CN111793710B - 与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的snp标记及方法和应用 - Google Patents

与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的snp标记及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记及方法和应用，该SNP标记具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中任意一个所示的核苷酸序列。本发明的SNP标记及方法，利用花梗分枝角度性状连锁的分子标记，开发出适宜高通量检测的KASP引物，具有时效性强、适合高通量检测的优点，对种质资源或育种材料进行鉴定，可以大大提高育种效率，减少育种选择的盲目性，是加快花球形状育种改良进程的有力工具。

Description

与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记及方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种SNP标记，具体涉及一种与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记及方法和应用。
背景技术
花椰菜的花球形状有平底和斜底之分。平底花球一般较为紧实，花梗颜色较白；而斜底花球一般较为松散，花梗由于更易受到阳光照射而较绿。目前市场对于绿梗的消费需求日益提高。因此，通过选育斜底花球的花椰菜品种而使花梗更绿是花椰菜育种的重要方向之一。
参照图1(图中SA表示角)，区别平底和斜底花球的最重要指标是花球底部花梗的分枝角度，平底的花球底部花梗的分枝角度大，斜底花球的花球底部花梗的分枝角度小。分枝角度具有较高的遗传力，可以通过人工选择进行品种的性状改良。
然而，由于花椰菜花球器官的独特性和分子生物学研究的相对滞后性，以往针对花球性状的品种改良均以基于表型选择的传统手段为主，周期较长，效率较低，且易受环境和季节的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，解决基于表型选择的品种改良存在周期长且效率低的问题，能够通过SNP标记快速鉴定出花椰菜的花球底部花梗分枝角度性状。
为了达到上述目的，本发明提供了一种与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，该SNP标记具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4中任意一个所示的核苷酸序列。
优选地，具有所述SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度小；具有所述SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度大。
本发明的另一目的是提供一种对花椰菜的花球底部花梗分枝角度鉴定的KASP引物组，该KASP引物组为引物组1或引物组2。
其中，所述引物组1具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序列的正向引物1、如SEQIDNO6所示的核苷酸序列的正向引物2和如SEQIDNO7所示的核苷酸序列的反向引物。
所述引物组2具有如SEQIDNO8所示的核苷酸序列的正向引物1、如SEQIDNO9所示的核苷酸序列的正向引物2和如SEQIDNO10所示的核苷酸序列的反向引物。
优选地，所述引物组1用于鉴定区分具有所述SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的核苷酸序列的花椰菜；所述引物组2用于鉴定区分具有所述SEQIDNO2和SEQIDNO4所示的核苷酸序列的花椰菜。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴定花椰菜花球底部花梗分枝角度的试剂盒，该试剂盒中的引物采用所述的KASP引物组。
本发明的另一目的是提供一种花椰菜花球底部花梗分枝角度的鉴定方法，该方法采用KASP反应体系进行PCR扩增，通过扩增产物进行判断：
具有所述SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度小；具有所述SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度大。
其中，所述KASP反应体系中采用的引物为所述的KASP引物组。
本发明的另一目的是提供一种花椰菜花球底部花梗分枝角度的分子标记辅助选择方法，该方法采用具有所述的KASP引物组的KASP反应体系进行PCR扩增，将同时具有SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的核苷酸序列的花椰菜作为选择的育种材料。
本发明的另一目的是提供一种所述的SNP标记在花椰菜花球底部花梗分枝角度性状鉴定或育种的应用。
优选地，在育种选择时，将同时具有所述SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的核苷酸序列的花椰菜作为育种材料。
本发明的与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，解决了基于表型选择的品种改良存在周期长且效率低的问题，具有以下优点：
本发明的SNP标记及方法，利用花梗分枝角度性状连锁的分子标记，开发出适宜高通量检测的KASP引物，具有时效性强、适合高通量检测的优点，对种质资源或育种材料进行鉴定，可以大大提高育种效率，减少育种选择的盲目性，是加快花球形状育种改良进程的有力工具。
附图说明
图1为花椰菜平底和斜底花球花梗的分枝角度图。
图2为本发明花椰菜花球底部花梗分枝角度的鉴定结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，具体如下：
(1)花球底部花梗分枝角度较小的花椰菜具有以下任意一个特异序列：
ZAAS.SA01-T(SEQIDNO1)：
5’-CGATTTCAATCTCTTCTAAAAGAAAATTTAAAAGGCAGATATTTTTG-3’；或
ZAAS.SA02-C(SEQIDNO2)：
5’-AACGCGAATCGAACCCGGGACCGTATTGGGGCCGAAGC-3’；
(2)花球底部花梗分枝角度较大的花椰菜具有以下任意一个特异序列：
ZAAS.SA01-A(SEQIDNO3)：
5’-CGATTTCAATCTCTTCTAAAAGAAAAATTAAAAGGCAGATATTTTTG-3’；或
ZAAS.SA02-T(SEQIDNO4)：
5’-AACGCGAATCGAACCCGGGACTGTATTGGGGCCGAAGC-3’。
一种对花椰菜的花球底部花梗分枝角度鉴定的KASP引物组，该KASP引物组包含：用于鉴定区分ZAAS.SA01-T和ZAAS.SA01-A的引物组ZAAS.SA01，或用于鉴定区分ZAAS.SA02-C和ZAAS.SA02-T的引物组ZAAS.SA02。
其中，引物组ZAAS.SA01包含：
正向引物1a(SEQIDNO5)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGTAGATCAAAAATATCTGCCTTTTAAA；
正向引物2a(SEQIDNO6)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGTAGATCAAAAATATCTGCCTTTTAAT；和
反向引物a(SEQIDNO7)：
CTCTAGTTCTTATCGATTTCAATCTCTTCTA。
其中，引物组ZAAS.SA02包含：
正向引物1b(SEQIDNO8)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGAATCGAACCCGGGACC；
正向引物2b(SEQIDNO9)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCGAATCGAACCCGGGACT；
反向引物b(SEQIDNO10)：
TGGTACTTGAGGGAGCTTCGGC。
一种花椰菜花球底部花梗分枝角度的鉴定方法，采用KASP反应体系进行PCR扩增，通过扩增产物的荧光信号判断花椰菜花球底部花梗分枝角度；其中，KASP反应体系中采用的引物对为上述用于对花椰菜的花球底部花梗分枝角度鉴定的KASP引物组。
具体地，该鉴定方法包含：
(1)花椰菜样品基因组DNA提取；
(2)PCR扩增及其产物检测：以步骤(1)中获得的基因组DNA为模板，以ZAAS.SA01或/和ZAAS.SA02引物组作为KASP引物组进行PCR扩增反应；
(3)根据扩增产物的荧光信号判断对应花椰菜材料的基因型，依据基因型数据判断花椰菜花球底部花梗分枝角度：
具有ZAAS.SA01-T或ZAAS.SA02-C特异序列的花椰菜材料花球底部花梗分枝角度较小；
具有ZAAS.SA01-A或ZAAS.SA02-T特异序列的花椰菜材料球底部花梗分枝角度较大；
同时具有ZAAS.SA01-T和ZAAS.SA01-A特异序列或同时具有ZAAS.SA02-C和ZAAS.SA02-T特异序列的花椰菜材料为杂合材料，其自交后代会出现花球底部花梗分枝角度分离。
实施例1
一种花椰菜花球底部花梗分枝角度性状快速鉴定的方法，该方法包含：
(1)幼苗基因组DNA抽提
将花椰菜种质材料的种子播种于穴盘，采用常规方法育苗，分单株编号；取各单株嫩叶按照常规CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。
(2)PCR扩增
以各幼苗基因组DNA为模板，以ZAAS.SA01为引物对分别进行PCR扩增。PCR体系采用96孔模块的KASP基本反应体系：总体积10μL，其中1μLDNA模板(50ng/μL)，5μLKASPmastermix(2×)，0.14μL引物对混合物，4μLddH2O。
(3)利用LC480softwarev1.5.1对PCR扩增产物进行分析，根据各样本荧光信号辨别其对应的基因型，参见图2，红色信号代表对应花椰菜材料具有ZAAS.SA01-T或ZAAS.SA02-C特异片段，其表型性状为花球底部花梗分枝角度较小；蓝色信号代表对应花椰菜材料具有ZAAS.SA01-A或ZAAS.SA02-T特异片段，其表型性状为花球底部花梗分枝角度较大；绿色信号代表对应花椰菜材料同时具有ZAAS.SA01-T和ZAAS.SA01-A或同时具有ZAAS.SA02-C和ZAAS.SA02-T特异序列，为杂合材料，其自交后代会出现花球底部花梗分枝角度分离；粉红色信号代表检测失败的样品，这个主要依赖于DNA提取质量，以及KASP分析时PCR的扩增情况，即实验操作质量。平均每100分材料可能会有3.5份是不准确的，检测的准确率为96.5％。
实施例2
一种选择花椰菜品种‘白玉80’(台湾禾丰种苗有限公司杂交种)与自交系‘4306-1’(台湾庆农种苗有限公司杂交种‘庆农90天’的自交F8代后裔)杂交后代中花球底部花梗分枝角度性状的分子标记辅助选择方法，包含：
(1)将‘白玉80’和‘4306-1’种子分别播种、育苗、定植于塑料大棚；以‘4306-1’为父本，‘白玉80’为母本开花期进行人工剥蕾杂交，待种荚成熟后收集种子，次年将种子定植于塑料大棚，开花时进行人工授粉自交，收获种子。
(2)将步骤(1)收获的种子播种于穴盘，采用常规方法育苗，分单株编号；取各单株嫩叶按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。
(3)以各幼苗基因组DNA模板，以ZAAS.SA01和ZAAS.SA02为引物对分别进行PCR扩增。PCR体系采用96孔模块的KASP基本反应体系：总体积10μL，其中1μLDNA模板(50ng/μL)，5μLKASPmastermix(2×)，0.14μL引物对混合物，4μLddH2O。
(4)利用LC480softwarev1.5.1对PCR扩增产物进行分析，选择ZAAS.SA01和ZAAS.SA02扩增产物荧光均为绿色或红色的材料继续定植于大田，其他材料淘汰。当定植于大田的花椰菜材料花球成熟时，在其中选择产量和抗逆性优秀的材料移栽至塑料大棚。
(5)将定植于大棚的花椰菜材料进行小孢子培养。对小孢子培养获得植株幼苗按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，按照步骤(3)中步骤进行扩增，并利用LC480softwarev1.5.1对PCR扩增产物进行分析，ZAAS.SA01-T和ZAAS.SA02-C扩增产物荧光均为红色的材料即为遗传稳定的兼具丰产性和斜底绿梗的花椰菜育种材料。
采用的花椰菜品种‘白玉80’农艺性状优异、丰产性好，但花球底部花梗分枝角度大，球底较平，花梗接受光照少而偏白。采用的花椰菜自交系‘4306-1’花球底部花梗分枝角度小，但花梗绿，商品性优。通过二者杂交，可在分离后代选择兼具丰产性和斜底绿梗的花椰菜育种材料。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记及方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgatttcaat ctcttctaaa agaaaattta aaaggcagat atttttg 47
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aacgcgaatc gaacccggga ccgtattggg gccgaagc 38
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgatttcaat ctcttctaaa agaaaaatta aaaggcagat atttttg 47
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aacgcgaatc gaacccggga ctgtattggg gccgaagc 38
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tcatgtagat caaaaatatc tgccttttaa a 51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat tcatgtagat caaaaatatc tgccttttaa t 51
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctctagttct tatcgatttc aatctcttct a 31
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgaatcga acccgggacc 40
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gaaggtcgga gtcaacggat tcgcgaatcg aacccgggac t 41
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tggtacttga gggagcttcg gc 22

Claims (9)

1.一种与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，其特征在于，该SNP标记核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中任意一个所示。
2.根据权利要求1所述的与花椰菜花球底部花梗分枝角度连锁的SNP标记，其特征在于，具有所述SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度小；具有所述SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度大。
3.一种对花椰菜的花球底部花梗分枝角度鉴定的KASP引物组，其特征在于，该KASP引物组为引物组1或引物组2；
其中，所述引物组1具有如SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的正向引物1、如SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的正向引物2和如SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的反向引物；
所述引物组2具有如SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的正向引物1、如SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的正向引物2和如SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的反向引物。
4.根据权利要求3所述的用于对花椰菜的花球底部花梗分枝角度鉴定的KASP引物组，其特征在于，所述引物组1用于鉴定区分具有所述SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的花椰菜；所述引物组2用于鉴定区分具有所述SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的花椰菜。
5.一种用于鉴定花椰菜花球底部花梗分枝角度的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的引物采用如权利要求3所述的KASP引物组。
6.一种花椰菜花球底部花梗分枝角度的鉴定方法，其特征在于，该方法采用KASP反应体系进行PCR扩增，通过扩增产物进行判断：
具有所述SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度小；具有所述SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的花椰菜的花球底部花梗分枝角度大；
其中，所述KASP反应体系中采用的引物为如权利要求3所述的KASP引物组。
7.一种花椰菜花球底部花梗分枝角度的分子标记辅助选择方法，其特征在于，该方法采用具有如权利要求3所述的KASP引物组的KASP反应体系进行PCR扩增，将同时具有SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的花椰菜作为选择的育种材料。
8.一种如权利要求1所述的SNP标记在花椰菜花球底部花梗分枝角度性状鉴定或育种的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在育种选择时，将同时具有所述SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的花椰菜作为育种材料。
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