株病级指数。

由图2和图3可知，CDPK18L突变体能够显著提高其对细菌新叶斑病的抗性。

实施例4CDPK18L基因编辑突变体的抗高温性能研究

将3-4周大小的番茄幼苗放入人工气候培养箱，12小时光照12小时黑暗，光强200umol m^-2s^-1，温度为42℃，期间及时补充水分，防止幼苗干旱。两天后发现对照植株比CDPK18L#1和CDPK18L#2萎蔫更加严重，选取其中代表性植株进行拍照，表型差异如图4所示。

实施例5CDPK18L和谷氨酰胺合成酶的互作鉴定

以对照番茄cDNA为模板，分别扩增CDPK18L蛋白编码区片段(SEQ ID NO.1)并重组至pGBKT7载体，谷氨酰胺合成酶片段并重组至pGADT7 载体。将上述pGBKT7和pGADT7共同转化到酵母AH109菌株。

具体操作步骤如下：挑去在YPAD培养基上的AH109单菌落至3ml YPDA中，250rpm，30min振荡培养8h，取约200μl菌液转移到含20ml YPDA的50ml离心管中，同样条件下培养过夜。当OD600数值到达0.6-0.8 之间时，4000rpm，5min离心，弃上清。用TE/LiAc重悬，4000rpm，5min 离心，弃上清。再用TE/LiAc重悬，制得酵母感受态。将上述重组的pGBKT7 和pGADT7，鲑鱼精子DNA，PEG/LiAc与酵母感受态混合，30℃静置30min，加入60μl二甲亚砜。42℃水浴15min，冰上放置5min后离心去上清，加入100μl无菌ddH₂O，涂抹于营养缺陷型固体培养基SD-Trp-Leu，30℃培养3-4天。挑取成功转入两个重组质粒的单克隆酵母用SD-Trp-Leu液体培养基培养，至OD600数值到达0.6-0.8之间，用4000rpm，5min离心,弃上清。用无菌ddH₂O重悬至OD600数值到达0.3，并分别稀释10倍，100 倍。吸取10μl菌液，分别滴至SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade固体培养基30℃培养3-4天观察结果。

如图5所示，酵母菌落在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade固体培养基均生长良好，说明CDPK18L和谷氨酰胺合成酶存在互作。

序列表

<110> 浙江大学

<120> CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 1

atgggcaaca tatgtttttc tagctcaaaa gttagtggtt ctaacagcaa caccccttcc 60

accaccacca caaataccgc cgccgtgaat ggccaccgta atcggcggag ctcagcgaac 120

ccggtttctg caacaacaaa tacatcaaga aaacaagagg ggtctcatta caatcgacag 180

aaaggtaagg ataacggtgg ggttaagcaa caaacgagaa attctcagaa aaatgttaag 240

cataatacga ggaagcaaag tgggattatt ccttgtggga aaagaacgga ttttgggtat 300

gataaagatt ttgataacaa gtttacaatc ggaaagttgt tgggtcatgg acaatttgga 360

tacacatatg ttgcaacaga caagtctaat ggaaatcgtg tggctgtcaa gagaattgaa 420

aagaaaaaga tggttgttcc aattgcagtt gaggatgtaa aacgagaagt caagatattg 480

aaggccttag ccggtcacga gaatgtagtt gatttctata atgcatttga ggatgataac 540

tatgtttaca tagtaatgga gttatgtgag ggtggagaac tgttggaccg cattttggcc 600

aaaaaggaca gccgttatac cgagaaagat gcagcaatag ttgtcggtca gatgttaaaa 660

gttgccgctc agtgtcactt acatggattg gtgcatcgtg atatgaaacc tgagaatttt 720

ctctttaaat cttcaaagga ggactcatca ttaaaggcca cagattttgg tctttcagac 780

ttcataagac cagggaagaa attccaagat atagttggaa gtgcatatta cgtagcccca 840

gaggtattaa agcgtaaatc tggacctgaa tcagatgtgt ggagcattgg cgtaattaca 900

ttcattttac tttgtggtcg tcggcccttc tgggataaaa cagaggatgg catattcaag 960

gaggtcttac gaaacaaacc tgattttcgt cgcaagccat ggccaactat aagcaacagt 1020

gctaaagatt ttgttaagaa attattggtg aaagatcctc gtgctagact tactgctgcc 1080

caggccctgt cacatccatg ggtccgtgaa ggaggtgatg catctgagat tccactagac 1140

atatctgtct tgtccaacat gcggcaattt gtcaaataca gtcgattaaa gcaatttgca 1200

ttacgggcat tggctagcac acttgatgag gaggagctgg cagatgtccg ggaccagttt 1260

tctgcaattg atgtggataa aaatggtgtt attagccttg aagaaatgag acaggccctt 1320

gccaaggatc tcccctggaa gatgaaagaa tcgcgggttc ttgagattct tcaagcgatt 1380

gatagtaaca cagacgggct tgttgatttc ccggagtttg ttgcagcgac tctacatgtg 1440

catcagttag aggagcataa tttgttaaaa tggcagcaaa gatcgcaaac tgcttttgag 1500

aaatttgacg ttgatagaga tggattcata actccagaag aacttagaat gcataccggc 1560

ttaaaaggct ctatagaccc attgctcgaa gaagcagata tcgacaaaga tggaaagata 1620

agcttatcag aattccggag gcttctaaga actgcaagta taagttcgcg aatggtgaat 1680

agtccaacgg tcagaggctc tcgcaaaatt tag 1713

<210> 2

<211> 570

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 2

Met Gly Asn Ile Cys Phe Ser Ser Ser Lys Val Ser Gly Ser Asn Ser

1 5 10 15

Asn Thr Pro Ser Thr Thr Thr Thr Asn Thr Ala Ala Val Asn Gly His

20 25 30

Arg Asn Arg Arg Ser Ser Ala Asn Pro Val Ser Ala Thr Thr Asn Thr

35 40 45

Ser Arg Lys Gln Glu Gly Ser His Tyr Asn Arg Gln Lys Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Gly Gly Val Lys Gln Gln Thr Arg Asn Ser Gln Lys Asn Val Lys

65 70 75 80

His Asn Thr Arg Lys Gln Ser Gly Ile Ile Pro Cys Gly Lys Arg Thr

85 90 95

Asp Phe Gly Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Asn Lys Phe Thr Ile Gly Lys

100 105 110

Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr Thr Tyr Val Ala Thr Asp Lys

115 120 125

Ser Asn Gly Asn Arg Val Ala Val Lys Arg Ile Glu Lys Lys Lys Met

130 135 140

Val Val Pro Ile Ala Val Glu Asp Val Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu

145 150 155 160

Lys Ala Leu Ala Gly His Glu Asn Val Val Asp Phe Tyr Asn Ala Phe

165 170 175

Glu Asp Asp Asn Tyr Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly

180 185 190

Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Ala Lys Lys Asp Ser Arg Tyr Thr Glu

195 200 205

Lys Asp Ala Ala Ile Val Val Gly Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Gln

210 215 220

Cys His Leu His Gly Leu Val His Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe

225 230 235 240

Leu Phe Lys Ser Ser Lys Glu Asp Ser Ser Leu Lys Ala Thr Asp Phe

245 250 255

Gly Leu Ser Asp Phe Ile Arg Pro Gly Lys Lys Phe Gln Asp Ile Val

260 265 270

Gly Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Lys Ser Gly

275 280 285

Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Phe Ile Leu Leu

290 295 300

Cys Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asp Lys Thr Glu Asp Gly Ile Phe Lys

305 310 315 320

Glu Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp Phe Arg Arg Lys Pro Trp Pro Thr

325 330 335

Ile Ser Asn Ser Ala Lys Asp Phe Val Lys Lys Leu Leu Val Lys Asp

340 345 350

Pro Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Pro Trp Val

355 360 365

Arg Glu Gly Gly Asp Ala Ser Glu Ile Pro Leu Asp Ile Ser Val Leu

370 375 380

Ser Asn Met Arg Gln Phe Val Lys Tyr Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ala

385 390 395 400

Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Asp Glu Glu Glu Leu Ala Asp Val

405 410 415

Arg Asp Gln Phe Ser Ala Ile Asp Val Asp Lys Asn Gly Val Ile Ser

420 425 430

Leu Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu Ala Lys Asp Leu Pro Trp Lys Met

435 440 445

Lys Glu Ser Arg Val Leu Glu Ile Leu Gln Ala Ile Asp Ser Asn Thr

450 455 460

Asp Gly Leu Val Asp Phe Pro Glu Phe Val Ala Ala Thr Leu His Val

465 470 475 480

His Gln Leu Glu Glu His Asn Leu Leu Lys Trp Gln Gln Arg Ser Gln

485 490 495

Thr Ala Phe Glu Lys Phe Asp Val Asp Arg Asp Gly Phe Ile Thr Pro

500 505 510

Glu Glu Leu Arg Met His Thr Gly Leu Lys Gly Ser Ile Asp Pro Leu

515 520 525

Leu Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Phe Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala Ser Ile Ser Ser Arg Met Val Asn

545 550 555 560

Ser Pro Thr Val Arg Gly Ser Arg Lys Ile

565 570

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 3

cacggcggcg gtatttgtgg 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gattgcacgg cggcggtatt tgtgg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

aaacccacaa ataccgccgc cgtgc 25

<210> 6

<211> 4763

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

atgggcaaca tatgtttttc tagctcaaaa gttagtggtt ctaacagcaa caccccttcc 60

accaccacca caaataccgc cgccgtgaat ggccaccgta atcggcggag ctcagcgaac 120

ccggtttctg caacaacaaa tacatcaaga aaacaagagg ggtctcatta caatcgacag 180

aaaggtaagg ataacggtgg ggttaagcaa caaacgagaa attctcagaa aaatgttaag 240

cataatacga ggaagcaaag tgggattatt ccttgtggga aaagaacgga ttttgggtat 300

gataaagatt ttgataacaa gtttacaatc ggaaagttgt tgggtcatgg acaatttgga 360

tacacatatg ttgcaacaga caagtctaat ggaaatcgtg tggctgtcaa gagaattgaa 420

aagaaaaagg tttttttttt ctttccccat cctctgctat atctaattct tatggagttg 480

tgtagtgcac caaatttgga atctgtgaaa atttctgttc aatcctaatt ataggttcaa 540

ctatttcttc tttaattatt tttaaatgtc ttttgacttt ggttgactca gaagaatata 600

cattaactac tgaattgcga attcacatgc tttatccttt ctgtttttag ttcatgtctc 660

tgtttatttg gttcaatcag tgtatttgtt tagcttttgc ggttacaaaa tactatcttc 720

tgctaatctt gaaataccaa tttaagttgt tgttaatttt taatggattg ctaactggtg 780

aagctgtgct ttttaagaga cataaatata tcgaaaacta taggtttatg gaagctgttt 840

ggttaattat gatggttgtg gttctaagca ttgacatata ggaacaccta acactggacc 900

ttagttttct gtgattagtg ctgcttgttg ttattatgta cagttaaatg gaaaatggct 960

tccttgcctg gtttagagag agtcagtttt taatcaatag gtagtggtag cttctttggt 1020

tttctgatga atggacttat ctgaaagtga ctgcacaagt cttggttatt gatgcatgac 1080

gcaactattt agttcgtcat cggcttctat ggagaataac tcttctttaa ggtttgtcca 1140

actttgtctc ctattatctc tgcacaccag ttatgatgtg ttcatccttc tggaatgatg 1200

gggttattca tgcaaataag aatatttgcg gaagtttctt ttttagaagc ttgttaagtt 1260

ttatactatt tttgcataat caattgcctt atcttgaact tcttgatgtt ccagtttatt 1320

acaactatag cataactcta gtgaatcatt gcagatggtt gttccaattg cagttgagga 1380

tgtaaaacga gaagtcaaga tattgaaggc cttagccggt cacgagaatg tagttgattt 1440

ctataatgca tttgaggatg ataactatgt ttacatagta atggagtaag tttcgttatt 1500

aagagctctg tatggattcg tcaggtcata gttctttcct tacaatcgat tatgctaatc 1560

taaaggaaag ttgattgatt acaaatttgt tttcctgtag gttatgtgag ggtggagaac 1620

tgttggaccg cattttggcc aagtaagtag tataaaccag gtttacttaa tatcgtgatt 1680

tgtggtgctt gctctataat ttatttcttg ttaagaagaa tacttatgta agttatcaat 1740

gatttccttt gattagaaag gacagccgtt ataccgagaa agatgcagca atagttgtcg 1800

gtcagatgtt aaaagttgcc gctcagtgtc acttacatgg attggtgcat cgtgatatga 1860

aacctgaggt ttgcaagaag ttatgtactt cctttggttt actaatgctg ctttatgttt 1920

cttctcttac acacatttct tttcttgtag aattttctct ttaaatcttc aaaggaggac 1980

tcatcattaa aggccacaga ttttggtctt tcagacttca taagaccagg tgattggatg 2040

tccacaaatc tactcaatga catattttag tttaaactca tttttcgtat ttgagtaaag 2100

atctttttgc tatggtgtat gaacttcaat tcttcataaa tctgttaaag ccgtcaaaga 2160

tgtttttggt tcttccttag atagcaaaaa cttataactt taaatcaata aatgcaggga 2220

agaaattcca agatatagtt ggaagtgcat attacgtagc cccagaggta ttaaagcgta 2280

aatctggacc tgaatcagat gtgtggagca ttggcgtaat tacattcatt ttactttgtg 2340

gtcgtcggcc cttctgggat aaaacagagg atggcatatt caaggaggtg agctgctaat 2400

atttattctt atagctctgc agctgggcaa cattttaaat tgtgattctt tcttggaaat 2460

ttgtggaatt gtgttatgat ctttaagctc ttctaggaaa taaactttgt attctgtcaa 2520

agtggcatat ttaccaatat taactttaat acattttaaa aaattgcata attctctgtc 2580

tgattagcca attttacatt tgagatttca aaattttact ccaaatatgg tactgatgat 2640

gaatctcctg tatagttttg ctttattatt cttagttctt gattagctta gtctgcattc 2700

catagttggt attgaaattt cttaaacctg aaattttctt gttctctttt gagttcattg 2760

aagctacggc tgtatctttg aatttgggtt gttggttatt taaataaaat cttattcgaa 2820

tgtgttattt aattcctttg agaagtgtaa cttgttcatt gtcatgtttg atgaagtatt 2880

tgtgctttta gctgatttag tattgtttat aactccgctt ctactatgct aaggtcttac 2940

gaaacaaacc tgattttcgt cgcaagccat ggccaactat aagcaacagt gctaaagatt 3000

ttgttaagaa attattggtg aaagatcctc gtgctagact tactgctgcc caggccctgt 3060

gtaagtaatt atattctgat ttagtacaat ctttttaagt gatgattacg ttttacaatt 3120

acgaagcatg attatcggag aagtaactca aggtccaaaa gattcatata ctgaatttgt 3180

caattttgat tcggcaactt cattagcaat gtgttggatg tccatttatc aattcttgct 3240

atatagtcca tgcttctgct aaatttcaaa taattatatt gaataatttt cattgttttc 3300

acttaattag atgttactgg tattctcgtg acctttgaat tgatgatgca ataaatggta 3360

gttttttcat actgatatat atgaacattt cagcacatcc atgggtccgt gaaggaggtg 3420

atgcatctga gattccacta gacatatctg tcttgtccaa catgcggcaa tttgtcaaat 3480

acagtcgatt aaagcaattt gcattacggg taacttcata gctttcttac tttcataaaa 3540

agtagagaac attaacttca tgcaatttca ttatctggca ggcattggct agcacacttg 3600

atgaggagga gctggcagat gtccgggacc agttttctgc aattgatgtg gataaaaatg 3660

gtgttattag ccttgaagaa atgagacagg tatttccctt atttcatggt ctagttagtt 3720

tcttcctgta cagtttctct aagtttctgg ctaacatcgt aagcacttat attcctgtct 3780

ttgcaacaaa gcattgtgta atataatgtc atttatgtta tcacttatga cacccaattc 3840

taatgcaggc ccttgccaag gatctcccct ggaagatgaa agaatcgcgg gttcttgaga 3900

ttcttcaagc ggtaagctaa tatatttagg aatgaaagta tatcactata ataatatggc 3960

atgtaagatc aagttattac tatgaaatac cttctataac gtcaagctgg gacgtgtgtt 4020

tgcaaccaat ttagtcccta ctcctatgaa agggaataag gaaagaaaag gactaacgca 4080

cctaagagcc atccacaaaa aggaaaaagc gaagatgaaa aggaatgtga tgtctgtcac 4140

atagtagttc tgtaaatttc cggcttatga gtccatgcga taatctgagg gtttactcaa 4200

tgattgcaaa cgctttttat ctgcctgtgt atactgcatt tcctacagtt gaagcatttt 4260

gttcattgat ttttcagatt gatagtaaca cagacgggct tgttgatttc ccggagtttg 4320

ttgcagcgac tctacatgtg catcagttag aggagcataa tttgttaaaa tggcagcaaa 4380

gatcgcaaac tgcttttgag aaatttgacg ttgatagaga tggattcata actccagaag 4440

aacttagaat ggttagtatg tcgtattttc ttgttcaagt gatcaacact gttgtatata 4500

taaattctag ctttcaaatc ctacagagcg tgattttttt attcttagat tgaattaaag 4560

ataaaacaaa atattcatat gtggctttta cttgtatgca gcataccggc ttaaaaggct 4620

ctatagaccc attgctcgaa gaagcagata tcgacaaaga tggaaagata agcttatcag 4680

aattccggag gcttctaaga actgcaagta taagttcgcg aatggtgaat agtccaacgg 4740

tcagaggctc tcgcaaaatt tag 4763

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 7

ctacttatcg tcatcgtctt tg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gagggcttat ggttttcttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

caattctctt gacagccaca 20

Claims

1.CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述CDPK18L基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.CDPK18L基因编码的蛋白作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白通过与谷氨酰胺合成酶互作，负调控番茄对细菌性叶斑病的抗性。

4.CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄高温抗性中的应用，其特征在于，所述CDPK18L基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种培育抗细菌性叶斑病和抗高温的番茄的方法，其特征在于，包括：

(1)在番茄CDPK18L基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRIPR/Cas9载体；

(2)构建含步骤(1)所述CRIPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，构建所述CRIPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。