CN110213961A - 基于基因组编辑的作物工程化和生产矮秆植物 - Google Patents
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Abstract
本文公开了与对照野生型植物相比表现出具有降低的株高度的半矮化表型的植物。一些公开的半矮化植物包含至少一种非天然矮秆突变，其中BR2基因的活性降低。还公开了使用基于CRISPR的基因组编辑系统生产半矮化玉米植物的方法。
Description
相关申请的交叉引用和序列表的引入
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年12月22日提交的美国临时申请No.62/438,370的权益，该专利的全文以引用方式并入本文。包含在名为“62248-0000-WO_ST25”的文件中的序列表为32,079字节(在操作系统MS-Windows中测量的)并且是在2017年12月21日创建的，与本文件一起提交并以引用方式并入本文。
发明背景
技术领域
本公开涉及用于生产表现出半矮化表型的改性植物的组合物和方法。
背景技术
在过去的几十年中已经实现了例如小麦和水稻的作物产量持续增加。该增加部分归因于肥料和杀虫剂的使用以及降低植株高度的半显性矮化突变的引入。较高的植物更容易响应于暴雨或烈风而倒伏，并且高产优良品种的较重花序也使它们更容易倒伏。相比之下，具有较矮身材的作物更抗倒伏。此外，矮化和半矮化性状也可以允许更高的种植密度和帮助提高作物收获指数和氮响应。小麦和水稻的矮化品种的引入充当了20世纪后期所谓的“绿色革命”的基石。
玉蜀黍(Zea mays L.)是禾本科属的成员，提供类似于来自其他禾本种的圆柱形秆。玉蜀黍秆在内部是厚的和海绵状的并且分成称为节间和结节的部分。根据品种和生长条件，结节数的范围在8到40之间。商业杂交玉蜀黍通常生长至典型地超过2米的高度，每株植物具有一个或两个穗。穗通常生长在植物上方的约三分之一处或离地面约三英尺处。因此，玉蜀黍植物除了大量的叶和秆结构外还提供大穗，可能具有相当大的机械稳定性问题。降低玉蜀黍植物的高度可以改善该植物的机械稳定性。
已经描述了玉蜀黍的超过40种单基因矮化突变体。这些突变体中的大多数导致籽粒产量大大降低，并因此它们尚未被用于提高对倒伏敏感的种质的作物产量。因此，在玉米育种中重要但困难的目标是识别并使用矮化或半矮化突变，所述矮化或半矮化突变在不会严重影响其他器官、尤其是生殖器官(例如，穗)的情况下赋予矮身材。
在玉蜀黍中，由于节间长度缩短而节间数目或其他器官(包括叶、穗和雄穗)的数量和大小没有相应减少，因此矮秆突变体显示出矮身材。参见Kempton J.Hered.,11:111-115(1920)；Pilu等人，Molecular Breeding,20:83-91(2007)。BR基因是植物激素，其调节许多主要植物生长和发育过程。迄今为止，已在玉蜀黍中分离出了三种矮秆的br突变体：矮秆1(br1)、矮秆2(br2)和矮秆3(br3)。br1和br3突变都导致玉米植物高度降低，该玉米植物高度降低由于对产量的潜在影响而已被认为对于商业利用来说过于严重。相比之下，br2突变体由于下部秆的节间缩短而其他植物器官没有明显减少，而具有特定的农艺潜力。此外，br2品系表现出不寻常的秆强度和对风倒伏的耐受性，同时与野生型植物的叶子相比，叶子的活性绿色通常更深并且持续更长时间。br2表型对使用赤霉素、植物生长激素、油菜素类固醇和细胞分裂素进行处理不敏感，表明这些激素的生物合成没有因br2突变而被修改。
Multani等人鉴定了Br2基因的基因组序列，并将该基因组序列以GenBank登录号AY366085保藏。参见Science,302(5642)81-84(2003)。Br2被注释为编码与多药抗性(MDR)类别的P-糖蛋白(PGPS)的三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运体类似的推定蛋白。预测的BR2蛋白由两个相似的半部分组成，每个半部分含有六个推定的跨膜结构域和一个细胞内ATP核苷酸结合结构域。br2基因的长度为7139bp，其编码序列为4185bp。Pilu等人报道了在Br2基因的3'末端具有8bp缺失的br2-23等位基因，并宣称该缺失与它们的br2-23植物中的矮秆表型之间的直接关系。参见Pilu等人，Molecular Breeding,20:83-91(2007)。然而，由于可用的矮秆突变等位基因的严重性，在玉米中使用矮秆突变尚未被商业利用。
需要在玉米研究中对玉米植物进行工程化，该工程化提供新型的和商业相关的矮秆突变等位基因，例如赋予半矮化表型并维持或改善籽粒产量的等位基因。
附图说明
图1示意性地示出了BR2基因的结构。
图2示意性地示出了天然BR2突变等位基因br2-MX的结构，及其多态性和突变。
图3示出了与野生型对照植物相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑R1玉米植物在V6生长阶段的植物高度降低(半矮化)。
图4示出了与野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑BR2 01DKD2玉米植物的植物高度降低(半矮化)。
图5A示出了与天然br2-MX突变体和野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑BR2玉米植物(下文中称为“br2-GE”)的植物高度降低(半矮化)。图5B示出了与杂合基因组编辑的BR2植物、负偏析基因组编辑的BR2植物和野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的纯合基因组编辑BR2植物的植物高度降低。
图6示出了与天然BR2野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑BR2玉米植物的节间较短。
发明内容
本说明书提供了一种玉米植物，其包含至少一种非天然矮秆突变，其中与在可比条件下生长时不包含至少一种非天然矮秆突变的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出半矮化表型。
本说明书还提供了一种矮秆玉米植物，其包含至少一种非天然矮秆突变。
本说明书还提供了一种矮秆玉米植物，其包含至少一个非天然矮秆突变等位基因。
本说明书还提供了一种玉米植物，其包含至少一种表现出半矮化表型的非天然矮秆突变。
在一个方面，本说明书提供了一种玉米植物，其包含至少一个表现出半矮化表型的非天然矮秆突变等位基因。
在另一个方面，本说明书提供了一种经改性的玉米植物，其包含BR基因中的非天然存在的突变，该非天然存在的突变降低BR基因的活性，其中所述突变不是经由转座子引入的。
在另一个方面，本说明书提供了一种经改性的玉米植物，其包含具有降低的活性的经改性的BR2基因，其中所述经改性的玉米植物不包含br2-23矮秆等位基因或SNP5259。
在另一个方面，本说明书提供了一种非转基因玉米植物，其包含BR基因中的合成突变，该合成突变降低BR基因的活性。
在另一个方面，本说明书提供了一种经改性的玉米植物，其包含BR基因中的非转基因或非转座子介导的突变，该突变降低BR基因的活性。
在另一个方面，本说明书提供了一种矮秆玉米植物，其包含显性非转基因BR突变等位基因。
本说明书还提供了一种用于生产半矮化玉米植物的方法，所述方法包括：(a)提供识别玉米细胞中BR基因中的靶位点的指导RNA，其中所述指导RNA与在靶位点产生链断裂的RNA引导的核酸酶相关联地起作用，(b)从玉米细胞产生玉米植物，以及(c)选择表现出半矮化表型的玉米植物。
在另一个方面，本说明书包括一种基于CRISPR的基因组编辑系统，其包含Cas9和指导RNA，其中所述基于CRISPR的基因组编辑系统降低BR基因的活性。
本说明书进一步提供了一种用于切割玉米细胞中的BR基因的方法，其包括将指导RNA和RNA引导的核酸酶提供到玉米细胞中，其中所述指导RNA与RNA引导的核酸酶相关联地起作用以在靶位点产生链断裂。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。描述与本文所用的分子生物学相关的许多术语的资源的示例可见于Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第5版，Garland Science Publishing,Inc.:New York,2007；Rieger等人，Glossary of Genetics:Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag:New York,1991；King等人，A Dictionary of Genetics，第6版，OxfordUniversity Press:New York,2002；以及Lewin,Genes IX,Oxford University Press:NewYork,2007。使用如37C.F.R.§1.822所阐述的DNA碱基命名法。
本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物均全文以引用方式并入。
术语“和/或”在用于列出两个或更多个项时意指可以单独地采用所列的项中的任一个项，或可以采用所列的项中的两个或更多个项的组合。例如，表述“A和/或B”旨在意指A和B之一或两者——即单独A、单独B或A与B组合。表述“A、B和/或C”旨在意指单独A、单独B、单独C、A与B组合、A与C组合、B与C组合，或A、B与C组合。
如本文所用，单数形式的术语和单数形式“一”、“一个”和“该/所述”例如包括多个指代物，除非内容另外明确指出。因此，例如，提及“植物”、“该植物/所述植物”或“一植物”也包括多种植物；此外，根据上下文，术语“植物”的使用也可包括该植物的遗传上相似或相同的子代；实际上，术语“核酸”的使用任选地包括该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。
如本文所用的术语“约”旨在限定其所修饰的数值，表示该值在误差范围内是可变的。当没有列出特定的误差范围，诸如平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为意指包含所述值的范围和考虑到有效数字通过对该数字进行上舍入或下舍入而包括的范围。
如本文所用，“植物”是指完整植物、植物的任何部分或源自植物的细胞或组织培养物，其包含以下任一种：完整植物、植物部件或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其子代。植物细胞是取自植物或通过培养取自植物的细胞来源的植物的生物细胞。如本文所用，“植物部分”可以指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、枝条器官/结构(例如，叶、茎或结节)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚胎、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体，或其他植物组织(例如，维管组织、表皮组织、基本组织(ground tissue)等)，或它们的任何部分。本发明的植物部分可以是有活力的、无活力的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括能够生长成整株植物的任何植物部分。
如本文所用，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指物种Zea mays L的植株，并且包括可与玉米相交繁殖的所有植物品种，包括野生玉蜀黍物种。
如本文所用，“矮化”植物是指非典型小植物。通常，该“矮化植物”的身材或高度相对于对照野生型植物(例如，包括除矮化性状之外的所有其他性状的同属植物)的身材或高度降低约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多。
如本文所用，“半矮化植物”是指身材或高度相对于对照野生型植物的身材或高度降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％或更少的植物。通常但非排他地，该矮化植物表征为当与可比生长条件下的对照野生型植物的茎、秆或躯干长度相比时，茎、秆或躯干长度缩短。在一个方面，包含本公开的BR基因中的非天然存在的突变的经改性的玉米植物的茎、秆或躯干长度为与可比生长条件下在BR基因中不具有非天然存在的突变的对照植物的茎、秆或躯干长度相比的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。如本文所用，“矮秆植物”是指由于节间长度缩短而节间数量或其他器官(包括但不限于叶子、穗和雄穗)的数量和大小没有相应减少，而因此显示出矮身材的植物。“矮化”是指这样的植物异常变异，该植物异常变异表征为节间缩短，而其他植物部分没有相应减少。“矮秆突变”是指导致矮秆植物的BR基因突变。
如本文所用，“BR基因”是指植物中的任何矮秆基因，该矮秆基因的突变导致矮秆植物。在一个方面，BR基因是BR1基因。在另一个方面，BR基因是BR2基因。在另一个方面，BR基因是BR3基因。
如本文所用，“种质”是指遗传物质的活体源。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以自生物体或细胞中分离。通常，种质为遗传物质提供特定的分子组成，该特定的分子组成为生物体或细胞培养物的一些或所有遗传性质提供物理基础。如本文所用，种质包括可以生长成新植物的细胞、种子或组织，或者可以培养成整株植物的植物部分，诸如叶、茎、花粉或细胞。
如本文所用，“转基因植物”是指这样的植物，该植物的基因组已通过整合或插入重组DNA分子、构建体或序列而改变。转基因植物包括从最初转化的植物细胞开发或再生的R0植物，以及较晚世代中的子代转基因植物或来自R0转基因植物的杂交植物。
如本文所用，“突变”是指对生物体基因组的核苷酸序列、染色体外DNA或其他遗传元件的永久性改变。
如本文所用，术语“取代突变”是指单个核苷酸与另一个核苷酸的交换。
如本文所用，术语“插入”是指将一个或多个额外核苷酸添加到DNA中。基因编码区中的插入可以改变mRNA的剪接(剪接位点突变)，或引起阅读框移位(移码)，mRNA的剪接和阅读框移位两者都可以显著改变基因产物。
如本文所用，术语“缺失”是指从DNA中去除一个或多个核苷酸。像插入一样，这些突变可以改变基因的阅读框。
如本文所用，术语“倒位”是指逆转染色体区段的定向。
如本文所用，术语“复制”是指产生染色体区域的多个拷贝，从而增加位于染色体区域中的基因的剂量。
本文中关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列使用的术语“同一性百分比”或“同一百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定在该两个序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置数以得到匹配位置数，(iii)将该匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，然后(iv)将该商乘以100％以得到同一性百分比。如果在没有指定特定比较窗口的情况下计算相对于参考序列的“同一性百分比”，则通过将比对区域上的匹配位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳比对(允许它们的比对中有空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于这两个序列之间的相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)中的位置总数，然后乘以100％。
如本文所用，“上游”是指核酸序列位于连接的核酸序列的5'末端之前。如本文所用，“下游”是指核酸序列位于连接的核酸序列的3'末端之后。如本文所用，“5'”是指编码DNA序列的起点或RNA分子的起点。如本文所用，“3'”是指编码DNA序列的末端或RNA分子的末端。应当理解，“倒位”是指逆转给定多核苷酸序列的定向。
为了最佳比对序列以计算它们的同一性百分比，本领域已知各种逐对或多序列比对算法和程序(诸如ClustalW等)可用于比较两个或更多个核苷酸或蛋白质序列之间的序列同一性或相似性。尽管本领域已知其他比对和比较方法，但是两个序列之间的比对和同一性百分比(包括上述同一性百分比范围)可以通过ClustalW算法确定，参见例如ChennaR.等人，“Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson JD等人，“Clustal W:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994)；以及Larkin MA等人，“Clustal W andClustal X version 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)，该等文献的全部内容和公开内容以引用方式并入本文。
如本领域中通常所理解的，术语“启动子”通常可指这样的DNA序列，该DNA序列含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒，并辅助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达。启动子可以由已知的或天然存在的启动子序列或其他启动子序列合成产生、变化或衍生。启动子还可以包括嵌合启动子，该嵌合启动子包含两个或更多个异源序列的组合。因此，本公开的启动子可以包括启动子序列的变体，所述变体与本文已知或提供的其他启动子序列在组成上相似但不相同。可以根据与启动子可操作地连接的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式相关的各种标准对启动子进行分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。驱动在植物的所有或大多数组织中表达的启动子被称为“组成型”启动子。驱动在某些发育时期或发育阶段中表达的启动子被称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织驱动在植物的某些组织中的增强表达的启动子被称为“组织增强型”或“组织偏好型”启动子。因此，“组织偏好型”启动子引起在植物的特定组织中的相对较高或优先的表达，而在植物的其他组织中具有较低水平的表达。在植物的特定组织内表达，而在其他植物组织中很少或没有表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于诸如冷、干旱或光之类的环境刺激或诸如创伤或化学品施加之类的其他刺激而启动转录的启动子。启动子也可以根据其来源进行分类，诸如为异源、同源、嵌合、合成的等等。“异源”启动子是这样的启动子序列，该启动子序列相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同来源，和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的。术语“植物可表达的启动子”是指这样的启动子，该启动子能够启动、辅助、影响、导致和/或促进其相关联的可转录DNA序列、编码序列或基因在植物细胞或组织中的转录和表达。
关于启动子的术语“异源的”是这样的启动子序列，该启动子序列相对于其相关的可转录DNA序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同来源，和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的。当两种或更多种DNA分子或序列的组合是人为制造的，而非通常在自然界中存在的时，术语“异源”可以更广泛地指该两种或更多种DNA分子或序列的组合，诸如启动子和相关的可转录的DNA序列、编码序列或基因。
关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白、构建体、载体等等的术语“重组”是指这样的多核苷酸或蛋白质分子或序列，该多核苷酸或蛋白质分子或序列是人为制造的，而非通常在自然界中存在的，和/或存在于在自然界中通常不存在的环境中，包括包含在没有人为干预的情况下不会天然地连续或紧密靠近在一起存在的多核苷酸或蛋白质序列的组合的多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体等，和/或包含至少两个相对于彼此异源的多核苷酸或蛋白质序列多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可以包含这样的多核苷酸或蛋白质序列，该多核苷酸或蛋白质序列(i)与在自然中彼此邻近存在的其他多核苷酸或蛋白质序列分离，和/或或(ii)与不是天然彼此邻近的其他多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)。该重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等也可以指已经在细胞外进行了遗传工程化和/或构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何合适的质粒、载体等，并且可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括原核复制起点和选择性标记，以及一个或多个转基因或表达盒，以及可能还有植物选择标记基因等。术语重组还可以指具有重组物质的生物体，例如包含重组核酸的植物被视为重组植物。
如本文所用，“等位基因”通常是指在特定基因座处的另选的核酸序列；等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但通常更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在另一个同源染色体上，例如在杂合个体的不同染色体中出现，或者在群体中不同的纯合或杂合个体之间出现。有利的等位基因是赋予或有助于农学上所需的表型的特定基因座处的等位基因，或者另选地，是允许鉴定可以从育种程序或种植中移除的易感植物的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型分离、或者另选地与易感植物表型分离从而提供鉴定易患疾病的植物的益处的标记等位基因。染色体区间的有利等位基因形式是这样的染色体区间，该染色体区间包括在物理上位于染色体区间上的一个或多个遗传基因座处的有助于优异的农学性能的核苷酸序列。
如本文所用，“杂交的(crossed)”或“杂交(cross)”意指通过受精(例如，细胞、种子或植物)产生子代，并且包括植物之间的杂交(有性杂交)和自体受精(自交)。
如本文所用，“回交(backcross/backcrossing)”是指子代植物重复与其亲本之一回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座所渗入到的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此类推。在一个方面，重复执行回交，其中每个连续回交世代的子代个体自身与相同的亲本基因型进行回交。
如本文所用，“基因型”是与可观察到的性状(表型)形成对比的一个或多个遗传基因座处的个体(或个体群)的遗传构成。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指在单个基因座、多个基因座处的个体遗传构成，或者更通常地，术语基因型可用于指个体关于其基因组中所有基因的遗传组成。“单倍型”是在多个遗传基因座处个体的基因型。通常，由单倍型描述的遗传基因座在物理上和遗传上是连锁的，即在相同的染色体区间上。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇，基因或标记所位于的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一种或多种多态性；例如在一些个体中存在另选等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的另选核酸序列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但通常更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在另一个同源染色体上，例如在杂合个体的不同染色体中出现，或者在群体中不同的纯合或杂合个体之间出现。如本文所用，当仅存在一个基因座拷贝时，二倍体植物中的染色体是“半合子的”。例如，插入的转基因在其仅插入到一个姊妹染色体中时是半合子的(即第二个姊妹染色体不包含插入的转基因)。
术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状。表型可以通过肉眼或通过本领域已知的任何其他评价方式(例如显微镜、生物化学分析、基因组分析、特定耐病性的测定等)观察到。在一些情况下，表型由单个基因或遗传基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。
“可操作地连接”是指两个或多个核酸元件在重组DNA构建体中缔合，例如如当启动子可操作地与DNA连接，该DNA被转录成用于表达或抑制蛋白质的RNA时。重组DNA构建体可经设计以表达蛋白质，该蛋白质可以是内源性蛋白、内源性蛋白的外源同源物，或没有天然同源物的外源性蛋白。另选地，重组DNA构建体可以被设计为抑制内源性蛋白的水平，例如通过抑制天然基因。通过天然RNA干扰(RNAi)机制可以有效地利用此种基因抑制，在所述机制中重组DNA包含与靶向抑制的基因匹配的有义定向和反义定向的DNA，其中重组DNA被转录成可形成双链以启动RNAi机制的RNA。基因抑制也可以通过这样的重组DNA实现，该重组DNA包含与靶向抑制的基因匹配的反义定向的DNA。基因抑制也可以通过这样的重组DNA实现，所述重组DNA包含这样的DNA，该DNA被转录成与靶向抑制的基因匹配的微RNA。
“多态性”意指群体中存在一种或多种变异。多态性可表现为核酸的核苷酸序列的变异或蛋白质的氨基酸序列的变异。多态性包括在一个或多个个体的群体中一个或多个基因座处的核酸序列或核酸特征的一个或多个变异的存在。所述变异可以包括但不限于一个或多个核苷酸碱基变化、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可以从核酸复制中的随机过程、通过诱变、因为移动的基因组元件、从拷贝数变异以及在减数分裂过程期间(例如不等交叉、基因组复制以及染色体断裂和融合)出现。所述变异可以是常见的或可以以低频率存在于群体内，前者在一般植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变异相关。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标记、基因、DNA来源序列、RNA来源序列、启动子、基因的5'非翻译区、基因的3'非翻译区、微RNA、siRNA、耐受基因座、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式也可以包含多态性。此外，前述的拷贝数的存在、不存在或变异可以包含多态性。
如本文所用，“载体”、“表达盒”或“盒”是在细胞之间转移核酸的多核苷酸或其他分子。载体通常源于质粒、噬菌体或病毒，并且任选地包含介导载体维持并实现其预期用途的部分。“克隆载体”或“穿梭载体”或“亚克隆载体”含有促进亚克隆步骤的可操作连接的部分(例如，含有多个限制性内切核酸酶位点的多克隆位点)。如本文所用的术语“表达载体”是指这样的载体，该载体包含可操作连接的多核苷酸序列，该可操作连接的多核苷酸序列促进编码序列在特定宿主生物中的表达(例如，细菌表达载体或植物表达载体)。
如本文所用，“产量”是所有农艺性状的顶点，如由具有商业价值的特定植物产品的每单位面积的生产率确定的。“农艺性状”包括特定植物品种的基础遗传元件，所述基础遗传元件有助于生长季节过程中的产量。
如本文所用，“可比的生长条件”是指类似的环境条件和/或农艺实践，所述类似环境条件和/或农艺实践用于使两种或更多种植物基因型生长和用于在该两种或更多种植物基因型之间进行有意义比较，使得环境条件和农艺实践都不会有助于或解释在该两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光、温度、水、湿度和营养(例如，氮和磷)。农艺实践包括例如播种、修剪、底切、移栽、打顶和分株。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology的第4B章和第4C章，Davis和Nielsen编辑，Blackwell Publishing,Oxford(1999)，第70-103页。
如本文所用，在育种的背景下“选择(selecting/selection)”是指通常基于某种预定标准从群体挑选或选取所需个体的行为。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员应认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸，以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，其包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎和环结构等。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。
说明
BR2基因和半矮化表型
由于节间长度缩短而节间数目或其他器官(包括叶、穗和雄穗)的数量和大小没有相应减少，因此矮秆玉米突变体显示出矮身材。参见Pilu等人，Molecular Breeding,20:83-91(2007)。已分离出三种矮秆突变体矮秆1(br1)、矮秆2(br2)和矮秆3(br3)。具有特定农艺潜力的玉米矮秆突变体是隐性突变br2，该隐性突变br2导致下部秆的节间缩短而其他植物器官没有明显减少。此外，br2品系表现出不寻常的秆强度和对风倒伏的耐受性，同时与野生型植物的叶子相比，叶子的活性绿色通常更深并且持续更长时间。br2表型对使用GAs、植物生长激素、油菜素类固醇和细胞分裂素进行处理不敏感，表明这些激素的生物合成没有因br2突变而被修改。Multani等人识别出了Br2基因的基因组序列，并将该基因组序列以GenBank登录号AY366085保藏。参见Science,302(5642)81-84(2003)。Br2被注释为编码与多药耐药性(MDR)类别的P-糖蛋白(PGP)的三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运体类似的推定蛋白。如图1所示，BR2基因含有5个外显子和4个内含子：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3和内含子4。
本公开内容提供了一种玉米植物，其包含至少一种非天然BR突变，其中与在可比条件下生长时不包含该非天然BR突变的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出半矮化表型。
已经探索出天然BR基因突变有助于玉米植物中的矮秆或半矮化表型。本公开内容提供了一种经改性的玉米植物，该经改性的玉米植物包含BR基因(包括BR2基因)中的非天然存在的突变。
如本文所用，“天然突变”、“天然存在的突变”或“天然的”突变是指这样的突变，因为在不涉及实验室或实验程序或暴露于诱变剂的情况下，该突变在自然中自发发生。不受科学理论的束缚，天然存在的突变可以来自各种来源，包括DNA复制、自发病变和可转座元件(或转座子)中的错误。
术语“非天然突变”或“非天然存在的突变”是指这样的突变，该突变本质上不能自发发生，而是实验室或实验程序或暴露于诱变剂下的结果。
本公开内容提供了一种经改性的玉米植物，该经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的突变，该非天然存在的突变降低BR基因的活性，其中该突变不是经由转座子引入的。
如本文所用，在植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组的背景下，“改性的”是指包含相对于它们的自然或天然状态的变化或变异的状态。经改性的植物或种子在其遗传物质中包含分子变化，包括遗传或表观遗传改性。通常，经改性的植物或种子、或其亲本或祖细胞系已经进行了诱变、基因组编辑(例如但不限于经由使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如但不限于经由农杆菌属转化或微粒轰击的方法)，或它们的组合。
如本文所用，“转座子”是指这样的DNA序列，所述DNA序列可以改变其在基因组内的位置，产生或逆转突变和改变细胞的基因组大小。
在一个方面，本文提供的经改性的玉米植物不包含br2-23矮秆突变。如本文所用，术语“br2-23矮秆突变”是指与矮秆表型一致的在玉蜀黍br2基因的编码区中携带八核苷酸缺失的天然存在的隐性突变，如在Pilu等人，Molecular Breeding,20:83-91(2007)和Cassani等人，Plant Growth Regul.,64:185-192(2011)中所报道的。这些参考文献的全文以引用方式并入本文。
在一个方面，本公开的经改性的玉米植物不包含SNP5259。如本文所用，术语“SNP5259”是指玉蜀黍植物高度定量性状基因座(QTL)qph1中的天然存在的单核苷酸多态性(SNP)，该SNP被证实为致病突变，该致病突变降低植物高度并增大玉蜀黍的产量潜力。这报道于Xing等人，J.Exp.Bot.,66:3791-802(2015)中。该参考文献的全文以引用方式并入本文。
在一个方面，本公开的经改性的玉米植物不包含通过在玉蜀黍中使用标记辅助选择而鉴定出的br2矮秆多态性等位基因，如在美国申请公开No.2016/0319375中所报道的，该美国申请公开与美国临时申请No.62/180,430和62/153,831一起全文以引用方式并入本文。
在一个方面，本公开的经改性的玉米植物不包含任何含有天然BR2突变等位基因的玉米植物。在一个方面，本公开的经改性的玉米植物不包含含有天然br2-MX突变等位基因的玉米植物，如在本公开的实施例1中所述和图2和图5A中所示。
在另一个方面，本公开的经改性的玉米植物不包含br2-23矮秆突变SNP5259、多个br2矮秆多态性等位基因、br2-MX突变等位基因，或BR基因中的任何其他天然存在的或天然的突变。在一个方面，BR基因是Br1基因。在另一个方面，BR基因是Br2基因。在另一个方面，BR基因是Br3基因。
在一个方面，本文描述的植物包含经由靶向基因组编辑引入的br2突变，以模拟天然存在的突变br2等位基因。在另一个方面，本文描述的方法包括在期望的近交背景下对矮秆基因(例如，BR2)进行靶向基因组编辑，以引入天然存在的突变br2等位基因。
在一个方面，本公开提供了一种非转基因玉米植物，其包含BR基因中的合成突变，该合成突变降低BR基因的活性。如本文所用，术语“合成突变”是指非自发突变并且由于暴露于诱变剂而发生。
在另一方面，本公开提供了一种经改性的玉米植物，其包含BR基因中的非转基因或非转座子介导的突变，该突变降低BR基因的活性。如本文所用，术语“转基因”是指整合或插入基因组中并因此改变该基因组的重组DNA分子、构建体或序列。
在一个方面，经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的取代突变。在另一个方面，经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的插入。在另一个方面，经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的倒位。在另一个方面，经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的缺失。在另一个方面，经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的复制。
本公开还提供了一种经改性的玉米植物，其包含BR2基因中的非天然存在的插入，其中该插入导致BR2基因编码的BR2蛋白的截短。在一个方面，插入发生在BR2基因的外显子1中，其中该插入引入提前终止密码子。在另一个方面，插入发生在BR2基因的外显子2中，其中该插入引入提前终止密码子。在另一个方面，插入发生在BR2基因的外显子3中，其中该插入引入提前终止密码子。在另一个方面，插入发生在BR2基因的外显子4中，其中该插入引入提前终止密码子。在另一个方面，插入发生在BR2基因的外显子5中，其中该插入引入提前终止密码子。在另一个方面，该插入发生在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该插入发生在BR2基因的5'UTR中。
在一个方面，该至少一个非天然BR或BR2突变是至少一个插入。在另一个方面，该至少一个插入是单核碱基插入。在一个方面，单核碱基是鸟嘌呤。在另一个方面，单核碱基是胞嘧啶。在另一个方面，单核碱基是腺嘌呤。在另一个方面，单核碱基是胸腺嘧啶。在另一个方面，单核碱基是尿嘧啶。在另一个方面，根据BR2开放阅读框将胸腺嘧啶插入在核苷酸编号5420与5421之间以产生提前终止密码子。在一个方面，单核碱基插入在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的启动子中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，单核碱基插入在BR2基因的内含子4中。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的外显子1中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的外显子2中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的外显子3中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的外显子4中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的外显子5中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的3'UTR中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的5'UTR中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的启动子中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的内含子1中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的内含子2中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的内含子3中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该至少一个插入在BR2基因的内含子4中，其中该至少一个插入包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在一个方面，该至少一个非天然BR或BR2突变是至少一个取代。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子4中。
在一个方面，该至少一个非天然BR或BR2突变是至少一个缺失。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子4中。
在一个方面，该至少一个非天然BR或BR2突变是至少一个复制。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子4中。
基因组编辑
鉴于抑制玉米中的BR基因产生具有较矮植物高度、增大的秆直径和增强的抗倒伏性的植物，本发明人进一步提出可通过基因组编辑来减少或消除BR基因的表达，以向玉米或其他单子叶植物或谷类植物提供这些有益性状。
如本文所用，“靶向编辑技术”是指允许精确和/或靶向编辑基因组中的特定位置的任何方法、方案或技术(例如，该编辑不是随机的)。不受限制，使用位点特异性核酸酶是靶向编辑技术的一个示例。
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指对内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个、至少5000个、至少10000个、或至少25000个核苷酸的靶向诱变、插入、缺失或取代。
经由使用一个或多个位点特异性核酸酶可以实现基因组编辑或靶向编辑。位点特异性核酸酶可以诱导基因组序列的靶位点处的双链断裂(DSB)，该双链断裂(DSB)然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程来修复。诸如插入、缺失之类的序列改性可以经由NHEJ修复在DSB位置处进行。HR可用于将供体核酸序列整合到靶位点中。如果产生两个位于一个靶区域侧翼的DSB，则可以通过逆转靶向DNA的定向(也称为“倒位”)而经由NHEJ修复断裂。
在一个方面，本文提供的载体或构建体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、或至少10种位点特异性核酸酶的多核苷酸。在另一个方面，本文提供的细胞已经包含位点特异性核酸酶。在一个方面，将编码本文提供的位点特异性核酸酶的多核苷酸稳定地转化到细胞中。在另一个方面，将编码本文提供的位点特异性核酸酶的多核苷酸瞬时转化到细胞中。在另一个方面，编码位点特异性核酸酶的多核苷酸处于可调控启动子、组成型启动子、组织特异性启动子或任何可用于表达位点特异性核酸酶的启动子的控制之下。
在一个方面，载体包含编码位点特异性核酸酶的顺式盒和供体分子，使得当与细胞基因组接触时，该位点特异性核酸酶实现对供体分子的位点特异性整合。在一个方面，第一载体包含编码位点特异性核酸酶的盒并且第二载体包含供体分子，使得当与细胞基因组接触时，反式提供的位点特异性核酸酶实现对供体分子的位点特异性整合。
本文提供的位点特异性核酸酶可用作靶向编辑技术的一部分。本文提供的方法和/或组合物中使用的位点特异性核酸酶的非限制性示例包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的核酸酶(例如，Cas9和Cpf1)、重组酶(不限于例如附接至DNA识别基序的丝氨酸重组酶、附接至DNA识别基序的酪氨酸重组酶)、转座酶(不限于例如附接至DNA结合结构域的DNA转座酶)，或它们的任何组合。在一个方面，本文提供的方法包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种位点特异性核酸酶，以诱导在一个、两个、三个、四个、五个或超过五个靶位点处的一个、两个、三个、四个、五个或超过五个DSB。
在一个方面，在方法中使用本文提供的一种基因组编辑系统(例如，大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶)或本文提供的基因组编辑系统的组合以将一个或多个插入、缺失、取代或倒位引入细胞中的基因座，以引入突变或产生显性负等位基因或显性正等位基因。
位点特异性核酸酶，诸如大范围核酸酶、ZFN、TALEN、Argonaute蛋白(Argonaute蛋白的非限制性示例包括Argonaute嗜热栖热菌(Thermus thermophilus Argonaute,TtAgo)、Argonaute强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus Argonaute,PfAgo)、Argonaute格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi Argonaute,NgAgo)，它们的同源物或它们改性形式)、Cas9核酸酶(RNA引导的核酸酶的非限制性示例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式)诱导基因组序列的靶位点处的双链DNA断裂，该双链DNA断裂然后由HR或NHEJ的自然过程来修复。然后在切割位点处进行序列改性，该序列改性可以包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的倒位、缺失或插入，或通过HR整合核酸序列。
在一个方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶，或它们的任何组合。在另一个方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一个方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在另一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由以以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在另一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。
重组酶
在一个方面，附接至本文提供的DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下项组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶，以及Tnp1重组酶。在一个方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶系留至锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统来自源自面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒。在该系统中，Flp重组酶(翻转酶)重组翻转酶识别靶标(FRT)位点之间的序列。FRT位点包含34个核苷酸。Flp结合至FRT位点的“臂”(一个臂处于反向定向)并在居间的核酸序列的任一端切割FRT位点。切割后，Flp重组两个FRT位点之间的核酸序列。Cre-lox是来源于噬菌体P1的定点重组系统，该定点重组系统类似于Flp-FRT重组系统。Cre-lox可用于使核酸序列反转、使核酸序列缺失或使核酸序列易位。在该系统中，Cre重组酶使一对lox核酸序列重组。Lox位点包含34个核苷酸，其中第一个和最后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组期间，Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合，并在lox位点处进行切割。将切割的核酸拼接在一起(相互易位)并完成重组。在另一个方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
在另一个方面，附接至本文提供的DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下项组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶，以及TP-901整合酶。在另一个方面，附接至本文提供的DNA结合结构域的DNA转座酶选自由以下项组成的组：TALE-piggyBac和TALE-增变基因。
ZFN
ZFN是合成蛋白质，其由与FokI限制性核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成。ZFN可以设计成切割几乎任何长段的双链DNA，以用于对锌指DNA结合结构域进行改性。ZFN由单体形成二聚体，所述二聚体由与经工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列融合的FokI核酸酶的非特异性DNA切割结构域构成。
ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。在相对于锌指∞螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸有助于与靶DNA的位点特异性结合，所述氨基酸可以经改变和定制以适配特定靶序列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则在本领域中是已知的。
FokⅠ核酸酶结构域需要进行二聚化以切割DNA，因此两个ZFN需要以它们的C末端区域结合切割位点的相对DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶位点。如本文所用的术语ZFN是广泛的，并且包括可以在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN还用于指一对ZFN中的一个或两个成员，该一对ZFN经工程化以共同作用以在相同位点切割DNA。
不受任何科学理论的限制，因为原则上可以使用各种方法中的一种对锌指结构域的DNA结合特异性进行重新工程化，所以理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公开可用方法包括相邻装配(Context-dependent Assembly,CoDA)、寡聚体库工程化(OPEN)和模块化装配。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一个方面，本文提供的ZFN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸。
大范围核酸酶
通常在微生物中鉴定出的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式通常具有扩展的DNA识别序列(例如，14至40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN的工程化更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中缠结在一起。已经使用专门的诱变方法和高通量筛选来产生新颖的大范围核酸酶变体，该新颖的大范围核酸酶变体识别独特序列并具有改善的核酸酶活性。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一个方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸。
TALEN
TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并引起靶位点处的双链DNA断裂。除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokⅠ结构域用作二聚体，从而需要两个构建体，所述两个构建体具有针对靶基因组中具有适当的定向和间隔的位点的独特DNA结合结构域。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目都是用于实现高水平活性的参数。
TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。在一些方面，核酸酶选自由以下项组成的组：PvuII、MutH、TevI和FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051、Pept071。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并引起靶位点处的双链DNA断裂。
如本文所用的术语TALEN是广泛的，并且包括可以在没有另一个TALEN帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指一对TALEN中的一个或两个成员，该一对TALEN共同作用以在相同位点切割DNA。
转录激活因子样效应物(TALE)可经工程化以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白质是来源于黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。X病原体在感染期间将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在细胞核处TALE识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中的特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由13-28个33-34个氨基酸的重复单体构成的中心DNA结合结构域。除了位置12和13处的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都是高度保守的。该两种可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。
除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域用作二聚体，从而需要两个构建体，所述两个构建体具有针对靶基因组中具有适当的定向和间隔的位点的独特DNA结合结构域。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目都是用于实现高水平活性的参数。PvuII、MutH、和TevI切割结构域是与TALE一起使用的FokI和FokI变体的可用替代物。PvuII在耦合到TALE时用作高特异性切割结构域(参见Yank等人，2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人，2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在靶向位点处的DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人，2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。可使用诸如DNA Works的软件程序来设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人，Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一个方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸。
CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9系统或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代方案。在一个方面，本文提供的基因组编辑系统包括CRISPR系统。CRISPR系统基于RNA引导的工程化核酸酶，该RNA引导的工程化核酸酶使用互补碱基配对来识别靶位点处的DNA序列。
在一个方面，本文提供的载体可包含编码RNA引导的核酸酶的核酸序列的任何组合。
虽然不受任何特定科学理论的限制，但是CRISPR/Cas核酸酶是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割靶DNA来保护它们免受诸如病毒之类的入侵核酸。通过在CRISPR基因座(CRISPR阵列)的近端处的约20个核苷酸长的CRISPR重复序列之间整合入侵DNA的短片段(称为间隔区)来获取免疫力。充分描述的Cas蛋白是Cas9核酸酶(也称为Csn1)，其是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中的2类II型CRISPR/Cas系统的一部分。参见Makarova等人，Nature Reviews Microbiology(2015)doi：10.1038/nrmicro3569。Cas9包含在其氨基末端的RuvC样核酸酶结构域和位于该蛋白质中间的HNH样核酸酶结构域。Cas9蛋白还含有PAM相互作用(PI)结构域、识别叶(REC)和BH结构域。另一种II型系统Cpf1核酸酶以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。参见Cong等人，Science(2013)339:819-823；Zetsche等人，Cell(2015)doi：10.1016/j.cell.2015.09.038；美国专利公开No.2014/0068797；美国专利公开No.2014/0273235；美国专利公开No.2015/0067922；美国专利No.8,697,359；美国专利No.8,771,945；美国专利No.8,795,965；美国专利No.8,865,406；美国专利No.8,871,445；美国专利No.8,889,356；美国专利No.8,889,418；美国专利No.8,895,308；以及美国专利No.8,906,616，该等文献中的每一者全文以引用方式并入本文。
当Cas9或Cpf1切割靶向DNA时，内源性双链断裂(DSB)修复机制被激活。DSB可以经由非同源末端连接修复，该非同源末端连接修复可以将插入或缺失(插入和缺失)结合到靶向基因座中。如果产生两个位于一个靶区域侧翼的DSB，则可以通过逆转靶向DNA的定向来修复断裂。或者，如果提供与靶向DNA序列具有同源性的供体多核苷酸，则可以通过同源定向修复来修复DSB。该修复机制允许将供体多核苷酸精确整合到靶向DNA序列中。
虽然不受任何特定科学理论的限制，但在2类II型CRISPR/Cas系统中，CRISPR阵列(包括间隔区)在与公认的入侵DNA相遇时被转录，并被加工成小的干扰CRISPR RNA(crRNA)，所述crRNA的长度为约40个核苷酸。crRNA与反式激活的crRNA(tracrRNA)杂交以激活并引导Cas9核酸酶进入靶位点。本文提供的核酸分子可以将crRNA和tracrRNA组合成一个核酸分子，该核酸分子在本文中被称为“单链指导RNA(sgRNA)”。切割靶位点的先决条件是在靶DNA下游存在保守的前间隔序列-相邻基序(protospacer-adjacent motif,PAM)，该PAM通常具有序列5-NGG-3，但NAG较不频繁。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，该“种子序列”必须在RNA与靶DNA之间匹配。Cpf1以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。因此，在利用Cpf1的方面，sgRNA可以被crRNA替代。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶。在另一个方面，本文提供的Cas9核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶。在另一个方面，本文提供的Cpf1核酸酶能够产生靶向DSB。
在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种sgRNA的载体。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种sgRNA的载体。在另一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供包含编码Cpf1的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的载体。
在一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式，Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性示例包括Argonaute嗜热栖热菌(TtAgo)、Argonaute强烈炽热球菌(PfAgo)、Argonaute格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo)，它们的同源物、它们的改性形式)、Argonaute蛋白的DNA指导物，以及它们的任何组合。在另一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由Cas9和Cpf1组成的组。在另一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶包括Cas9。在一个方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在一个方面，位点特异性核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、TtAgo、PfAgo，以及NgAgo。在另一个方面，RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、TtAgo、PfAgo，以及NgAgo。
转化
根据本公开内容的各方面，提供了用于重组DNA分子或构建体转化细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至启动子的可转录DNA序列或转基因，以产生转基因的或基因组编辑的细胞。根据本公开的其他方面，提供了用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至植物可表达的启动子的可转录DNA序列或转基因，以产生转基因的或基因组编辑的植物或植物细胞。
用于利用重组DNA分子或构建体转化植物细胞中的染色体或质体的许多方法是本领域已知的，所述方法可以根据本公开的方法使用以产生转基因的植物细胞和植物。可以根据本发明方法使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，诸如农杆菌属介导的或根瘤菌属(Rhizhobium)介导的转化和微粒轰击介导的转化。本领域已知有多种方法用于经由细菌介导的转化或微粒轰击使用转化载体来转化外植体，然后培养这些外植体以使转基因植物再生或发育。用于植物转化的其他方法，诸如显微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅拌、PEG介导的转化等，也是在本领域中已知的。通过这些转化方法产生的转基因植物取决于所用的方法和外植体而对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，用于通过微粒轰击使用包被有重组DNA的颗粒转化植物细胞的具体说明见于美国专利No.5,550,318；No.5,538,880；No.6,160,208；No.6,399,861；以及No.6,153,812中；并且农杆菌属介导的转化描述于美国专利No.5,159,135；No.5,824,877；No.5,591,616；No.6,384,301；No.5,750,871；No.5,463,174；和No.5,188,958中，所有这些专利都以引用方式并入本文。用于转化植物的其他方法可见于例如Compendium of Transgenic Crop Plants(2009)BlackwellPublishing中。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来用本文提供的任何核酸分子转化植物细胞。
或者，可将本公开的核苷酸序列引入生物体中并使其经历与生物体基因组的同源区域的重组。这种同源重组方法是本领域普通技术人员所熟知的，并且可用于将本发明的序列稳定地结合到生物体中。此外，此类策略可用于将“敲除突变”引入生物体的特定基因中，该基因与本公开的序列共享基本同源性。敲除突变是基因序列中消除或基本上降低由基因编码的产物的功能或水平的任何突变。涉及转化生物体然后进行同源重组以将本公开的序列稳定整合到生物体基因组中的方法包括在本公开内容中。本公开内容特别涉及利用本公开的序列来改变生物体生长的方法。此类方法包括使用本公开的序列来干扰控制生物生长的P糖蛋白的功能或合成。
已经转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化菌株或不同菌株授粉，并鉴定出具有所需表型特性的组成型表达的所得杂合体。可以生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传所需表型特性的组成型表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特性的组成型表达。
用于转化的受体细胞或外植体靶包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚胎细胞、胚乳细胞、根细胞、枝条细胞、茎细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、秆细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞或维管组织细胞。在另一个方面，本公开提供植物叶绿体。在另一个方面，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞或块茎细胞。在另一个方面，本公开提供了原生质体。在另一个方面，本公开提供了植物愈伤组织细胞。可以再生可育植物的任何细胞被认为是用于实践本公开的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种组织来源开始，包括但不限于未成熟胚或胚的各部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。这些能够作为愈伤组织增殖的细胞可以作为用于转化的受体细胞。用于制备本公开的转基因植物的实际转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化，以及随后可育转基因植物的再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公开2004/0216189中，所有这些专利都以引用方式并入本文。如本领域已知的，可以对转化的外植体、细胞或组织进行附加的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。根据本领域已知的方法，可以将含有重组DNA插入的转化细胞、组织或外植体在培养物、穴盘(plug)或土壤中培养、发育或再生成转基因植物。在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一个方面，本发明还提供了为繁殖材料并介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一个方面，本发明提供了不能经由光合作用维持自身的植物细胞。在另一个方面，本公开内容提供了植物体细胞。与种系细胞不同，体细胞不介导植物繁殖。
转基因植物可以进一步与自身或其他植物杂交以产生转基因种子和子代。还可以通过将包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏插入的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将重组DNA构建体或序列引入易于转化的第一植物株系中，然后可以将该第一植物株系与第二植物株系杂交以将重组DNA构建体或序列渗入第二植物株系中。这些杂交的子代可以诸如通过6至8个世代或6至8次回交而进一步多次回交成更理想的品系，以产生与原始亲本品系具有基本上相同的基因型，但引入了重组DNA构建体或序列的子代植物。
本文提供的植物、细胞或外植体可以是优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指通过育种和选择优异农艺性能而产生的任何品种。本文提供的植物、细胞或外植体可以是杂交植物、细胞或外植体。如本文所用，通过以下方式来产生“杂种”：将来自不同品种、品系或物种的两种植物杂交，使得子代包含来自每个亲本的遗传物质。熟练的技术人员认识到也可以产生更高阶的杂种。例如，可以通过将品种C与品种D杂交以产生C×D杂种来制备第一杂种，并且可以通过将品种E与品种F杂交以产生E×F杂种来制备第二杂种。可以将第一杂种和第二杂种进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的高阶杂种(C×D)×(E×F)。
本发明的重组DNA分子或构建体可包含用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体，或包含在用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体中。除了至少一种选择标记基因、编码一种或多种位点特异性核酸酶的至少一种表达盒和/或可转录DNA序列，以及任选的一种或多种sgRNA或crRNA之外，本公开的此类转化载体通常还可以包含对于有效转化必需或有益的序列或元件。对于农杆菌属介导的转化，转化载体可包含工程化的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，该区段或区域具有在至少可转录的DNA序列或转基因侧翼的两个边界序列左边界(LB)和右边界(RB)，使得将T-DNA插入植物基因组中将产生可转录的DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。换句话说，所述转基因(即编码位点特异性核酸酶的可转录的DNA序列、转基因或表达盒)和/或sgRNA或crRNA可能将与附加的转基因或表达盒(诸如植物选择标记转基因和/或可赋予植物感兴趣的农艺学性状或表型的其他农艺学上感兴趣的基因)一起位于T-DNA的左右边界之间。根据另选方面，编码至少一种位点特异性核酸酶的可转录的DNA序列、转基因或表达盒，任何必需的sgRNA或crRNA，以及植物选择标记转基因(或其他农艺学上感兴趣的基因)可以存在于相同或不同重组DNA分子上的单独T-DNA区段中，诸如以用于共转化。转化载体或构建体可以进一步包含原核维持元件，所述原核维持元件对于农杆菌属介导的转化可以位于T-DNA区域外的载体骨架中。
由于存在选择剂，诸如抗生素或除草剂，所以本公开的转化载体或构建体中的植物选择标记转基因可用于帮助选择转化的细胞或组织，其中植物选择标记转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可能偏向或有利于表达植物选择标记基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加转化细胞或组织在R0植物中的比例。常用的植物选择标记基因包括例如赋予对抗生素的耐受性或抗性的植物选择标记基因，诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)；或赋予对诸如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或Cp4-EPSPS)之类除草剂的耐受性或抗性的植物选择标记基因。还可以使用植物可筛选标记基因，所述植物可筛选标记基因提供视觉筛选转化体的能力，所述植物可筛选标记基因为诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)、或表达β葡糖醛酸酶的基因，或各种已知的生色底物的uidA基因(GUS)。在一个方面，本文提供的载体或多核苷酸包含选自由以下项组成的组的至少一种标记基因：nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、aroA、GFP，以及GUS。
根据本公开的各方面，用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法可以进一步包括使用位点特异性核酸酶的定点或靶向整合。根据这些方法，可以将一部分重组DNA供体分子(即，插入序列)插入或整合到基因组内的所需位点或基因座处。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如小的设计元件或组织特异性启动子。供体分子还可以在插入序列侧翼具有一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复来促进靶向插入事件。因此，本公开的重组DNA分子可以进一步包含用于将转基因或构建体(诸如编码小的设计元件或组织特异性启动子的转基因或可转录的DNA序列)定点或靶向整合到基因组中的供体模板。
本公开的一些方面涉及筛选用于靶向编辑的细胞或植物并选择包含靶向编辑的细胞或植物。可以使用本领域常规技术分离核酸。例如，可以使用包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)的任何方法来分离核酸。一般PCR技术描述于例如PCRPrimer:A Laboratory Manual,Dieffenbach和Dveksler编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如限制酶消化和连接，所述重组核酸技术可用于分离核酸。分离的核酸也可以化学合成作为单一核酸分子或作为一系列寡核苷酸。可以通过诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析之类的已知方法从天然来源(例如的生物样品)纯化多肽。例如，也可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，纯化的多肽可以通过化学合成获得。多肽的纯度可以使用例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析之类的任何合适方法测量。
在一个方面，本公开提供了检测植物细胞中的重组核酸和多肽的方法。不受限制，也可以使用杂交来检测核酸。在Sambrook等人(1989，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中详细讨论了核酸之间的杂交。
可以使用抗体来检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记，免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法产生对本文提供的多肽具有特定结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附接至诸如微量滴定板之类的固相支撑物。
可以使用可检测标记来完成检测(例如，对扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)。术语“标记”旨在包括使用直接标记以及间接标记。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料，以及放射性材料。
经改性的或转基因的植物或植物细胞的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的示例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、新一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定，以及蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀，以及用于检测多肽的酶联免疫测定。其他技术，诸如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有参考技术的方法是已知的。
本领域已知的用于抑制靶基因的任何方法可用于根据本公开的各方面抑制BR基因，包括反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过表达小的干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA)进行共抑制或RNA干扰(RNAi)。此外，可以使用靶向基因内或基因附近的非编码基因组序列或区域的有义和/或反义RNA分子，以使该基因沉默。因此，这些方法中的任何一种都可以用于以组织特异性或组织偏好型方式对内源BR基因进行靶向抑制。参见例如美国专利申请公开No.2009/0070898、No.2011/0296555和No.2011/0035839，该等美国专利申请公开的内容和公开内容以引用方式并入本文。
本文所用的术语“抑制”是指与由靶基因编码的mRNA和/或蛋白质在处于给定植物发育阶段的野生型或对照植物、细胞或组织中的表达水平相比较，此类靶mRNA和/或蛋白质在处于同一植物发育阶段的植物、植物细胞或植物组织中的表达水平降低、下降或消除。根据本公开的各方面，本文提供的经改性或转基因的植物包含与对照植物相比降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的BR表达水平。根据本公开的各方面，本文提供的经改性或转基因的植物包含与对照植物相比降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％或10％-75％的BR表达水平。
用于生产半矮化玉米植物的方法
本公开还提供了用于生产半矮化玉米植物的方法，所述方法包括提供识别玉米细胞中BR基因中的靶位点的指导RNA，其中所述指导RNA与在靶位点产生链断裂的RNA引导的核酸酶相关联地起作用；从玉米细胞产生玉米植物；以及选择表现出半矮化表型的玉米植物。
如本文所用，术语“指导RNA”或“gRNA”是短RNA序列，该短RNA序列包含(1)与RNA引导的核酸酶结合所必需的支架RNA序列，和(2)与靶序列或靶位点互补的RNA序列。在一个方面，支架RNA序列如SEQ ID NO:5所示。在另一个方面，BR2基因的靶序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:17所示。
在一个方面，gRNA包含如SEQ ID NO:6所示的序列。在一个方面，gRNA包含与如SEQID NO:6所示的核苷酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的序列。
如本文所用，“RNA引导的核酸酶”是指与CRISPR系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶。RNA引导的核酸酶的非限制性示例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、它们的同源物或它们的改性形式。在一个方面，RNA引导的核酸酶是Cas9。在一个方面，RNA引导的核酸酶包含与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的核苷酸序列。在另一个方面，RNA引导的核酸酶包含与如SEQ ID NO:2所示的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一个方面，RNA引导的核酸酶包含N末端和C末端核定位序列(NLS)。在一个方面，N末端NLS位于SEQ ID NO:1的核苷酸位置4至33，并且C末端NLS位于SEQ ID NO:1的核苷酸位置3586至3615。
如本文所用，术语“靶位点”或“靶序列”是指与位点特异性核酸酶结合并被该位点特异性核酸酶切割，从而将链断裂引入核酸骨架中的多核苷酸序列位置。在一个方面，链断裂是双链断裂。靶位点紧邻2-6个碱基对的DNA序列的上游存在，也称为前间隔序列相邻基序(PAM)。在另一个方面，靶位点包含至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个，或至少30个连续核苷酸。在另一个方面，本文提供的靶位点为至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸。在一个方面，位点特异性核酸酶结合至靶位点。在另一个方面，位点特异性核酸酶经由指导的非编码RNA(即，诸如但不限于CRISPR RNA或单链指导RNA(均在详下面详细描述))结合至靶位点。在一个方面，本文提供的非编码RNA与靶位点互补。应当理解，非编码RNA不需要完全互补性来结合靶位点；靶位点与非编码RNA之间的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、或至少5个、至少6个、至少7个或至少8个错配是可以耐受的。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧接两个或更多个靶位点的多核苷酸序列。不受限制，在一些方面，靶区域可以进行缺失或倒位。如本文所用，“侧接”当用于描述靶区域时，是指两个或更多个靶位点物理围绕靶区域，在靶区域的每一侧上具有一个靶位点。
靶位点可位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、多腺苷酸化位点或终止序列的多核苷酸序列中。应当理解，靶位点也可以位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、多腺苷酸化位点或终止序列的序列的上游或下游。在一个方面，靶位点位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、多腺苷酸化位点、基因或终止序列的多核苷酸的10个核苷酸内、20个核苷酸内、30个核苷酸内、40个核苷酸内、50个核苷酸内、75个核苷酸内、100个核苷酸内、125个核苷酸内、150个核苷酸内、200个核苷酸内、250个核苷酸内、300个核苷酸内、400个核苷酸内、500个核苷酸内、600个核苷酸内、700个核苷酸内、800个核苷酸内、900个核苷酸内、1000个核苷酸内、1250个核苷酸内、1500个核苷酸内、2000个核苷酸内、2500个核苷酸内、5000个核苷酸内、10,000个核苷酸内、或25,000个核苷酸内。
在一个方面，靶位点是BR2基因。在另一个方面，靶位点在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的启动子中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，靶位点在BR2基因的内含子4中。
在一个方面，靶位点包含如SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。另一方面，靶位点包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
如本文所用，“供体分子”被定义为已经选择用于定点靶向插入基因组中的核酸序列。在一个方面，本文提供的靶向编辑技术包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种供体分子。本文提供的供体分子可以为任何长度。例如，本文提供的供体分子的长度在2与50,000个核苷酸之间、2与10,000个核苷酸之间、2与5000个核苷酸之间、2与1000个核苷酸之间、2与500个核苷酸之间、2与250个核苷酸之间、2与100个核苷酸之间、2与50个核苷酸之间、2与30个核苷酸之间、15与50个核苷酸之间、15与100个核苷酸之间、15与500个核苷酸之间、15与1000个核苷酸之间、15与5000个核苷酸之间、18与30个核苷酸之间、18与26个核苷酸之间、20与26个核苷酸之间、20与50个核苷酸之间、20与100个核苷酸之间、20与250个核苷酸之间、20与500个核苷酸之间、20与1000个核苷酸之间、20与5000个核苷酸之间，或20与10,000个核苷酸之间。供体分子可包含编码有效转录和/或翻译的基因序列的一种或多种基因。此类转录的序列可以编码蛋白质或非编码RNA。在一些方面，供体分子可包含不包含功能基因或完整基因的多核苷酸序列(即，供体分子可简单地包含调控序列，诸如启动子)，或可以不含任何可识别的基因表达元件或任何有效转录的基因序列。此外，供体分子可以是线性或环状的，并且可以是单链或双链的。它可以分别作为裸核酸，作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、泊洛沙姆、用蛋白质包封的T-链等)的复合物或包含在细菌或病毒递送载体(例如根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或双生病毒)中而递送至细胞。在另一个方面，本文提供的供体分子与启动子可操作地连接。在另一个方面，本文提供的供体分子被转录成RNA。在另一个方面，本文提供的供体分子不与启动子可操作地连接。
在一个方面，本文提供的供体分子可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种，或至少十种基因。在一个方面，本文提供的供体分子不包含基因。不受限制，本文提供的基因可包括杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、选择标记基因、RNAi构建体、位点特异性基因组改性酶基因、CRISPR/Cas9系统的单链指导RNA、基于双生病毒的表达盒，或植物病毒表达载体系统。在一个方面，所述供体分子包含编码启动子的多核苷酸。在另一个方面，本文提供的供体分子包含编码组织特异性启动子或组织偏好型启动子的多核苷酸。在另一个方面，本文提供的供体分子包含编码组成型启动子的多核苷酸。在另一个方面，本文提供的供体分子包含编码诱导型启动子的多核苷酸。在另一个方面，供体分子包含编码选自由以下项组成的组的结构的多核苷酸：前导序列、增强子、转录起始位点、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、多腺苷酸化位点、转录终止位点、启动子、全长基因、部分基因、基因，或非编码RNA。
可以潜在地选择植物基因组内的任何位点或基因座来定点整合供体序列。对于定点整合，可首先使用位点特异性核酸酶在选定的基因组基因座处制备双链断裂(DSB)或切口，所述位点特异性核酸酶为例如锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE内切核酸酶、或RNA引导的内切核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)。可以使用本领域已知的任何用于定点整合的方法。在供体序列存在下，然后可以通过供体模板的同源臂与植物基因组之间的同源重组，或通过非同源末端连接(NHEJ)来修复DSB或切口，从而导致将供体序列定点整合到植物基因组中以在DSB或切口的位点处产生靶向插入事件。因此，可以实现转基因或构建体的位点特异性插入或整合。
在一个方面，可以在不存在供体序列的情况下，将序列插入通过基于CRISPR的基因组编辑系统产生的双链断裂中。在一个方面，可以在没有供体序列的情况下，经由非同源末端连接(NHEJ)来实现到通过基于CRISPR的基因组编辑系统产生的双链断裂中的单碱基插入。在另一个方面，可以经由本公开的基于CRISPR的基因组编辑系统将单个碱基插入BR2基因中。在一个方面，可以将单个碱基插入BR2基因的外显子1中，从而产生提前终止密码子。在另一个方面，可以将单碱基插入BR2基因的外显子2中，从而产生提前终止密码子。在另一个方面，可以将单碱基插入BR2基因的外显子3中，从而产生提前终止密码子。在另一个方面，可以将单碱基插入BR2基因的外显子4中，从而产生提前终止密码子。在另一个方面，可以将单碱基插入BR2基因的外显子5中，从而产生提前终止密码子。
在另一个方面，可以将供体序列插入或整合到由与RNA引导的核酸酶相关联地起作用的指导RNA产生的链断裂中。在一个方面，该链断裂是双链断裂(DSB)。该供体序列可包含转基因或构建体，诸如靶向BR基因的非编码RNA分子。在一个方面，供体序列将提前终止密码子引入BR2基因。在一个方面，将提前终止密码子插入BR2基因的外显子1中。在另一个方面，将提前终止密码子插入BR2基因的外显子2中。在另一个方面，将提前终止密码子插入BR2基因的外显子3中。在另一个方面，将提前终止密码子插入BR2基因的外显子4中。在另一个方面，将提前终止密码子插入BR2基因的外显子5中。
根据本公开的一个方面，用于生产半矮化玉米植物的方法产生至少一种非天然BR或BR2突变，所述方法进一步包括整合到序列中的链断裂中。在一个方面，将该序列经由非同源末端连接(NHEJ)整合到BR或BR2基因中。在一个方面，该序列是单个鸟嘌呤。在另一个方面，该序列是单个胞嘧啶。在另一个方面，该序列是单个腺嘌呤。在另一个方面，该序列是单个胸腺嘧啶。在另一个方面，序列是单个尿嘧啶。在另一个方面，根据BR2开放阅读框将胸腺嘧啶插入在核苷酸编号5420与5421之间以产生提前终止密码子。
在一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的启动子中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子4中。
在一个方面，该序列包含至少2个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少3个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少4个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少5个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少6个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少7个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少8个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少9个核苷酸。在另一个方面，该序列包含至少10个核苷酸。在一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子4中。
在另一个方面，经由同源重组(HR)通过供体序列将该序列整合到BR或BR2基因中。在一个方面，该序列是单核苷酸。在一个方面，该序列是单个鸟嘌呤。在另一个方面，该序列是单个胞嘧啶。在另一个方面，该序列是单个腺嘌呤。在另一个方面，该序列是单个胸腺嘧啶。在另一个方面，序列是单个尿嘧啶。在另一个方面，根据BR2开放阅读框将胸腺嘧啶插入在核苷酸编号5420与5421之间以产生提前终止密码子。在一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的启动子中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，单核苷酸整合在BR2基因的内含子4中。
在一个方面，该序列包含至少2个核苷酸，并通过供体序列整合到BR或BR2基因内。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子1中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子2中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子3中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子4中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的外显子5中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的3'UTR中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的5'UTR中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的启动子中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子1中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子2中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子3中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在另一个方面，该序列整合在BR2基因的内含子4中，其中该序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
在一个方面，用于生产半矮化玉米植物的方法还包括将至少一个取代、至少一个倒位、至少一个缺失、至少一个复制或它们的组合整合到链断裂中。
在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个取代在BR2基因的内含子4中。
在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个缺失在BR2基因的内含子4中。
在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子1中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子2中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子3中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子4中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的外显子5中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的3'UTR中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的5'UTR中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的启动子中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子1中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子2中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子3中。在另一个方面，该至少一个复制在BR2基因的内含子4中。
半矮化表型
本文公开的矮秆、矮化或半矮化玉米可具有使其适合于籽粒和饲料生产，尤其是在短季环境中生产的特征。具体地，短季环境中的有限热量单位降低了籽粒产量并降低了作物在给定年份内达到生理成熟的可能性。所公开的矮秆、矮化或半矮化玉米植物比常规杂种需要更少的热单位(例如，需要10％)来达到开花期并且通常比常规栽培种更早地达到生理成熟。由于较短的秆和较低的穗布置，本文公开的半矮化玉米植物不易发生秆和根倒伏。本文公开的玉米植物还由于其高穗与秸秆比率而具有生产高质量饲料的潜力。
矮身材或半矮玉米植物也可具有一种或多种附加性状，包括但不限于茎直径增加、绿色折断减少、根加深，叶面积增大、冠层郁闭提前，气孔导度升高、穗高度降低、叶片含水量增大、耐旱性提高、氮利用效率提高、水利用效率提高、在正常或氮或水限制性胁迫条件下叶中的花青素含量和面积减少、穗重增加、籽粒数增加、籽粒重量增加、产量增加、种子数量增加、种子重量增加，以及繁殖力增加，和/或增加的收获指数。
根据本公开的实施方案，提供了经改性的谷类或玉米植物，所述经改性的谷类或玉米植物具有至少一种有益的农艺性状和基本上或完全不含非正常型的至少一种雌性生殖器官或穗。该有益的农艺性状可包括但不限于较矮的株高、一个或多个节间中较短的节间长度、较大(较厚)的茎或秆直径、增强的抗倒伏性、提高的耐旱性、提高的氮利用效率、增加的水利用效率、更深的根、更大的叶面积、提前的冠层郁闭和/或增加的可收获产量。如本文所用，“收获指数”是指收获的籽粒的质量除以收获区域上植物的地上生物质的总质量。
在一个方面，相对于在可比条件下生长的未提供指导RNA和RNA引导的核酸酶的对照植物，表现出半矮化表型的玉米植物的成熟时高度降低了约10％、20％、30％、40％、60％或70％。
在另一个方面，表现出半矮化表型的玉米植物的产量等于或大于在可比条件下生长的未提供指导RNA和RNA引导的核酸酶的对照植物的产量。
在另一个方面，表现出半矮化表型的玉米植物比未提供指导RNA和RNA引导的核酸酶的对照植物需要少约5％、10％、15％、20％或25％的热量单位来达到开花期。
在另一个方面，表现出半矮化表型的玉米植物的相对成熟度比在可比条件下生长的未提供指导RNA和RNA引导的核酸酶的对照植物的相对成熟度的天数少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物包括小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm或小于1000mm的高度和至少17.5mm、至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm、或至少22mm的平均茎直径。根据另一方面，所述经改性的玉米植物还包括至少一个基本上不含成熟雄性生殖组织的穗。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物包括在1000mm与1600mm之间、在1000mm与1500mm之间、在1050mm与1500mm之间、在1100mm与1500mm之间、在1150mm与1500mm之间、在1200mm与1500mm之间、在1250mm与1500mm之间、在1300mm与1500mm之间、在1350mm与1500mm之间、在1400mm与1500mm之间、在1450mm与1500mm之间、在1000mm与1600mm之间、在1100mm与1600mm之间、在1200mm与1600mm之间、在1300mm与1600mm之间，或在1000mm与1300mm之间的高度，以及在17.5mm与22mm之间、在18mm与22mm之间、在18.5与22mm之间、在19mm与22mm之间、在19.5mm与22mm之间、在20mm与22mm之间、在20.5mm与22mm之间、在21mm与22mm之间、在21.5mm与22mm之间、在17.5mm与21mm之间、在17.5mm与20mm之间、在17.5mm与19mm之间、在17.5mm与18mm之间、在18mm与21mm之间、在18mm与20mm之间，或在18mm与19mm之间的平均茎直径。根据另一方面，所述经改性的玉米植物还包括至少一个基本上不含成熟雄性生殖组织的穗。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物包括比未改性的对照植物的高度矮至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的高度，以及比未改性的对照植物的茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的茎直径。根据本公开的另一方面，本文提供的经改性的玉米植物包括比未改性的对照植物的高度矮在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间，或在50％与75％之间的高度，以及比未改性的对照植物的茎直径大在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间，或在50％与75％之间的茎直径。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物包括比未改性的对照植物的鲜穗重量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少100％的鲜穗重量。根据本公开的另一方面，本文提供的经改性的玉米植物包括比比未改性的对照植物的鲜穗重量大在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间，或在50％与75％之间的鲜穗重量。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物包括至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64，或至少0.65的收获指数。根据本发明的另一方面，本文提供的经改性的玉米植物包括在0.57与0.65之间、在0.57与0.64之间、在0.57与0.63之间、在0.57与0.62之间、在0.57与0.61之间、在0.57与0.60之间、在0.57与0.59之间、在0.57与0.58之间、在0.58与0.65之间、在0.59与0.65之间，或者在0.60与0.65之间的收获指数。根据本公开的又一方面，本文提供的经改性的玉米植物包括与未改性的对照植物相比大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％，或至少50％的收获指数。根据本公开的又一方面，本文提供的经改性的玉米植物包括与未改性的对照植物相比大在1％与45％之间、在1％与40％之间、在1％与35％之间、在1％与30％之间、在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与30％之间，或在5％与40％之间的收获指数。
根据本公开的一个方面，本文提供的经改性的玉米植物的群体包括与未改性的对照植物的群体相比低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％的倒伏频率。根据本公开的另一方面，本文提供的经改性的玉米植物的群体包括与未改性的对照植物的群体相比低在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间，或在50％与75％之间的倒伏频率。
根据一个方面，本公开提供了一种经改性的玉米植物的群体，其中所述经改性的玉米植物的群体与经单一改性的玉米植物共享祖先，其中所述经改性的玉米植物的群体包括1500mm或更矮的平均高度，其中所述经改性的玉米植物的群体的平均茎直径为18mm或更大，其中所述经改性的玉米植物的群体中的小于5％、小于10％、小于15％、小于20％或小于25％包括大于1500mm的高度，并且其中所述经改性的玉米植物的群体中的少于5％、少于10％、少于15％、少于20％或少于25％包括至少一个包含成熟雄性生殖组织的穗。在另一个方面，经改性的玉米植物的群体的平均高度为1200mm或更低。
根据一个方面，本公开提供了一种经改性的玉米植物的群体，其中所述经改性的玉米植物的群体与经单一改性的玉米植物共享祖先，其中所述经改性的玉米植物的群体包括1500mm或更矮的平均高度，其中所述经改性的玉米植物的群体中的小于5％、小于10％、小于15％、小于20％或小于25％的高度大于1500mm，并且所述经改性的玉米植物的群体的倒伏频率与未改性的对照玉米植物的群体相比低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
根据一个方面，本公开提供了一种经改性的玉米植物，所述经改性的玉米植物的高度为1500mm或更矮，其中所述经改性的玉米植物还包括为18mm或更大的茎直径，并且其中所述经改性的玉米植物的至少一个穗基本上不含成熟的雄性生殖组织。
根据一个方面，本公开提供了一种经改性的玉米植物，所述经改性的玉米植物包括1500mm或更矮的高度，其中所述经改性的玉米植物还包括至少0.58的收获指数，并且其中所述经改性的玉米植物还包括至少一个基本上不含成熟的雄性生殖组织的穗。
示例性实施方案
以下是本说明书的示例性实施方案。
实施方案1.一种玉米植物，所述玉米植物包含至少一种非天然矮秆突变，其中与在可比条件下生长时不包含所述至少一种非天然矮秆突变的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出半矮化表型。
实施方案2.一种矮秆玉米植物，所述矮秆玉米植物包含至少一种非天然矮秆突变。
实施方案3.一种矮秆玉米植物，所述矮秆玉米植物包含至少一个非天然矮秆突变等位基因。
实施方案4.一种玉米植物，所述玉米植物包含至少一种表现出半矮化表型的非天然矮秆突变。
实施方案5.一种玉米植物，所述玉米植物包含至少一种表现出半矮化表型的非天然矮秆突变等位基因。
实施方案6.一种经改性的玉米植物，所述经改性的玉米植物包含BR基因中的非天然存在的突变，所述非天然存在的突变降低所述BR基因的活性，其中所述突变不是经由转座子引入的，并且其中所述经改性的玉米植物不包含br2-23矮秆等位基因或SNP5259。
实施方案7.一种经改性的玉米植物，所述经改性的玉米植物包含具有降低的活性的经改性的BR2基因，其中所述经改性的玉米植物不包含br2-23矮秆等位基因或SNP5259。
实施方案8.一种非转基因玉米植物，所述非转基因玉米植物包含BR基因中的合成突变，所述合成突变降低所述BR基因的活性。
实施方案9.一种经改性的玉米植物，所述经改性的玉米植物包含BR基因中的非转基因或非转座子介导的突变，所述突变降低所述BR基因的活性。
实施方案10.一种矮秆玉米植物，所述矮秆玉米植物包含显性的非转基因BR突变等位基因。
实施方案11.根据实施方案1所述的玉米植物，其中所述BR基因是BR2基因。
实施方案12.根据实施方案1或11所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然BR突变选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组。
实施方案13.根据实施方案12所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然BR突变是至少一个插入。
实施方案14.根据实施方案13所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案15.根据实施方案14所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的外显子5中。
实施方案16.根据实施方案13至15中任一项所述的玉米植物，其中所述至少一个插入包含至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
实施方案17.根据实施方案15所述的玉米植物，其中所述至少一个插入是选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶组成的组的单一核碱基。
实施方案18.根据实施方案17所述的玉米植物，其中所述单一核碱基是胸腺嘧啶。
实施方案19.根据实施方案18所述的经改性的玉米植物，其中所述单一胸腺嘧啶(T)插入根据BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间发生。
实施方案20.根据实施方案12所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然突变是至少一个取代。
实施方案21.根据实施方案20所述的玉米植物，其中所述至少一个取代在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案22.根据实施方案12所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然突变是至少一个缺失。
实施方案23.根据实施方案22所述的玉米植物，其中所述至少一个缺失在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案24.根据实施方案12所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然突变是至少一个复制。
实施方案25.根据实施方案24所述的玉米植物，其中所述至少一个复制在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案26.根据实施方案1至25中任一项所述的经改性的玉米植物，其中所述BR基因中的所述非天然存在的突变的存在对所述玉米植物的农艺或品质性质没有不利影响。
实施方案27.根据实施方案26所述的经改性的玉米植物，其中相对于对照玉米，表现出半矮化表型的所述经改性的玉米植物的成熟时高度降低了约10％、20％、30％、40％、60％，或70％。
实施方案28.根据实施方案26所述的经改性的玉米植物，其中所述经改性的玉米植物的产量等于或大于对照玉米植物的产量。
实施方案29.根据实施方案26所述的经改性的玉米植物，其中所述玉米植物需要比对照植物少约5％、10％、15％、20％或25％的热量单位。
实施方案30.根据实施方案26所述的经改性的玉米植物，其中所述经改性的玉米植物的相对成熟度比对照玉米植物的相对成熟度的天数少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
实施方案31.根据实施方案1至30中任一项所述的经改性的玉米植物，其中所述至少一种非天然BR突变以显性方式转移。
实施方案32.根据实施方案31所述的经改性的玉米植物，其中所述经改性的玉米植物可产生反义BR2转录物。
实施方案33.根据实施方案1至30中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于所述至少一种非天然矮秆突变是纯合的。
实施方案34.根据实施方案33所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组。
实施方案35.根据实施方案34所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变是至少一个插入。
实施方案36.根据实施方案35所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案37.根据实施方案36所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在BR2基因的外显子5中。
实施方案38.根据实施方案37所述的玉米植物，其中所述至少一个插入是选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶组成的组的单一核碱基。
实施方案39.根据实施方案38所述的玉米植物，其中所述单一核碱基是胸腺嘧啶。
实施方案40.根据实施方案39所述的玉米植物，其中所述单一胸腺嘧啶(T)插入根据BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间发生。
实施方案41.根据实施方案1至30中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于至少一种非天然矮秆突变是杂合的。
实施方案42.根据实施方案41所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含野生型BR2等位基因。
实施方案43.根据实施方案41所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含天然BR2突变等位基因。
实施方案44.根据实施方案43所述的玉米植物，其中所述天然BR2突变等位基因是br2-MX。
实施方案45.根据实施方案44所述的玉米植物，其中所述天然BR2突变等位基因包含在所述BR2基因的外显子5中插入4.7kb的转座子。
实施方案46.根据实施方案43至45中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组的至少一种非天然矮秆突变。
实施方案47.根据实施方案46所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变是至少一个插入。
实施方案48.根据实施方案47所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案49.根据实施方案48所述的玉米植物，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的外显子5中。
实施方案50.根据实施方案49所述的玉米植物，其中所述至少一个插入是选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶组成的组的单一核碱基。
实施方案51.根据实施方案50所述的玉米植物，其中所述单一核碱基是胸腺嘧啶。
实施方案52.根据实施方案51所述的玉米植物，其中所述单一胸腺嘧啶(T)插入根据BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间发生。
实施方案53.一种用于生产半矮化玉米植物的方法，所述方法包括：(a)提供识别玉米细胞中BR基因中的靶位点的指导RNA，其中所述指导RNA与在所述靶位点产生链断裂的RNA引导的核酸酶相关联地起作用，(b)从所述玉米细胞产生玉米植物，以及(c)选择表现出半矮化表型的所述玉米植物。
实施方案54.根据实施方案53所述的方法，所述方法进一步包括将序列整合到所述链断裂中，其中所述链断裂是双链断裂。
实施方案55.根据实施方案54所述的方法，其中所述序列是选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶组成的组的单一核碱基。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中所述单一核碱基是胸腺嘧啶。
实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中根据所述BR2开放阅读框将所述胸腺嘧啶插入在核苷酸编号5420与5421之间。
实施方案58.根据实施方案54所述的方法，其中所述序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸，或至少10个核苷酸。
实施方案59.根据实施方案54、55、56和58中任一项所述的方法，其中所述序列整合在BR2基因中。
实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中所述序列整合在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案61.根据实施方案54所述的方法，其中所述序列由供体序列引入。
实施方案62.根据实施方案61所述的方法，其中所述序列是选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶组成的组的单一核碱基。
实施方案63.根据实施方案62所述的方法，其中所述单一核碱基是胸腺嘧啶。
实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中根据BR2开放阅读框将所述胸腺嘧啶插入在核苷酸编号5420与5421之间。
实施方案65.根据实施方案61所述的方法，其中所述序列包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸。
实施方案66.根据实施方案61、62、63和65中任一项所述的方法，其中所述序列整合在BR2基因中。
实施方案67.根据实施方案66所述的方法，其中所述序列整合在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案68.根据实施方案53或54所述的方法，所述方法还包括将至少一个取代、至少一个倒位、至少一个缺失、至少一个复制或它们的组合整合到所述链断裂中。
实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中所述至少一个取代在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案70.根据实施方案68所述的方法，其中所述至少一个缺失在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案71.根据实施方案68所述的方法，其中所述至少一个复制在BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案72.根据实施方案53-71中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。
实施方案73.根据实施方案72所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9，所述Cas9包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
实施方案74.根据实施方案72或73所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶包含N末端核定位序列、C末端核定位序列，或两者。
实施方案75.根据实施方案73所述的方法，其中所述Cas9由与SEQ ID NO:1至少85％同一的核苷酸序列编码。
实施方案76.根据实施方案72所述的方法，其中所述靶位点在所述BR2基因的多核苷酸序列中选自由以下项组成的组的位置处：BR2启动子、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、3'UTR、5'UTR以及它们的组合。
实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述靶位点在外显子5中。
实施方案78.根据实施方案77所述的方法，其中所述靶位点包含选自由SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:17组成的组的核苷酸序列。
实施方案79.根据实施方案77所述的方法，其中所述靶位点包含如SEQ ID NO:15所示的序列。
实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中所述指导RNA包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案81.根据实施方案53至80所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物对于所述BR基因是纯合的、半合子的或杂合的。
实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物对于所述BR基因是纯合的。
实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物包含选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组的至少一种非天然矮秆突变。
实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其中所述至少一种非天然矮秆突变是至少一个插入。
实施方案85.根据实施方案84所述的方法，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的外显子5中。
实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述至少一个插入是根据所述BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间发生的单一胸腺嘧啶(T)插入。
实施方案87.根据实施方案81所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物对于所述BR基因是杂合的。
实施方案88.根据实施方案87所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物包含野生型BR2等位基因。
实施方案89.根据实施方案87所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物包含天然BR2突变等位基因。
实施方案90.根据实施方案89所述的方法，其中所述天然BR2突变等位基因是br2-MX。
实施方案91.根据实施方案89所述的方法，其中所述天然BR2突变等位基因包含在所述BR2基因的外显子5中插入4.7kb的转座子。
实施方案92.根据实施方案89至91中任一项所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述植物包含选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组的至少一种非天然矮秆突变。
实施方案93.根据实施方案92所述的方法，其中所述至少一种非天然矮秆突变是至少一个插入。
实施方案94.根据实施方案93所述的方法，其中所述至少一个插入在所述BR2基因的外显子5中。
实施方案95.根据实施方案94所述的方法，其中所述至少一个插入是根据所述BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间发生的单一胸腺嘧啶(T)插入。
实施方案96.根据实施方案53所述的方法，其中相对于在可比条件下生长的未提供所述指导RNA和所述RNA引导的核酸酶的对照植物，表现出半矮化表型的所述玉米植物的成熟时高度降低了约10％、20％、30％、40％、60％或70％。
实施方案97.根据实施方案53所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述玉米植物的产量等于或大于在可比条件下生长的未提供所述指导RNA和所述RNA引导的核酸酶的对照植物的产量。
实施方案98.根据实施方案53所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述玉米植物比未提供所述指导RNA和所述RNA引导的核酸酶的对照植物需要少约5％、10％、15％、20％或25％的热量单位来达到开花期。
实施方案99.根据实施方案53所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述玉米植物的相对成熟度比在可比条件下生长的未提供所述指导RNA和所述RNA引导的核酸酶的对照植物的相对成熟度的天数少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
实施方案100.一种基于CRISPR的基因组编辑系统，所述基于CRISPR的基因组编辑系统包含Cas9和指导RNA，其中所述基于CRISPR的基因组编辑系统降低BR基因的活性。
实施方案101.根据实施方案100所述的基于CRISPR的基因组编辑系统，其中所述BR基因是BR2基因。
实施方案102.根据实施方案101所述的基于CRISPR的基因组编辑系统，其中所述Cas9由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码。
实施方案103.根据实施方案100所述的基于CRISPR的基因组编辑系统，其中所述Cas9由与SEQ ID NO:1至少85％同一的核苷酸序列编码。
实施方案104.根据实施方案101所述的基于CRISPR的基因组编辑系统，其中所述指导RNA包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案105.一种用于切割玉米细胞中的BR基因的方法，所述方法包括将指导RNA和RNA引导的核酸酶提供到所述玉米细胞中，其中所述指导RNA与所述RNA引导的核酸酶相关联地起作用以在靶位点产生链断裂。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，所述方法还包括将核酸序列整合到所述链断裂中。
实施方案107.根据实施方案106所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9。
实施方案108.根据实施方案105所述的方法，其中所述BR基因是BR2基因。
实施方案109.根据实施方案105所述的方法，其中所述靶位点包含选自由SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:17组成的组的序列。
实施方案110.根据实施方案105所述的方法，其中所述指导RNA包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案111.根据实施方案105所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
实施方案112.根据实施方案105至111中任一项所述的方法，其中所述玉米细胞表达截短的BR蛋白，所述截短的BR蛋白导致半矮化表型。
实施例
实施例1.产生表现出半矮化表型的玉米植物
产生表达重组Cas9的构建体
将玉米优化形式的嗜热链球菌LMD9Cas9与N末端和C末端核定位信号(NLS)和内部内含子一起克隆到载体中(“重组Cas9”)。重组Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。N末端和C末端NLS分别位于SEQ ID NO:1的核苷酸位置4-33和3586-3615处，并且内部内含子位于SEQ ID NO:1的核苷酸位置507-695处。重组Cas9蛋白在大丽花花叶病毒(DaMV)启动子(SEQ ID NO:3)下表达。重组Cas9蛋白能够与具有5'AGAA'3的DNA序列的前间隔序列相邻基序(PAM)结合。将AGAA PAM序列用作Cas9的结合信号，并且由重组Cas9介导的DNA切割需要该序列的存在。
搜索BR2基因靶位点
搜索玉米BR2基因序列的具有N-20-NNAGAA构型的潜在AGAA PAM序列。将该序列用作重组Cas9的结合位点。因此，如下表所示选择与AGAA PAM序列相邻的11个靶指导RNA(gRNA)序列：
表I.BR2基因的靶序列
上述BR2gRNA中的每一者的靶序列在其5'末端处与启动子序列(SEQ ID NO:4)可操作地连接，并且在其3'末端处与支架指导gRNA序列(SEQ ID NO:5)可操作地连接。得到的完整单个指导RNA(sgRNA)序列如表I的最右列所示。
上述靶gRNA序列之一Br2gRNA9如SEQ ID NO:15所示，在其5'末端处与启动子序列(SEQ ID NO:4)可操作地连接，并且在其3'末端处与支架指导gRNA序列(SEQ ID NO:5)可操作地连接。将得到的序列(SEQ ID NO:6)经由载体在玉米细胞中表达，如下所述。
BR2基因的附加gRNA序列如SEQ ID NO:24-26所示。在SEQ ID NO:24-26中的每一者的5'末端处包括启动子(SEQ ID NO:4)的完整序列分别如SEQ ID NO:31-33所示。SEQ IDNO:20-23所示的序列是gRNA序列，所述gRNA序列能够结合至酿脓链球菌Cas9的玉米优化形式并靶向用于基因组编辑的BR2基因。在SEQ ID NO:20-23中的每一者的5'末端处包括启动子(SEQ ID NO:4)的表达盒序列分别如SEQ ID NO:27-30所示。
测试平末端双链DNA片段的插入
评估CRISPR/Cas9系统的功能性gRNA在将平末端双链DNA(dsDNA)插入BR2基因的切割位点中方面的靶向功效。如果重组Cas9具有内切核酸酶活性并将双链断裂(DSB)引入所选BR2靶位点的前间隔序列中，则内源性玉米非同源末端连接(NHEJ)DNA修复系统将使平末端dsDNA插入DSB中。
选择表I的11个sgRNA，并使用如上所述的SEQ ID NO:4所示的启动子在载体中表达。如下进行对Cas9/gRNA功效的原生质体测试：用(1)0.8pmol的表达重组Cas9蛋白的质粒，(2)1.6pmol的gRNA质粒和(3)50pmol的预退火的平末端dsDNA(SEQ ID NO:18和19)来转化玉米叶原生质体。为了测试转化效率，在原生质体转化中还包括2.5ug编码绿色荧光蛋白(GFP)的构建体。使用标准PEG介导的方案转化含有约320,000个细胞的玉米叶原生质体悬浮液的等分试样。
两天后，收集转化的玉米叶原生质体的等分试样，以在PE 成像系统(PerkinElmer,Waltham,MA)上计算转染频率，该成像系统计算GFP阳性细胞/总细胞的比率。在玉米原生质体转化期间的重组Cas9表达盒缺失作为阴性对照。转染后48小时收获原生质体，并通过使用用寡核苷酸特异性引物和基因特异性引物的PCR将平末端双链DNA片段插入到靶位点中来进行分析。
鉴定出两个靶序列能够将平末端dsDNA插入BR2基因的相应靶位点中。选择具有最小潜在脱靶的靶序列(SEQ ID NO:15)用于稳定转化(用于表达的完整序列如SEQ ID NO:6所示)。
玉米植物的转化和再生
使用标准根瘤农杆菌介导的转化，以使用转移DNA(T-DNA)二元载体系统，用Cas9和gRNA转化01DKD2玉米植物。简而言之，产生在35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子的控制下的含有草甘膦抗性CP4标记和编码重组Cas9和gRNA(SEQ ID NO:6)的序列的二元载体。创建标准辅助载体。将两种载体固定到感受态的根瘤农杆菌菌株中。通过非同源末端连接(NHEJ)，将单一核碱基胸腺嘧啶(T)根据BR2开放阅读框(ORF)添加在核苷酸编号5420与5421之间的BR2基因的外显子5中，或在去除内含子后添加在ORF的核苷酸编号2907与2908之间，从而在其中产生提前终止密码子，进而导致截短的BR2蛋白。
通过使用含有草甘膦的培养基从来自接种有根瘤农杆菌菌株的转化01DKD2玉米植物的枝条尖选择转基因植物。随后将再生的小植株转移到容器中并种植到生长室中的土壤中。
选择半矮化玉米植物
经由隐性等位基因转移与玉米中的BR2基因相关的半矮化性状。通过使第一回交世代生长和自交来进行对具有半矮化性状的转基因玉米植物的选择，以确定哪些植物携带隐性等位基因。在连续的回交世代中进行附加的子代测试以确定感兴趣的基因座的存在。最后的回交世代通常自交以产生截短的BR2基因的纯育种子代。
将表现出半矮化表型的天然BR2突变体用作对照。天然BR2突变体包含br2-MX等位基因。如图2所示，内含子4含有多个插入和缺失。外显子5中的4.7kb插入在其中引入了提前终止密码子。
半矮化表型
表现出半矮化表型的经基因组编辑的玉米植物如图3至图6所示。
图3示出了与野生型对照植物相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑的R1玉米植物在V6生长阶段的植物高度降低(半矮化)。
图4示出了与野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑的BR2 01DKD2玉米植物的植物高度降低(半矮化)。
图5A示出了与天然br2-MX突变体和野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑的BR2玉米植物的植物高度降低(半矮化)。经基因组编辑的植物的植物高度降低类似于天然br2-MX突变植物的植物高度。与野生型对照相比，两种植物均显示出显著的高度降低。
图5B示出了与杂合基因组编辑的BR2植物、负偏析基因组编辑的BR2植物和野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的纯合基因组编辑的BR2植物的植物高度降低。只有纯合的经基因组编辑的BR2植物表现出半矮化表型，表明这种性状以隐性方式传播。
图6示出了与天然BR2野生型对照相比，由于外显子5中的单个T插入而表达截短的BR2蛋白的基因组编辑的BR2玉米植物的节间较短。
实施例2.将BR2矮秆等位基因渗入以产生新的矮秆品种
将包含本文公开的矮秆等位基因的玉米植物与另一种包含所需性状(例如，在干旱、冷、热胁迫条件下改善的产量)的非矮秆玉米品系杂交。根据BR2基因的ORF，测定来自该次杂交的F1子代植物在核苷酸编号5420与5421之间的BR2基因外显子5中的单一胸腺嘧啶(T)插入。然后将选择的F1子代植物与包含所需性状的亲本非矮秆玉米品系(轮回亲本)进行回交。还针对单个T插入将来自BC1世代的植物进行基因分型，以选择矮秆等位基因。在多轮回交(例如，5-7个世代)后，获得了新的矮秆玉米品系，所述新的矮秆玉米品系包含轮回亲本优良品系中的所需性状。
实施例3.产生br2杂交玉米植物
通过育种，通过以下方式产生br2杂种玉米植物：将非br2/野生型或br2天然突变体(br2-MX)与br2基因组编辑的突变体(br2-GE)杂交。在本文公开的田间试验中生长和测量的杂种玉米植物汇总于下表2中：
表2.br2杂种和对照玉米植物
值得注意的是，01DKD2-ZAB-R1表示经基因组编辑的br2在玉蜀黍中的BR2ORF的核苷酸编号5420与5421之间的BR2基因外显子5中具有单个T插入(br2-GE)。CV666824和CV648265表示来自墨西哥的相同天然br2突变体，其中在BR2基因的外显子5中插入了4.7kb的转座子(br2-MX)，从而产生了提前终止密码子，进而导致具有1234个氨基酸残基的推定的截短BR2蛋白。01DKD2和CV126318都是非矮秆(野生型)近交玉米植物。
实施例4.br2杂交玉米植物的表型——田间试验
使用标准农艺实践将br2杂交玉米植物种植在处于自然病害条件下的田地中。具体地，种植八排玉米植物(两行之间30英寸)，其中每行12株玉米植物。测量至R3阶段的上部舌状叶的植物高度(“PHTR3”)，并测量至R3阶段的穗结节的穗高度(“EHTR3”)。在R3阶段的穗下方的两片叶子处测量秆直径(“STDIEM2R3”)。
还如下测量了与开花或产量构成因素相关的其他性状：花粉脱落与花丝出现之间的以天计的时间(开花-花丝间隔或“ASI”)；在R1阶段50％花粉脱落的以天计的时间(“P50DR1”)；在R1阶段50％花丝可见的以天计的时间(“S50DR1”)；通过在R6阶段成像测量的穗直径(“EDR6”)；在R6阶段的穗面积(通过成像测量的一侧)(“EAIMAR6”)；在R6阶段的自动化穗体积(“EAVR6”)；在R6阶段计算的穗体积(“ECVR6”)；在R6阶段的空穗尖百分比(“EVPCTR6”)；在R6阶段的空穗尖(“ETVR6”)；空穗尖百分比(“ETVPCR6”)；通过在R6阶段成像测量的穗长度(“ELENR6”)；在R6阶段的单谷粒重量(“SKWTR6”)；在R6阶段每单位面积的谷粒数(“KARR6”)；以及通过在R6阶段成像测量的空穗(“EVR6”)。
表3. 01DKD2-ZAB-R1+CV666824中的植物高度降低
如上表3所示，与CV648265+CV666824(包含两个br2-MX天然突变等位基因)相比，01DKD2-ZAB-R1+CV666824(包含一个br2-GE等位基因和一个br2-MX天然突变等位基因)具有4.8英寸的平均穗高度降低(EHTR3)和6.2英寸的平均株高度降低(PHTR3)。穗高度降低和植物高度降低均具有统计学显著性，其中p值<0.01。
在另一个方面，没有观察到开花或产量构成性状的统计学上显著的差异，所述开花或产量构成性状包括ASI、P50DR1、S50DR1、EDR6、EAIMAR6、EAVR6和ECVR6。
表4. 01DKD2-ZAB-R1+CV666824中的植物高度降低和秆直径增大
如上表4所示，与01DKD2+CV666824(包含野生型等位基因和一个br2-MX天然突变等位基因)相比，01DKD2-ZAB-R1+CV666824(包含一个br2-GE等位基因和一个br2-MX天然突变等位基因)具有24英寸的平均穗高度降低(EHTR3)和34.6英寸的平均株高度降低(PHTR3)。此外，与01DKD2+CV666824相比，01DKD2-ZAB-R1+CV666824的秆直径增长(STDIEM2R3)为平均0.3英寸。所有该三个测量值均具有统计学显著性，其中p值<0.01。
在另一个方面，没有观察到开花或产量构成性状的统计学上显著的差异，所述开花或产量构成性状包括EDR6、EVPCTR6、EAIMAR6、ETVR6、ETVPCR6、EAVR6、ELENR6、EVR6和ECVR6。
表5. 01DKD2-ZAB-R1+CV126318中的植物高度降低
如上表5中所示，与01DKD2+CV126318(包含两个野生型BR2等位基因)相比，01DKD2-ZAB-R1+CV126318(包含一个br2-GE等位基因和一个野生型BR2等位基因)具有2.0英寸的平均穗高度降低(EHTR3)和2.2英寸的平均株高度降低(PHTR3)。这些测量值具有统计学显著性，其中p值≤0.04。
在另一个方面，没有观察到开花或产量构成性状的统计学上显著的差异，所述开花或产量构成性状包括ASI、P50DR1、S50DR1、KPER6、ETVPCR6、EAVR6、ELENR6、EDR6、EAIMAR6、SKWTR6、ETVR6、ECVR6、KARR6、EVPCTR6和EVR6。
Claims (20)
1.一种玉米植物，所述玉米植物包含至少一种非天然矮秆突变，其中与在可比条件下生长时不包含所述至少一种非天然矮秆突变的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出半矮化表型。
2.根据权利要求1所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变在BR基因中发生以降低所述BR基因的活性并且不是经由转座子引入的，并且其中所述玉米植物不包含br2-23矮秆等位基因或SNP5259。
3.根据权利要求2所述的玉米植物，其中所述BR基因是BR2基因。
4.根据权利要求3所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组。
5.根据权利要求4所述的玉米植物，其中所述至少一种非天然矮秆突变是根据BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间的单一胸腺嘧啶(T)插入。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于所述至少一种非天然矮秆突变是杂合的。
7.根据权利要求6所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含天然BR2突变等位基因。
8.根据权利要求7所述的玉米植物，其中所述天然BR2突变等位基因是br2-MX。
9.根据权利要求8所述的玉米植物，其中所述天然BR2突变等位基因包含在所述BR2基因的外显子5中插入4.7kb的转座子。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含选自由取代、插入、倒位、缺失、复制以及它们的组合组成的组的至少一种非天然矮秆突变。
11.根据权利要求10所述的玉米植物，其中至少一种非天然矮秆突变是根据所述BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间的单一胸腺嘧啶(T)插入。
12.一种用于生产半矮化玉米植物的方法，所述方法包括：
a.提供识别玉米细胞中BR基因中的靶位点的指导RNA，其中所述指导RNA与在所述靶位点处产生链断裂的RNA引导的核酸酶相关联地起作用；
b.从所述玉米细胞产生玉米植物；以及
c.选择表现出半矮化表型的所述玉米植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括将序列整合到所述链断裂中，其中所述链断裂是双链断裂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述序列整合在BR2基因中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述序列是根据所述BR2开放阅读框在核苷酸编号5420与5421之间插入的单一胸腺嘧啶核碱基。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶位点包含选自由SEQ ID NO:7-17组成的组的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述指导RNA包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述玉米植物对于所述BR基因是杂合的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中表现出半矮化表型的所述玉米植物包含天然BR2突变等位基因。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述天然BR2突变等位基因是br2-MX。
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