CN113481315A

CN113481315A - 一个与玉米植株矮化相关的分子标记

Info

Publication number: CN113481315A
Application number: CN202110764318.7A
Authority: CN
Inventors: 秦莉; 路小铎; 刘基生; 李海燕
Original assignee: Qilu Normal University
Current assignee: Qilu Normal University
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-06
Also published as: CN113481315B

Abstract

本发明公开了一个与玉米植株矮化相关的分子标记。本发明筛选到一个玉米株高变矮的突变体e975，虽然节数显著减少，植株高度显著变矮，穗长度显著变短，但e975和野生型相比产量并无明显差异。基因定位显示，该突变体的Zm00001d027807基因第1个外显子上有一个G→A的突变，导致非极性的甘氨酸变为碱性的精氨酸。针对该变异，我们开发了对应的分子标记引物(SEQ ID NO.3‑4)，PCR扩增后利用Sanger测序进行基因型判读可以鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型。该分子标记有助于玉米矮杆新品种的辅助选育。

Description

一个与玉米植株矮化相关的分子标记

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一个与玉米植株矮化相关的分子标记。

背景技术

玉米长期以来都是人类生存的基本食物来源和主要的动物饲料原料。我国玉米产量已居世界第二位，玉米产量提高对于解决我国粮食、食品、能源等问题都具有重要意义。提高作物产量的途径一是提高单株产量，二是增加种植密度。近几十年来，种植密度在提高玉米产量方面发挥了主要作用(Duvick，2005，Advances in agronomy 86，83-145)，提高种植密度成为提高产量的重要研究方向(Kebrom&Brutnell,2007)。玉米种植密度增加会导致倒伏、病害及光合效率降低等问题；矮化品种则可以提高玉米高种植密度下的抗倒性、抗病性及光合效率。

与赤霉素合成与信号传导相关的半矮杆基因的应用极大实现了粮食作物的大增产，被称为“第一次绿色革命”(Sasaki，2002，Nature 416，701-702；Hedden，2003，Trendsin Genetics 19，5-9)。目前发现的大部分矮化、半矮化基因均来自赤霉素合成与信号转导通路，如水稻中发现的3个GA缺陷型半矮化突变体d35、Sd(Semi dwarf1)和d18分别是由水稻合成基因OsKO2、OsGA20ox2和OsGA3ox2上的位点变异引起的(Tohet，2004；Sasaki，2002，Nature 416，701-702；；Itoh，2002，Plant Cell 14，57-70)；豌豆中4个GA缺陷型矮化突变体ls、lh、le和na分别是赤霉素合成基因KS、KO、GA3ox和KAO位点上的变异引起的(Ait-Ali，1997，Plant Journal 11，443-454；Davidson，2004，Plant Physiolgy 134，1123-1134；Martin et al.,1996；Davidson，2003，Plant Physiolgy 131，335-344)。

前人筛选到的矮杆、半矮杆种质资源多是由于赤霉素合成或信号转导通路基因突变，且玉米中这类遗传资源的背景不尽相同，同时植株矮化引起穗长度降低，进而穗行数、行粒数均有不同程度的下降，单株产量下降10％以上，甚至达到50％左右(比如：2016年四川农业大学徐敏的学位论文：一个玉米矮秆突变体K123d的遗传鉴定)。而以基因组解析最为透彻的B73自交系为背景的矮杆、半矮杆材料鲜有报道。申请人前期从实验室构建的玉米EMS突变体库中筛选得到一个植株变矮的突变体。基因克隆结果显示，该突变体中编码未知蛋白的基因Zm00001d027807在第1个外显子上发生了G→A单碱基突变，该突变体命名为e975。除植株变矮外，e975的穗行数、籽粒重等农艺性状无显著减少，具有较大的应用前景，因此通过将其导入生产上常用的优良自交系中可获得植株矮化的新种质，为培育矮杆耐密植玉米新品种提供了可能。

发明内容

申请人前期从本实验室构建的以玉米自交系B73为背景的EMS突变体库(MEMD，http://elabcaas.cn/memd/)中筛选到一个玉米株高变矮的突变体(植株高度为野生型的79.5％，图4)，虽然节数显著减少，植株高度显著变矮，穗长度显著变短，但e975和野生型相比产量并无明显差异。利用实验室开发的EcMutMap方法进行基因定位显示，该突变体的Zm00001d027807基因第1个外显子上有一个G→A的突变，导致非极性的甘氨酸变为碱性的精氨酸，该突变体命名为e975。针对该变异，我们开发了对应的分子标记引物，PCR扩增后利用Sanger测序进行基因型判读。经验证，该分子标记可以很好的用来区分Zm00001d027807基因突变位点的野生型和突变型。该分子标记有助于玉米矮杆新品种的辅助选育。

本发明首先提供一个与玉米植株矮化相关的分子标记，其特征是，玉米矮化基因Zm00001d027807第1个外显子上有一个G→A的突变；

与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点野生基因型检测相关的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1，加粗下划线碱基为单核苷酸位点变异SNP)：

GTTCAAAATCCTTGTGAAGAACCATAATCTTTCAGTGCACAATCTAAACAGGGTGATTCGATTTGCTGTAGAGGAACTCAGGGGGTTGCCATCTGGGTCACTACTGCTTAATCACTCTTTGGACGAGTCGCCACTTTGCATTCGCTTCTTGGAGGCATCATCACTGCAGAAAGTAGATAATTTCTTGCAGGACTTAATGCAGGCTTCTGGACTTAATAGGAACTTACAGAAGGCTGAAGGATTAGGTGACGGGGATAGTTTCATCCAAAACCACGATGTACTAGAGAAGGTTACCCTTAATTCTGATTCATCAGAACTGATCATTGATGGGCACACCTTCGGCGGAAAGTTTGATTCCGAGAGTGTTGATACTGATGCATTGCTTTCATGGCTGTACGCCGGATCTTCAATTGGTGAGCAGCTATTGGCCTGGAATCGTATGATCGACGAAAGGTCAAATCAGTGCGTCGACCTTATTCGAGCACTTGGGAGGGAGTTCAA。

与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点纯合突变基因型检测相关的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2，加粗下划线碱基为单核苷酸位点变异SNP)：

GTTCAAAATCCTTGTGAAGAACCATAATCTTTCAGTGCACAATCTAAACAGGGTGATTCGATTTGCTGTAGAGGAACTCAGGGGGTTGCCATCTGGGTCACTACTGCTTAATCACTCTTTGGACGAGTCGCCACTTTGCATTCGCTTCTTGGAGGCATCATCACTGCAGAAAGTAGATAATTTCTTGCAGGACTTAATGCAGGCTTCTGGACTTAATAGGAACTTACAGAAGGCTGAAGGATTAGGTGACAGGGATAGTTTCATCCAAAACCACGATGTACTAGAGAAGGTTACCCTTAATTCTGATTCATCAGAACTGATCATTGATGGGCACACCTTCGGCGGAAAGTTTGATTCCGAGAGTGTTGATACTGATGCATTGCTTTCATGGCTGTACGCCGGATCTTCAATTGGTGAGCAGCTATTGGCCTGGAATCGTATGATCGACGAAAGGTCAAATCAGTGCGTCGACCTTATTCGAGCACTTGGGAGGGAGTTCAA。

本发明还提供了一个与玉米植株矮化相关的分子标记引物，其特征是：

Forward primer：5’-CGATTTGCTGTAGAGGAACTCAGG-3’(SEQ ID NO.3)，

Reverse primer：5’-AATCAAACTTTCCGCCGAAGGTGT-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了上述的分子标记及分子标记引物在矮杆耐密植玉米新品种的辅助选育中的应用。

本发明还提供了上述的分子标记引物在鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型(鉴定矮化玉米植株)中的应用。

本发明还提供了一种应用上述分子标记引物鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型(鉴定矮化玉米植株)的方法，其特征是，

(1)以待测玉米材料的基因组DNA为模板，以上述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列为引物进行PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的PCR产物进行Sanger测序，然后利用Lasergene软件包SeqMan进行峰图判读，若变异位点为碱基G，则待测玉米材料为野生基因型；若变异位点为碱基A，则待测玉米材料为纯合突变基因型(植株高度变矮)；若变异位点为G/A，则待测玉米材料为杂合基因型(植株高度与野生型材料一致)。

所述PCR扩增体系为：正反向引物各1μL(10μmol/L)，基因组DNA 1μL，EasyTaq DNA聚合酶0.2μL，buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为：95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃过度延伸5min；16℃保存。

本发明的有益效果是：

1、本发明中筛选得到的e975突变体表现为植株变矮，穗行数、籽粒重等农艺性状无明显减少，在培育矮杆耐密植玉米新品种方面具有潜在应用价值。

2、本发明鉴定e975突变体中Zm00001d027807基因单碱基突变的分子标记物，可以快速鉴定野生基因型和突变矮杆基因型，为分子标记辅助选择育种提供新的靶标，可以大大缩短育种周期。

附图说明

图1为e975突变位点；A，挖掘e975突变位点的EcMutMap工作流程；B，突变位点在基因结构上的图示；

图2为e975突变位点分子标记开发；A和B分别为野生和突变基因型结果，方框内为突变位点；

图3为分子标记与植株高度的相关性；G和A表示野生基因型和突变基因型；***表示0.001水平下极显著相关。

图4为B73野生型和突变体e975的表型；A-B，植株高度表型；C，叶长和叶宽表型；D，穗部表型；E-J，植株高度、节数、叶长、叶宽、穗长和粒重统计结果；统计采用双因素方差分析，其中***表示P<0.001，**表示P<0.01。

具体实施方式

实施例1：e975突变体分子鉴定

按照本实验室开发的EcMutMap基因克隆方法(原理见图1A)，从野生型B73和e975突变体配制的F2分离群体中选35个具有e975突变表型的单株，取叶片提取DNA，DNA提取采用卡罗登试剂盒(Karroten,sK2304)，具体步骤参照说明书。然后按照每个单株500ng进行等量混合，送公司进行外显子捕捉测序。以网上公布的B73基因组为参考，利用GATK(v2.1-9)进行变异挖掘。采用SnpEff v3.6c进行变异位点注释。利用自编Perl脚本计算变异结果中的单核苷酸替换(SNPs)的指数(SNP-InDex)。按照如下条件选择与突变表型连锁的变异：1)G→A(C→T)；2)SNP-InDex>＝0.9；3)变异类型为非同义突变，提前终止/终止丢失，剪切位点供体/受体，起始密码子ATG获得/丢失，总共获得2个非同义突变位点，利用PCR和Sanger测序分析其与矮化表型的共分离情况，仅其中一个G→A的变异与表型共分离，该位点导致基因第1个外显子上一个氨基酸从甘氨酸转变为精氨酸(图1B)。

实施例2：e975变异位点分子标记设计

在突变位点两侧各截取250bp的基因组序列用作引物合成的模板(如SEQ IDNO.1-2所示，包含突变位点共计501bp)，利用Primer Premier 5在模板第251位碱基左右设计正向引物及反向引物。引物设计原则：Tm值60℃左右，产物大小250-550bp，引物长度22-24bp。

实施例3：野生型和e975突变体分子标记的验证

引物由南京擎科生物技术有限公司合成，具体序列如下。

Forward primer：5’-CGATTTGCTGTAGAGGAACTCAGG-3’(SEQ ID NO.3)，

Reverse primer：5’-AATCAAACTTTCCGCCGAAGGTGT-3’(SEQ ID NO.4)。

PCR体系总体积25μL，其中正反向引物各1μL(10μmol/L)，基因组DNA 1μL，EasyTaqDNA聚合酶0.2μL，buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序为：95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃过度延伸5min；16℃保存。

PCR扩增产物长度为298bp，然后利用1％琼脂糖胶凝胶电泳分离，符合目的片段大小的PCR产物送公司进行Sanger测序。测序峰图提交Lasergene软件包SeqMan分析，结果(图2)显示野生型单株突变位点为G碱基，突变单株变异位点为A碱基。说明该标记能够很好区分野生型和突变型基因。

实施例4：分子标记与植株高度的相关分析

为分析开发的分子标记引物在育种实践中的有效性，从B73和e975配制的F2分离群体中各选100株具有野生表型和矮化表型的单株，测量其植株高度，然后对这些单株分子标记的基因型和植株高度进行student t测验，结果如图3所示，开发的分子标记物与株高表型在0.001水平上显著相关(p值:2.291e-16<0.001)，说明该标记可用于玉米矮化育种中分子辅助选择且具有较高的可靠性。

实施例5：B73野生型和突变体e975的表型分析

B73野生型和突变体e975种植于大田中，在抽雄、散粉后选取长势良好的植株利用塔尺进行植株高度测量，同时去掉叶片，测量雌穗以下高度和雄穗长度，统计茎秆的节数。利用米尺测量第6，7，8片叶子(L6，L7，L8)的长度和宽度。种子收获晾干后测定穗子长度和穗粒重。

结果如图4所示，相比野生型B73，突变体e975的植株高度、节数、穗长都显著下降，植株高度为野生型的79.5％，叶长和穗粒重并无明显差异(下降幅度分别为2.7％，5.5％)，叶宽略有增加(增加幅度3.4％)。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁师范学院

<120> 一个与玉米植株矮化相关的分子标记

<130> 0

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点野生基因型检测相关的核苷酸序列

<400> 1

gttcaaaatc cttgtgaaga accataatct ttcagtgcac aatctaaaca gggtgattcg 60

atttgctgta gaggaactca gggggttgcc atctgggtca ctactgctta atcactcttt 120

ggacgagtcg ccactttgca ttcgcttctt ggaggcatca tcactgcaga aagtagataa 180

tttcttgcag gacttaatgc aggcttctgg acttaatagg aacttacaga aggctgaagg 240

attaggtgac ggggatagtt tcatccaaaa ccacgatgta ctagagaagg ttacccttaa 300

ttctgattca tcagaactga tcattgatgg gcacaccttc ggcggaaagt ttgattccga 360

gagtgttgat actgatgcat tgctttcatg gctgtacgcc ggatcttcaa ttggtgagca 420

gctattggcc tggaatcgta tgatcgacga aaggtcaaat cagtgcgtcg accttattcg 480

agcacttggg agggagttca a 501

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点纯合突变基因型检测相关的核苷酸序列

<400> 2

gttcaaaatc cttgtgaaga accataatct ttcagtgcac aatctaaaca gggtgattcg 60

atttgctgta gaggaactca gggggttgcc atctgggtca ctactgctta atcactcttt 120

ggacgagtcg ccactttgca ttcgcttctt ggaggcatca tcactgcaga aagtagataa 180

tttcttgcag gacttaatgc aggcttctgg acttaatagg aacttacaga aggctgaagg 240

attaggtgac agggatagtt tcatccaaaa ccacgatgta ctagagaagg ttacccttaa 300

ttctgattca tcagaactga tcattgatgg gcacaccttc ggcggaaagt ttgattccga 360

gagtgttgat actgatgcat tgctttcatg gctgtacgcc ggatcttcaa ttggtgagca 420

gctattggcc tggaatcgta tgatcgacga aaggtcaaat cagtgcgtcg accttattcg 480

agcacttggg agggagttca a 501

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 玉米植株矮化相关的分子标记引物Forward primer

<400> 3

cgatttgctg tagaggaact cagg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 一个与玉米植株矮化相关的分子标记引物Reverse primer

<400> 4

aatcaaactt tccgccgaag gtgt 24

Claims

1.一个与玉米植株矮化相关的分子标记，其特征是，玉米矮化基因Zm00001d027807第1个外显子上有一个G→A的突变；

与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点野生基因型检测相关的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，与玉米矮化基因Zm00001d027807突变位点纯合突变基因型检测相关的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一个与玉米植株矮化相关的分子标记的分子标记引物，其特征是：

Forward primer：5’-CGATTTGCTGTAGAGGAACTCAGG-3’；

Reverse primer：5’-AATCAAACTTTCCGCCGAAGGTGT-3’。

3.权利要求1所述的分子标记或者权利要求2所述的分子标记引物在矮杆耐密植玉米新品种的辅助选育中的应用。

4.权利要求2所述的分子标记引物在鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型中的应用。

5.一种应用权利要求2所述的分子标记引物鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型的方法，其特征是，

(1)以待测玉米材料的基因组DNA为模板，以分子标记引物进行PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的PCR产物进行Sanger测序，然后利用Lasergene软件包SeqMan进行峰图判读，若变异位点为碱基G，则待测玉米材料为野生基因型；若变异位点为碱基A，则待测玉米材料为纯合突变基因型，植株高度变矮；若变异位点为G/A，则待测玉米材料为杂合基因型，植株高度与野生型材料一致。

6.如权利要求5所述的鉴定杂交后代携带玉米矮化基因Zm00001d027807野生基因型和突变基因型的方法，其特征是，所述PCR扩增体系为：10μmol/L的正反向引物各1μL，基因组DNA 1μL，EasyTaq DNA聚合酶0.2μL，buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，ddH₂O补足至25μL；所述PCR反应程序为：95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃过度延伸5min；16℃保存。