CN102373278A - 与玉米株高性状相关的snp位点 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与玉米株高性状相关的SNP位点。本发明的玉米株高性状相关的SNP位点为SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸，所述SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸位于玉米基因组中玉米矮秆突变体基因br2的第5个外显子内；所述第5248位核苷酸为T。本发明分子标记，可以应用于不同遗传背景下的玉米育种，可以用于玉米遗传改良；该方法和标记在玉米育种领域具有广阔的应用前景。

Description

与玉米株高性状相关的SNP位点

技术领域

本发明涉及一个玉米株高基因Br2的两个等位基因，及它们内部功能位点、所编码蛋白及在作物遗传育种及生上应用。

背景技术

玉米不仅是重要的粮食作物，也是重要的饲料来源和工业原料，同时作为C4作物的玉米还是重要的能源作物。随着耕地面积的不断减少，增加单位面积的产量是增加玉米产量的首要选择，而单位面积种植密度的增加则是提高单产的最重要的途径。因此，改良玉米的株型以提高种植密度是玉米遗传育种的重要方向，而株高的适度降低在调控株型中起着至关重要的作用。矮化品种的采用曾使水稻、小麦等作物的产量有了飞跃性提高，引发了第一次绿色革命；而目前在玉米中被克隆的株高基因，大多来自于表型极端的突变体，对其它农艺性状影响过大，很难广泛应用于生产。近年来，随着分子生物学的迅速发展，许多控制株高的QTL被定位，分析和研究其机理并通过分子生物学手段适度调整株型成为玉米遗传改良的重要突破口。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于鉴定玉米株高的引物对，或者说提供一种用于鉴定下述SNP位点的引物对。

本发明所提供的用于鉴定玉米株高的引物对，为如下(1)或(2)所示：

(1)第一条引物序列为：SEQ ID NO：3；第二条引物序列为：SEQ ID NO：4；第三条引物序列为：SEQ ID NO：5；

(2)第一条引物序列为：SEQ ID NO：6；第二条引物序列为：SEQ ID NO：7。

上述任一所述引物对在鉴定玉米株高中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述引物对在鉴定玉米基因组中权利要求3所述SNP位点中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述引物对在玉米选择育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一个与玉米株高性状相关的SNP位点。

本发明所提供的与玉米株高性状相关的SNP位点，为SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸，所述SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸位于玉米基因组中玉米矮秆突变体基因br2的第5个外显子内；所述第5248位核苷酸为T。

上述SNP位点在鉴定玉米株高中的应用也属于本发明的保护范围。

上述SNP位点在玉米选择育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种与玉米株高性状相关的DNA片段。

本发明所提供的与玉米株高性状相关的DNA片段，为如下甲或乙所示：

甲：SEQ ID NO.1中自5’末端起第4331位至第5957位核苷酸所示DNA片段；

乙：将SEQ ID NO.1中自5’末端起第4331位至第5957位核苷酸所示DNA进行任意突变得到的突变后DNA；所述突变后的DNA片段具有降低玉米株高但不影响玉米产量的功能。

上述SNP位点或上述DNA片段在调节玉米株高中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种用于扩增上述SNP位点的引物对。

本发明所提供的用于扩增上述SNP位点的引物对，为如下(1)或(2)所述：

(1)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示DNA分子；

(2)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示DNA分子。

本发明通过大量实验研究，发现了一个影响玉米株高但不影响玉米产量的SNP位点，进一步开发了鉴定该SNP位点的引物对。应用本发明的SNP位点及引物对可以在玉米早期事先鉴定玉米株高，而不用等到玉米成熟后通过表型鉴定株高。本发明SNP位点及引物对加快了玉米育种进程，在玉米的选择育种领域有广阔的应用前景。

附图说明

图1为QTL-qPH1区段近等基因系(NIL_88\279)的构建示意图。

图2为qPH1基因结构。

图3为155份关联群体测序引物位置示意图(其中P1，P2和P3，P4两对引物扩增区段在基因中有一段交叉)。

图4为目标基因的蛋白质空间结构预测。

图5为用分子标记扩增产物的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

NIL_88\279同样为本实验室自己选育的近等基因系材料(见图1：QTL-qPH1区段近等基因系(NIL_88\279)的构建示意图)；RIL88为本实验室自己选育的重组自交系群体中的第88份材料，其中重组自交系群体在文献“Tang J H，Teng W T，Yan J B，et al.Genetic analysis ofplant height using a set of recombinant inbred line populations in maize.Euphytica，2007，155：117-124”公开过，公众可以从中国农业大学获得。

玉米自交系B73、综3、87-1、掖107、81162、郑32、郑58、4F1、川48-2、W138、丹9046、综31、昌7-2、Mo17、By804、A619均在文献“Genetic analysis and characterizationof a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Xiaohong Yang，Jianbing Yan，et.，al.Theor Appl Genet(2010)121：417-431”中公开过。公众可以从中国农业大学获得。

实施例1、功能位点SNP5259的发现及功能研究

一、QTL-qPH1精细定位与克隆

(一)QTL-qPH1近等基因系构建及评价：

采用高代回交策略构建目标基因QTL-qPH1的近等基因系，如图1所示，选择强优势组合综3和87-1发展而来的重组自交系群体中株高极端的两个家系RIL88(平均株高136cm)和RIL279(平均株高236cm)，在qPH1所在目标区段，RIL88携带来自Zong3的片段，而RIL279所携带片段来自于87-1.全基因组101个SSR标记的扫描结果显示两家系间仅存在40％的遗传学差异。以RIL88为轮回亲本对供体亲本RIL279进行多带回交构建了株高主效QTL-qPH1的近等基因系(NIL_88\279).

在早期世代BC₁F₁，BC₂F₁和BC₃F₁仅根据表型进行选择，保留株高高的个体。在BC₄F₁代，利用RIL88和RIL279之间有差异的101个SSR标记进行扫描，检测到其中一个单株(05YH175-2)株高与轮回亲本RIL88存在很大差异，同时只有qPH1区段(1号染色体)和8号染色体8.03bin上umc1360-umc1741区段为杂合基因型，而其他区域均已回复到轮回亲本RIL88的基因型，因此选择该单株自交发展的BC₄F₂群体在于2006年北京对qPH1进行定位。在2006年海南由BC₄F₂发展的BC₄F₃家系中，扫描到其中一个单株(06YH054-6)只有在qPH1区域为RIL279的基因型，其他遗传背景全部回复到轮回亲本RIL88，并仍在株高上与RIL88表现出很大的差异，利用RIL88继续对该单株回交并自交得到BC₅F₂群体，利用umc1122和MH405为两端侧翼标记筛选重组单株并通过自交得到BC₅F₃和BC₅F₄进行后代证用而对qPH1进行精细定位。在重组单株的BC₅F₄家系中，选择qPH1渗入片段最小的家系中的一个单株(08YB036-7)用RIL88回交并自交，发展BC₆F₂进行进一步精细定位并同时发展渗入片段更小的qPH1近等基因系(NIL_88\279)。(图1，P：表型鉴定；G：基因型鉴定)。

(二)田间实验与表型测定：

田间试验分别于2006年至2010年春季在中国农业大学昌平实验站和上庄试验站(北京)，2006年至2009年冬季在中国农业大学南滨国营农场试验站(海南三亚)进行，每年5月中旬在北京进行春播，9月份收获，6月中旬在北京进行夏播，10月份收获；每年11月初在海南进行南繁播种，次年3月份初收获。播种地块平坦肥沃，均匀施足底肥(海南三亚起垄播种)，灌水保墒，采用完全随机区组设计，行长300cm或500cm，株距25cm，行距50cm，大小走道各为100cm和50cm。每穴2-3粒或单粒播。五叶一心进行定苗后，乳熟期调查株高和穗位高，株高为从地面到雄穗顶部的高度；穗位高为地面至第一个雌穗着生节的高度。

(三)基因型鉴定

F₁群体与F₂群体分别在5～7片展开叶时取叶片提取DNA，并分别标记每个单株，对于F₃家系，则将具有同一基因型的所有单株进行混合叶片取样，以小区号进行标记，在田间迅速冷冻保存。每个样品DNA稀释到10ng/μl左右进行PCR扩增，用聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。目标基因组区域序列信息来源于玉米B73全基因组测序数据，用SSRHunter扫描目标基因组序列中的SSR位点，再利用Primer5.0(www.Premier5BioSoft.com)设计引物，开发多态性标记，用于目标基因组区域有利重组单株的筛选，相关引物信息见表1。

表1、精细定位PCR扩增引物信息

注：表中的M13序列为：5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′，引物序列均为5’端至3’端。

(四)QTL定位分析

利用Windows QTL Cartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)对BC₄F_2:3群体进行复合区间QTL作图定位分析(1000次permutation，P＝0.05水平)。对qPH1进行初步的定位分析。然后结合BC₄F₂，BC₅F₂和BC₆F₂的重组单株基因型及后代表型验证结果，对qPH1进行最终的精细定位。

实验结论：利用BC₄F_2:3在umc2396附近定位到一个影响株高和穗位高的主效QTL，影响株高的主效QTL的LOD值高达26.1-48.4，能够解释65.7-88.3％的表型变异，影响穗位高的主效QTL的LOD值高达24.4-44.9，能够解释55.3-86.4％的表型变异(表2)。

通过发展8030个单株的BC₆F₂群体筛选重组单株并进行后代验证，最终将qPH1定位在玉米基因组1号染色体1.07bin上约1.6kb的范围内(图2)。在目标区段中，RIL88和NIL_88\279共存在5个SNP的差异，其中RIL88的目标区段为SEQ ID NO：1中5’端第4331位至第5957位核苷酸，NIL_88\279的目标区段为SEQ ID NO：2中5’端第4342位至第5968位核苷酸。

表2：BC₄F₂和BC₄F₃群体中株高及穗位高的QTL定位(A：加性效应，D：显性效应，A/D：

加性/显性，R²：贡献率)

二、序列分析

根据精细定位结果，利用生物信息学手段，获取B73中目标区段及其上下游的序列，根据B73中Br2基因的GSS、mRNA全长及蛋白序列对qPH1的两个等位基因进行了结构划分和序列分析。目标区段位于该区段位于玉米株高基因Br2(Multani et al.，2003，Sience)的第5个外显子上，基因产物为负责生长素极性运输的输出膜蛋白，是生长素胞间运输的输出载体。Br2基因由5个外显子和4个内含子组成，其中，前4个外显子长度较短，第五个外显子较长、长度超过2kb(图3)。利用primer5.0设计覆盖整个基因的扩增引物，共筛选出7对有交叠的引物(表3)，对轮回亲本RIL88及近等基因系NIL_88\279中的两个Br2等位基因扩增并进行序列比对分析，结果显示：在基因组水平上，RIL88及NIL_88\279存在诸多差异，包括不同长度的插入、缺失及一些SNP位点；在mRNA水平上，与NIL_88\279相比，RIL88存在一个3bp缺失(第1外显子)、一个9bp插入(第3外显子)及分布于整个mRNA上的22个SNP位点。结合BC₆F₂群体的定位结果，只有位于第5个外显子上的5个SNP位于1.6kb的精细定位置信区间内；用Primer5.0对NIL_88\279及RIL88的mRNA序列进行翻译得到蛋白序列并对比显示存在4处差异：与NIL_88\279相比，RIL88存在一个氨基酸的缺失、3个氨基酸的插入、1个氨基酸发生由脯氨酸(P)变为亮氨酸(L)及一个氨基酸由精氨酸(R)变成亮氨酸(L)；在这4处差异中，只有位于第5外显子上SNP5259导致由NIL_88\279中精氨酸(R)至RIL88中亮氨酸(L)的改变位于精细定位的置信区间内。进一步利用蛋白质三维结构分析软件Pymol(http://www.pymol.org/)对此基因的空间结构进行分析，发现该基因为膜蛋白，由具有相似结构并对称的两部分组成，每一部分都包括由6个α-螺旋组成的跨膜区(TM：trans-membrane domain)及ATP结合区(NBD：nucleotide-bindingdomain)，整个蛋白质分子共有12个α-螺旋组成跨膜区，其中SNP5259参与编码的氨基酸位于第9个α-螺旋上。对发生改变的氨基酸性质进行分析发现，在NIL_88\279中该位点上的精氨酸(R)具有长侧链基团、带正电且亲水；而RIL88中该位点上的亮氨酸(L)侧链较短、带正电且疏水。由于该氨基酸的残基伸向蛋白质跨膜区通道内侧，带正电荷的精氨酸可捕捉带负电荷的IAA^-并在通道中传递和输出细胞，当突变导致其变为中性且短侧链的亮氨酸后，捕获和传递生长素分子的能力受到很大影响，使植株下部生长素获得量减少而导致节间逐渐缩短，进而影响株高。(图4，箭头所指为SNP5259造成的氨基酸改变在蛋白上的位置，其位于跨膜区的α-螺旋上)

表3：qPH1全长扩增及real-timr PCR引物

5个SNP的位置及详细信息如下：

SNP4519：玉米株高基因Br2在NIL_88\279中等位基因SEQ No.2中第4519位核苷酸为C，Br2在RIL88中等位基因SEQ No.1中第4508位核苷酸为A。

SNP4999：玉米株高基因Br2在NIL_88\279中等位基因SEQ No.2中第4999位核苷酸为C，Br2在RIL88中等位基因SEQ No.1中第4988位核苷酸为G。

SNP5041：玉米株高基因Br2在NIL_88\279中等位基因SEQ No.2中第5041位核苷酸为A，Br2在RIL88中等位基因SEQ No.1中第5030位核苷酸为C。

SNP5259：玉米株高基因Br2在NIL_88\279中等位基因SEQ No.2中第5259位核苷酸为G，Br2在RIL88中等位基因SEQ No.1中第5248位核苷酸为T。

SNP5320：玉米株高基因Br2在NIL_88\279中等位基因SEQ No.2中第5320位核苷酸为C，Br2在RIL88中等位基因SEQ No.1中第5309位核苷酸为G。

NIL_88\279中5个SNP基因型依次为：

SNP4519：C，SNP4999：C，SNP5041：A，SNP5259：G，SNP5320：C

RIL88中5个SNP基因型依次为：

SNP4519：A，SNP4999：G，SNP5041：C，SNP5259：T，SNP5320：G

三、RIL88及NIL_88\279的表型解析

(一)株高、穗位高及其他农艺性状的测量

RIL88及NIL_88\279于2008年冬在海南，2009年春在北京进行种植，田间种植采用完全随机区组设计，每一种材料种植成一个小区，一个小区4行，每行13个单株。每一个环境种植两个重复，田间管理采用普通大田种植管理技术。调查各种农艺性状，其中在乳熟期调查株高和穗位高，株高为从地面到雄穗顶部的高度。在2009年春天测量每个节间的长度，测量结果以平均值±标准差表示。

(二)细胞学检验

为研究目标基因qPH1中SNP功能位点造成株高变化的细胞学机理，取RIL88及NIL_88\279拔节期存在显著差异的下部对应节间进行扫描电镜检测，取样时期为植株叶片数展11见16。将地上部由下至上第2节节间中段切下，用锋利的双面刀片分别对所取茎块进行平行及垂直维管束切割成厚度约1mm的片状，装入盛有FAA固定液的10ml玻璃小瓶中待用。对样品进行前脱水前处理：在浓度为70％、80％、90％乙醇中各处理15min，无水乙醇中处理3次各15min，进而将样品转入醋酸异戊酯中处理15min，重复一次。将通过前处理的材料进行干燥，干燥后固定于样品台上，喷金，置于扫描电镜内，观察和统计高度、面积等细胞大小的各项指标。

实验结果：RIL88及NIL_88\279在不同环境下(2年两点)的株高及穗位高均表现出显著差异；而株高的差异主要是由节间长度变化导致。组织学检验证明了节间长度的差异由细胞数目的变化导致而非细胞大小，纵向叠加的细胞数不同最终决定了RIL88与NIL_88\279间的株高差异。

四、关联分析检验

(一)、155份温带自交系关联群体验证其它4个SNP与株高不相关

l、关联群体来源、田间试验及表型测定

本专利中所涉155份自交系组成的关联群体信息可参考文献：Genetic analysis andcharacterization of a new maize association mapping panel for quantitative traitloci  dissection  (Xiaohong  Yang，Jianbing  Yan.et  al.Theor  ApplGenet(2010)121：417-431)。利用覆盖全基因组的82对SSR和1536个SNP多态性分子标记对此155份温带优良自交系组成的关联群体进行了群体结构及系间的亲缘关系评估(Yang等，2010)，于2006年春(北京上庄)、2007年冬(海南三亚)及2008年春(北京昌平、上庄两点)进行种植，完全随机区组设计，每个系种植1个小区(每小区1行，每行13株)，每点设置两个重复。采用普通大田种植管理技术并调查各种农艺性状；株高及穗位高在乳熟期调查，地面至雄穗顶部高度记为株高，地面至雌穗着生点高度记为穗位高，最终计算平均值及标准差。

2、个体的基因型检测：

利用5N3F/5N3R及212F/211R两对有重叠的引物对关联群体中155份材料进行PCR扩增并测序，检测5个SNP，引物在基因上的位置及交叠情况如图3。5N3F/5N3R扩增区段为Br2在NIL_88\279中等位基因(SEQ ID No.2)3760-5146位核苷酸。212F/211R扩增区段为Br2在NIL_88\279中等位基因(SEQ ID No.2)第4960-5786位核苷酸。5N3_F：SEQ ID NO：8；5N3_R：SEQ ID NO：9；212_F：SEQ ID NO：10；211R：SEQ ID NO：11。

3、分析方法：

利用MUSCLE软件(Edgar，2004)对所有序列进行比对分析，利用TASSEL2.10(Bradbury等，2007)进行关联分析，在最小等位基因频率≥0.05水平下，统计核苷酸多态性位点数并根据每个位点的P值结合多年多点的表型数据判断其是否与株高及穗位高关联。

结合qPH1基因的目标区段在155份中国优良自交系中的核苷酸多态性和2006年春(北京上庄)、2007年冬(海南三亚)及2008年春(昌平和上庄)三年四个点的株高表型值，利用混合线性模型进行关联分析(Yu等，2006；Zhang等，2010)，用于验证精细定位结果和功能位点挖掘。

155份中国关联群体的每个材料名称、其平均株高、每个SNP位点的基因型类型结果如下表。

表4：155份自交系材料名称，基因型及表型

NA＝not avai lable

结论：155份温带自交系关联分析结果显示：精细定位置信区间内5个SNP中，引起氨基酸改变的SNP5259频率低于0.05(只存在于掖107、81162、综3及丹9046中)，未达到统计学检验的标准，因此关联分析不能验证其功能；其余4个未导致氨基酸差异的SNP均达到统计学检验的标准，基于3年4点的表型数据进行关联分析，显示均与表型不关联，进而排除了4个SNP影响株高的可能性，同时说明只有目标区段内仅存的SNP5259可能是功能位点(表4)。

表5：目标区域内5个SNP在155份温带自交系中的关联分析结果：

E1至E4为155份自交系群体4个不同环境下的表型数据，NA＝not available，RIL88及NIL_88\279基因型分别表示于斜线前后。

(二)、527份温带自交系关联群体验证其他4个SNP与株高不相关

本实验目以来自全世界范围内更多的玉米种质资源(527份自交系)为材料进行关联分析，为精细定位置信区间内5个SNP的功能检验提供更多证据。

527份来自全世界范围内的优良自交系涵盖温带、热带及亚热带材料。其中，238份自交系为来自中国的温带材料，235份CIMMYT(国际玉米小麦改良中心)材料及54份GEM(GermplasmEnhancement of Maize)材料。527份材料在文献中公开过：“Characterization of a globalgermplasm  collection  and  its potential  utilization  for  analysis  of  complexquantitative traits in maize.[Xiaohong Yang，Shibin Gao，Shutu Xu，Zuxin Zhang，Boddupalli M.Prasanna，Lin Li，Jiansheng Li，Jianbing Yan.Mol Breeding 2010”。公众可从中国农业大学获得该527份种质资源。

表型检测：方法与实验(一)中所述方法一致。株高及穗位高表型数据为527份自交系与2009年在海南、云南及四川三个地点的表现。

基因型检测：使用扩增155份自交系的两对引物5N3F/5N3R及212F/211R对527份自交系进行PCR扩增并测序，检测其基因型；两对引物的扩增长度及位置同上。

关联分析：方法与实验(一)中所述方法一致。

实验结果：通过扫描527份自交系，除155自交系组成的关联群体中发现的4个系(掖107、81162、综3及丹9046)外，在W138中也检测出含有稀有SNP(T)，5个含此稀有SNP的自交系均为温带材料。此外，与155份关联群体的结论一致，在527份自交系群体中，精细定位区域内的在序列水平上有差别的5个SNP中，没有引起氨基酸变化的4个SNP仍被检测到与株高无关联(表6)，从而同样排除了这4个SNP对株高的作用，SNP5259即成为精细定位目标区段内仅存的多态性位点，是最有可能导致株高变化的变异。其功能最终通过构建F₁及F₂分离群体而被验证。

表6：目标区域内5个SNP在527份自交系中的关联分析结果：

L1，L2及L3分别为527份自交系在海南、云南及四川的株高及穗位高表现，NA＝notassociated，RIL88及NIL_88\279的基因型分别表示于斜线前后。

(三)、SNP5259在玉米祖先大刍草中的研究

1、实验材料：192份大刍草DNA由CIMMYT(国际玉米小麦改良中心)提供，具体信息如表7中所示。

表7：192份大刍草的名称及来源

2、基因型检测：用引物212F/211R进行PCR扩增并测序，在基因上的扩增位置同上，扩增长度为827bp。由于大刍草为高度杂合材料，因而采取对PCR产物直接进行测序，并通过SNP5259位点的测序峰图来判断其基因型及杂合程度。

3、实验结果

192份大刍草测序结果显示：所测区段内存在许多杂合位点，但SNP5259位置上的核苷酸均为纯和G(NIL_88\279中基因型，即野生型)，并未检测到RIL88中的稀有SNP(T)；说明该突变在玉米的祖先大刍草中不存在。含此稀有SNP(T)的5个系均来自温带种质资源中，且在系谱上存在血缘关系，因此推测该SNP的产生源于自然突变，发生时间很可能位于温、热带材料分化后；其发生时间及稀少程度预示着该突变还未引起育种家的关注而被应用到玉米遗传改良中，因此这个能使株高适度降低的有益突变有着极大的应用前景及应用价值。

五、qPH1的表达分析

为进一步验证RIL88与NIL_88\279的差异是由qPH1候选基因内部功能位点SNP5259变异造成，还是由候选基因的表达量的变化引起的，对不同发育时期的RIL88与NIL_88\279茎节组织相应节间部位取样进行表达差异分析。

以节间伸长最快的拔节期为标准，在即将进入拔节期(8片展开叶及13片可见叶)及拔节中(9片展开叶及14片可见叶)、后期(11片展开叶及16片可见叶)各选取1个时间点取样，根据叶龄指数，每个时期每个材料平行选取展开叶片数与总叶片数均一致、株高及分化节数相同、发育程度最一致、无病虫侵袭的植株10株作为10个生物学重复，切取地上部同一节间正中部区段，再将其按中心轴分割成6个大小一致的扇形小块，尽量保证切取的茎块含有同样比例的木质部与韧皮部及表皮组织。使用TRIZOL reagent(Invitrogen)提取所取组织的总RNA，在AMV-RT反转录酶的作用下实施反转录反应，使用Ex Taq预混液(TakaraShuzo，Kyoto，Japan)、ABI 7500实时定量PCR仪进行real-time PCR反应，方法为2^-ΔΔCt法。Real-time PCR引物RT12设计于近基因3’端，扩增长度为141bp，使用β-actin作为内标，基因特异性引物序列及内标引物序列参见表3.

结果：对三个时期的RIL88及NIL_88\279表达量值进行显著性测验，P值分别为0.669，0.290及0.337，即两材料3时期该基因的表达量差异不显著，因此株高的差异不是由目标基因的表达量变化导致。

综合关联分析及表达分析的结果，位于玉米Br2基因第5外显子上的SNP5259变异导致携带此基因不同等位基因的NIL_88\279及RIL88间株高差异。分子生物学机理为：该SNP由G(NIL_88\279中)至T(RIL88中)的突变导致氨基酸由R(NIL88\279中)至L(RIL88中)的改变，氨基酸性质上的极大转变导致了该基因编码的生长素输出载体捕获和传递生长素的能力下降，进而导致RIL88中下部茎节获得的生长素逐渐减少而矮化。本研究结果同时说明，精细定位的置信区间及附近区域为该基因的重要功能区段，对该区段进行一个多若干个能导致氨基酸变化的点突变都可作为适度降低玉米株高的有效手段。

实施例2、PCR的分子标记的开发及应用

为方便在玉米育种及品种改良中更好的应用此稀有等位基因，在SNP5259的两侧筛选及开发了两个与其紧密连锁的侧翼标记(公共标记umc2396及INDEL标记MH412)，并在SNP5259上开发了一个直接检测此稀有SNP的AC-PCR标记MN3。

一、实验材料如下：

(1).具有稀有SNP5259(T)的5份自交系：81162、掖107(Ye107)、综3(Zong3)及W138，

(2).不具有稀有SNP5259(即此处SNP为G)的10份自交系：87-1，综31(Zong31)，郑58(Zheng58)，昌7-2(Chang7-2)，B73，Mo17，4F1，郑32(Zheng32)，By804，A619。

(3).精细定位使用的两个亲本材料：RIL88及NIL_88\279。

二、基因型检测引物：

第一组：引物MH412

MH412_F：SEQ ID NO：6；MH412_R：SEQ ID NO：7。

第二组：MN3：

MN3_F1：SEQ ID NO：3；MN3_F2：SEQ ID NO：4；MN3_R：SEQ ID NO：5。

第三组：umc2396。

umc2396为性质为SSR的公共标记，公众可从www.maizesequence.org获得其序列，该标记位于Br2基因第4内含子；MH412为本课题组通过对基因3’端测序后，基于一处若干碱基的插入缺失而开发的INDEL标记；两标记均显示长度多态性。

三、基因型检测方法

1、umc2396或MH412的扩增体系及程序

分别在5～7片展开叶时，提取叶片DNA，稀释到10ng/μl浓度的工作液进行PCR扩增，并对所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

PCR扩增体系为：10×Buffer  1.5μl，dNTP(2.5mM)1.2μl，Forward primer(10pM)0.5μl，Reverse primer(10pM)   0.5μl，DNA  polymerase(2.5u/μl)0.1μl，DNA5.0μl，ddH₂O 6.2μl，Total  15μl。

PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s，35个循环；72℃，45s；72℃，10min；4℃，till use。

2、AC-PCR标记MN3

AC-PCR标记MN3基于等位基因竞争性PCR原理开发，针对无法开发CAPs标记的SNP设计可直接对SNP进行分型的标记。具体做法为：根据已知SNP位点设计两条特异正向引物(FP)，引物3’末端的碱基分别与已知SNP的两个碱基相同，在其中一条引物的5’端加一段19bp的M13序列(5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’)，然后选择一条合适的共同反向引物(RP)。进行PCR扩增是同时加入三条引物(两条特异正向引物及一条公共反向引物)，在较高的退火温度下进行扩增；当脱货温度足够高时，与模板完全匹配的正向引物竞争性增强，而在3’端与模板存在一个SNP差异的另一条正向引物竞争力减弱直至完全不能结合模板扩增；含有不同SNP的模板扩增出不同的PCR产物，而添加了M13尾巴的引物扩增出的PCR产物较长，即将SNP差异转换为长度多态性，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。更详细的原理和方法参考“一种基于聚合酶链式反应检测SNP的方法中国农业大学学报200611(3)51-55”。

PCR扩增体系为：10×Buffer  1.5μl，dNTP(2.5mM)0.3μl，Forward primer1(10pM)0.15μl，Forward primer2(10pM)0.15μl，Reverse primer(10pM)0.3μl，DNA polymerase(2.5u/μl)0.1μl，DNA 5.0μl，ddH₂O 7.5μl，Total  15μl。

PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s；66℃，30s，×35；72℃，45s；72℃，10min；4℃，till use。

四、鉴定结果：

1、MH412的结果：电泳检测显示一条126bp长度的条带时，则鉴定为RIL88基因型，当扩增片段长度为120bp时，则鉴定为NIL_88\279基因型。由MH412扩增的序列不在SEQ ID NO：1范围内，而是位于该基因3’端。

2、MN3的结果：电泳检测只显示一条128bp长度的条带时，鉴定基因型为稀有SNP(T)，而当出现109bp条带时则鉴定基因型为非稀有SNP(G)。由MN3扩增的产物序列如SEQ ID NO：1中第5230-5520位核苷酸所示。

结果显示，利用MN3对两个亲本及各个自交系进行扩增，含稀有SNP(T)的81162、掖107、综3及W138基因型与RIL88相同，而其他自交系基因型与_NIL88\279相同(图5)，与测序结果吻合，因此可以作为可靠标记进行分子标记辅助选择。

综上，基于SNP5259开发了一个可供育种使用的AC-PCR分子标记，辅以两个与此SNP紧密连锁的侧翼标记，可对其直接进行分子标记辅助育种。

实施例3、qPH1功能验证及效应评估

一、qPH1在不同遗传背景中的效应

在所有扫描的自交系中，qPH1的功能位点SNP(5259)共有两种等位基因即G(NIL_88\279基因型，以qPH1+/+表示)和T(RIL88基因型，以qPH1-/-表示)。由于能适中的降低株高，RIL88中的Br2等位基因为适于育种使用的优良等位基因。由于目标SNP为稀有SNP，在自然群体中频率过低而不能通过关联分析验证功能。选取RIL88及含此稀有有利SNP的3份自交系Zong3，Ye107和81162，并使其分别与株高正常的4个常规自交系杂交，发展了4个F2分离群体，提高稀有等位基因的频率以评估其效应。4个杂交组配81162×4F1，掖107×郑32，掖107×B73和综3×川48-2与2008年冬在海南三亚组配，并于2009年春在北京将各个F₁单株自交得到F₂。播种前对每个F2群体的种子切取一小块胚乳组织，根据稀有SNP5259基因型进行基因型检测并分基因型于2009年冬及2010年春在海南三亚、北京上庄进行种植(qPH1-/-∶qPH1+/-∶qPH1+/+＝1∶2∶1，即5行∶10行∶5行；每行13株)。考察群体所有单株的田间株高，穗位高及产量性状，在excel中对同一背景下三种等位基因间进行单因素方差分析以评估环境影响，最终将数据在SPASS10.0中进行平均值的成组数据统计分析进行比较，检测功能位点SNP5259在不同遗传背景下的效应值。

结果显示：在4个杂交组合的F₂群体的两年两点的试验中，株高和穗位高均随着SNP5259的基因型变化而产生显著变化，qPH1-/-与qPH1+/+的植株间均检测到显著的差异(P＝0.05水平上)。说明在不同的遗传背景下，稀有SNP5259(T)都可以起到显著降低株高和穗位高的作用。而绝大多数产量相关性状并未因SNP5259基因型的变化而呈显著差异，少数性状存在较小差异或差异不稳定(只能在一种环境下检测到)，说明在不同遗传背景下，此稀有SNP可在不影响产量或对产量影响较小的前提下被应用于遗传改良。

表8：4个群体中不同基因型株高和穗位高的表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著

表9：4个群体中不同基因型产量相关性状的表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著，N代表在P＝0.05水平上没有差异

NS＝Not Significant

二、SNP5259在杂交种F1中的效应评估

由于玉米在生产上广泛应用的形式为杂交种，因此评估qPH1在不同杂交组合中的表现对其在育种及品种改良种的应用有极大意义。

于2009年冬在海南三亚，利用RIL88(qPH1-/-)和NIL_88\279(qPH1+/+)分别与具稀有SNP5259(基因型为T，以qPH1-/-表示)的自交系掖107、81162及不含稀有SNP5259(基因型为G，以qPH1+/表示)的两个自交系B73、昌7-2分别杂交，并比较两亲本NIL_88\279及RIL88与同一自交系杂交所得两个F1间的株高、穗位高及各个产量性状差异。各杂交组合于2010年春在北京上庄试验站分别种植，采用完全区组设计，每个组合种成一个小区(4行，每行13株)，设置两个重复，田间管理采用普通大田种植管理技术。对株高、穗位高及各个产量性状进行测量，并在SPASS10.0中进行平均值的成组数据统计分析及T检验。

结果显示：与同一常规自交系组配的两个F₁中，RIL88为亲本的F₁在株高及穗位高上显著低于以NIL_88\279为亲本的F₁，但两者在大部分产量性状上并无显著差异、差异很小或差异只能在一个重复中检测到(表10、11)。而在RIL88、NIL_88\279与不含稀有SNP5259的两个系B73、昌72分别组配的F1中，qPH1-/+与qPH1+/+间在株高、穗位高上仍存在显著差异，说明该稀有SNP5259在于其显性等位基因共存的杂合状态下也可有效降低株高；即只改良杂交组合中的其中一个亲本，也可达到适度降低株高的效果。

表10：B73杂交组合不同基因型个体间性状表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著，N代表在P＝0.05水平上没有差异

NS＝Not Significant

表11：昌7-2杂交组合不同基因型个体间性状表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著，N代表在P＝0.05水平上没有差异

NS＝Not Significant

表12：掖107杂交组合不同基因型个体间性状表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著，N代表在P＝0.05水平上没有差异

NS＝Not Significant

表13：81162杂交组合不同基因型个体间性状表现

**表示在P＝0.01水平上差异显著，*表示P＝0.05水平上差异显著，N代表在P＝0.05水平上没有差异。NS＝Not Significant。

通过对稀有SNP5259在F₁及F₂群体中的效应评估，验证了该稀有突变对株高、穗位高的显著影响及其为株高主效QTL-qPH1功能位点。该位点可在多个遗传背景下显著降低株高及穗位高且对产量无影响或影响较小，在杂合状态下仍对株高产生显著影响的事实说明仅改良杂交组配中的一个亲本即可达到降低株高的效果，决定其在玉米遗传改良中更广泛的应用。

Claims (7)

1.一种用于鉴定玉米株高的引物对，为如下(1)或(2)所示：

(1)第一条引物序列为：SEQ ID NO：3；

第二条引物序列为：SEQ ID NO：4；

第三条引物序列为：SEQ ID NO：5；

(2)第一条引物序列为：SEQ ID NO：6；

第二条引物序列为：SEQ ID NO：7。

2.权利要求1所述引物对在鉴定玉米株高中的应用；或权利要求1所述引物对在鉴定玉米基因组中权利要求3所述SNP位点中的应用；或权利要求1所述引物对在玉米选择育种中的应用。

3.一个与玉米株高性状相关的SNP位点，为SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸，所述SEQ ID NO：1中自5′末端起第5248位核苷酸位于玉米基因组中玉米矮秆突变体基因br2的第5个外显子内；所述第5248位核苷酸为T。

4.权利要求3所述SNP位点在鉴定玉米株高中的应用；或权利要求3所述SNP位点在玉米选择育种中的应用。

5.一种与玉米株高性状相关的DNA片段，为如下甲或乙所示：

甲：SEQ ID NO.1中自5’末端起第4331位至第5957位核苷酸所示DNA片段；

乙：将SEQ ID NO.1中自5’末端起第4331位至第5957位核苷酸所示DNA进行任意突变得到的突变后DNA；所述突变后的DNA片段具有降低玉米株高但不影响玉米产量的功能。

6.权利要求3所述SNP位点或权利要求5中所述DNA片段在调节玉米株高中的应用。

7.一种用于扩增权利要求3所述SNP位点的引物对，为如下(1)或(2)所述：

(1)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示DNA分子；

(2)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示DNA分子。

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